CN108037275A - 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒 - Google Patents
一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108037275A CN108037275A CN201711338605.1A CN201711338605A CN108037275A CN 108037275 A CN108037275 A CN 108037275A CN 201711338605 A CN201711338605 A CN 201711338605A CN 108037275 A CN108037275 A CN 108037275A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cer
- concentration
- tantile
- sample
- study subject
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 title claims abstract description 132
- VODZWWMEJITOND-NXCSZAMKSA-N N-octadecanoylsphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC VODZWWMEJITOND-NXCSZAMKSA-N 0.000 claims abstract description 62
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000013517 stratification Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 18
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 133
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 claims description 118
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 claims description 84
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 claims description 73
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 73
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 73
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 66
- ZJVVOYPTFQEGPH-UHFFFAOYSA-N 102917-80-6 Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)NC(CO)C(O)C=CCCCCCCCCCCCCC ZJVVOYPTFQEGPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- ZJVVOYPTFQEGPH-AUTSUKAISA-N N-tetracosanoylsphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC ZJVVOYPTFQEGPH-AUTSUKAISA-N 0.000 claims description 61
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 claims description 47
- YDNKGFDKKRUKPY-TURZORIXSA-N N-hexadecanoylsphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-TURZORIXSA-N 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 34
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 28
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 25
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 22
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 14
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 claims description 14
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 claims description 12
- 208000007718 Stable Angina Diseases 0.000 claims description 11
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 claims description 10
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 10
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 claims description 9
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 claims description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 claims description 7
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 claims description 7
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 claims description 6
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 claims description 6
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 6
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000012549 congenital acardia Diseases 0.000 claims description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 101710095342 Apolipoprotein B Proteins 0.000 claims description 4
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 claims description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108090000362 Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 claims description 4
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013534 Troponin C Human genes 0.000 claims description 4
- 102000013394 Troponin I Human genes 0.000 claims description 4
- 108010065729 Troponin I Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 4
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 claims description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 4
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 claims description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 claims description 3
- 102000057248 Lipoprotein(a) Human genes 0.000 claims description 3
- 108010033266 Lipoprotein(a) Proteins 0.000 claims description 3
- -1 acyl Amine Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 200000000007 Arterial disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 133
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 32
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 30
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 21
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 230000034994 death Effects 0.000 description 15
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 15
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 13
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 11
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 8
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100537532 Rattus norvegicus Tnni3 gene Proteins 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 5
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 5
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 101150102415 Apob gene Proteins 0.000 description 3
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 3
- 208000013875 Heart injury Diseases 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000006 Nitroglycerin Substances 0.000 description 3
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 3
- 102000004903 Troponin Human genes 0.000 description 3
- 108090001027 Troponin Proteins 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 229960003711 glyceryl trinitrate Drugs 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 2
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000011971 Sphingomyelin Phosphodiesterase Human genes 0.000 description 2
- 108010061312 Sphingomyelin Phosphodiesterase Proteins 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- LRYZPFWEZHSTHD-HEFFAWAOSA-O 2-[[(e,2s,3r)-2-formamido-3-hydroxyoctadec-4-enoxy]-hydroxyphosphoryl]oxyethyl-trimethylazanium Chemical class CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](NC=O)COP(O)(=O)OCC[N+](C)(C)C LRYZPFWEZHSTHD-HEFFAWAOSA-O 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 241000206601 Carnobacterium mobile Species 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- VJSBNBBOSZJDKB-KPEYJIHVSA-N N-(15Z)-tetracosenoylsphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@H](CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC VJSBNBBOSZJDKB-KPEYJIHVSA-N 0.000 description 1
- NPRJSFWNFTXXQC-QFWQFVLDSA-N N-(hexanoyl)sphing-4-enine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@H](CO)NC(=O)CCCCC NPRJSFWNFTXXQC-QFWQFVLDSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061876 Obstruction Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014458 Protein Kinase C-epsilon Human genes 0.000 description 1
- 108010078137 Protein Kinase C-epsilon Proteins 0.000 description 1
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 206010049418 Sudden Cardiac Death Diseases 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 1
- 230000009876 antimalignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 description 1
- 208000026758 coronary atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 208000012947 ischemia reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002464 muscle smooth vascular Anatomy 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 description 1
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000013214 routine measurement Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002107 sheath cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000027849 smooth muscle hyperplasia Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供一种评估冠状动脉疾病的试剂盒，该试剂盒包括：用于检测受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)浓度的检测试剂、以及说明书。本发明的试剂盒能够高效、准确用于冠状动脉疾病诊断、危险分层、病情监测和疗效评价，且灵敏度和特异性较好，能够满足冠状动脉疾病的临床诊断和治疗的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒。
背景技术
心血管病已成为全球人类死亡率最高的疾病，心血管病的每年死亡率已超过其他疾病，成为第一位的死亡病因。2015年，约有1.77亿人由于心血管病死亡，占全球死亡人数的31％，其中有7400万人死于冠状动脉疾病。随着我国经济水平的发展，人民生活水平的提高，饮食结构的改变及人口迅速老龄化，心血管病的发病率和死亡率呈上升趋势。2016年“中国心血管病报告”指出我国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段。推算我国心血管疾病患病人数为2.9亿，其中冠心病为1100万。在中国，心血管病死亡率居首位，高于肿瘤和其他疾病，占居民因疾病死亡构成的40％以上。
鉴于冠状动脉疾病的高发病率和高死亡率，预防冠状动脉患者的致命性和非致命性心肌梗死，仍然是临床上的挑战。每年稳定性冠状动脉患者的死亡率在1-3％之间，非致命性发病率在1-2％之间。在急性病症存活的急性冠状动脉综合征患者中，心肌梗死的死亡率明显升高(尤其在第一年内)。然而发病风险在各个病人中非常不同，这就需要有效的诊断、危险分层、病情监测和疗效评价的工具来提高病人的识别和管理。
冠状动脉疾病标志物是动脉粥样硬化发生发展过程中增加或减少的生物活性物质，可用于冠状动脉疾病的诊断、危险分层、病情监测和疗效评价。它会对冠状动脉疾病的临床治疗带来巨大的影响，因此为了满足冠状动脉疾病的临床诊断和治疗的需求，高效、准确的标志物的研发亟待加速。
目前用于冠状动脉疾病诊断、危险分层、病情监测和疗效评价的标志物，大多由于缺乏灵敏度和特异性而不能为临床医生提供更多的参考价值。例如，血清中的总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与动脉粥样硬化相关联，其被长期用来进行心血管疾病的诊断、危险分层和预后。但是，这些传统的危险分子的测定不能识别出很大一部分具有高风险心血管疾病的病人。因此，除了低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)这些传统的危险分子，急需寻找一种更准确的、更具预测性的危险因子。
游离脂质组学分析显示一些脂质可能作为冠状动脉疾病的有效诊断、危险分层和预后的标志物。脂质组学研究发现在冠状动脉疾病患者中特定的神经酰胺种类与心血管死亡显著相关(Meikle,P.J.et al.Plasma lipidomic analysis of stable and unstablecoronary artery disease.Arterioscler Thromb Vasc Biol 31,2723-2732,doi:10.1161/ATVBAHA.111.234096(2011).)。神经酰胺是由鞘氨醇和脂肪酸组成。神经酰胺主要通过鞘磷脂酶通路产生，鞘磷脂酶分解鞘细胞膜上的磷脂并释放神经酰胺。同时神经酰胺可以通过新合成通路由六种脂酰选择性神经酰胺合成酶利用简单分子合成。不同的神经酰胺类分子具有特定的生理功能。几个关键的细胞因子(如肿瘤坏死因子和白介素)可以诱导炎性反应(如动脉粥样硬化和缺血再灌流损伤)，而神经酰胺水平在这些炎性反应中升高。一些心血管危险因子和标志物(如氧化的低密度脂蛋白和同型半胱氨酸)可以增加神经酰胺的产生。另外，神经酰胺作为信号分子参与调控许多细胞反应和功能，包括分化、增值、细胞凋亡、活性氧产生和基因表达，这些作用直接参与心血管疾病的分子机制。
神经酰胺目前也是治疗冠状动脉疾病药物开发的一个重要靶点。研究证明，鞘磷脂的代谢过程是一个动态的过程，鞘磷脂的代谢物(包括神经酰胺、鞘氨醇)作为第二信使在冠状动脉疾病中起到重要作用(Kolesnick,R.The therapeutic potential ofmodulating the ceramide/sphingomyelin pathway.J Clin Invest 110,3-8,doi:10.1172/JCI16127(2002).)。当把神经酰胺类似物直接作用于受损的动脉时，可以表现出强烈的抗恶性细胞增生扩散的作用(Bourbon,N.A.,Yun,J.,Berkey,D.,Wang,Y.&Kester,M.Inhibitory actions of ceramide upon PKC-epsilon/ERK interactions.Am JPhysiol Cell Physiol 280,C1403-1411(2001).)。血管平滑肌细胞的新内膜增生和冠状动脉的二次阻塞是气囊血管成形术和动脉支架植入术后发生再狭窄的原因，影响全球300万接受冠状动脉血管成形术的患者。神经酰胺可以抑制由ERK激酶和AKT激酶级联反应诱导的血管平滑肌的增生。C6神经酰胺包被的气囊导管可以阻止拉伸诱导的血管平滑肌细胞的新内膜增生(Charles,R.et al.Ceramide-coated balloon catheters limit neointimalhyperplasia after stretch injury in carotid arteries.Circ Res 87,282-288(2000).)。
已有大量的分析方法来测量神经酰胺，包括薄层色谱法、常液相色谱法、免疫化学方法、气相色谱法和串联质谱法。然而，大部分的方法都是为研究工作而非临床使用而设计的，这些方法的共同缺点是它们在分子种类水平上无法对神经酰胺进行分析，并缺乏选择性、通量低、精确度和准确性低，因此不能满足临床实验室的要求。我们同样不能利用传统的免疫实验方法来区分这四种神经酰胺，因为每种神经酰胺的抗原表位都太相似了。抗神经酰胺抗体识别一类神经酰胺分子，它们只在脂肪酸链长度上有所不同。因此，现有抗体的低选择性阻碍了临床有效免疫测定方法的发展(Krishnamurthy,K.,Dasgupta,S.&Bieberich,E.Development and characterization of a novel anti-ceramideantibody.J Lipid Res48,968-975,doi:10.1194/jlr.D600043-JLR200(2007).)。而LC-MS/MS的主要优点在于结合色谱分离与质谱的精确监测，可以明确检测每种神经酰胺分子(Kauhanen,D.et al.Development and validation of a high-throughput LC-MS/MSassay for routine measurement ofmolecular ceramides.Anal Bioanal Chem 408,3475-3483,doi:10.1007/s00216-016-9425-z(2016).)。
发明内容
本发明基于神经酰胺类物质与动脉粥样硬化的发生和发展密切相关，并与心血管死亡显著相关的发现，将血浆心血管死亡风险相关的神经酰胺分子(Cer(d18:1/16:0)，Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:1/24:1))及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值用于冠状动脉疾病的诊断、危险分层、病情监测、疗效评价及候选药物疗效评价。
本发明的目的之一在于提供用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于确定可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险的试剂盒中的应用。
本发明的目的之二在于提供用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的试剂盒中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种评估冠状动脉疾病的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于确定可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险的试剂盒中的应用，所述冠状动脉疾病标志物包括Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)，所述浓度比值是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度分别与Cer(d18:1/24:0)的浓度的比值；优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。
用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的试剂盒中的应用，所述冠状动脉疾病标志物包括Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)，所述浓度比值是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度分别与Cer(d18:1/24:0)的浓度的比值；优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。
在上述应用中，作为一种优选实施方式，确定所述来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度的方法为蛋白快速沉淀的方法和LC-MS/MS的方法；优选地，所述样品为血液、血浆或血清。
在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述冠状动脉疾病标志物还包括非神经酰胺类化合物，所述非神经酰胺类化合物为总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、低密度脂蛋白颗粒数目(LDL-P)、致密的低密度脂蛋白(sdLDL)、载脂蛋白B(apoB)、脂蛋白a(LP(a))、脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、高密度脂蛋白颗粒数目(HDL-P)、致密的高密度脂蛋白(sdHDL)、载脂蛋白A1(apoA1)、C反应蛋白(CRP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)、肌钙蛋白C(cTnC)、肌红蛋白(Mb)中的一种或多种。
一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒，包括：
用于检测受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)浓度的检测试剂、以及说明书；
针对所述受试对象为可能或潜在患病受试对象，所述说明书中包括：健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，以及利用受试对象的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度检测结果确定可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或者具有罹患冠状动脉疾病的风险的方法，其中所述方法具体如下：
将所述可能或潜在患病受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与健康人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价；
当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分；
在判断受试对象是否患有冠状动脉疾病时，当所述六项检测指标的总得分等于或大于7分时，判断受试对象患有冠状动脉疾病；
在判断受试对象罹患冠状动脉疾病的风险时，当所述六项检测指标的总得分为0-2分时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分为3-6分时，判断为中等风险；当所述六项检测指标的总得分为7-9分时，判断为较高风险；当所述六项检测指标的总得分为10-12分时，判断为高风险；
针对所述受试对象为正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象，所述说明书中包括：标准人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，以及利用受试对象的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度检测结果对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的方法，其中所述方法具体如下：
将所述正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与标准人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价，所述标准人群样本由健康人的样本和具有稳定性冠状动脉疾病的人的样本组成，其中所述健康人的样本占标准人群样本总数的50％；
当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分；
在对所述受试对象进行危险分层评价时，当所述六项检测指标的总得分为0-2分时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分为3-6分时，判断为中等风险；当所述六项检测指标的总得分为7-9分时，判断为较高风险；当所述六项检测指标的总得分为10-12分时，判断为高风险；
在对所述受试对象进行病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价时，对比所述受试对象在治疗前和治疗后的所述六项检测指标的总得分；当治疗后所述受试对象的六项检测指标的总得分大于治疗前所述受试对象的六项检测指标的总得分，则判定该受试对象的病情进展和/或疗效较差，或判定所述候选治疗药物疗效较差；当治疗后所述受试对象的六项检测指标的总得分小于治疗前所述受试对象的六项检测指标的总得分，则判定该受试对象的病情进展和/或疗效较好，或判定所述候选治疗药物疗效较好；
优选地，所述说明书中还包括：Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度的检测方法；进一步优选地，所述检测方法是蛋白快速沉淀的方法和LC-MS/MS的方法；所述样品优选为血液、血浆或血清。
在上述试剂盒，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括检测所述受试对象的样品中的非神经酰胺类化合物的浓度的试剂，所述非神经酰胺类化合物为总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、低密度脂蛋白颗粒数目(LDL-P)、致密的低密度脂蛋白(sdLDL)、载脂蛋白B(apoB)、脂蛋白a(LP(a))、脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、高密度脂蛋白颗粒数目(HDL-P)、致密的高密度脂蛋白(sdHDL)、载脂蛋白A1(apoA1)、C反应蛋白(CRP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)、肌钙蛋白C(cTnC)、肌红蛋白(Mb)中的一种或多种；优选地，所述说明书中还包括：所述非神经酰胺类化合物浓度的检测方法，以及所述非神经酰胺类化合物的阈值；
更优选地，针对所述受试对象为可能或潜在患病受试对象，所述说明书还包括：综合利用Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度以及非神经酰胺类化合物的浓度检测结果确定所述可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险的方法，其中，所述具体如下：
将所述可能或潜在患病受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与健康人群样本总体的相应指标值进行比较、评分；然后，将所述非神经酰胺类化合物的浓度与所述阈值进行比较；根据分值范围和比较结果对所述可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价；
当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分；
在判断受试对象是否患有冠状动脉疾病时，当所述六项检测指标的总得分等于或大于7分时，且所述非神经酰胺类化合物的浓度达到或超过所述阈值，则判定受试对象患有冠状动脉疾病；
在判断罹患冠状动脉疾病的风险时：
当所述六项检测指标的总得分超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度超过所述阈值时，判断为高风险；当所述六项检测指标的总得分未超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度未超过所述阈值时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度未超过所述阈值、或者所述六项检测指标的总得分未超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度超过所述阈值(即判断相反)时，判断为中风险，需要进一步检测；
进一步优选地，针对所述受试对象为正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象，所述说明书还包括：综合利用受试对象Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度以及非神经酰胺类化合物的浓度检测结果对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层价的方法，其中，所述方法具体如下：
将正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与所述标准人群样本总体的相应指标值进行比较、评分；然后，将所述非神经酰胺类化合物的浓度与所述阈值进行比较；根据分值范围和比较结果对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层；
当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分；
在对所述受试对象进行危险分层评价时，当所述六项检测指标的总得分超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度超过所述阈值时，判断为高风险；当所述六项检测指标的总得分未超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度未超过所述阈值时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度未超过所述阈值、或者所述六项检测指标的总得分未超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度超过所述阈值(即判断相反)时，判断为中风险，需要进一步检测。
在上述试剂盒，作为一种优选实施方式，所述用于检测受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)浓度的检测试剂包括：
所述受试对象的样本的预处理试剂，优选包括：蛋白质沉淀溶剂，所述蛋白质沉淀溶剂优选是体积比为2:8的乙酸乙酯和异丙醇的混合物；
用于制作Cer(d18:1/16:0)，Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)和Cer(d18:1/24:0)四种神经酰胺的标准曲线的试剂，优选包括：四种神经酰胺纯品或四种神经酰胺纯品存储溶液、5％的BSA稀释剂；
D7‐Cer(d18:1/16:0)、D7‐Cer(d18:1/18:0)、D7‐Cer(d18:1/24:0)、D7‐Cer(d18:1/24:1)四种神经酰胺内标纯品或溶液，优选地，四种神经酰胺内标溶液的浓度分别为D7‐Cerd18:1/16:0：0.125pmol/μl，D7‐Cer d18:1/18:0 0.05pmol/μl，D7‐Cer d18:1/24:0：1.5pmol/μl，D7‐Cer d18:1/24:1：0.5pmol/μl。
在上述试剂盒中，作为一种优选方式，所述试剂盒还包括：
质控品为新鲜冻存混合血浆质控品，所述混合血浆质控品是有稳定心脏病史的多位病人的血浆混合而成的血盘；优选地，所述混合血浆质控品包括：中间质量控制(MQC)：未处理的FFP；低质量控制(LQC)：用水稀释中间质量控制2倍来制备；下限量化质量控制(LLOQ)：用水稀释中间质量控制3倍来制备；高质量控制(HQC)：向未处理的FFP中加入Cerd18:1/16:0、Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品或溶液使Cer d18:1/16:0和Cerd18:1/18:0的浓度达到0.1pmol/μl，且加入Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1神经酰胺纯品或溶液使Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的浓度达到1pmol/μl；和上限量化质量控制(ULOQ)：向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品或溶液以使Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0浓度达到0.15pmol/μl，且加入Cer d18:1/24:0和Cerd18:1/24:1神经酰胺纯品或溶液以使Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1浓度达到1.5pmol/μl。
在上述试剂盒，作为一种优选实施方式，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。
在上述试剂盒，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：基质空白对照：人血浆，所述人血浆是无心脏病史的多位健康人的血浆混合而成的血盘；更优选地，所述试剂盒还包括：用于采集血液样本的容器，并且所述容器中包含EDTA-K2、EDTA-K3或肝素；优选地，所述容器为包含EDTA-K2的采血管。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
1、本发明利用Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)和Cer(d18:1/24:0)冠状动脉疾病标志物，本发明的试剂盒能够高效、准确用于冠状动脉疾病诊断、危险分层、病情监测和疗效评价，且灵敏度和特异性较好，能够满足冠状动脉疾病的临床诊断和治疗的需求。
2、本发明采用LC‐MS/MS(液相二级质谱)方法检测标志物，能够从分子种类水平上对神经酰胺标志物进行分析，选择性好、通量高、精确度和准确性高。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。其中：
图1：Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的产物离子谱；
图2：在5％BSA中的Cer d18:1/16:0的校准曲线；
图3：在5％BSA中的Cer d18:1/18:0的校准曲线；
图4：在5％BSA中的Cer d18:1/24:0的校准曲线；
图5：在5％BSA中的Cer d18:1/24:1的校准曲线；
图6：Cer d18:1/16:0(Cer1)、Cer d18:1/18:0(Cer2)、Cer d18:1/24:0(Cer3)和Cer d18:1/24:1(Cer4)的LC-MS/MS分析方法的ULOQ质控品精密度；
图7：Cer d18:1/16:0(Cer1)、Cer d18:1/18:0(Cer2)、Cer d18:1/24:0(Cer3)和Cer d18:1/24:1(Cer4)的LC-MS/MS分析方法的HQC质控品精密度；
图8：Cer d18:1/16:0(Cer1)、Cer d18:1/18:0(Cer2)、Cer d18:1/24:0(Cer3)和Cer d18:1/24:1(Cer4)的LC-MS/MS分析方法的MQC质控品精密度；
图9：Cer d18:1/16:0(Cer1)、Cer d18:1/18:0(Cer2)、Cer d18:1/24:0(Cer3)和Cer d18:1/24:1(Cer4)的LC-MS/MS分析方法的LQC质控品精密度；
图10：Cer d18:1/16:0(Cer1)、Cer d18:1/18:0(Cer2)、Cer d18:1/24:0(Cer3)和Cer d18:1/24:1(Cer4)的LC-MS/MS分析方法的LLOQ质控品精密度；
图11：Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的萃取回收率；
图12：稳定性心绞痛和正常对照组Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度，和Cer(d18:1/16:0)/Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/18:0)/Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)/Cer(d18:1/24:0)比值的比较；
图13：神经酰胺评分与罹患冠状动脉疾病的风险的关联性；
图14：神经酰胺评分与冠状动脉疾病危险分层的关联性。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Cer(d18:1/16:0)为N-棕榈酰基-D-赤式-鞘氨醇(N-Palmitoyl-D-erythro-sphingosine)，结构如式I所示：
Cer(d18:1/18:0)为N-硬脂酰基-D-赤式-鞘氨醇(N-stearoyl-D-erythro-sphingosine)，结构如式II所示：
Cer(d18:1/24:0)为N-二十四烷酰基-D-赤式-鞘氨醇(N-lignoceroyl-D-erythro-sphingosine)，结构如式III所示：
Cer(d18:1/24:1)为N-二十四碳烯酰基-D-赤式-鞘氨醇(N-nervonoyl-D-erythro-sphingosine)，结构如式IV所示：
D7-Cer(d18:1/16:0)为N-棕榈酰基-D-赤式-鞘氨醇-d7(N-palmitoyl-D-erythro-sphingosine-d7)，结构如式V所示：
D7-Cer(d18:1/18:0)为N-硬脂酰基-D-赤式-鞘氨醇-d7(Nstearoyl-D-erythro-sphingosine-d7)，结构如式VI所示：
D7-Cer(d18:1/24:0)为N-廿四烷酰基-D-赤式-鞘氨醇-d7(Nlignoceroyl-D-erythro-sphingosine-d7)，结构如式VII所示：
D7-Cer(d18:1/24:1)为N-二十四碳烯酰基-D-赤式-鞘氨醇-d7(N-nervonoyl-D-erythro-sphingosine-d7)，结构如式VIII所示：
判断是否患有冠状动脉疾病时，所选择的受试对象为来医院就诊的可能患者；
判断受试对象具有罹患冠状动脉疾病的风险时，所选择的受试对象为来医院就诊的潜在患者或进行体检的健康人；
健康人群样本总体指目前实验研究收录的所有健康人的样本的总和(健康人数在200个，都是经过常规检查确定无冠状动脉疾病史的人)，对每个健康人的样本或血液样本进行Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度的测定，测定方法可以按下方实施例中对受试者样本中的各项指标的测定方法相同，并换算出Cer(d18:1/16:0)/Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/18:0)/Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)/Cer(d18:1/24:0)比值。所有健康人的Cer(d18:1/16:0)浓度形成一组数据，并通过这组数据计算出健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度的中位数和四分位数间距，即计算出健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度的50％分位值和75％分位值。同理，计算健康人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体Cer(d18:1/16:0)/Cer(d18:1/24:0)浓度比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体Cer(d18:1/18:0)/Cer(d18:1/24:0)浓度比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体Cer(d18:1/24:1)/Cer(d18:1/24:0)浓度比值的50％分位值和75％分位值。健康人群样本总体的各项指标值的50％分位值和75％分位值用于评价受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险。
标准人群样本总体指由目前实验研究收录的健康无冠状动脉疾病史的人的样本和具有稳定性冠状动脉疾病的人的样本组成，其中所述健康人的样本占标准人群样本总数的50％，(健康无冠状动脉疾病史的人的人数为200个，具有稳定性冠状动脉疾病的人的人数为200个)，对每个健康人的样本或血液样本进行Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度的测定，测定方法可以按下方实施例中对受试者样本中的各项指标的测定方法相同，并换算出Cer(d18:1/16:0)/Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/18:0)/Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)/Cer(d18:1/24:0)比值，对每个具有稳定性冠状动脉疾病的人的样本或血液样本进行Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度的测定，并换算出Cer(d18:1/16:0)/Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/18:0)/Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)/Cer(d18:1/24:0)比值。所有健康人和具有稳定性冠状动脉疾病的人的Cer(d18:1/16:0)浓度形成一组数据，并通过这组数据计算出标准人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度的中位数和四分位数间距，即计算出标准人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度的50％分位值和75％分位值。同理，计算标准人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)/Cer(d18:1/24:0)浓度比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)/Cer(d18:1/24:0)浓度比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)/Cer(d18:1/24:0)浓度比值的50％分位值和75％分位值。标准人群样本总体的各项指标值的50％分位值和75％分位值用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价。
所述非神经酰胺类化合物的阈值可以采用已公开的数据，比如(TC):3.4-6.5mmol/L、(TG):0.3-1.8mmol/L、(LDL-C):0-3.36mmol/L、(apoB):0.6-1.1g/L、(LP(a)):0-30mg/L、(Lp-PLA2):0-200ng/ml、(HDL-C):1.0-1.6mmol/L、(apoA1):1.40-1.45g/L、(CRP):0.068-8.2mg/L、(CK-MB):0-25IU/L、(cTnT):0.02-0.13mg/L、肌钙蛋白I(cTnI):0-1ng/ml、(Mb):0-100μg/L。无论是用于评价受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险还是用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价，所述阈值都可以采用相同标准。
受试对象样本中的非神经酰胺类化合物浓度的测定可以采用常规方法，在此不再赘述。
以下通过不同实施例来说明具体说明用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于确定受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险的试剂盒中的应用；以及用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的试剂盒中的应用。或者说用如下具体实施例来说明本发明试剂盒的内含物和使用方法，或者说用如下具体实施例来说明利用神经酰胺分子(Cer(d18:1/16:0)，Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:1/24:1))及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值来确定可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险的方法以及对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价。
实施例1：受试者样品采集、保存与运输
用于采集受试者样品的试剂和试验用品可以包含在本发明的试剂盒中，比如下方使用到的EDTA抗凝管(紫色盖)。
(1)样本采集
通过静脉采血采集受试对象的血液3ml，采血后6小时内采用离心沉淀法(离心条件为：1300g,10min)分离出血浆；优选地，首选采用EDTA抗凝管(紫色盖)来分离血浆。
(2)样本保存
如果不能立即用于检测，须将分离出的血浆置于2-8℃或-20℃避光保存。
(3)样本运输
在4℃蓝冰的条件下运输血浆。
实施例2：在LC-MS/MS检测前对实施例1采集的血浆样品进行预处理(蛋白质快速沉淀法)
用于对血浆样品进行预处理的试剂和试验用品可以包含在本发明的试剂盒中，比如：蛋白质沉淀(PPT)溶剂：乙酸乙酯：异丙醇(2:8，v/v)，本发明的试剂盒中还可以包括：用于制作Cer(d18:1/16:0)，Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)和Cer(d18:1/24:0)四种神经酰胺的标准曲线的四种神经酰胺纯品(市售产品)或者由甲醇溶剂配制的四种神经酰胺纯品存储溶液(存储溶液的浓度可以为500pmol/μl)；采用甲醇溶剂配制的四种神经酰胺内标(IS，即四种神经酰胺相应氘代物)溶液，其浓度分别为D7-Cer d18:1/16:0：0.125pmol/μl，D7-Cer d18:1/18:0 0.05pmol/μl，D7-Cer d18:1/24:0：1.5pmol/μl，D7-Cer d18:1/24:1：0.5pmol/μl；质控品(QC)：新鲜冻存混合血浆(FFP，Fresh frozen pooled plasma)，具体地，该混合血浆质控品是具有稳定心脏病史的病人400例(2ml/人)的血浆混合而成的血盘；基质空白对照：人血浆，具体地，该人血浆是无心脏病史的健康人200例的血浆混合而成的血盘。另外，下方的预处理方法也可以记载于本申请试剂盒的说明书上。
将实施例1采集的血浆样品在4℃内解冻并恢复到室温后进行如下预处理，除了实施例1采集的血浆样品采用如下方法进行预处理以外，用于制备标准曲线的由四种神经酰胺纯品存储溶液稀释后的四种神经酰胺纯品工作液、质控品、基质空白对照在进行LC-MS/MS分析前也需要做如下预处理：将等量(通常为10μl)的四种神经酰胺纯品的工作液(以5％的BSA作为稀释剂稀释四种神经酰胺纯品存储溶液得到的，浓度均为1pmol/μl)、质控品(QC)、基质空白对照或受试者的血浆样品加到96孔板内(2ml/孔)，然后分别向四种神经酰胺纯品的工作液、质控品(QC)、基质空白对照(10μl)或研究样本(即受试者的血浆样品)加入四种神经酰胺内标(IS)的混合物(四种神经酰胺内标溶液等体积混合，共计20μl)，再向其中加入蛋白质沉淀(PPT)溶剂，每个孔中的混合溶液的最终体积为600μl。各孔中混合溶液混合10分钟后在3,000g条件下离心10分钟。然后将上清转移到Eppendorf的PCR 96孔板内，在进行LC-MS/MS分析检测之前，用热密封箔片(Hamburg,Germany)密封。
实施例3：LC-MS/MS检测分析条件优化。
本实施例得到优化后的LC-MS/MS检测分析条件以及采用的设备可以记载于本申请试剂盒的说明书上。或者/和将优化LC-MS/MS检测分析条件所需的试剂作为本发明试剂盒中试剂的一部分。
LC-MS/MS分析是在一个与Thermo SCIENTIFIC UPLC Ultimate3000相结合的Thermo SCIENTIFIC TSQ Quantitative质谱仪上进行。在阳离子模式下的电喷雾电离化(ESI)采用多反应监测(MRM)。使用Thermo SCIENTIFIC TSQ Quantitative配套软件控制仪器和数据采集。
在对受试者血浆样品进行检测工作之前，对检测条件进行了综合优化，以获得Cerd18:1/16:0、D7-Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、D7-Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:0、D7-Cer d18:1/24:0、Cer d18:1/24:1、D7-Cer d18:1/24:1的最佳质谱仪条件分析，分析条件的优化是1pmol/μl神经酰胺标准品溶液(即以5％的BSA作为稀释剂稀释四种神经酰胺纯品存储溶液得到的四种神经酰胺纯品工作液，浓度均为1pmol/μl)在20μl/min条件下进行的(四种神经酰胺标准品溶液分别进行)。以下为优化后的参数：汽化温度，320℃；离子传输管温度，350℃；气帘气压，40Arb；补充气压，15Arb；残气，0Arb；正离子电压，3500V；扫描模式，SRM。色谱分离是在Waters CORTECS UPLC C18,2.1mm*50mm*1.6μm的色谱柱进行的。温度设定在40℃。流动相包括(A)40％10mM醋酸铵溶液(溶剂为LC-MS级水)和60％的乙腈，(B)90％的异丙醇和10％的乙腈。注入体积为1μl，流量设置为0.3ml/min。应用以下梯度：0到0.5分钟，A/B(65/35％)；0.5到1.5分钟，A/B(65/35％)；1.5到3.6分钟，A/B(2/98％)；3.6到3.7分钟，A/B(2/98％)；3.7到5分钟，A/B(65/35％)。
利用LC-MS/MS分析方法得到的Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的产物离子谱参见附图1，图中标明了出峰时间(横坐标)、峰强度(纵坐标)以及荷质比。
实施例4：校准曲线(又称标准曲线)的制作。
本发明的试剂盒中可以包括用于制作校准曲线的试剂比如5％的BSA(牛血清蛋白)。
制作校准线的四种神经酰胺纯品的工作液(标准品溶液)是采用连续稀释法以5％的BSA(牛血清蛋白)作为稀释剂稀释四种神经酰胺纯品Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的存储溶液得到的。由于在人血浆中存在内源性脂质和无脂质血浆基质，因此，为了增加检测结果的准确性，用于制作校准线的四种神经酰胺纯品的工作液用5％的BSA(牛血清蛋白)制备。实验的线性度是通过每种神经酰胺的六个不同浓度来确定的。Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0的校准线点的浓度为0.008、0.01、0.02、0.1、1和2pmol/μl，Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的校准线点的浓度为0.08、0.1、0.2、1、10和20pmol/μl，也就是说，每种神经酰胺纯品工作液包括六种不同浓度，同时以水作为完全空白对照，人血浆(该人血浆是无心脏病史的健康人200例的血浆混合而成的血盘)作为基质空白对照，在利用LC-MS/MS分析前，这六种不同浓度的神经酰胺纯品工作液、完全空白对照、基质空白对照均需要按照实施例2的预处理方法进行预处理，然后，再按照实施例3记载的条件进行LC-MS/MS分析，利用LC-MS/MS分析方法得到的Cerd18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的校准点对应的质谱信号峰面积结果参见附图2-5，图2～5的横坐标代表相应神经酰胺的浓度(pmol/μl)，纵坐标代表质谱信号峰面积。本实施例得到的校准线可以用于查询受试者血浆样本中相应神经酰胺的浓度。
在每个试验中，两个校准线集包含了所有4个四种神经酰胺分析物。所有的校准曲线都以1/x2(浓度平方的倒数)加权，将校准线集中到校准线的低点，从而减少了在低浓度下的定量误差。
由于在人血浆中存在内源性神经酰胺，不知其具体含量，所以无法作为基质溶解确定浓度的神经酰胺纯品后画出校准曲线，也就是说，不能采用人血浆去稀释四种神经酰胺的存储溶液得到相应神经酰胺的标准品溶液，所以校准线标准品溶液的制备只能退而求其次用5％的BSA(牛血清蛋白)制备。但是5％的BSA和人血浆基质毕竟是不同的，为了证明我们在5％BSA中做出的校准曲线可以作为以后在人血浆中测得的神经酰胺浓度的参考，所以检测了校准线的平行度。对5％BSA的标准品溶液和人血浆进行了评估。从人血浆样品(该人血浆是无心脏病史的健康人200例的血浆混合而成)中获得的校准线与上述5％BSA的校准线进行比较。其中，人血浆样品制作的标准线上的校准线点分别是：用5％的BSA稀释人血浆样本2-3倍以获得较低的校准点，未稀释的人血浆样本代表中间点，而体积浓缩为原人血浆样本体积的三分之一至二分之一时的样本代表高点。用这两条线斜率的95％置信区间的重叠来表明它们的平行度。结果表明二者平行度良好，说明采用5％BSA作为标准品溶液的稀释剂是可行的，5％BSA中做出的校准曲线可以作为以后在人血浆中测得的神经酰胺浓度的参考。
实施例5：质量控制。
本发明的试剂盒中可以包括用于质量控制的试剂，比如FFP。
利用新鲜冻存混合血浆(FFP，Fresh frozen pooled plasma，该混合血浆质控品是具有稳定心脏病史的病人400例(2ml/人)的血浆混合而成的血盘)用来代表质量控制样品。为了确定每个神经酰胺的内源性浓度，重复6次提取(按照实施例2的预处理方法)和分析(按照实施例3的分析方法)未处理的FFP。具体地，未处理的FFP代表中间质量控制(MQC)，低质量控制(LQC，用水稀释中间质量控制2倍来制备)，以及下限量化质量控制(LLOQ，用水稀释中间质量控制3倍来制备)，高质量控制(HQC，向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品以使其浓度均为0.1pmol/μl，加入Cer d18:1/24:0、Cerd18:1/24:1神经酰胺纯品以使其浓度均为1pmol/μl)和上限量化质量控制(ULOQ，向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品以使其浓度均为0.15pmol/μl；，加入Cer d18:1/24:0、Cer d18:1/24:1神经酰胺纯品以使其浓度均为1.5pmol/μl)是通过向未处理的FFP中加入添加神经酰胺纯品或溶液制备的。在对上述质量控制品进行LC-MS/MS分析前采用实施例2的方法对其进行预处理，预处理后采用实施例3的条件进行LC-MS/MS分析。
利用LC-MS/MS分析方法得到的Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的ULOQ、HQC、MQC、LQC、LLOQ质量控制品精密度结果参见附图6-10。图6～10显示试验准确度，通过多次检测线性范围内的5种不同浓度的样品，观察其检测结果的变异系数(CV％)，判断试验准确度，其中Area Ratio是指神经酰胺与其相应的氘代物内标准品(IS)的峰面积比值。在对受试者血浆样品进行LC-MS/MS分析的同时设置质量控制，质量控制的目的是为了排除检测过程中因为仪器不正常和人员操作失误导致的结果不可信的情况。
实施例6：本发明四种神经酰胺浓度检测方法的萃取回收率分析。
将四种神经酰胺存储溶液加入到原始的人血浆(即受试者的血浆)中，使其最终浓度分别为：Cer d18:1/16:0：0.10pmol/μl，Cer d18:1/18:0：0.25pmol/μl，Cer d18:1/24:0：1.0pmol/μl，Cer d18:1/24:1：2.5pmol/μl。然后按照实施例2的方式对其进行预处理，再采用实施例3的条件对预处理后的样品进行LC-MS/MS分析，利用分析结果通过校准曲线查找到Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的检测浓度，相对于原始人血浆四种神经酰胺浓度的增减量除以实际加入原始人血浆后四种神经酰胺的浓度来估计萃取回收率。
利用LC-MS/MS分析方法得到的Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的萃取回收率结果参见附图11。图11表明，通过本发明方法可以将血浆中的这几种神经酰胺几乎全部萃取出来进行上机检测，证明本试验采用的萃取方法很好。进行萃取回收率实验主要是为了检测血浆样本中多少比例的神经酰胺可以上机检测。
实施例7：辅助诊断是否患有冠状动脉疾病的临床试验。
临床试验被试入组条件：
稳定性心绞痛组：可由运动或其他增加心肌需氧量的情况诱发短暂的胸痛(<10分钟)，休息或舌下含服硝酸甘油可迅速缓解症状的心绞痛，入院前6个月没有病情恶化或在静息状态下发生心绞痛，需要冠状动脉造影检查作为金标准进行确诊，共计50为受试者；
对照组(即形成健康人群样本的组)：年龄、性别配对的志愿者(男女各一半，年龄分布在20-70岁之间)，无任何心血管疾病或其他长期疾病的病史或没有临床症状或生化指标指示心血管疾病或其他长期疾病的志愿者，共计200名志愿者。
排除条件：
(a)肾功能衰竭(肌酐清除率<15ml/min)；
(b)随机分组前12个月出现严重胃肠道出血；
(c)有颅内出血病史；
(d)其他疾病可能直接影响药物选择或测试结果。
样品采集、保存与运输方法具体参见实施例1所述，样品预处理具体参见实施例2所述，LC-MS/MS分析具体见实施例3所述。
健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)的中位数和四分位数间距(50％分位值和75％分位值)：通过正常对照组中各个人的Cer(d18:1/16:0)浓度汇总计算出该对照组中全部Cer(d18:1/16:0)浓度的中位数和四分位数间距；
健康人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)的中位数和四分位数间距(50％分位值和75％分位值)：通过正常对照组中各个人的Cer(d18:1/18:0)浓度汇总计算出该对照组中全部Cer(d18:1/18:0)浓度的中位数和四分位数间距；
健康人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)的中位数和四分位数间距(50％分位值和75％分位值)：通过正常对照组中各个人的Cer(d18:1/24:1)浓度汇总计算出该对照组中全部Cer(d18:1/24:1)浓度的中位数和四分位数间距；
健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的中位数和四分位数间距(50％分位值和75％分位值)：通过正常对照组中各个人的Cer(d18:1/16:0)与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值汇总计算出该对照组中全部Cer(d18:1/16:0)与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的中位数和四分位数间距；
健康人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的中位数和四分位数间距(50％分位值和75％分位值)：通过正常对照组中各个人的Cer(d18:1/18:0)与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值汇总计算出该对照组中全部Cer(d18:1/18:0)与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的中位数和四分位数间距；
健康人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的中位数和四分位数间距(50％分位值和75％分位值)：通过正常对照组中各个人的Cer(d18:1/24:1)与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值汇总计算出该对照组中全部Cer(d18:1/24:1)与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的中位数和四分位数间距；
将受试对象的血浆样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与健康人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分。按照所述六项检测指标的总得分7分以上(包括7分)时，判断受试对象患有冠状动脉疾病，然后通过冠状动脉造影检查作为金标准进行确诊。
结果参见附图12，对于Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的六项检测指标值，稳定性心绞痛组的均值均高于正常对照组的均值，由此确定上述六项检测指标值与冠状动脉疾病有很高的关联性。另外，通过本发明试剂盒和方法对受试对象的诊断结果与经过冠状动脉造影检查的结果基本一致，由此确定，本发明的方法对冠状动脉疾病的诊断准确度高。
实施例8：判断罹患冠状动脉疾病风险的临床试验。
临床试验被试入组条件：
受试对象：以社区或社团为基础，选择未患或未患过冠状动脉疾病的50岁以上60岁以下的健康人作为研究队列，共70人。
正常对照组(即形成健康人群样本的组)：年龄、性别配对的志愿者(男女各一半，年龄分布在20-70岁之间)，无任何心血管疾病或其他长期疾病的病史或没有临床症状或生化指标指示心血管疾病或其他长期疾病的志愿者，共计200名志愿者。
排除条件：
(a)肾功能衰竭(肌酐清除率<15ml/min)；
(b)随机分组前12个月出现严重胃肠道出血；
(c)有颅内出血病史；
(d)其他疾病可能直接影响药物选择或测试结果。
研究终点：
被试者因心血管相关疾病死亡，明确诊断为动脉粥样硬化、稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、非ST段抬高心肌梗死和ST段抬高心肌梗死。
样品采集、保存与运输方法具体参见实施例1所述，样品预处理具体参见实施例2所述，LC-MS/MS分析具体见实施例3所述。
将受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与健康人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对受试对象具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分。在判断罹患冠状动脉疾病的风险时，当所述六项检测指标的总得分为0-2分时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分为3-6分时，判断为中等风险；当所述六项检测指标的总得分为7-9分时，判断为较高风险；当所述六项检测指标的总得分为10-12分时，判断为高风险。
结果参见附图13。
实施例9：对冠状动脉疾病患者进行危险分层的临床试验。
临床试验被试入组条件：
以医院为基础，选择确诊的稳定性心绞痛和急性冠状动脉综合征(包括不稳定性心绞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死)作为研究队列。(注：所有的病例确诊都进行冠状动脉造影检查)。
1)稳定性心绞痛组：可由运动或其他增加心肌需氧量的情况诱发短暂的胸痛(<10分钟)，休息或舌下含服硝酸甘油可迅速缓解症状，入院前6个月没有病情恶化或在静息状态下发生心绞痛；
2)不稳定性心绞痛：入院前24小时内在静息状态下发生心绞痛，胸痛发作时心电图出现至少2个相邻导联ST段压低≥0.1mV，或一过性至少2个相邻导联ST段升高≥0.1mV(<30分钟)，心肌损伤标记物(肌酸激酶CK、肌酸激酶同工酶CK-MB、心脏特异的肌钙蛋白cTNT和cTNI、肌红蛋白)在正常范围内；
3)非ST段抬高心肌梗死组：入院前24小时内在静息状态下发生心绞痛，胸痛发作时心电图出现至少2个相邻导联ST段压低≥0.1mV，或一过性至少2个相邻导联ST段升高≥0.1mV(<30分钟)，心肌损伤标记物(肌酸激酶CK、肌酸激酶同工酶CK-MB、心脏特异的肌钙蛋白cTNT和cTNI、肌红蛋白)升高(增高或增高后降低，至少有一次数值超过参考值上限的99百分位)；
4)ST段抬高心肌梗死组：持续剧烈胸痛>30分钟，含服硝酸甘油不缓解，相邻两个或两个以上导联心电图ST段抬高≥0.1mV，心肌损伤标记物(肌酸激酶CK、肌酸激酶同工酶CK-MB、心脏特异的肌钙蛋白cTNT和cTNI、肌红蛋白)异常升高；
排除条件：
1)肾功能衰竭(肌酐清除率<15ml/min)；
2)随机分组前12个月出现严重胃肠道出血；
3)有颅内出血病史；
4)残疾；
5)痴呆等导致无法理解研究；
6)由于非心血管相关疾病预计生命不超过1年的患者。
7)其他疾病可能直接影响药物选择或测试结果。
研究终点：
被试者因心血管死亡(心源性猝死、致死性心肌梗塞、充血性心脏衰竭死亡、缺血性心脏病死亡、干预治疗冠心病后立刻死亡、致死性中风、其他由于心脏疾病引发的死亡)。
样品采集、保存与运输方法具体参见实施例1所述，样品预处理方法具体参见实施例2所述，LC-MS/MS分析具体见实施例3所述。
将受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与标准人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于标准人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分。在进行危险分层时，当所述六项检测指标的总得分为0-2分时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分为3-6分时，判断为中等风险；当所述六项检测指标的总得分为7-9分时，判断为较高风险；当所述六项检测指标的总得分为10-12分时，判断为高风险。
结果参见附图14。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于确定可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险的试剂盒中的应用，所述冠状动脉疾病标志物包括Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)，所述浓度比值是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度分别与Cer(d18:1/24:0)的浓度的比值；优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。
2.用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的试剂盒中的应用，所述冠状动脉疾病标志物包括Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)，所述浓度比值是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度分别与Cer(d18:1/24:0)的浓度的比值；优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，确定所述来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度的方法为蛋白快速沉淀的方法和LC-MS/MS的方法；优选地，所述样品为血液、血浆或血清。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述冠状动脉疾病标志物还包括非神经酰胺类化合物，所述非神经酰胺类化合物为总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白颗粒数目、致密的低密度脂蛋白、载脂蛋白B、脂蛋白a、脂蛋白磷脂酶A2、高密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白颗粒数目、致密的高密度脂蛋白、载脂蛋白A1、C反应蛋白、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、肌红蛋白中的一种或多种。
5.一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒，其特征在于，包括：
用于检测受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)浓度的检测试剂、以及说明书；
针对所述受试对象为可能或潜在患病受试对象，所述说明书中包括：健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，以及利用受试对象的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度检测结果确定可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或者具有罹患冠状动脉疾病的风险的方法，其中所述方法具体如下：
将所述可能或潜在患病受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与健康人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价；
当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分；
在判断受试对象是否患有冠状动脉疾病时，当所述六项检测指标的总得分等于或大于7分时，判断受试对象患有冠状动脉疾病；
在判断受试对象罹患冠状动脉疾病的风险时，当所述六项检测指标的总得分为0-2分时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分为3-6分时，判断为中等风险；当所述六项检测指标的总得分为7-9分时，判断为较高风险；当所述六项检测指标的总得分为10-12分时，判断为高风险；
针对所述受试对象为正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象，所述说明书中包括：标准人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，以及利用受试对象的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度检测结果对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的方法，其中所述方法具体如下：
将所述正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与标准人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价，所述标准人群样本由健康人的样本和具有稳定性冠状动脉疾病的人的样本组成，其中所述健康人的样本占标准人群样本总数的50％；
当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分；
在对所述受试对象进行危险分层评价时，当所述六项检测指标的总得分为0-2分时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分为3-6分时，判断为中等风险；当所述六项检测指标的总得分为7-9分时，判断为较高风险；当所述六项检测指标的总得分为10-12分时，判断为高风险；
在对所述受试对象进行病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价时，对比所述受试对象在治疗前和治疗后的所述六项检测指标的总得分；当治疗后所述受试对象的六项检测指标的总得分大于治疗前所述受试对象的六项检测指标的总得分，则判定该受试对象的病情进展和/或疗效较差，或判定所述候选治疗药物疗效较差；当治疗后所述受试对象的六项检测指标的总得分小于治疗前所述受试对象的六项检测指标的总得分，则判定该受试对象的病情进展和/或疗效较好，或判定所述候选治疗药物疗效较好；
优选地，所述说明书中还包括：Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度的检测方法；进一步优选地，所述检测方法是蛋白快速沉淀的方法和LC-MS/MS的方法；所述样品优选为血液、血浆或血清。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测所述受试对象的样品中的非神经酰胺类化合物的浓度的试剂，所述非神经酰胺类化合物为总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白颗粒数目、致密的低密度脂蛋白、载脂蛋白B、脂蛋白a、脂蛋白磷脂酶A2、高密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白颗粒数目、致密的高密度脂蛋白、载脂蛋白A1、C反应蛋白、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、肌红蛋白中的一种或多种；优选地，所述说明书中还包括：所述非神经酰胺类化合物浓度的检测方法，以及所述非神经酰胺类化合物的阈值；
更优选地，针对所述受试对象为可能或潜在患病受试对象，所述说明书还包括：综合利用Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度以及非神经酰胺类化合物的浓度检测结果确定所述可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险的方法，其中，所述具体如下：
将所述可能或潜在患病受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与健康人群样本总体的相应指标值进行比较、评分；然后，将所述非神经酰胺类化合物的浓度与所述阈值进行比较；根据分值范围和比较结果对所述可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价；
当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分；
在判断受试对象是否患有冠状动脉疾病时，当所述六项检测指标的总得分等于或大于7分时，且所述非神经酰胺类化合物的浓度达到或超过所述阈值，则判定受试对象患有冠状动脉疾病；
在判断罹患冠状动脉疾病的风险时：
当所述六项检测指标的总得分超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度超过所述阈值时，判断为高风险；当所述六项检测指标的总得分未超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度未超过所述阈值时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度未超过所述阈值、或者所述六项检测指标的总得分未超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度超过所述阈值(即判断相反)时，判断为中风险，需要进一步检测；
进一步优选地，针对所述受试对象为正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象，所述说明书还包括：综合利用受试对象Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度以及非神经酰胺类化合物的浓度检测结果对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层价的方法，其中，所述方法具体如下：
将正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与所述标准人群样本总体的相应指标值进行比较、评分；然后，将所述非神经酰胺类化合物的浓度与所述阈值进行比较；根据分值范围和比较结果对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层；
当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分；
在对所述受试对象进行危险分层评价时，当所述六项检测指标的总得分超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度超过所述阈值时，判断为高风险；当所述六项检测指标的总得分未超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度未超过所述阈值时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度未超过所述阈值、或者所述六项检测指标的总得分未超过7分且所述非神经酰胺类化合物的浓度超过所述阈值(即判断相反)时，判断为中风险，需要进一步检测。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，
所述用于检测受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)浓度的检测试剂包括：
所述受试对象的样本的预处理试剂，优选包括：蛋白质沉淀溶剂，所述蛋白质沉淀溶剂优选是体积比为2:8的乙酸乙酯和异丙醇的混合物；
用于制作Cer(d18:1/16:0)，Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)和Cer(d18:1/24:0)四种神经酰胺的标准曲线的试剂，优选包括：四种神经酰胺纯品或四种神经酰胺纯品存储溶液、5％的BSA稀释剂；
D7‐Cer(d18:1/16:0)、D7‐Cer(d18:1/18:0)、D7‐Cer(d18:1/24:0)、D7‐Cer(d18:1/24:1)四种神经酰胺内标纯品或溶液，优选地，四种神经酰胺内标溶液的浓度分别为D7‐Cerd18:1/16:0：0.125pmol/μl，D7‐Cer d18:1/18:0 0.05pmol/μl，D7‐Cer d18:1/24:0：1.5pmol/μl，D7‐Cer d18:1/24:1：0.5pmol/μl。
8.根据权利要求5‐7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
质控品为新鲜冻存混合血浆质控品，所述混合血浆质控品是有稳定心脏病史的多位病人的血浆混合而成的血盘；
优选地，所述混合血浆质控品包括：
中间质量控制：未处理的FFP；
低质量控制：用水稀释中间质量控制2倍来制备；
下限量化质量控制：用水稀释中间质量控制3倍来制备；
高质量控制：向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品或溶液使Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0的浓度达到0.1pmol/μl，且加入Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1神经酰胺纯品或溶液使Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的浓度达到1pmol/μl；和
上限量化质量控制：向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品或溶液以使Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0浓度达到0.15pmol/μl，且加入Cerd18:1/24:0和Cer d18:1/24:1神经酰胺纯品或溶液以使Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1浓度达到1.5pmol/μl。
9.根据权利要求5-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。
10.根据权利要求5-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
基质空白对照：人血浆，所述人血浆是无心脏病史的多位健康人的血浆混合而成的血盘；
优选地，所述试剂盒还包括：用于采集血液样本的容器，并且所述容器中包含EDTA-K2、EDTA-K3或肝素；优选地，所述容器为包含EDTA-K2的采血管。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711338605.1A CN108037275A (zh) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒 |
| CN202111345567.9A CN114062581A (zh) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711338605.1A CN108037275A (zh) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111345567.9A Division CN114062581A (zh) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108037275A true CN108037275A (zh) | 2018-05-15 |
Family
ID=62103207
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111345567.9A Pending CN114062581A (zh) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒 |
| CN201711338605.1A Pending CN108037275A (zh) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111345567.9A Pending CN114062581A (zh) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN114062581A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110111859A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-08-09 | 嘉兴迈维代谢生物科技有限公司 | 一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯lc-ms/ms数据库的方法 |
| CN111595993A (zh) * | 2020-02-26 | 2020-08-28 | 江苏豪思睦可生物科技有限公司 | 高通量液相色谱串联质谱检测4种神经酰胺的方法 |
| CN111830142A (zh) * | 2019-04-23 | 2020-10-27 | 北京市心肺血管疾病研究所 | 神经酰胺在制备用于评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒中的应用 |
| CN112730638A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-04-30 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 糖尿病合并心梗代谢标志物、检测试剂及试剂盒 |
| CN113782177A (zh) * | 2020-12-02 | 2021-12-10 | 北京市心肺血管疾病研究所 | 一种用于鉴别诊断冠心病患者斑块稳定性的数据处理装置、系统 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116500179B (zh) * | 2023-04-21 | 2023-12-26 | 南京品生医疗科技有限公司 | 一种血浆中神经酰胺相关因子的原始得分计算及转换方法和系统 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102757954A (zh) * | 2012-06-07 | 2012-10-31 | 中国医学科学院阜外心血管病医院 | 与冠心病相关的多个基因单核苷酸多态性位点组合及其应用 |
| CN102971633A (zh) * | 2010-05-05 | 2013-03-13 | 佐拉生物科学公司 | 针对动脉粥样硬化和心脏血管疾病的脂质组学生物标志 |
| CN103154742A (zh) * | 2010-06-20 | 2013-06-12 | 佐拉生物科学公司 | 用于鉴定高风险冠状动脉疾病患者的脂质组学标志 |
| CN103917876A (zh) * | 2011-11-08 | 2014-07-09 | 佐拉生物科学公司 | 用于预测未接受他汀药物治疗的冠状动脉疾病患者的心血管后果的脂质组学生物标志 |
| CN104508488A (zh) * | 2012-05-25 | 2015-04-08 | 佐拉生物科学公司 | 针对前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin 9抑制的灵敏的功效性和特异性生物标志 |
| CN106461685A (zh) * | 2014-06-16 | 2017-02-22 | 佐拉生物科学公司 | 神经酰胺及其在诊断cvd中的应用 |
| US20170160264A1 (en) * | 2015-12-07 | 2017-06-08 | Zora Biosciences, Oy | USE OF CERAMIDES AND LPLs IN DIAGNOSING CVD |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105853482A (zh) * | 2015-01-21 | 2016-08-17 | 熊慧 | 人参总次苷在制备治疗和/或预防心肌缺血后脂质代谢异常的药物中的应用 |
-
2017
- 2017-12-14 CN CN202111345567.9A patent/CN114062581A/zh active Pending
- 2017-12-14 CN CN201711338605.1A patent/CN108037275A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102971633A (zh) * | 2010-05-05 | 2013-03-13 | 佐拉生物科学公司 | 针对动脉粥样硬化和心脏血管疾病的脂质组学生物标志 |
| CN103154742A (zh) * | 2010-06-20 | 2013-06-12 | 佐拉生物科学公司 | 用于鉴定高风险冠状动脉疾病患者的脂质组学标志 |
| CN103917876A (zh) * | 2011-11-08 | 2014-07-09 | 佐拉生物科学公司 | 用于预测未接受他汀药物治疗的冠状动脉疾病患者的心血管后果的脂质组学生物标志 |
| CN104508488A (zh) * | 2012-05-25 | 2015-04-08 | 佐拉生物科学公司 | 针对前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin 9抑制的灵敏的功效性和特异性生物标志 |
| CN102757954A (zh) * | 2012-06-07 | 2012-10-31 | 中国医学科学院阜外心血管病医院 | 与冠心病相关的多个基因单核苷酸多态性位点组合及其应用 |
| CN106461685A (zh) * | 2014-06-16 | 2017-02-22 | 佐拉生物科学公司 | 神经酰胺及其在诊断cvd中的应用 |
| US20170160264A1 (en) * | 2015-12-07 | 2017-06-08 | Zora Biosciences, Oy | USE OF CERAMIDES AND LPLs IN DIAGNOSING CVD |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| AKI S. HAVULINNA等: "Circulating Ceramides Predict Cardiovascular Outcomes in the Population-Based FINRISK 2002 Cohort", ARTERIOSCLER THROMB VASC BIOL, vol. 36, no. 12, pages 2424 - 2430, XP055543479, DOI: 10.1161/ATVBAHA.116.307497 * |
| DIMPLE KAUHANEN等: "Development and validation of a high-throughput LC–MS/MS assay for routine measurement of molecular ceramides", ANAL BIOANAL CHEM, vol. 408, pages 3475 - 3483, XP035867729, DOI: 10.1007/s00216-016-9425-z * |
| PANAGIOTIS A. VORKAS等: "Untargeted UPLC-MS Profiling Pipeline to Expand Tissue Metabolome Coverage: Application to Cardiovascular Disease", ANAL. CHEM., vol. 87, pages 4184 * |
| REIJO LAAKSONEN等: "Plasma ceramides predict cardiovascular death in patients with stable coronary artery disease and acute coronary syndromes beyond LDL-cholesterol", EUROPEAN HEART JOURNAL, vol. 37, pages 1967, XP055658292, DOI: 10.1093/eurheartj/ehw148 * |
| REIJO LAAKSONEN等: "Plasma Ceramides Predict Residual Cardiovascular Death Risk in Optimally Statin Treated Patients With Stable Coronary Artery Disease", JOURNAL OF CLINICAL LIPIDOLOGY, vol. 11, no. 3, pages 775, XP085021202, DOI: 10.1016/j.jacl.2017.04.009 * |
| 赵娟等: "冠状动脉疾病的代谢组学特点及其诊断价值", 中国循证心血管医学杂志, vol. 9, no. 9, pages 1112 - 1117 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110111859A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-08-09 | 嘉兴迈维代谢生物科技有限公司 | 一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯lc-ms/ms数据库的方法 |
| CN110111859B (zh) * | 2019-02-27 | 2021-05-04 | 嘉兴迈维代谢生物科技有限公司 | 高通量建立甘油三酯lc-ms/ms数据库的方法 |
| CN111830142A (zh) * | 2019-04-23 | 2020-10-27 | 北京市心肺血管疾病研究所 | 神经酰胺在制备用于评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒中的应用 |
| CN111595993A (zh) * | 2020-02-26 | 2020-08-28 | 江苏豪思睦可生物科技有限公司 | 高通量液相色谱串联质谱检测4种神经酰胺的方法 |
| CN112730638A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-04-30 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 糖尿病合并心梗代谢标志物、检测试剂及试剂盒 |
| CN112730638B (zh) * | 2020-11-25 | 2022-07-29 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 糖尿病合并心梗代谢标志物、检测试剂及试剂盒 |
| CN113782177A (zh) * | 2020-12-02 | 2021-12-10 | 北京市心肺血管疾病研究所 | 一种用于鉴别诊断冠心病患者斑块稳定性的数据处理装置、系统 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114062581A (zh) | 2022-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108037275A (zh) | 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒 | |
| Zimmerli et al. | Urinary proteomic biomarkers in coronary artery disease | |
| Griffin et al. | Metabolomics as a tool for cardiac research | |
| Guo et al. | Quantitative proteomic and functional analysis of liver mitochondria from high fat diet (HFD) diabetic mice | |
| Rolim et al. | Lipidomics in the study of lipid metabolism: Current perspectives in the omic sciences | |
| US9863965B2 (en) | Lipidomic biomarkers for the prediction of cardiovascular outcomes in coronary artery disease patients not undergoing statin treatment | |
| Lazar et al. | High‐Sensitivity Troponin: A Review on Characteristics, Assessment, and Clinical Implications | |
| CN108445241B (zh) | 用于鉴定高风险冠状动脉疾病患者的脂质组学标志 | |
| US11940453B2 (en) | Ceramides and their use in diagnosing CVD | |
| Earley et al. | Cytochrome p-450 epoxygenase products contribute to attenuated vasoconstriction after chronic hypoxia | |
| Zhou et al. | Comprehensive metabolomic and proteomic analyses reveal candidate biomarkers and related metabolic networks in atrial fibrillation | |
| Fraser et al. | Plasma biomarkers and identification of resilient metabolic disruptions in patients with venous thromboembolism using a metabolic systems approach | |
| Nijmeijer et al. | Secretory type II phospholipase A2 binds to ischemic myocardium during myocardial infarction in humans | |
| US20120171705A1 (en) | Combination of spla2 activity and oxpl/apob cardiovascular risk factors for the diagnosis/prognosis of a cardiovascular disease/event | |
| Corso et al. | Development and validation of an enzymatic method for total cholesterol analysis using whole blood spot | |
| Huang et al. | Serum VEGF: diagnostic value of acute coronary syndrome from stable angina pectoris and prognostic value of coronary artery disease | |
| Al-Thihli et al. | Performance of serum and dried blood spot acylcarnitine profiles for detection of fatty acid β-oxidation disorders in adult patients with rhabdomyolysis | |
| Song et al. | Identification of DGAT2 inhibitors using mass spectrometry | |
| Bobin-Dubigeon et al. | Paired measurement of serum amyloid A (SAA) and paraoxonase 1 (PON1) as useful markers in breast cancer recurrence | |
| Fan et al. | C-reactive protein as a predictor for poor collateral circulation in patients with chronic stable coronary heart disease | |
| KR101565889B1 (ko) | 혈장 대사체를 이용한 혈관경직도 예측 또는 진단 방법 | |
| Baldassarre et al. | Old and New Biomarkers Associated with Endothelial Dysfunction in Chronic Hyperglycemia | |
| CN114137193A (zh) | 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒及其应用 | |
| Koyuncu et al. | Rapid and sensitive determination of carnitine profiling by tandem mass spectrometry can be a diagnostic marker of paroxysmal atrial fibrillation | |
| Namazi et al. | Association of the total cholesterol content of erythrocyte membranes with the severity of disease in stable coronary artery disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20180731 Address after: 225312 Taizhou City, Jiangsu Province, China Pharmaceutical Chengkou Tai Road west, east of Lujia Road, 0009 building G75 east of the third floor Applicant after: Jiangsu HAOSI Biotechnology Co. Ltd. Address before: 100094 1, 115, 117, 123, 125 rooms, 1 building, 538 Yongfeng Tun, Haidian District, Beijing. Applicant before: Beijing HAOSI Biotechnology Co. Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |