CN108034704A - 应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切优化方法，包括提取细胞核、酶切反应、回收DNA片段、数据预处理和可靠性检验。首先，对组织的细胞核的前期收集方法进行改进，并通过细胞核的数量，优化酶切反应条件，提高了DNase I的酶切效率。其次，采用DNase I的酶切方法与高通量方法的结合，不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低由于前期研磨样本产生的假阳性，能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点，提高了临床样本的研究进程。最后，还对高通测序数据的可靠性进行检验。

Description

应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，尤其涉及应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切优化方法。
背景技术
在上世纪八十年代初期，研究人员就发现当一个基因处于转录活性状态时，含有这个基因的染色质区域对脱氧核糖核酸酶(DNase I)降解的敏感性要比无转录活性区域高出100倍以上，即染色质对DNase I的敏感性与基因的转录有关，这个位点被称为DNase I超敏感位点，当时认为是真核生物某部分染色质处于开链或松散状态，容易被DNase I进行非特异性的降解所造成的。经过进一步研究发现具有功能的顺式作用元件，如启动子、增强子、抑制因子和绝缘子等都与DNase I超敏感位相偶联。
目前DNase-seq技术只在国外应用，并未在国内推广，并且该方法也只是用于细胞样本中，对于调控元件结合位点的研究也只限于细胞水平，没有很好的应用于临床。没有对临床样本的DNase I酶切优化方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种解决或部分解决上述问题的应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法。
为达到上述技术方案的效果，本发明的技术方案为：应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法，包括以下处理步骤：
步骤一：提取细胞核：
首先将收集的组织样本在冰浴中研磨成粉状；然后加入细胞核提取液并在冰上静置10分钟，细胞核提取液包括：10mM MgSO4，5mM KCl，0.5mM HEPES，1mg/L DDT，0.25wt％Triton-100，2wt％PVP40；再在冰上分别以孔径为100、50和20μm的尼龙膜过滤静置后的液体；而后将过滤后的液体在4℃下离心10分钟，除去上层清液得到悬浮物；最后将悬浮物加入到细胞核贮存液中，细胞核贮存液包括：10mM MgSO4，5mM KCl，0.5mM HEPES，1mg/L DDT；
步骤二：酶切反应：
首先在步骤一得到的液体中加入脱氧核糖核酸酶I，在37℃下孵育10分钟；然后加入与脱氧核糖核酸酶I等量的EDTA终止酶切反应；
步骤三：回收DNA片段：
首先将步骤二得到的液体加入到融化好的琼脂糖中，在55℃下孵育15分钟，琼脂糖的质量分数为1％；然后进行脉冲场电泳，条件为12小时，20～50秒切换，5v/cm，1wt％琼脂糖；再将电泳后的产物用T4DNA聚合酶缓冲液洗涤后，加入Tris缓冲液，在65℃下孵育10分钟，融化凝胶；最后回收融化凝胶中的DNA；
步骤四：数据预处理：
首先将步骤三回收的DNA进行高通量测序得到DNase-seq数据；然后将DNase-seq数据进行接头过滤后进行读段定位，将得到的读段回填到基因组序列中得到读段回填结果；
步骤五：可靠性检验：
首先，将基因组序列从第一个碱基对开始依次划分为多个长度为100bp的非重叠的连续的检验片段，并按照划分的次序对检验片段编号，检验片段的编号为由1开始的连续的正整数序列；然后，统计每个检验片段内的读段数量；最后，用公式一计算可靠因子：
公式一：
其中，γ是可靠因子，为0～1之间的实数；x是检验片段内的读段数量，为正整数；n是检验片段的个数，为正整数；i是检验片段的编号，为正整数；xi是编号为i的检验片段内的读段数量；
最后，可靠因子的处理方法为：如果可靠因子大于0.7，则酶切效率达到要求，DNase-seq数据可靠；否则，酶切效率达不到要求，DNase-seq数据不可靠。
本发明的有益成果为：本发明提供了应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法，包括提取细胞核、酶切反应、回收DNA片段、数据预处理和可靠性检验。首先，对组织的细胞核的前期收集方法进行改进，并通过细胞核的数量，优化酶切反应条件，提高了DNase I的酶切效率。其次，采用DNase I的酶切方法与高通量方法的结合，不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低由于前期研磨样本产生的假阳性，能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点，提高了临床样本的研究进程。最后，还对高通测序数据的可靠性进行检验。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下：
实施例1：本实施例具体介绍了顺式调控元件，如下：
当一个基因处于转录活性状态时，含有这个基因的染色质区域对DNase I降解的敏感性要比无转录活性区域高出100倍以上，即染色质对DNase I的敏感性与基因的转录有关，这个位点被称为DNase I超敏感位点(DNase I hypersensitive site)，原因是真核生物某部分染色质处于开链或松散状态(Open chromatin)，容易被DNase I进行非特异性的降解所造成的。经过进一步研究发现具有功能的顺式作用元件，如启动子、增强子、抑制因子和绝缘子等都与DNase I超敏感位相偶联。顺式调控元件分类：
(1)启动子
启动子(promoter)为可以指导RNA聚合酶并起始RNA转录的一段DNA序列。该序往往位于编码基因的上游，可以调控目标基因表达的程度、时间和组织等。通常核心启动子都具有一些特征序列，这些特征序列被称为基序(motif)，常见的基序有TATA盒(TATAbox)等。在哺乳动物中，多数启动子为GC或者Cp G富集区域，这些区域缺乏TATA盒，而在植物中则广泛存在一类未知功能的motif—Y-patch。启动子虽然不直接编码蛋白，但若启动子发生突变，尤其是基序发生突，变将导致转录因子(transcription factor)无法识别该位点，从而使转录无法起始。目前已经报道，在人类中由于启动子突变可以引起上百余种疾病，例如哮喘、β地中海贫血等；而在植物中启动子的多样性与植物的适应性进化也密切相关。
(2)增强子和沉默子
增强子和沉默子是DNA分子上可以与特定的蛋白相结合从而正向或负向调控基因表达的顺式作用元件。其中，增强子与蛋白结合之后，基因的转录水平会增强，其位置可以位于启动子上游、基因内、基因下游或基因间区，甚至与被调控基因不在同一条染色体上，这是由于增强子主要是依靠空间作用来调控基因的表达。而沉默子则与增强子相反，其主要功能是抑制基因的表达。
(3)绝缘子
绝缘子是一种长程调控元件，主要具有两类。第一类主要的功能是阻遏临近的调控元件，例如增强子。绝缘子发挥功能时具有方向性，其可以阻断增强子与启动子的作用，从而导致增强子的目标基因表达下调。第二类是异染色质的边界元件。由于异染色质包装折叠较常染色显得更加紧密，异染色质中的基因很少表达，而第二类绝缘子可以在异染色质的边界阻断异染色质结构的延伸，保证边界另一侧的基因的表达不受影响。
实施例2：本实施例具体说明了应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法，包括以下处理步骤：
步骤一：提取细胞核：
首先将收集的组织样本在冰浴中研磨成粉状；然后加入细胞核提取液并在冰上静置10分钟，细胞核提取液包括：10mM MgSO4，5mM KCl，0.5mM HEPES，1mg/L DDT，0.25wt％Triton-100，2wt％PVP40；再在冰上分别以孔径为100、50和20μm的尼龙膜过滤静置后的液体；而后将过滤后的液体在4℃下离心10分钟，除去上层清液得到悬浮物；最后将悬浮物加入到细胞核贮存液中，细胞核贮存液包括：10mM MgSO4，5mM KCl，0.5mM HEPES，1mg/L DDT；
步骤二：酶切反应：
首先在步骤一得到的液体中加入脱氧核糖核酸酶I，在37℃下孵育10分钟；然后加入与脱氧核糖核酸酶I等量的EDTA终止酶切反应；
步骤三：回收DNA片段：
首先将步骤二得到的液体加入到融化好的琼脂糖中，在55℃下孵育15分钟，琼脂糖的质量分数为1％；然后进行脉冲场电泳，条件为12小时，20～50秒切换，5v/cm，1wt％琼脂糖；再将电泳后的产物用T4DNA聚合酶缓冲液洗涤后，加入Tris缓冲液，在65℃下孵育10分钟，融化凝胶；最后回收融化凝胶中的DNA；
步骤四：数据预处理：
首先将步骤三回收的DNA进行高通量测序得到DNase-seq数据；然后将DNase-seq数据进行接头过滤后进行读段定位，将得到的读段回填到基因组序列中得到读段回填结果；
步骤五：可靠性检验：
首先，将基因组序列从第一个碱基对开始依次划分为多个长度为100bp的非重叠的连续的检验片段，并按照划分的次序对检验片段编号，检验片段的编号为由1开始的连续的正整数序列；然后，统计每个检验片段内的读段数量；最后，用公式一计算可靠因子：
公式一：
其中，γ是可靠因子，为0～1之间的实数；x是检验片段内的读段数量，为正整数；n是检验片段的个数，为正整数；i是检验片段的编号，为正整数；xi是编号为i的检验片段内的读段数量；
最后，可靠因子的处理方法为：如果可靠因子大于0.7，则酶切效率达到要求，DNase-seq数据可靠；否则，酶切效率达不到要求，DNase-seq数据不可靠。
本发明的有益成果为：本发明提供了应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法，包括提取细胞核、酶切反应、回收DNA片段、数据预处理和可靠性检验。首先，对组织的细胞核的前期收集方法进行改进，并通过细胞核的数量，优化酶切反应条件，提高了DNase I的酶切效率。其次，采用DNase I的酶切方法与高通量方法的结合，不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低由于前期研磨样本产生的假阳性，能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点，提高了临床样本的研究进程。最后，还对高通测序数据的可靠性进行检验。
以上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明的权利要求保护范围。同时以上说明，对于相关技术领域的技术人员应可以理解及实施，因此其他基于本发明所揭示内容所完成的等同改变，均应包含在本权利要求书的涵盖范围内。

Claims (1)

1.应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切优化方法，其特征在于，该方法包括以下处理步骤：
步骤一：提取细胞核：
首先，将收集的组织样本在冰浴中研磨成粉状；然后，加入细胞核提取液并在冰上静置10分钟，所述细胞核提取液包括：10mM MgSO4，5mM KCl，0.5mM HEPES，1mg/L DDT，0.25wt％Triton-100，2wt％PVP40；再在冰上分别以孔径为100、50和20μm的尼龙膜过滤静置后的液体；而后，将过滤后的液体在4℃下离心10分钟，除去上层清液得到悬浮物；最后，将所述悬浮物加入到细胞核贮存液中，所述细胞核贮存液包括：10mM MgSO4，5mM KCl，0.5mM HEPES，1mg/L DDT；
步骤二：酶切反应：
首先，在步骤一得到的液体中加入脱氧核糖核酸酶I，在37℃下孵育10分钟；然后，加入与所述脱氧核糖核酸酶I等量的EDTA终止所述酶切反应；
步骤三：回收DNA片段：
首先，将步骤二得到的液体加入到融化好的琼脂糖中，在55℃下孵育15分钟，所述琼脂糖的质量分数为1％；然后，进行脉冲场电泳，条件为12小时，20～50秒切换，5v/cm，1wt％琼脂糖；再将电泳后的产物用T4DNA聚合酶缓冲液洗涤后，加入Tris缓冲液，在65℃下孵育10分钟，融化凝胶；最后，回收融化凝胶中的DNA；
步骤四：数据预处理：
首先，将步骤三回收的DNA进行高通量测序得到DNase-seq数据；然后，将所述DNase-seq数据进行接头过滤后进行读段定位，将得到的读段回填到参考基因组上得到读段回填结果；
步骤五：可靠性检验：
首先，将所述DNase-seq数据中的基因组序列从第一个碱基对开始依次划分为多个长度为100bp的非重叠的连续的检验片段，并按照划分的次序对所述检验片段编号，检验片段的编号为由1开始的连续的正整数序列；其次，统计每个检验片段内的读段数量；然后，用公式一计算可靠因子：
公式一：
其中，γ是所述可靠因子，为0～1之间的实数；i是所述检验片段的编号，为正整数；n是检验片段的个数，为正整数；x是所述检验片段内的读段数量，xi是编号为i的检验片段内的读段数量，xi-1是编号为i-1的检验片段内的读段数量，所述x、所述xi-1和所述xi为正整数；
最后，所述可靠因子的处理方法为：如果所述可靠因子大于0.7，则酶切效率达到要求，所述DNase-seq数据可靠；否则，所述酶切效率达不到要求，所述DNase-seq数据不可靠。
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