CN108057034A - 柚皮素和积雪草酸组合治疗癌症 - Google Patents

Abstract

本申请涉及由于柚皮素和积雪草酸的组合使用而产生的先前未认识的协同效应的令人惊讶的发现。因此，为治疗或预防各种类型的癌症提供了新的方法和组合物。

Description

柚皮素和积雪草酸组合治疗癌症

相关申请

本申请要求于2016年11月9日提交的美国临时专利申请第62/419,565号的优先权，所述临时专利申请的内容为了所有目的通过引用整体并入。

发明背景

癌症是由于不受控制、具有扩散或转移潜能的细胞增殖而形成的致命疾病。2012年(最新获得全球癌症数据)，全世界有1410万新诊断的癌症病例(其中有740万男性病例和670万女性病例)和820万例癌症死亡。到2030年，全球数目预计达到2170万新的癌症病例和1300万例癌症死亡。由于经济发展中国家采用西方生活方式，如吸烟、饮食不良、缺乏身体锻炼和分娩较少，全球人口的癌症总量在将来有可能还更大。2008年，全世界由于癌症的过早死亡和残疾带来的总经济影响为$8950亿，占世界国内生产总值(GDP)的1.5％。来自癌症的这种经济损失比心脏病(经济损失的第二大主要原因)高出几乎19％。美国四分之一的死亡是由于癌症。在美国，癌症是仅次于心脏病的死亡原因。每年约120万美国人被诊断患有癌症；每年超过500,000人死于癌症。

由于癌症对人类健康的极大威胁和对全球经济的重要影响，仍急切需要开发用于治疗和预防各种类型癌症的新的有效方法。本发明解决了此需求和其它相关需求。

发明概述

已知柚皮素(NG)和积雪草酸(AA)独立地参与不同的细胞信号转导途径(参见，例如EP 2162274)。单独使用柚皮素和积雪草酸已经被用于治疗癌症和相关疾病(参见，例如美国专利申请第2004/0097463号；美国专利第5,145,839号；WO 1999/01567；EP 0352147；WO 2001/051043)。同时，柚皮素和积雪草酸已经被用于治疗纤维化，参见，例如WO2014/063660。本发明人令人惊讶地发现，当柚皮素和积雪草酸一起施用时，在抑制血管增生、细胞增殖，尤其是控制癌细胞增殖，侵袭和转移有明显的协同效应。更重要的是，柚皮素和积雪草酸联合应用可达到最大限度的提高机体本身免疫细胞功能，特别是自然杀伤细胞的抗癌作用。因此，本发明在防癌、治癌提供了有效治疗和预防各个解剖部位的癌症的新的方法和高效组合物。

在一方面，本公开提供了抑制细胞增殖的新方法。所述方法包括柚皮素和积雪草酸抗癌作用方法、效量和步骤。在一些实施方案中，抑制细胞增殖的方法包括使所述细胞与有效量的柚皮素和/或积雪草酸接触的步骤。在一些实施方案中，所述接触步骤为使柚皮素和/或积雪草酸作用于所述细胞。在一些实施方案中，所述接触步骤包括皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用或口服施用。所述细胞可以为组织或器官，如肝、肾、皮肤或肺的一部分。在一些实施方案中，应用步骤包括皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用、局部施用或口服施用。在一些实施方案中，柚皮素的有效量低端值为约1-10mg/kg(例如，约2或5mg/kg)体重和高端值为约100-500mg/kg(例如，约200或250mg/kg)体重，而积雪草酸的有效量低端值为约1-10mg/kg(例如，约2或5mg/kg)体重和高端值为约15-50mg/kg(例如，约20或25mg/kg)体重。在一些实施方案中，积雪草酸和柚皮素以高端值约1:1或1:2至低端值约1:10或1:15或1:20的重量比施用，例如比例可以为约1:5。在一些实施方案中，柚皮素和积雪草酸以单一组合物施用。在其它实施方案中，柚皮素和积雪草酸以两种单独的组合物施用。柚皮素和积雪草酸以任何适当的形式施用，包括但不限于溶液、粉剂、凝胶、乳膏/糊剂、片剂或胶囊。通常，积雪草酸与柚皮素的重量比在以下变化：1至0.001或更低；0.001；0.002；0.005；0.01；0.025；0.05；0.1；0.25；0.50；0.75；1.0；2.0；2.5；5.0；7.5；10；20；25；50；75；100；200；250；300；400；500；600；700；800；900；或1,000或甚至更高。

在另一方面，本发明提供了柚皮素和/或积雪草酸在制备用于抑制细胞增殖的药物中的用途，优选地，提供了包含柚皮素和积雪草酸的组合物在制备用于抑制细胞增殖的药物中的用途。在一些实施方案中，所述细胞为癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞为黑色素瘤或肺癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞在人体内。在一些实施方案中，本发明提供了有效量的柚皮素和积雪草酸在制备用于抑制细胞增殖的组合物中的用途。在一些实施方案中，所述有效量为约5mg/kg至250mg/kg体重的柚皮素和1mg/kg至50mg/kg体重的积雪草酸。在一些实施方案中，以约10:1至约1:10，优选约1:5的重量比施用柚皮素和积雪草酸。在一些实施方案中，柚皮素和积雪草酸以单一组合物施用。在一些实施方案中，柚皮素和积雪草酸以两种单独的组合物施用。在一些实施方案中，柚皮素和积雪草酸以溶液、粉剂、凝胶、乳膏/糊剂、片剂或胶囊的形式施用。

在另一方面，本公开提供了新的组合物，其包含(1)有效量的柚皮素和积雪草酸，以及(2)药学可接受的赋形剂。在一些实施方案中，积雪草酸和柚皮素以一端约1:1或1:2至另一端约1:10或1:15或1:20的重量比存在，例如，比例可以为约1:5。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用、局部施用或口服施用。例如，组合物可以呈溶液、粉剂、凝胶、乳膏、糊剂、片剂或胶囊的形式。通常，组合物中积雪草酸与柚皮素的重量比在以下变化：1至0.001或更低；0.001；0.002；0.005；0.01；0.025；0.05；0.1；0.25；0.50；0.75；1.0；2.0；2.5；5.0；7.5；10；20；25；50；75；100；200；250；300；400；500；600；700；800；900；或1,000或甚至更高。

另一方面，本公开提供了用于抑制细胞增殖，尤其是癌细胞增殖的试剂盒。所述试剂盒含有至少两个容器：第一容器含有第一组合物，其包含柚皮素；和第二容器含有第二组合物，其包含积雪草酸。在一些实施方案中，所述第一组合物被配制用于皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用、局部施用或口服施用。在一些实施方案中，所述第二组合物被配制用于皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用、局部施用或口服施用。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于施用所述第一组合物和第二组合物的说明书。通常，当积雪草酸与柚皮素联合使用时，积雪草酸与柚皮素的重量比可以在以下变化：1至0.001或更低；0.001；0.002；0.005；0.01；0.025；0.05；0.1；0.25；0.50；0.75；1.0；2.0；2.5；5.0；7.5；10；20；25；50；75；100；200；250；300；400；500；600；700；800；900；或1,000或甚至更高。

在上述方面中，用积雪草酸的两种已知类似物——羟基积雪草酸和积雪草苷替代积雪草酸与柚皮素组合同样可实现柚皮素和积雪草酸的协同疗效。

附图简述

图1.正常小鼠中AA或NG的安全剂量的测定。正常小鼠(每组4只)接受不同剂量的积雪草酸(AA)或柚皮素(NG)治疗两周，并测量各种参数以确定治疗剂量的安全剂量。如框所示，10mg/kg AA和50mg/kg NG为选定安全剂量。每个柱条代表4只小鼠的组的平均值±SEM。与未经处理的小鼠(BLK)相比，*p<0.05,**p<0.01，有显著差异。

图2.与AA和NG的单独治疗相比，组合治疗进一步抑制黑色素瘤和LLC肺癌的生长。(A-D)AA或NG对B16F10黑色素瘤体积和重量的剂量依赖性抑制作用。(E,F)与单一疗法相比，AA(10mg/kg/天)和NG(50mg/kg/天)的组合治疗对B16F10黑色素瘤生长产生更好的抑制作用。(G-J)与单一疗法相比，AA(10mg/kg/天)和NG(50mg/kg/天)的组合治疗对LLC肺癌产生更好的抑制作用，资料为肿瘤体积、肿瘤重量和生物发光成像分析。每个误差线代表六至八只小鼠的组的平均值±SEM。与对照相比，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；如所示的，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001，有显著差异。

图3.AA、NG以及AA和NG的组合治疗在LLC肺癌小鼠中未引起显著的细胞毒性、骨髓毒性及肝肾毒性。包括外周血白细胞计数、血清LDH、肝功能(AST和ALT)和肾功能(肌酸酐)的变化。每个柱条代表6只小鼠的组的平均值±SEM。

图4.在B16F10黑色素瘤和LLC肺癌小鼠模型中，相比于AA和NG的单独治疗，组合治疗可以产生更好的平衡TGF-β1/Smad信号通路的作用。蛋白质印迹分析显示，在黑色素瘤和肺癌小鼠模型中，AA和NG组合治疗可以进一步抑制p-Smad3水平，并增加Smad7水平，因而重新获得TGF-β1/Smad信号通路的平衡。每个柱条代表六至八只小鼠的组的平均值±SEM。与未经处理的肿瘤(对照)相比，*p<0.05,**p<0.01，有显著差异。

图5.AA和NG的组合治疗可以显著抑制肿瘤细胞增殖及肿瘤微环境内的血管生成。与单独AA或NG治疗相比，组合治疗很大程度抑制肿瘤内Ki67的表达，标志着组合只有可以有效的抑制肿瘤细胞的增殖。同时，体外实验证实组合治疗有效地抑制肿瘤集落的形成。此外，组合治疗显著的降低肿瘤微环境内CD31和VEGF的水平，表明AA和NG组合治疗明显降低肿瘤内的血管生成。数据代表6只小鼠的组或至少三次独立实验。

图6.AA或NG对体外血管生成的有效比例的测定。用TGF-β1(2ng/ml)刺激经AA和NG培养的肿瘤细胞(B16F10)，并通过实时PCR测量肿瘤细胞的血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA水平。结果显示，1uM AA能够显著抑制TGF-β1诱导的VEGF表达，其效应通过添加0.5至250uM NG而叠加增强。每个柱条代表3次独立实验的平均值±SEM。与TGF-β1单独处理的肿瘤细胞相比，*p<0.05,**p<0.01，有显著差异。

图7.AA和NG的组合治疗明显抑制B16F10黑色素瘤的体外侵袭力。AA、NG和组合治疗(CB)对B16F10黑色素瘤侵袭力的抑制作用比较。(A)伤口愈合试验，(B)transwell体外侵袭试验。每个柱条代表三次独立试验的平均值±SEM。与未经处理的肿瘤(对照)相比，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；与所示的单独处理相比，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001，有显著差异。

图8.AA和NG的组合治疗显著抑制LLC肺癌的体内侵袭力。与单独AA或NG治疗相比，组合治疗(CB)显著降低LLC肺部肿瘤的基质金属蛋白酶MMP2、MMP9和MMP13的表达水平，从而抑制LLC肺癌的侵袭和转移能力。每个柱条代表6只小鼠的组的平均值±SEM。与未经处理的肿瘤(对照)相比，*p<0.05,**p<0.01；与所示的NG处理相比，#p<0.05，有显著差异。

图9.AA和NG的组合治疗显著提高LLC肿瘤微环境中杀伤性NK细胞(NK1.1+NKp46+)的数量。(A)双色免疫荧光显示，与单一治疗相比，AA和NG组合治疗(CB)的小鼠肿瘤微环境中NK1.1+NKp46+NK细胞数目大幅度增加。NK1.1(绿色)，NKp46(红色)，DAPI(蓝色)。(B)双色流式细胞术检测，与每种单一治疗相比，AA和NG组合治疗的小鼠外周血中NK1.1+NKp46+的NK细胞大幅度增加。每个柱条代表三只小鼠的组的平均值±SEM。与对照相比，**p<0.01,***p<0.001；如所示的，##p<0.01,###p<0.001，有显著差异。比例尺，100μm。

图10.AA和NG的组合治疗显著增强NK的肿瘤杀伤效应。(A,B)双色免疫荧光检测LLC肿瘤微环境中NK细胞分泌的颗粒酶B及干扰素明显增多。NK1.1+细胞(绿色)，IFN-γ+或颗粒酶B+细胞(红色)，DAPI(蓝色)。每个误差线代表三至四只小鼠的组的平均值±SEM。与对照相比，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；如所示，##p<0.01,###p<0.001，有显著差异。比例尺，100μm。(C,D)ELISA检测在LLC肿瘤组织中干扰素和颗粒酶B的水平。(E,F)ELISA检测TGF-β1(5ng/ml)环境中AA(10μmol)、NG(100μmol)及组合治疗对的脾脏NK细胞分泌干扰素和颗粒酶B影响。(G)以LLC作为靶细胞，检测NK细胞的毒性实验。每个误差线代表三次独立实验组的平均值±SEM。与TGF-β1相比，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；如所示的，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001，有显著差异。

图11.相对于AA和NG的单独治疗，AA和NG的组合治疗可以产生更好的平衡TGF-β1/Smad信号通路的作用。(A,B)应用双色免疫荧光检测LLC肿瘤微环境中的NK细胞中pSmad3及Smad7的表达水平。NK1.1+细胞(绿色)，p-Smad3+或Smad7+细胞(红色)，DAPI(蓝色)。每个条代表三至四只小鼠的组的平均值±SEM。与对照相比，**p<0.1,***p<0.01；如所示的，#p<0.5,###p<0.01，有显著差异。比例尺：100μM。(C)蛋白质印迹分析显示5ng/ml TGF-β1环境中，相对于单独AA(10μmol)和NG(100μmol)治疗，组合治疗可以更显著的抑制骨髓来源的NK细胞中的p-Smad3水平并提升Smad7的水平。每个柱条代表三次独立实验组的平均值±SEM；与TGF-β1相比，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；如所示的，#p<0.05,##p<0.01，有显著差异。

图12.AA和NG的组合治疗有效缓解TGF-β1对于NK细胞分化的抑制。(A)流式细胞术显示TGF-β1抑制NK细胞分化的剂量依赖效应，明显抑制骨髓来源的NK细胞中NK1.1+CD122+的数量的比例确定。与对照相比，***p<0.01；如所示的，#p<0.5，有显著差异。(B)流式细胞术检测单一AA、NG及其组合对于缓解TGF-β1抑制NK分化的影响。每个误差条代表三次独立实验组的平均值±SEM。与TGF-β1相比，***p<0.001；如所示，###p<0.001，有显著差异。

图13.AA和NG的组合治疗通过逆转TGF-β1对Id2和IRF2表达的抑制作用从而促进NK细胞的分化。(A,B)通过实时PCR检测单一AA、NG及其组合(CB)治疗对LLC肺癌小鼠外周血NK细胞中Id2和IRF2的mRNA水平；与对照相比，**p<0.01；如所示，##p<0.01，有显著差异。(C,D)通过实时PCR检测单一AA、NG及其组合(CB)治疗对骨髓来源的NK细胞中Id2和IRF2的mRNA水平。(E)体外检测单一AA、NG及其组合(CB)逆转TGF-β1对骨髓来源的NK细胞的Id2和IRF2表达的抑制作用。每个柱条代表三至四只小鼠的组或三次独立实验组的平均值±SEM。与TGF-β1相比，**p<0.01,***p<0.001；如所示，##p<0.01,###p<0.001，有显著差异。

图14.利用siRNA技术证实AA和NG组合治疗通过逆转TGF-β1对Id2和IRF2表达的抑制作用从而促进NK细胞的分化。蛋白质印迹测量显示，特异siRNA敲低骨髓来源的NK细胞的Id2和IRF2基因，可阻断AA和NG逆转TGF-β1对Id2和IRF2表达的抑制作用。每个误差线代表三次独立实验的组的平均值±SEM。与TGF-β1相比，*p<0.1,***p<0.01，与CB相比，###p<0.01，有显著差异。

图15.AA和NG的组合治疗通过逆转Smad3对Id2和IRF2的抑制作用而促进NK细胞的分化。(A)通过双色流式细胞术检测siRNA技术沉默Id2或IRF2后阻断了AA和NG组合治疗对于NK分化(NK1.1+NKp46+细胞)的保护作用。(B)Id2 3’UTR上预测的Smad结合位点及ChIP分析Smad3通过直接结合Id2启动子抑制Id2的转录。(C)IRF2 3’UTR上预测的Smad结合位点及ChIP分析Smad3通过直接结合IRF2启动子抑制IRF 2的转录。

定义

本文使用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对靶标生物过程或病理过程，如癌细胞的增殖或癌症的进展的任何可检测的不利作用或抑制作用。通常，与对照相比，抑制体现在靶标过程特有的特征(如癌细胞增殖的速度)减少至少10％、20％、30％、40％或50％。

术语“癌症”涵盖以下的任何疾病，其涉及不适当和不受控制的细胞增殖，导致这些不适当增殖的细胞在最初解剖部位积聚或生长，具有扩散至另一解剖部位的趋势，该过程称为转移。癌症可以从几乎任何组织类型产生，并且可以影响所有器官和身体部分，一些高发病率的癌症包括肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、胃癌、肝癌、食道癌、膀胱癌、肾癌、皮肤癌(黑色素瘤)和各种血癌，如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。所有年龄的人均可能得癌症。

本文使用的术语“有效量”是指施用物质而产生疗效的物质的量。效果包括预防、调整或抑制疾病或病况症状和相关并发症进展至任何可检测的程度。在两种或更多种物质用于期望效果的情况下,“有效量”可以以多于一种方式表示。例如，“有效量”可以以所有活性成分的总量表示，或以每种活性成分的单独的量表示，或以一种成分与另一种成分的比(如，重量比或体积比)表示。“有效量”的精确量将取决于治疗目的以及活性物质的形式和特性，并且将由本领域技术人员使用已知的技术确定(参见,如,Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；以及Pickar,Dosage Calculations(1999))。

“柚皮素”为黄烷酮，其系统(IUPAC)命名为5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮，又名4',5,7-三羟基黄烷酮(CAS编号480-41-1)。其化学式为C₁₅H₁₂O₅，分子量为272.257。实际上，柚皮素富含于葡萄柚、橙子和西红柿外皮中。高纯度的柚皮素可购自多个供应商。

“积雪草酸”为来源于植物积雪草(Centella asiatica)，通常被称为雷公根(GotuKola)的古老的传统中药提取物。其还被称为哒玛醇酸(dammarolic acid,CAS编号464-92-6)。其化学式(Hill Notation)为C₃₀H₄₈O₅，分子量为488.70。积雪草酸与其类似物羟基积雪草酸和积雪草苷共有许多相似性。其可通过供应商诸如Sigma-Aldrich获得。

本文使用的术语“施用”涵盖将物质，如具有治疗效果或预防效果的药剂递送至受试者的任何方式，可以包括但不限于全身应用、区域应用和局部应用。“施用”的实例为注射(如通过皮下、肌内、静脉内或腹膜内方式)、口服摄取、通过鼻腔或通过眼睛或耳朵摄入、吸入、透皮递送以及肛门或阴道沉积等。

术语“药学可接受的赋形剂”和“生理上可接受的赋形剂”可以互换使用，是指包含在含有活性成分的组合物的制剂中以实现某些特性如更期望的pH、溶解度、稳定性、生物利用率、质地、一致性、外观、风味/味道、粘度等，但是就其本身而言不会不利地影响活性成分的预期治疗效果或预防效果的惰性物质。

本文使用的术语“组织”是指其诸如形态学和生物活性的生物属性相似并且来自相同来源的全体细胞，这样这些细胞一起执行特定功能。“器官”为以结构单元连接的行使共同功能的不同组织的集合。

本文使用的术语“约”描述引用值的正或负10％的范围。例如，“约10”的数值可为10±1范围内(即9至11)的任何数值。

发明详述

I.导言

癌症是人类死亡的主要原因之一，然而目前使用细胞毒性药物治疗癌症仍然是非特异性且无效的，具有严重副作用。在本公开内容中，描述了通过促进宿主对肿瘤的免疫性来有效治疗癌症的新开发的治疗组合物。发现与单独使用时相比，含有从柠檬类水果纯化的组分的化合物(被称为柚皮素(NG))和来自中药的积雪草酸(AA)联合使用可以在B16F10黑色素瘤和LLC侵袭性肺癌的两种同源小鼠模型中产生更有效的抑制肿瘤生长和侵袭的作用，且不产生明显细胞毒性。同时，还发现AA和NG的组合治疗增强NK细胞发育和NK细胞依赖性杀癌活性为本公开的主要治疗机制，此外，AA和NG的组合治疗还可以有效抑制肿瘤生长/增殖和侵袭/迁移活性，包括血管生成(CD31⁺)和基质金属蛋白酶(MMP)的表达。因此，本发明对癌症治疗而言具有新形成和有前景的意义。

本公开涉及以下发现：包含柚皮素和积雪草酸的混合组合物可以更显著的抑制癌细胞(如B6F10黑色素瘤和LLC侵袭性肺癌细胞)的生长,侵袭和转移，同时对机体正常细胞和器官并未表现出毒性。该公开还揭示了柚皮素和积雪草酸的混合组合物可以作为免疫调节剂发挥功能，包括促进肿瘤微环境内NK细胞发育和NK细胞依赖性杀癌活性。因此，本发明优于目前使用且经常产生许多严重副作用及癌细胞耐药性的细胞毒性药物抗癌疗法。

II.药物组合物和施用

本公开提供包含有效量的柚皮素和积雪草酸的药物组合物或生理组合物，在预防和治疗应用中，所述组合物有效抑制组织或器官中不期望的细胞增殖，尤其是癌细胞。此类药物组合物或生理组合物还包含一种或多种药学或生理上可接受的赋形剂或载体。本公开的药物组合物适合用于多种药物递送体系。用于本公开的合适的制剂见于Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版.(1985)。对于药物递送方法的简述综述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。

本公开的药物组合物可通过各种途径施用，如口服、局部、皮下、透皮、肌内、静脉内、鼻内或腹膜内。施用药物组合物的优选途径为对于70kg成人/天来说以每天约0.35-17.5g，优选为2.5-5.5g的柚皮素和约0.1-3.5g，优选为0.5-1.0g的积雪草酸的剂量局部递送至患有纤维化或处于形成癌症风险的器官或组织中(如，腹膜内注射至器官)。适当的剂量可以单次日剂量施用或以适当的间隔，例如以每天两次、三次、四次或更多次的亚剂量呈现的分份剂量施用。

为了制备含有柚皮素或积雪草酸，或含有两者的药物组合物，使用一种或多种惰性且药学可接受的载体。药物载体可为固体或液体。固体形式制剂包括，例如，粉剂、凝胶/乳膏/糊剂、片剂、分散粒剂、胶囊、扁囊剂和栓剂。固体载体可为一种或多种同时可充当稀释剂、芳香剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂或片剂崩解剂的物质；其也可为包封材料。

在粉剂中，载体通常为细粒固体，所述细粒固体在具有细粒活性组分，如柚皮素和/或积雪草酸的混合物中。在片剂中，活性成分(柚皮素和/或积雪草酸)与具有必需粘合性质的载体以合适的比例混合并压制成期望的大小和形状。

为了制备呈栓剂形式的药物组合物，首先熔化低熔点蜡如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物，通过例如搅拌将活性成分分散于其中。然后将熔化的均匀混合物倾入体积适中的模具中并使其冷却和固化。

粉剂和片剂优选地含有约5重量％至约70重量％的柚皮素和/或积雪草酸活性成分。合适的载体包括例如，碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、乳糖、糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。

药物组合物可包含柚皮素和/或积雪草酸活性成分和作为载体提供胶囊的包封材料的制剂，其中活性成分(含有或不含其它载体)被载体包围,使得载体因此与活性成分缔合。以相似的方式，也可包括扁囊剂。片剂、粉剂、扁囊剂和胶囊也可用作适合于口服施用的固体剂型。

液体药物组合物包括例如，适合于口服施用或肠胃外施用的溶液，适合于口服施用的悬浮液和乳状液。活性组分(如,柚皮素和/或积雪草酸)的无菌水溶液或活性组分在包括水、缓冲水、盐水、PBS、乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液为适合于肠胃外施用的液体组合物的实例。组合物可以根据需要含有药学可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。

无菌溶液可通过以下制备：将活性组分如柚皮素和/或积雪草酸溶解在期望的溶剂系统中，然后使所得溶液通过膜滤器以对其灭菌或，作为另一种选择，在无菌条件下将无菌化合物溶解在事先灭菌的溶剂中。可以将所得水溶液原样包装使用，或冻干，冻干制剂在施用之前与无菌水性载体混合。制剂的pH通常为3至11，更优选为5至9，并且最优选为7至8。

另外，在治疗或预防皮肤癌(黑色素瘤)的情况下，含有柚皮素和/或积雪草酸活性成分的药物组合物可以局部施用于患者。组合物可以被配制成容易使用的凝胶、乳膏、糊剂、粉剂或喷剂。

可施用含有柚皮素和/或积雪草酸活性成分的药物组合物用于预防性治疗和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，以足以预防、治愈、逆转或至少部分减缓或阻止癌症的症状及其并发症的量将组合物施用于已经患有涉及不期望的细胞增殖，如癌症的病况的患者。足以实现这些的量被定义为“治疗有效剂量”。用于该用途的有效量将取决于疾病或病况的严重度以及患者的体重和一般状态，对于70kg的患者来说，范围通常为每天约0.35g至约17.5g的柚皮素和0.lg至约3.5g的积雪草酸，对于70kg的患者来说，更常用的剂量为每天约2.5g至约5.5g的柚皮素和0.5g至约l.0g的积雪草酸。

在预防性应用中，以足以延迟或预防癌症-相关的症状出现的量将含有柚皮素和/或积雪草酸的药物组合物施用于易患癌性疾病或病况的患者或以其它方式处于患癌性疾病或病况的风险的患者。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在这种用途中，柚皮素和积雪草酸的精确量同样取决于患者的健康状态和体重，对于70kg的患者来说，范围通常为每天约0.35g至约5.5g的柚皮素和0.lg至约3.5g的积雪草酸，对于70kg的患者来说，更常见的为每天约2.5g至约5.5g的柚皮素和0.5g至约l.0g的积雪草酸。

组合物的单次施用或多次施用可按治疗医师选定的剂量水平和模式执行。在任何情况下，药物制剂应提供足以治疗性地或预防性地有效抑制患者中的不期望的细胞增殖(尤其是恶性细胞)的量的柚皮素和/或积雪草酸。

III.试剂盒

根据本公开的方法，本申请还提供用于抑制细胞增殖，尤其是不期望的增殖，如癌细胞增殖的试剂盒。试剂盒通常含有两个容器：第一容器含有包含柚皮素的组合物，第二容器含有包含积雪草酸的组合物。

作为另一种选择，试剂盒可以包含容器，所述容器含有具有有效量的柚皮素和积雪草酸的药物组合物(如本文详细描述的组合物)以及含有如何配药物组合物的说明书的信息材料，包括可以被治疗的患者的类型的描述(如患有过度增殖疾病如癌症的患者，或处于形成过度增殖疾病如癌症的风险的患者)，时程(如剂量和频率)和施用途径等。

实施例

下述实施例仅通过示例方式而非通过限制性方式被提供。本领域技术人员将容易地认识到可变化或修改以得到基本上相同或相似结果的多个非关键性参数。

实施例1.柚皮素/积雪草酸抑制癌细胞增殖和侵袭力

目前的抗癌药物在很大程度上具有细胞毒性，对身体具有严重副作用。已经显示柚皮素可以抑制TGF-β信号转导并且通过S-G2M-依赖性机制抑制肿瘤细胞生长而具有抗癌活性(专利号：EP2163247B1；Abaza MS等人:Cancer Cell Int.2015；15:46)。还报道积雪草酸对炎症、纤维化和癌症具有较广范围的效果(专利EP 1313462B1；US 20040097463A1；CN102391351B；CN 103467560A)。本申请的发明人先前也表明柚皮素(NG)为Smad3抑制剂，而积雪草酸(AA)作为Smad7激动剂发挥作用，两者的组合对重新平衡TGF-β/Smad3信号通路产生较好的作用并且对肾纤维化具有较好的疗效(Meng等人:Oncotarget 2015；6:36984,专利CN 104736151/WO2014063660A1)。该发明测试了含有柚皮素和积雪草酸的化合物是否可以用于更好地治疗癌症。出乎意料的是，发现与单一治疗相比，比例为1:5的AA和NG的组合治疗产生较好的抗癌效果。我们还确定了该化合物的治疗靶标与显著促进NK细胞发育和NK细胞对癌症的杀伤效应相关。因此，该化合物可以作为新的免疫调节剂发挥功能并且通过促进宿主对癌症的免疫抑制癌症，这在很大程度上不同于目前的细胞毒性药物。

在正常小鼠中通过腹膜注射不同剂量的AA或NG进行毒性试验，首先确定HLPC-纯化的柚皮素(NG)和积雪草酸(AA)的安全剂量，并选择10mg/kg体重的AA剂量和50mg//Kg体重的NG用于进一步检测对癌症的疗效(图1)。选择比例为AA:NG＝5:1的柚皮素(NG,10mg/kg)和积雪草酸(AA,50mg/kg)的安全剂量的组合使用的效果，并在侵袭性肺癌(LLC)和黑色素瘤(B16F10)的两种同源小鼠模型中测试对癌症的疗效。出乎意料的是，与AA或NG单一治疗相比，组合治疗(AA+NG)对肿瘤进展，包括肿瘤生长速度和肿瘤重量的抑制显示出协同效应(图2)，而未引起额外的毒性(图3)。同时还确定组合治疗的机制：很大程度上促进肿瘤微环境中NK细胞分化和杀癌活性(图9-11)，并通过阻断血管生成(CD31+)和血管内皮生长因子(VEGF)表达来抑制肿瘤生长/增殖(Ki67+)(图5)，并抑制肿瘤侵袭活性，如基质金属蛋白酶(MMP，包括MMP-2、MMP-9和MMP-13)的表达和肿瘤迁移活性(图7及图8)。因此，AA和NG的组合治疗代表了新兴且有前景的肿瘤治疗方案。

实施例2.积雪草酸和柚皮素的组合通过增强NK细胞对癌症的免疫来抑制肿瘤进展

肿瘤微环境中TGF-β1经由Smad3信号转导同时抑制Smad7的机，在肿瘤生长、侵袭和转移中发挥促进作用。本研究揭示用积雪草酸(AA，Smad7激动剂)和柚皮素(NG，Smad3抑制剂)重新平衡Smad3/Smad7信号转导可以显著抑制侵袭性黑色素瘤(B16F10)和肺癌(LLC)的两种同源小鼠肿瘤模型中的肿瘤生长。与单一疗法相比，AA和NG的组合治疗通过增强NK细胞免疫，对抑制B16F10和LLC模型中的肿瘤生长都产生协同效应。在机理上，发现Smad3通过结合Id2和IRF2的转录因子以抑制Id2和IRF2依赖的NK细胞发育和功能(图15)。在NK细胞中，AA和NG的组合治疗可以极大地使Smad3失活，同时恢复Smad7信号转导(图11)，从而大幅度上调NK细胞Id2和IRF2转录因子，显著促进Id2和IRF2依赖的NK细胞分化、成熟和针对癌症的细胞毒性(图9及图10)。并这一作用通过在体外沉默NK细胞中的Id2或IRF2以阻断AA和NG对NK细胞发育的保护作用进一步证实(图14及图15)。所以，AA和NG的组合治疗协同性地抑制TGF-β/Smad3信号通路，通过促进Id2和IRF2依赖的NK细胞免疫从而抑制黑色素瘤和肺癌生长。因此，AA和NG的组合治疗可代表临床应用中一种新颖、安全和有效的肿瘤免疫抗癌疗法。

导言

由于癌症的遗传异质性和细胞毒性药物针对癌症的特异性较低，越来越多的证据显示通过靶向肿瘤微环境的免疫疗法可能是抗癌治疗中有前景的方法(1)。在肿瘤微环境的信号转导分子中，TGF-β1信号转导已经被证明是肿瘤生长、侵袭和转移中的肿瘤促进剂(2-5)。因此，通过靶向TGF-β1信号转导将肿瘤微环境从对癌症的支持作用变为抑制作用可能代表一种前瞻性治疗靶标。

作为TGF-β1下游信号转导中的重要转录因子，Smad3对肿瘤进展至关重要(6)。先前的研究已经证实在人结肠直肠癌中观察到增强的Smad3表达(7)，而缺乏Smad3的小鼠对化学诱导的皮肤癌变具有抗性(8,9)。最近的研究还揭示TGF-β1/Smad3信号转导经由与抑制肿瘤微环境中NK细胞针对癌症的免疫的相关机制对癌症生长和侵袭至关重要(10)。相反，作为抑制性Smad蛋白，Smad7经由负反馈环抑制Smad2和Smad3的磷酸化，从而防止TGF-β1/Smad3信号转导的过度激活(11,12)。已报道，Smad7的低表达水平与胰腺癌的不良预后和淋巴结转移相关(13)。同时，Smad7的过表达抑制原发性肿瘤生长和转移，并在几种癌症模型中产生较好的临床结果(14,15)。因此，假设肿瘤微环境中Smad3和Smad7信号转导的重新平衡可为针对癌症的新型治疗策略，在本研究中对其进行检测。

NK细胞在肿瘤免疫监视中发挥关键作用，可以独立于抗原呈递和T细胞免疫而迅速反应肿瘤形成并抑制肿瘤进展(16-18)。然而，NK细胞介导的对肿瘤细胞的细胞毒性在肿瘤微环境中被TGF-β1钝化(19)。另一方面，TGF-β1通过抑制转录因子E4BP4、T-bet和GATA-3而影响NK细胞分化与成熟(10,20)。另一方面，TGF-β1经由降低NK细胞的细胞因子，如颗粒酶和IFN-γ的产生而显著损害NK细胞介导的细胞毒性(19,21)。如上文所提及的，Smad3的过表达和Smad7的损失导致TGF-β1诱导NK细胞抗癌能力的丢失和促进肿瘤进展。因此，假设恢复Smad3与Smad7之间的平衡可以通过增强NK细胞成熟并恢复NK细胞针对癌症的细胞毒性。

积雪草酸(AA)(来自积雪草的三萜)已经显示具有抗炎、抗氧化、神经保护和促进伤口愈合(22)。最近的一项研究还报道AA可以作为Smad7激动剂，能够诱导Smad7以减轻TGF-β1-诱导的肝纤维化(23)。相比之下，柚皮素(NG)(分离自柑橘的天然且主要的黄烷酮)作为肝和肺纤维化中Smad3的有效抑制剂发挥功能(24,25)。有趣的是，AA和NG的组合可以通过协同抑制Smad3同时促进Smad7信号转导来有效治疗单侧输尿管梗阻(UUO)模型中的肾纤维化(26)。因此，假设AA和NG的组合可以通过恢复肿瘤微环境中Smad3与Smad7信号转导之间的平衡增强对癌症的疗效。这通过用AA和NG的组合治疗两种同源小鼠肿瘤模型——黑素瘤(B16F10)和肺癌(LLC)进行测试。研究了AA和NG对肿瘤进展的疗效和抑制性机制。

结果

AA和NG的组合治疗协同抑制同源模型中的黑素瘤和肺癌生长

首先确定AA或NG在B16F10黑素瘤小鼠模型中的安全剂量。如图1和图2(A-D)中所示，用10mg/kg AA或50mg/kg NG的单一治疗有效抑制黑素瘤进展而对正常小鼠无明显毒性,然而在更高剂量的AA或NG中未发现肿瘤生长的进一步显著改善。因此，选择10mg/kg AA和50mg/kg NG作为本研究中组合治疗的最佳剂量。图2(E-F)中示出的结果清楚地显示，与AA或NG的单一疗法相比，AA和NG的组合治疗自肿瘤接种后第10天协同抑制肿瘤体积。在LLC肺癌小鼠模型上进一步验证组合治疗的抗肿瘤功效，其中在肿瘤生长速度、生物发光成像和肿瘤重量方面，获得了比单一疗法更好的抗肿瘤效果(图2G-J)。

另外，还发现AA(10mg/kg)和NG(50mg/kg)的组合治疗未在具有LLC的小鼠中诱导显著的骨髓抑制和对肾、心脏和肝的毒性，因为与正常对照或单一AA或NG治疗的小鼠相比，在接受组合治疗的小鼠中，白细胞计数未显著降低并且血清肌酸酐、LDH、AST和ALT未显著增加(图3)。

组合治疗增强肿瘤微环境中的NK细胞免疫反应

最近发现，在小鼠模型中，肿瘤浸润性NK细胞在LLC肺癌的富含TGF-β1的肿瘤微环境中显著降低(10)。如图9A中所示，与用AA或NG的单一治疗相比，组合治疗更有效地增加用NK1.1和NKp46标记细胞毒性NK细胞，表明用AA和NG治疗很大程度上促进局部在肿瘤微环境中的细胞毒性NK细胞群体。类似地，如通过双色流式细胞术测定的，AA和NG的组合治疗同样显著促进外周血中的全身NK细胞反应(图9B)。这些发现揭示AA和NG对肿瘤的疗效可以归因于通过加速NK细胞发育和归巢到肿瘤微环境而促进NK细胞抗肿瘤活性。已知，TGF-β1经由抑制包括颗粒酶B(GB)和IFN-γ在内的各种细胞因子的产生而显著损害NK细胞介导的细胞毒性(19)。如图10所示，AA或NG单一治疗显著增加肿瘤微环境中分泌颗粒酶B的NK细胞(GB⁺NK1.1⁺细胞)和产生IFN-γ的NK细胞(IFN-γ⁺NK1.1⁺细胞)，这一抗癌作用在接受组合治疗的LLC肿瘤的小鼠中进一步增强。同时，ELISA还检测到，与用对照溶剂和AA或NG的单一疗法处理相比，在用组合治疗处理的小鼠的肿瘤组织中IFN-γ和颗粒酶B显著增加(图10C，D)。这一观察结果在高TGF-β1条件下用AA或NG或者AA+NG处理的培养的脾脏NK细胞中得到进一步证实(图10E，F)。

然后，通过将脾脏NK细胞与B16F10黑素瘤细胞以5:1、10:1和20:1的比例进行共培养来评估组合治疗是否增强NK细胞的肿瘤杀伤能力。如图10G中示出的结果，用AA或NG的单一治疗以剂量依赖性方式增加NK细胞介导的对黑素瘤细胞细胞毒性，组合治疗进一步增强NK细胞对肿瘤细胞的杀死作用。

AA和NG的组合治疗经由重新平衡Smad3和Smad7信号转导而逆转TGF-β1对NK细胞发育的抑制作用

其次，在肿瘤微环境中，AA和NG的组合治疗通过重新平衡Smad3和Smad7促进NK细胞发育。与单一疗法相比，AA和NG联合治疗显著阻断B16F10黑色素瘤和LLC肺癌组织中的Smad3的磷酸化(p-Smad3)，而促进Smad7的表达(图4)。更重要的是，AA和NG联合治疗可最大程度平衡肿瘤微环境中NK细胞的TGF-β/Smad信号通路。如图11所示，与用对照或单一疗法处理的小鼠相比，在用AA和NG处理的肿瘤微环境中，p-Smad3⁺NK1.1⁺细胞的比例显著降低，而Smad7⁺NK1.1⁺细胞的比例显著增加。这些结果表明组合治疗能够重新平衡肿瘤浸润性NK细胞中的Smad3和Smad7信号转导。

为进一步探索在富含TGF-β的微环境中组合治疗促进NK细胞针对癌症的免疫的机制，将10μM AA和100μM NG(根据体内摩尔比)在体外应用于骨髓来源的NK细胞。如图11C中所示，AA或NG可降低TGF-β1增加Smad3的磷酸化水平，AA还可逆转TGF-β1对Smad7的抑制作用。AA和NG联合治疗大大增强对TGF-β/Smad信号的平衡作用(图11C)。

为了证实AA和NG组合治疗可以通过促NK细胞发育来促进NK细胞针对癌症的免疫作用，检测组合治疗对体外骨髓来源的NK细胞发育的影响。如图12A中所示，TGF-β1的添加以剂量依赖性方式显著抑制NK细胞发育。例如，剂量为5ng/ml的TGF-β1很大程度上降低NK1.1⁺CD122⁺细胞(未成熟的NK细胞)的比例，从80％降低至11％。单一AA或NG的添加可中等程度地减弱该抑制作用，AA和NG的组合治疗显著逆转TGF-β1对NK细胞分化的抑制作用(图12B)。

AA和NG的组合治疗经由Id2和IRF2依赖性机制促进NK细胞发育

已知NK细胞分化和成熟由包括Id2和IRF2在内的各种转录因子空间调控(28,29)。于是，检测AA和NG增强的NK细胞成熟是否由Id2和IRF2转录调控。实时PCR检测到，与对照或单一疗法相比，分离自接受AA和NG的组合治疗的具有LLC肺癌的小鼠的外周血的NK细胞中Id2和IRF2的表达显著增强(图13A，B)。该体内观察结果在体外骨髓来源的NK细胞中进一步证实，TGF-β1诱导的NK细胞中Id2和IRF2的抑制被单剂量的AA或NG显著降低，这一作用被AA和NG的组合治疗进一步增强(图13C-E)。因此，推测组合治疗可以通过恢复Id2和IRF2(两种基本的转录因子，分别负责NK细胞谱系定型和NK细胞终末成熟)的表达来增强富含TGF-β1的肿瘤微环境中的NK细胞的分化和成熟(30,31)。这一作用通过在体外沉默NK细胞中的Id2或IRF2以阻断AA和NG对NK细胞发育的保护作用进一步证实(图14及图15A)。用所以，AA和NG的组合治疗协同性地抑制TGF-β/Smad3信号通路转导，因此促进Id2和IRF2依赖的NK细胞免疫从而抑制黑色素瘤和肺癌生长。这与先前的报道一致：IRF2为NK细胞终末成熟过程中的检查点调节因子(31)。

用ECR browser发现预测的Smad3结合位点(SBS)在IRF2 3’UTR和5’UTR附近，另外两个Smad3结合位点(SBS)在Id2 3’UTR上(图15B，C)。ChIP分析确认TGF-β1的添加显著增强Smad3蛋白在Id23’UTR和IRF2附近的3’UTR的基因组序列上的物理结合(图15B,C)，从而抑制NK细胞中Id2和IRF2的转录。该发现证明TGF-β/Smad3对Id2/IRF2依赖性NK细胞发育的转录抑制的直接调控机制。

讨论

传统中药(TCM)已经用于中国医疗保健上千年。TCM的原理是使用各种草药或天然产物重新获得“阴-阳”之间的平衡并保持人体的内稳态。作为一种整体性药物(holisticmedicine)，TCM中使用的草药通常按照配方组合(中文称为“复方”)，以通过草药内的相互作用实现最佳功效以及降低某些药草的副作用。积累的证据表明Smad3与Smad7之间的失衡在包括组织纤维化和肿瘤微环境在内的各种病理学病况中发挥关键作用(10,26)。在本研究中，本申请的发明人首次提供了证据：通过用AA(Smad7激动剂)和NG(Smad3特异性抑制剂)的组合治疗来重新平衡肿瘤微环境中的TGF-β/Smad信号转导，以协同抑制黑素瘤和肺癌的小鼠模型中的肿瘤进展。

本研究中的最重大发现不仅是首次证明用AA和NG组合治疗以协同抑制黑素瘤和肺癌中的肿瘤生长，而且提供了组合的AA和NG治疗抑制癌症进展的明确机制，其通过重新平衡肿瘤微环境中的TGF-β/Smad信号转导而促进NK细胞针对肿瘤的免疫。与AA或NG对肿瘤细胞细胞毒性的先前研究相比(32-34)，本研究增加了新的治疗机制，通过该治疗机制，AA和NG的组合通过将Smad3依赖性免疫抑制肿瘤微环境转变成免疫反应性环境来抑制肿瘤生长，如通过大幅度增加NK细胞数目(NK1.1+CD122+和NK1.1+NKp46+)和抗癌活性，如IFN-γ和颗粒酶B的产生所证明的。该发现与先前的报道一致，Smad3的遗传学破坏或Smad3的药理学抑制保护黑素瘤和肺癌的小鼠模型以免癌症发展(10)。

此处，本申请的发明人还确定Smad3-Id2/IRF2介导免疫抑制对NK细胞发育和功能的抑制可为基本机制，由此AA和NG的组合治疗有效抑制癌症进展。作为肿瘤免疫监视中不可缺少的组成，NK细胞通过直接引发肿瘤细胞死亡而对肿瘤发生和癌症进展施加迅速的先天性免疫应答(16,18)。然而，NK细胞免疫反应已经被肿瘤微环境中极度活跃的TGF-β1/Smad信号转导严重抑制，特征在于显著降低的NK细胞积聚和NK细胞针对癌症的细胞毒性的丧失(20,35)。考虑到重新平衡Smad3和Smad7信号转导的能力，AA和NG的组合可以作为恢复TGF-β1丰富的肿瘤微环境中NK细胞针对癌症的免疫的有效治疗策略。

充分确定的是NK细胞发育由许多转录因子严格编程，并且TGF-β1经由抑制T-bet和GATA3来抑制CD11b^高CD43^高NK细胞(20)。最近的一项研究还确定TGF-β1经由Smad3通过抑制E4BP4介导的NK细胞发育来促进癌症进展(10)。在本研究中，还确定AA和NG的组合治疗经由重新平衡Smad3/Smad7信号转导促进Id2/IRF2依赖性NK细胞分化和成熟。作为E蛋白的拮抗剂的Id2对于NK细胞前体发育成未成熟NK细胞是必不可少的，并且还参与NK成熟(30,36,37)；同时，IRF2保护未成熟NK细胞免于凋亡以确保NK细胞完成GATA3诱导的终末成熟以及保持NK细胞增殖(31,38)。有趣的是，发现TGF-β1不仅通过抑制IRF2信号转导而降低CD11b⁺NK细胞比例来阻碍NK细胞终末成熟，而且还经由阻断Id2依赖性NK细胞谱系定型而损害不成熟NK的产生。此外，骨髓来源的NK细胞中的Id2或IRF2沉默结果损害了组合治疗分别对TGF-β1环境中的未成熟NK细胞的产生或CD11^高Dx5^高阶段的终末成熟的救援作用。该深入研究证实Smad3作为转录阻抑物经由与Id2和IRF2的3’UTR直接相互作用抑制Id2和IRF2。因此，证实了AA和NG的组合治疗在体内和体外经由减轻TGF-β1对Id2和IRF2依赖性NK细胞分化和成熟的抑制来增加具有肿瘤的小鼠中的NK细胞产生。

先前，Massagué等人确认TGF-β1激活Smad2/3和ATF1转录因子以直接结合干扰素-γ和颗粒酶B的启动子区域以诱导细胞因子产生的显著降低(39,40)。因此，如本研究所示，通过组合治疗经由重新平衡Smad3和Smad7信号转导抑制极度活跃的TGF-β1/Smad信号转导使TGF-β1对NK细胞中IFN-γ和颗粒酶B产生的抑制减弱。细胞毒性分析最终证实，与AA或NG单一疗法相比，AA和NG的组合治疗不仅促进细胞因子的产生，而且还有效提高NK细胞针对肿瘤细胞的细胞毒性。

总之，本研究通过使用AA和NG的组合为小鼠中的黑素瘤和肺癌提供新的有效且安全的基于TCM的治疗。还确定了以下内在机制，通过抑制TGF-β/Smad3介导的Id2/IRF2依赖性NK细胞分化和成熟的抑制，AA和NG的组合治疗协同促进NK细胞针对癌症的免疫。因此，AA和NG的治疗是临床上有前景的基于TCM的癌症治疗策略。

材料和方法

同源小鼠肿瘤模型和处理

在C57/Bl6雄性小鼠(8周龄和25g体重)中经由皮下注射1×10⁶个B16F10细胞诱导B16F10黑色素瘤同源肿瘤模型。在C57/Bl6雄性小鼠中经由皮下注射2×10⁶个荧光素酶标记的LLC细胞诱导Lewis肺癌同源肿瘤模型。当平均肿瘤大小达到50mm³时，将小鼠随机分成四组，分别接受下文所述的药物施用。通过用游标卡尺计算肿瘤体积以及通过用IVIS光谱系统(Xenogen,PerkinElmer,Inc.,MA,USA)进行生物发光成像来监测肿瘤进展。通过动物伦理实验委员会批准的方案在香港中文大学进行所有的动物实验。

本研究中使用两种基于TCM的药物，包括积雪草酸(95％HLPC纯化的,Nanning,China)和柚皮素(98％HLPC纯化的,Xian,China)。将两种药物以9:1的比例溶解在DMSO和Tween-80中，用生理盐水进一步稀释为工作溶液。将具有肿瘤的小鼠随机分为不同处理组，每天经由腹膜内注射10mg/kg体重剂量的AA，50mg/kg体重剂量的NG，或AA(10mg/kg)和NG(50mg/kg)的组合治疗。该实验已通过动物伦理实验委员会批准在香港中文大学进行研究。

免疫荧光染色

用5μm PLP固定的小鼠肿瘤组织的冷冻切片进行免疫荧光染色以检测肿瘤微环境中的NK细胞浸润以及这些肿瘤浸润性NK细胞中的p-Smad3、Smad7、IFN-γ和颗粒酶B的蛋白水平。用含有DAPI的封固剂固定所有载玻片，然后用荧光显微镜分析。

体外NK细胞培养

小鼠在安乐死后，取股骨和胫骨分离骨髓细胞。然后，将骨髓细胞以1×10⁶个细胞/ml的密度接种于补充有1ng/ml IL-7、10ng/ml Flt3L、30ng/ml SCF、50ng/ml IL-15和50mMβ-巯基乙醇的含有10％FBS的MEMα培养基中，并培养4天。然后，将细胞转移至补充有50ng/ml IL-15、20ng/ml IL-2和50mMβ-巯基乙醇的含有10％FBS的MEMα培养基中另外培养3天，以诱导NK细胞成熟。

为分离脾脏NK细胞，将脾脏组织通过40μm细胞过滤器轻轻捣碎至50mm²皿中，然后用NK细胞分离试剂盒II分离脾脏NK细胞。将脾脏NK细胞在补充有50ng/ml IL-15和20ng/mlIL-2的含有10％FBS的MEMα培养基中培养。

siRNA转染

在第0天和第4天，用Lipofectamine RNAiMAX转染IRF2特异性siRNA(5’-GCAAGCAGUACCUCAGCAATT-3’)，Id2特异性siRNA(5’-GCACGTCATCGATTACATC-3’)或无义对照(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)以沉默骨髓诱导的NK细胞中的Id2和IRF2，用于流式细胞术分析。

细胞毒性试验

收获LLC肺癌细胞作为靶细胞，用AA或NG处理的骨髓来源的NK细胞作为效应细胞。以5:1、10:1和20:1的效应细胞：靶细胞(E:T)比例接种于96孔板中。培养6小时后用CytoTox非放射性细胞毒性分析试剂盒检测各孔中LDH的释放。并用下式计算NK细胞介导的细胞毒性的百分数。

流式细胞术分析

使用各种标志物分析外周血NK细胞和培养的NK细胞，所述标志物包括大鼠抗-小鼠CD16/CD32抗体APC-缀合的抗-小鼠NK1.1、PE-缀合的抗-小鼠NKp46、PE-缀合的抗-小鼠CD122和Alexa 488-缀合的抗小鼠/人CD11b抗体。免疫染色之后，用200μl染色缓冲液重悬细胞，并用BD AccuriTM C6Cytometer对其进行分析。

ELISA

使用小鼠IFN-γELISA试剂盒和小鼠颗粒酶B ELISA试剂盒，通过酶联免疫吸附分析(ELISA)测量来自培养的NK细胞的肿瘤匀浆和上清液中的IFN-γ和颗粒酶B水平。

ChIP分析

将骨髓来源的NK细胞用5ng/ml TGF-β1刺激1小时，并通过在2000rpm离心5分钟进行收集。在用37％的甲醛交联固定后，用Enzymatic Chromatin IP试剂盒分离总染色质。用Smad3(C67H9)抗体和正常抗兔IgG沉淀交联的Smad3-DNA复合物。随后，用针对预测的保守的Smad结合位点的特异性引物，通过PCR检测靶向的基因组区域，并用凝胶电泳分析。

RNA提取和实时PCR

根据制造商的说明，用RNA微型试剂盒，从肿瘤组织或培养的细胞中分离总RNA。在CFX96TouchTM实时PCR检测系统上，根据制造商的说明，用具有Opticon2的Bio-Rad iQ SYBR Green supermix执行实时PCR程序。将GAPDH用作内部对照，并将靶标与GAPDH的比例计算为ΔCt＝Ct(靶标)-Ct(GAPDH)，比例(靶标)＝2(-Δ^Ct)。用于实时PCR的引物列于表1中。

蛋白质印迹

用冰冷的RIPA缓冲液裂解肿瘤组织和培养的NK细胞，然后如前所述(26)分离蛋白质。用含5％BSA的PBS将膜于室温封闭1小时，然后与针对Smad7、Id2、β-肌动蛋白、p-Smad3和IRF2的一抗于4℃温育过夜，随后与IRDye 800缀合的二抗温育。然后，通过LiCor/Odyssey红外成像系统检测靶蛋白的表达，并用Image J软件进行分析。

统计分析

数据呈现为平均值±平均值的标准误差(SEM)。用GraphPad Prism6.0软件(SanDiego,CA,USA)通过针对单变量分析的单向ANOVA或针对两个独立变量分析的双向ANOVA分析所有数据，随后进行Tukey多重比较检验。

本申请中引用的所有专利、专利申请和其它出版物，包括GenBank登录号为了所有目的通过引用整体并入。

表1.用于实时PCR的引物序列

表2.用于ChIP分析的引物序列

参考文献列表

1.J.A.Joyce,Therapeutic targeting of the tumormicroenvironment.Cancer Cell 7,513-520(2005).

2.J.A.Joyce,D.T.Fearon,T cell exclusion,immune privilege,and thetumor microenvironment.Science 348,74-80(2015).

3.J.Massague,TGFβin Cancer.Cell 134,215-230(2008).

4.S.B.Jakowlew,Transforming growth factor-beta in cancer andmetastasis.Cancer Metastasis Rev 25,435-457(2006).

5.L.Yang,Y.Pang,H.L.Moses,TGF-beta and immune cells:an importantregulatory axis in the tumor microenvironment and progression.Trends Immunol31,220-227(2010).

6.C.-H.Heldin,K.Miyazono,P.ten Dijke,TGF-[beta]signalling from cellmembrane to nucleus through SMAD proteins.Nature 390,465-471(1997).

7.O.Korchynskyi,M.R.Stoika,K.Funa,C.H.Heldin,P.ten Dijke,S.Souchelnytskyi,Expression of Smad proteins in human colorectalcancer.International journal of cancer 82,197-202(1999).

8.A.G.Li,S.-L.Lu,M.-X.Zhang,C.Deng,X.-J.Wang,Smad3knockout miceexhibit a resistance to skin chemical carcinogenesis.Cancer research 64,7836-7845(2004).

9.Q.Fan,D.Gu,H.Liu,L.Yang,X.Zhang,M.C.Yoder,M.H.Kaplan,J.Xie,Defective TGF-βSignaling in Bone Marrow–Derived Cells Prevents Hedgehog-Induced Skin Tumors.Cancer research 74,471-483(2014).

10.P.M.-K.Tang,S.Zhou,X.-M.Meng,Q.-M.Wang,C.-J.Li,G.-Y.Lian,X.-R.Huang,Y.-J.Tang,X.-Y.Guan,B.P.-Y.Yan,Smad3promotes cancer progression byinhibiting E4BP4-mediated NK cell development.Nature Communications 8,14677(2017).

11.A.Moustakas,S.Souchelnytskyi,C.-H.Heldin,Smad regulation in TGF-βsignal transduction.Journal of Cell Science 114,4359-4369(2001).

12.R.Derynck,Y.E.Zhang,Smad-dependent and Smad-independent pathwaysin TGF-βfamily signalling.Nature 425,577-584(2003).

13.P.Wang,J.Fan,Z.Chen,Z.-Q.Meng,J.-M.Luo,J.-H.Lin,Z.-H.Zhou,H.Chen,K.Wang,Z.-D.Xu,Low-level expression of Smad7 correlates with lymph nodemetastasis and poor prognosis in patients with pancreatic cancer.Annals ofsurgical oncology 16,826-835(2009).

14.A.Lamora,J.Talbot,G.Bougras,J.Amiaud,M.Leduc,J.Chesneau,J.Taurelle,V.Stresing,M.C.Le Deley,M.F.Heymann,Overexpression of smad7 blocksprimary tumor growth and lung metastasis development in osteosarcoma.ClinicalCancer Research 20,5097-5112(2014).

15.T.Feng,J.Dzieran,X.Gu,S.Marhenke,A.Vogel,K.Machida,T.S.Weiss,P.Ruemmele,O.Kollmar,P.Hoffmann,Smad7 regulates compensatory hepatocyteproliferation in damaged mouse liver and positively relates to betterclinical outcome in human hepatocellular carcinoma.Clinical Science 128,761-774(2015).

16.E.Vivier,D.H.Raulet,A.Moretta,M.A.Caligiuri,L.Zitvogel,L.L.Lanier,W.M.Yokoyama,S.Ugolini,Innate or adaptive immunity？The example of naturalkiller cells.Science 331,44-49(2011).

17.A.E.Wakil,Z.E.Wang,J.C.Ryan,D.J.Fowell,R.M.Locksley,Interferongamma derived from CD4(+)T cells is sufficient to mediate T helper cell type1 development.J Exp Med 188,1651-1656(1998).

18.I.Waldhauer,A.Steinle,NK cells and cancerimmunosurveillance.Oncogene 27,5932-5943(2008).

19.G.Bellone,M.Aste-Amezaga,G.Trinchieri,U.Rodeck,Regulation of NKcell functions by TGF-beta 1.The Journal of Immunology 155,1066-1073(1995).

20.J.P.Marcoe,J.R.Lim,K.L.Schaubert,N.Fodil-Cornu,M.Matka,A.L.McCubbrey,A.R.Farr,S.M.Vidal,Y.Laouar,TGF-beta is responsible for NK cellimmaturity during ontogeny and increased susceptibility to infection duringmouse infancy.Nat Immunol 13,843-850(2012).

21.Y.Laouar,F.S.Sutterwala,L.Gorelik,R.A.Flavell,Transforming growthfactor-beta controls T helper type 1 cell development through regulation ofnatural killer cell interferon-gamma.Nat Immunol 6,600-607(2005).

22.D.Bian,J.Zhang,X.Wu,Y.Dou,Y.Yang,Q.Tan,Y.Xia,Z.Gong,Y.Dai,Asiaticacid isolated from Centella asiatica inhibits TGF-beta1-induced collagenexpression in human keloid fibroblasts via PPAR-gammaactivation.International journal of biological sciences 9,1032-1042(2013).

23.L.-x.Tang,R.-h.He,G.Yang,J.-j.Tan,L.Zhou,X.-m.Meng,X.R.Huang,H.Y.Lan,Asiatic acid inhibits liver fibrosis by blocking TGF-beta/Smadsignaling in vivo and in vitro.PLoS One 7,e31350(2012).

24.X.Liu,W.Wang,H.Hu,N.Tang,C.Zhang,W.Liang,M.Wang,Smad3 specificinhibitor,naringenin,decreases the expression of extracellular matrix inducedby TGF-β1 in cultured rat hepatic stellate cells.Pharmaceutical research 23,82-89(2006).

25.G.Du,L.Jin,X.Han,Z.Song,H.Zhang,W.Liang,Naringenin:a potentialimmunomodulator for inhibiting lung fibrosis and metastasis.Cancer research69,3205-3212(2009).

26.X.-m.Meng,Y.Zhang,X.-R.Huang,G.-l.Ren,J.Li,H.Y.Lan,Treatment ofrenal fibrosis by rebalancing TGF-β/Smad signaling with the combination ofasiatic acid and naringenin.Oncotarget 6,36984(2015).

27.M.Wendel,I.E.Galani,E.Suri-Payer,A.Cerwenka,Natural killer cellaccumulation in tumors is dependent on IFN-gamma and CXCR3 ligands.Cancer Res68,8437-8445(2008).

28.A.S.Viel,M.Grau,T.Henry,J.Marvel,T.Walzer,Regulation ofmouse NK cell development and function by cytokines.Frontiers in immunology4,450(2013).

29.J.P.Di Santo,Natural killer cell developmental pathways:a questionof balance.Annu Rev Immunol 24,257-286(2006).

30.T.Ikawa,S.Fujimoto,H.Kawamoto,Y.Katsura,Y.Yokota,Commitment tonatural killer cells requires the helix–loop–helix inhibitor Id2.Proceedingsof the National Academy of Sciences 98,5164-5169(2001).

31.S.Taki,S.Nakajima,E.Ichikawa,T.Saito,S.Hida,IFN regulatory factor-2 deficiency revealed a novel checkpoint critical for the generation ofperipheral NK cells.The Journal of Immunology 174,6005-6012(2005).

32.M.S.I.Abaza,K.Y.Orabi,E.Al-Quattan,R.a.J.Al-Attiyah,Growthinhibitory and chemo-sensitization effects of naringenin,a natural flavanonepurified from Thymus vulgaris,on human breast and colorectal cancer.CancerCell International 15,46(2015).

33.X.-L.Tang,X.-Y.Yang,H.-J.Jung,S.-Y.Kim,S.-Y.Jung,D.-Y.Choi,W.-C.Park,H.Park,Asiatic acid induces colon cancer cell growth inhibition andapoptosis through mitochondrial death cascade.Biological and PharmaceuticalBulletin 32,1399-1405(2009).

34.C.Lou,F.Zhang,M.Yang,J.Zhao,W.Zeng,X.Fang,Y.Zhang,C.Zhang,W.Liang,Naringenin decreases invasiveness and metastasis by inhibiting TGF-β-inducedepithelial to mesenchymal transition in pancreatic cancer cells.PLoS One 7,e50956(2012).

35.H.-G.Kopp,T.Placke,H.R.Salih,Platelet-derived transforming growthfactor-βdown-regulates NKG2D thereby inhibiting natural killer cell antitumorreactivity.Cancer research 69,7775-7783(2009).

36.M.D.Boos,Y.Yokota,G.Eberl,B.L.Kee,Mature natural killer cell andlymphoid tissue–inducing cell development requires Id2-mediated suppressionof E protein activity.The Journal of experimental medicine 204,1119-1130(2007).

37.Y.Yokota,A.Mansouri,S.Mori,S.Sugawara,S.Adachi,S.-I.Nishikawa,P.Gruss,Development of peripheral lymphoid organs and natural killer cellsdepends on the helix–loop–helix inhibitor Id2.Nature 397,702-706(1999).

38.M.Lohoff,G.S.Duncan,D.Ferrick,H.-W.Mittrücker,S.Bischof,S.Prechtl,M.E.Schmitt,A.Pahl,T.W.Mak,Deficiency in the transcription factorinterferon regulatory factor(IRF)-2 leads to severely compromised developmentof natural killer and T helper type 1 cells.The Journal of experimentalmedicine 192,325-336(2000).

39.D.A.Thomas,J.Massagué,TGF-βdirectly targets cytotoxic T cellfunctions during tumor evasion of immune surveillance.Cancer cell 8,369-380(2005).

40.J.Yu,M.Wei,B.Becknell,R.Trotta,S.Liu,Z.Boyd,M.S.Jaung,B.W.Blaser,J.Sun,D.M.Benson,Pro-and antiinflammatory cytokine signaling:reciprocalantagonism regulates interferon-gamma production by human natural killercells.Immunity 24,575-590(2006).

Claims (17)

1.抑制细胞增殖的方法，包括使所述细胞与有效量的柚皮素和积雪草酸接触的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞为癌细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞为黑色素瘤或肺癌细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞在人体内。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述接触步骤包括皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用或口服施用。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述有效量为约5mg/kg至250mg/kg体重的柚皮素和1mg/kg至50mg/kg体重的积雪草酸。

7.如权利要求1所述的方法，其中以约10:1至约1:10，优选约1:5的重量比施用柚皮素和积雪草酸。

8.如权利要求1所述的方法，其中柚皮素和积雪草酸以单一组合物施用。

9.如权利要求1所述的方法，其中柚皮素和积雪草酸以两种单独的组合物施用。

10.如权利要求1所述的方法，其中柚皮素和积雪草酸以溶液、粉剂、凝胶、乳膏/糊剂、片剂或胶囊的形式施用。

11.组合物，其包含(1)有效量的柚皮素和积雪草酸，以及(2)药学可接受的赋形剂。

12.如权利要求11所述的组合物，其中柚皮素和积雪草酸以约10:1至约1:10，优选约1:5的重量比存在。

13.如权利要求11所述的组合物，所述组合物被配制用于皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用、局部施用或口服施用。

14.如权利要求11所述的组合物，所述组合物为溶液、粉剂、凝胶、乳膏/糊剂、片剂或胶囊。

15.用于抑制细胞增殖的试剂盒，其包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有包含柚皮素的第一组合物，所述第二容器含有包含积雪草酸的第二组合物。

16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述第一组合物或第二组合物被配制用于皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用、局部施用或口服施用。

17.如权利要求15所述的试剂盒，其还包含用于施用所述第一组合物和第二组合物的说明书。