CN108048296A - 微生物实时分离检测方法及分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用 - Google Patents

微生物实时分离检测方法及分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物实时分离检测方法，包括以下步骤：(1)在真空作用下，将微生物颗粒引入分离装置；(2)利用所述分离装置具有将不同颗粒粒径的微粒差异分离的特性，将不同粒径的微生物进行分散，并沉积在收集装置中的不同位置处；(3)将所述收集装置取出，加入基质进行干燥处理；(4)将干燥后收集装置放入微生物鉴定装置中进行鉴定，得到微生物的鉴定结果。本发明还提供一种分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用。本发明克服了微生物分离检测鉴定技术中难以实现快速检测的技术问题，实现了直接对不同颗粒的微生物进行检测，实现了各种检测场合下的微生物快速分离检测。

Description

微生物实时分离检测方法及分离检测装置在微生物分离检测 鉴定中的应用
技术领域
本发明涉及微生物的分离检测领域，特别涉及一种微生物实时分离检测方法及分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用。
背景技术
微生物的检测和鉴定涉及到诸多领域，如临床诊断、环境监测、食品安全等。快速准确的鉴定微生物对人类生活健康有着重要意义。传统的微生物检测与鉴定主要依据细菌的形态学和生理生化反应。虽然这类鉴定准确性较高且具有专一性，但微生物纯化培养和样品分析周期长，难以实现快速简单的检测鉴定。一些商业化的细菌自动化鉴别仪器，如微生物生化测试仪和自动化检测装置，虽然也具有较快速、自动化程度高等优点，但仍需花费大量时间精力，消耗多种耗材试剂对微生物进行培养和鉴定。通过遗传层面的方法，虽然准确性高，但操作复杂，且非常昂贵耗时。这些方法都不适合对微生物进行快检。
空气动力学透镜是一种用于收集空气中颗粒的装置，常用在单颗粒气溶胶质谱仪中，作为颗粒引入质谱仪前端处理装置。经特殊设计的空气动力学透镜具有使颗粒束的发散角与颗粒粒径成一定关系的特性，便可用于分离不同粒径的颗粒。不同细菌有着不一样的尺寸大小，如纳米细菌在50nm左右，嗜血流感菌在0.25×1.2μm左右，肺炎球菌在0.8μm左右，大肠杆菌在1×3μm左右，巨大芽孢杆菌在1.5×4μm左右。通过存在发散的空气动力学透镜可将不同微生物按照粒径的大小进行分离。
基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种新型软电离生物质谱。相对于传统的鉴定方法和分子生物学方法，MALDI-TOF MS具有快速、准确、灵敏度高、分辨率好等优点，现已广泛应用于微生物鉴定领域。该方法虽然可以对微生物进行快速检测，但需要对微生物进行培养后再鉴定，并无法直接对微生物准实时检测。
现有技术中，没有准确有效的方法可对微生物进行实时分离检测鉴定，常用的对微生物鉴定方法都需对微生物进行培养纯化后再进行鉴定，这些方法成本高、效率低、操作复杂，难以实现直接快速检测。
发明内容
针对现有技术的微生物鉴定技术的现状，本发明的目的旨在提一种微生物实时分离检测方法及分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用，克服了微生物分离检测技术中需对微生物进行培养纯化、难以实现快速检测的技术问题，实现了直接对不同颗粒的微生物进行检测，实现了各种检测场合下的微生物快速分离检测。
本发明中的微生物实时分离检测方法具体包括以下步骤：
(1)在真空作用下，将微生物颗粒引入分离装置；
(2)利用所述分离装置具有将不同颗粒粒径的微粒差异分离的特性，将不同粒径的微生物进行分散，并沉积在收集装置中的不同位置处；
(3)将所述收集装置取出，加入基质进行干燥处理；
(4)将干燥后收集装置放入微生物鉴定装置中进行鉴定，微生物鉴定装置将得到微生物信息与数据库进行对比检索，得到微生物的鉴定结果。
进一步地，所述基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。
进一步地，微生物颗粒来源为空气中的微生物，或单分散气溶胶发生器发生液体中的微生物，或其他环境中的微生物。
进一步地，还包括利用真空泵将分离装置抽至真空状态的步骤。
本发明还提供一种分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用，具体应用于不同粒径的微生物颗粒的分离检测。
进一步地，分离检测装置包括分离装置和微生物鉴定装置；所述分离装置包括在依次设置在同一竖直直线上的空气动力学透镜、分离锥、真空腔室、收集装置；空气动力学透镜包括多个设置有通孔的薄孔板，至少一个通孔偏心于空气动力学透镜的轴线而设置，分离锥包括用于分离颗粒束的分离板；微生物鉴定装置包括基质辅助激光解吸飞行时间的质谱仪和分析电脑，所述质谱仪和分析电脑电性连接。
进一步地，多个薄孔板的孔径沿颗粒物引入方向依次变小。
进一步地，所述分离锥包括两个间隔设置的分离板，两个分离板倾斜设置的且延长线夹角为锐角，该锐角指向空气动力学透镜的喷嘴。
进一步地，所述分离锥包括一级分离锥及二级分离锥，所述分离锥还包括用于固定分离板的固定板。
进一步地，所述真空泵设置有两个，分别设置于真空腔的侧壁上；所述收集装置内设置有样品靶，但不限于样品靶，还可用微孔或微管等替代。
与现有技术相比，本发明可实现以下有益技术效果：
本发明将传统的空气动力学透镜进行改进，从空气动力学透镜的原理出发，利用其性能的弊端，使其聚焦效果变差，发散加大，从而使含不同粒径的混合颗粒可依据颗粒粒径的差异分离开，达到相同粒径的颗粒物聚焦，不同粒径的颗粒发散，分开收集不同粒径的颗粒物的效果。
由于不同的微生物具有不同的粒径，例如，如纳米细菌在50nm左右，嗜血流感菌在0.25×1.2μm左右，肺炎球菌在0.8μm左右，大肠杆菌在1×3μm左右，巨大芽孢杆菌在1.5×4μm左右。因此，利用本发明中的空气动力学透镜将不同微生物按照粒径的大小进行分离特性，采用微生物实时分离检测方法，进一步实现对不同颗粒的微生物进行检测；实现了微生物无须经过复杂的培养、标志等过程，直接从环境中取样即可进行分离及鉴定。
本发明提供的微生物实时分离检测鉴定方法具有调节性和适应性。所采用的分离检测装置可根据外界环境的微生物浓度控制分离时间，保证收集的微生物数量以及检测精准度，且微生物颗粒的来源不仅为空气，还可以是经单分散气溶胶发生器发生液体中的微生物，实现了各种检测场合下的微生物快速分离检测。
本发明中分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用，解决现有微生物分离检测鉴定技术中需对微生物进行培养纯化、难以实现快速检测的技术问题。现有技术中并没有同类的装置用于对于微生物分离检测鉴定，将本发明中的分离检测装置应用于微生物分离检测鉴定领域，缩短对微生物的检测鉴定周期，在微生物检测领域起到了预料不到的技术效果，开创性的提出了新的微生物直接鉴定的方法。
附图说明
图1本分离检测装置整体结构示意图；
图2为分离装置的结构组成图；
图3为微生物鉴定装置的结构组成图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明中的分离检测装置，参见图1，包括分离装置和微生物鉴定装置。所述分离装置包括：空气动力学透镜2、分离锥3、真空腔室4、收集装置5、一级真空泵6和二级真空泵7。空气动力学透镜包括多个设置有通孔的薄孔板，至少一个通孔偏心于空气动力学透镜的轴线设置，多个薄孔板的孔径沿激光束发射方向依次变小，薄孔板垂直安装于空透镜2的内侧壁上，两个薄孔板间隔一定距离设置。薄孔板的数目可根据实际情况的需要设置，本实施例中，薄孔板设置有四个。空气动力学透镜2上方设有为进样口1，下方设有喷嘴。空气动力学透镜2的进样口1及喷嘴、空气动力学透镜2、分离锥3以及收集装置5在一垂直线上依次设置；喷嘴下方对应设置分离锥3，收集装置5设置于分离锥3正下方。所述空气动力学透镜2的下部，分离锥3及收集装置设置于真空腔室4的内部。分离锥3包括依次竖直设置的一级分离锥及二级分离锥，一级分离锥及二级分离锥分别包括两个分离板及固定板；两个分离板相隔一定距离设置，两个分离板倾斜设置，且其的延长线夹角为锐角，该锐角指向空气动力学透镜2的喷嘴；两个分离板通过水平设置的固定板固定于真空腔内；颗粒束穿过两个分离板之间的空隙到达收集装置5处。样品靶放置于收集装置5中。一级真空泵6设置于真空腔室4的侧壁的上部，二级真空泵7设置于真空腔室4的侧壁下部，两级抽真空装置可保证真空腔室4内的真空度维持在5×10-4pa以下。
微生物鉴定装置包括基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(Matrix-AssistedLaser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)8和分析电脑9。质谱仪8下方设置有样品靶的摆放位置，分析电脑9与质谱仪8电性相连。
利用一级真空泵6和二级真空泵7将分离装置至于真空状态，由于压力作用，生物颗粒从外部环境直接通过进样口1进入空气动力学透镜2。微生物颗粒流经过空气动力学透镜的透镜孔时，空透镜对颗粒物进行聚焦，由于颗粒束的发散角与颗粒粒径成一定关系，空气动力学透镜2根据其分散性，将微生物颗粒按照不同粒径进行分离，准颗粒束经由喷嘴加速后喷出；且准颗粒束于分离锥3实现分离。由于增加了空透镜对颗粒聚焦的分散度，不同粒径的颗粒从分离锥以一定速度和角度进入真空腔，并继续形成稳定的颗粒束，最终被载有样品靶的收集装置5收集。
经过一定时间后，在样品靶上会出现含有不同种微生物的沉积斑点。收集时间越长，斑点越大且明显。随后，将收集好沉积斑点的样品靶从收集装置中取出，加入α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)作为基质并进行干燥处理。干燥完成后将样品靶放入基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(Matrix-Assisted LaserDesorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)8的下方放置处等待检测，质谱仪对样品靶发出激光，用激光照射样品与基质的共结晶薄膜，基质从激光吸收能量传递给微生物样品，使得样品靶上的微生物样品吸收能量进行软电离产生离子，产生的离子在内部电场的作用下会由下而上运动通过质谱仪。在此期间，质谱仪的飞行时间质量分析器器通过计算离子的飞行时间与其质荷比进行对比分析，并且得到不同微生物核糖体蛋白质谱图，并将数据传送到分析电脑9。分析电脑9根据通过MALDI-TOF MS检测微生物的核糖体蛋白谱图，将得到的谱图与数据库中的蛋白质指纹图谱进行对比分析及检索鉴定，最终实现微生物的快速分离及检测鉴定，该鉴定方法可以用以鉴定微生物到属种水平。
本实施例中检测的微生物颗粒来源可以为空气中的微生物，也可以经单分散气溶胶发生器发生液体中的微生物，或其他环境中的微生物。
本实施例中微生物实时分离检测鉴定方法可对其他环境，如体液、培养液中的微生物进行分离鉴定。
本发明的实施方式不限于此，按照本发明的上述内容，利用本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微生物实时分离检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)在真空作用下，将微生物颗粒引入分离装置；
(2)利用所述分离装置具有将不同颗粒粒径的微粒差异分离的特性，将不同粒径的微生物进行分散，并沉积在收集装置中的不同位置处；
(3)将所述收集装置取出，加入基质进行干燥处理；
(4)将干燥后收集装置放入微生物鉴定装置中进行鉴定，微生物鉴定装置将得到微生物信息与数据库进行对比检索，得到微生物的鉴定结果。
2.根据权利要求1所述的微生物实时分离检测方法，其特征在于：所述基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。
3.根据权利要求1所述的微生物实时分离检测方法，其特征在于：微生物颗粒来源为空气中的微生物，或单分散气溶胶发生器发生液体中的微生物。
4.根据权利要求1所述的微生物实时分离检测方法，其特征在于：还包括利用真空泵将分离装置抽至真空状态的步骤。
5.一种分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用，其特征在于：应用于不同粒径的微生物颗粒的分离检测。
6.根据权利要求5所述的一种分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用，其特征在于：分离检测装置包括分离装置和微生物鉴定装置；所述分离装置包括在依次设置在同一竖直直线上的空气动力学透镜、分离锥、真空腔室、收集装置；空气动力学透镜包括多个设置有通孔的薄孔板，至少一个通孔偏心于空气动力学透镜的轴线而设置，分离锥包括用于分离颗粒束的分离板；微生物鉴定装置包括基质辅助激光解吸飞行时间的质谱仪和分析电脑，所述质谱仪和分析电脑电性连接。
7.根据权利要求6所述的一种分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用，其特征在于：空气动力学透镜中多个薄孔板的孔径沿颗粒物引入方向依次变小。
8.根据权利要求6所述的一种分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用，其特征在于：所述分离锥包括两个间隔设置的分离板，两个分离板倾斜设置的且延长线夹角为锐角，该锐角指向空气动力学透镜的喷嘴。
9.根据权利要求8所述的一种分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用，其特征在于：所述分离锥包括一级分离锥及二级分离锥，所述分离锥还包括用于固定分离板的固定板。
10.根据权利要求6所述的一种分离检测装置在微生物分离检测鉴定中的应用，其特征在于：所述真空泵设置有两个，分别设置于真空腔的侧壁上；所述收集装置内设置有样品靶，微孔或微管等。
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