CN108025034B - 乙型肝炎病毒复制的调控 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及通过使所述细胞与至少一种剂(agent)接触来调节乙型肝炎病毒(HBV)复制的方法、所述剂的筛选及其在用于治疗受试者中的HBV感染或与HBV感染相关的疾病或病症的药物中的用途，所述至少一种剂调控源自SNAI2、SOX7和其他因子组成的指定的组的至少一种因子。在一个优选的实施方案中，所述剂是来源于SOX7或SNAI2或其订书肽(stapled peptide)的一种肽。作为单独的发明，还公开了鉴定调控病毒的复制的至少一种因子的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年7月15日提交的新加坡申请No.10201505551U的优先权，该申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及病毒学领域，特别是HBV复制中涉及的潜在机制及影响因子的研究。更具体地，本发明涉及调控HBV复制的因子的鉴定，用于后续研发靶向这些因子的剂，用于在体外方法中使用或者用于治疗HBV感染及相关疾病或病症。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)在全球范围内影响2.4亿慢性携带者，并与每年约800,000例包括肝癌和肝硬化的并发症导致的死亡相关。
目前HBV抗病毒疗法是在病毒载量已显著上升时通过抑制病毒聚合酶/反转录酶(Pol/RT)靶向调控复制后期，限制其病毒清除效率。由于缺乏对驱动病毒复制的确切宿主因子的理解，靶向早期病毒复制尚不可行。
因此，需要阐明HBV复制的潜在的基本分子机制和相关因素。这些因素的鉴定将允许研发新的HBV干预途径以及用于治疗HBV感染和相关病症或疾病的疗法。
发明内容
根据一个方面，提供了调节细胞中HBV复制的方法，包括：使所述细胞与调控至少一种因子表达的至少一种剂(agent)接触，所述至少一种因子选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A。
在另一个方面，提供了至少一种剂在制备用于治疗受试者中的HBV感染的药物中的用途，其中所述至少一种剂调节至少一种因子的活性，所述至少一种因子选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A。
在另一个方面，本公开提供了至少一种剂在制备用于治疗受试者中的与HBV感染相关的疾病或病症的药物中的用途，所述至少一种剂调节至少一种因子的活性，所述至少一种因子选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A。
在另一个方面，提供了治疗受试者中HBV感染的方法，包括向受试者施用至少一种剂，所述至少一种剂调节至少一种因子的活性，所述至少一种因子选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A。
在另一个方面，提供了用于治疗受试者中的HBV感染相关的疾病或病症的方法，包括向受试者施用至少一种剂，所述至少一种剂调节至少一种因子的活性，所述至少一种因子选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A。
在另一方面，提供了源自SOX7或SNAI2的至少一种肽在制备用于抑制受试者中的HBV复制或者治疗受试者中的HBV感染的药物中的用途。
在另一方面，提供了筛选用于调节HBV复制的至少一种剂的方法，包括：a)将表达HBV病毒的细胞与至少一种剂接触，其中所述至少一种剂调控至少一种因子的表达，所述至少一种因子选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A；b)获得与至少一种剂接触的细胞的HBV表达谱；以及c)将b)中的HBV表达谱与未接触所述至少一种剂的对照细胞的HBV表达谱比较，其中所述细胞中HBV病毒的表达相对于所述对照细胞的降低或升高表明所述至少一种剂对HBV复制的调控。
在另一个方面中，提供了鉴定调控病毒的复制的至少一种因子的方法，包括：a)以包含可操作地连接至所述病毒的病毒启动子的筛选标志物的表达载体转染不同来源的至少两种细胞系；b)检测所述筛选标志物的表达，将所述至少两种细胞系分为容许细胞系(permissive cell lines)和非容许细胞系(non-permissive cell lines)；c)以包含所述病毒的病毒复制子的表达构建体转染所述容许细胞系和非容许细胞系；d)在c)的所述容许细胞系和非容许细胞系中筛选至少一种因子的表达，并比较所述至少一种因子在所述容许细胞系和所述非容许细胞系中的表达，以鉴定至少一种候选因子，其中所述至少一种因子在所述容许细胞系和非容许细胞系之间的差异表达是鉴定至少一种候选因子的表征；e)将表达病毒复制子的所述容许细胞系与剂接触以敲除至少一种所述候选因子的表达；以及f)相对于未与所述剂接触的对照细胞系，比较e)的所述容许细胞系中的所述病毒复制子的前基因组RNA水平，其中相对于对照细胞系，所述容许细胞系中前基因组RNA水平的表达水平的降低或升高表明鉴定到调控所述病毒复制的至少一种因子。
附图说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：
图1是图示说明用于发现并验证调控HBV复制的宿主因子的实验流程示意图。
图2示出大多数肝细胞对于支持HBVC是容许性的，但是以不同程度的效率。选择HepG2、HuH6、HuH7、HuH-4、PLC/PRF/5用于进一步的研究。HepG2、HuH6和HuH7对于整合的HBV是阴性的。
图3显示针对HBV复制容许或非容许的细胞系的鉴定。a)对由HBVCP构建体驱动的HBV复制容许的细胞，流式细胞术检测呈GFP阳性(上组)。b)使用CMV-GFP的转染对照表明所有细胞均可通过CMV启动子驱动的表达起作用(下组)。a)和b)二者中的数据点显示无启动子插入物的GFP载体的转染。
图4显示各种细胞系中的复制子转染的效率。
图5显示以候选基因特异性的siRNA处理影响HepG2细胞中复制子转染的效率。
图6表明Slug特异性地抑制HBV复制。a)使用GFP报告子示出的肝细胞系和非肝细胞系中HBVCP的活性。基于GFP+细胞的百分比将细胞分为HBV容许组或HBV非容许组；b)pgRNA仅在转染有HBV复制子的HBV容许细胞系中表达。GAPDH用作加样对照；c)来自HTA的细胞系的主成分分析(PCA)。肝HBV容许细胞系、非肝HBV容许细胞系及非肝HBV非容许细胞系形成不同的簇；d)BCP中的Slug结合基序与pgRNA的起始子完全重叠。图中数字表示HBV基因型A的核苷酸位置；e)通过RTPCR验证全长SNAI2(Slug)的相对表达量；f)Slug以序列依赖性方式与HBVCP特异性结合。由具有Slug基序的野生型探针形成的HBVCP-Slug复合物产生弱条带，该弱条带被Slug过表达(O/E)加强。具有突变的Slug基序的复合物被消除；g)过表达的Slug显著抑制转染HBVCP-Luc的容许细胞中HBVCP的依赖性转录；h)Slug过表达特异性抑制HBVCP转录活性，降低HBVCP-GFP细胞而非CMV-GFP对照细胞中GFP+细胞的平均荧光强度(M.F.I.)；i)过表达Slug的HBV容许细胞中针对HBcAg的染色极微弱；j)当与HBV复制子共同转染时，Slug的过表达使pgRNA减少。
图7示出Sox7通过阻断(blocking)HNF4α-HBVCP的相互作用特异性抑制HBV复制。a)使用对不同的N末端具有特异性的抗体进行Western印迹分析细胞中内源性HNF4α亚型的表达；b)使用HBVCP-Luc报告子，HNF4α亚型对在HBVCP的转录的剂量依赖性影响；c)HNF4α和Sox7结合基序有1nt的重叠并位于增强子II上；d)Sox7与野生型HBVCP探针形成特异性的DNA-蛋白质复合体，当Sox7基序发生变异时该复合体减少。在HNF4α和Sox7结合基序之间插入3nt间隔子时，HNF4α3-HBVCP复合体的条带强度增加；e)Sox7与HBVCP-GFP共转染时特异性降低GFP+细胞的M.F.I.，但与CMV-GFP对照共转染不会；f)Sox7过表达显著抑制HBVCP-Luc转染细胞中HBVCP的转录；g)通过免疫荧光染色法鉴定Sox7过表达对HBcAg表达的影响；h)Sox7过表达对原代人肝细胞及转染有HBV复制子的容许细胞系中的pgRNA的影响。
图8示了Slug和Sox7的组合效果。a)使用HBVCP-Luc报告子示出通过增加Slug剂量与Sox7共表达(25ng质粒)增强对HBVCP的转录抑制；b)将Slug和Sox7一起过表达显著抑制HBVCP依赖性转录；c)在以HBV复制子共转染72小时的细胞中，Slug和Sox7的过表达对pgRNA的合成的组合效果；d)通过RT-PCR示出全长Sox7转录本的表达；e)PC-3细胞中敲除Slug和Sox7同时过表达HNF4α3对HBVCP转录的影响。f)分别在表达Sox7(Sox7+)的细胞和不表达Sox7(Sox7-)的细胞中敲除Slug同时过表达HNF4α3对HBVCP转录的影响；g)当与以HBV复制子共转染的HBV非容许细胞中用Slug特异性siRNA共转染时，只有缺乏Sox7表达的细胞产生pgRNA容许细胞；h)Slug和Sox7确定细胞的HBV非容许状态。增强子II中的Sox7基序与HNF4α基序重叠而Slug基序与pgRNA起始子完全重叠。HNF4α在非容许细胞中低表达，且如果存在，被Sox7与HBVCP的结合拮抗。由此，Slug封闭了pgRNA起始子，同时Sox7阻止转录。在HBV容许细胞中，Sox7和Slug的极少量表达即可使HNF4α激活HBVCP的转录。
图9示出Slug和Sox7转录因子模拟物(mimetics)阻止HBV复制。a)Slug功能结构域的示意图。Slug具有5个C2H2锌指结构(ZF1-5)，每个锌指结构均可结合DNA。潜在的DNA结合残基被指明，订书烃(hydrocarbon staple)以下划线示出。螺旋轮图(Helical wheeldiagram)显示了所预测的每个肽的DNA结合交互面(interface)；b)使用HBVCP-Luc报告子分析比较IC50来鉴定Slug功能性模拟物；c)与DMSO对照组和Slug的过表达相比，Slug模拟物保持对HBVCP的转录抑制；d)Sox7功能结构域示意图示出DNA结合HMG-box包含3个α-螺旋(H1-H3)。预测只有H1和H2强结合DNA。DNA结合残基被指明，订书烃以下划线示出。螺旋轮图显示了所预测的每个肽的DNA结合交互界面；e)针对Sox7模拟物的剂量曲线，使用HBVCP-Luc报告子分析确定IC50；f)与DMSO对照组可忽略的作用效果相比，Sox7-H1s和Sox7-H2s通过抑制HBVCP转录活性模拟Sox7的功能；g)使用HBVCP-Luc报告子分析模拟物的组合对HBVCP转录抑制的效果；h)在于肽添加24小时之前转染HBV复制子的细胞中，Slug和Sox7模拟物对pgRNA的影响。
图10示出非肝细胞中的HBV复制。a)Western免疫印迹检测的细胞系中肝特异性标志物的表达。只有起源于肝脏的细胞系才表达白蛋白和/或转铁蛋白。使用肌动蛋白(Actin)作为加样对照；b)使用CMV-GFP报告子构建体测试细胞系的转染效率。c)HBV复制子。将来自基因型A(nt 1535-1937)的1.1x全长HBV克隆至pcDNA3.1+载体中CMV启动子的上游。pgRNA合成由HBVCP调控，在初步通读转录后终止于HBV聚腺苷酸(poly-A)信号。d)在HBV复制子转染72小时的细胞中，HBV衣壳蛋白HBcAg的表达。
图11示出人类转录组学阵列。a)通过差异表达的蛋白质的编码转录本的相对表达，对HBV容许细胞及非容许细胞的无监督层次聚类(Unsupervised hierarchicalclustering)；b)HBV容许细胞与非容许细胞之间差异表达的基因的数目。
图12示出了HBV容许细胞与非容许细胞之间差异化表达的基因。a)通过使用GO(基因本体论，Gene Ontology)定义的生物学功能对在HBV容许细胞与非容许细胞之间的差异表达的基因进行分类；b)在HBV容许细胞和非容许细胞之间差异表达的转录因子的相对mRNA转录本的表达。
图13示出了Slug是HBVCP的特异性转录阻遏物。a)通过HTA2比较了SNAI2与其他Snail家族基因SNAI1和SNAI3的基因表达；b)鉴于Slug基序缺失提高了HBVCP转录，Slug以基序依赖性方式施加其对HBVCP转录活性的抑制作用；c)Slug基序突变提高HepG2和Caco-2容许细胞中的HBVCP活性，表明Slug的抑制活性是基序序列依赖性的；d)荧光素酶报告子分析中过表达Slug条件下Slug基序缺失对HBVCP活性的影响；e)通过荧光素酶报告子分析示出的Slug过表达对转录的剂量依赖性作用。
图14示出差异化表达的HNF4α各亚型确定容许细胞内的HBVCP活性。a)HNF4α同源二聚体结合至其在HBVCP中的基序，所述基序的特征在于由单一核苷酸间隔子隔开的两个“半位点”(下划线标出)。5’端半位点的突变足以降低HBVCP转录；b)HTA分析细胞中HNF4A基因外显子的差异表达。外显子以条示出，粗体条表示除5’UTR区和3’UTR区外的蛋白质编码序列。检测HNF4α1、HNF4α2和HNF4α3利用的外显子2编码序列的第3组探针信号在肝细胞中比非肝细胞中更高，与Western blot结果一致。检测HNF4α1、HNF4α2、HNF4α7和HNF4α8的第13组探针的信号在HBV容许细胞中更高，但检测HNF4α2和HNF4α8中外显子10的探针组14在HBV容许细胞和非容许细胞之间没有差异表达，这一起表明了HNF4α1优先在HBV容许细胞中表达。探针组12的信号较高，其检测HBV容许细胞中的HNF4α3和HNF4α9利用的外显子9。c)针对HNF4A基因外显子阵列数据的总结表明，与HNF4α2和HNF4α8相反，HNF4α1/3/7/9与HBV复制的细胞兼容性相关；d)HNF4α各亚型的功能结构域示意图。HNF4α蛋白各亚型共享保守的DNA结合结构域及配体结合结构域，但在包含F-结构域的N末端和C末端不同。预测的分子量如图所示。AF-1：激活功能1，协同因子相互作用结构域；e)使用对不同N末端特异性的抗体克隆在细胞核裂解物中检测单独地过表达的HNF4α亚型；f)免疫荧光显微术检测过表达HNF4α的个体亚型的细胞中HBcAg的表达。细胞核以DAPI染色。
图15示出Sox7是HBVCP的特异性抑制剂。a)HTA分析与其他Sox组F家族基因相比，SOX7的基因表达；b)通过RT-PCR分析Sox7在原代人组织中的表达；c)在共转染HBVCP-Luc48小时的HBV容许细胞中，Sox7过表达对HBVCP转录抑制的剂量依赖效应；d)当Sox7过表达时，Sox7基序缺失对HBVCP转录的影响的萤光素酶测定。
图16示出Slug和Sox7对HBVCP抑制的组合作用。a)仅过表达HNF4α亚型不会增加非容许PC-3细胞中HBVCP依赖性荧光素酶的表达。b)HBV非容许细胞5637中，通过Slug基序突变和增加HNF4α与Sox7基序之间的间隔子可以HNF4α依赖性的方式大大增强转录激活。*双重突变：HBVCP-Luc构建体双重突变：在Slug基序突变并携带HNF4αN3Sox7突变。
图17示出Slug模拟物。a)Slug直系同源物和人Slug家族成员针对5个C2H2锌指(ZF1-5)的多序列比对。C2H2锌指通过α-螺旋上的-1、+2、+3和+6残基结合DNA，所预测的α-螺旋结构域的这些残基被高亮标出。由功能性SNP编码的可变Slug残基被高亮标出；b)通过荧光素酶报告子分析，Slug模拟物Slug-ZF4s和Slug-ZF5s存在时，Slug基序缺失对HBVCP转录抑制的影响。c)为保持来自Slug锌指4和5(Slug-ZF4n和Slug-ZF5n)的α-螺旋肽的螺旋性和功能的订书烃实现了增强的Slug模拟功能，导致HBVCP进一步的转录抑制。
图18示出Sox7模拟物。a)Slug直系同源物和人Sox组F家族成员针对N末端DNA结合HMG-Box的多序列比对。Sox17-DNA晶体结构中与DNA结合残基相对应的α-螺旋结构域的残基已特别标出。由于α-螺旋3仅有1个与DNA相互作用的残基，与α-螺旋1和α-螺旋2相比，α-螺旋3的DNA结合功能可忽略；b)源自Sox7HMG-box螺旋1和2(Sox7-H1n和Soc7-H2n)的订书烃肽(Sox7-H1s和Sox7-H2s)示出增强的Sox7模拟功能以进一步减少在HBVCP的转录；c)WST-1分析显示转录因子模拟物处理的HBV容许细胞与DMSO对照在细胞增殖上无差异。
详细内容
乙型肝炎病毒(HBV)主要被认为是引起慢性肝炎感染和肝癌的肝脏特异性病原体。然而，本公开基于以下发现：HBV可以在许多非肝细胞中有效复制。因此，这表明肝细胞中HBV增殖所需的宿主细胞因子也可以存在于非肝细胞中。
特别地，HBV在其早期复制期期间依赖于宿主转录因子在HBV核心启动子(HBVCP)(nt1600-1860)合成前基因组RNA(pgRNA)。这些宿主因子可包括但不限于在各种组织中广泛表达的Sp1、PARP1和HNF4α，因此不能视为HBV的肝脏特异性复制。
此外，由于病毒传播可以通过外泌体和网格蛋白依赖性内吞作用发生，有可能HBV复制起始被感染的非肝细胞固有的机制抑制。特别地，阻断pgRNA合成的机制可能会使HBV复制沉默，因为其损失会防止HBV DNA基因组、病毒聚合酶/逆转录酶(Pol/RT)和乙肝核心抗原衣壳蛋白(HBcAg)的产生。
相应地，本公开以对HBV复制和转录机制的进一步说明为基础，所述进一步说明是以鉴定在不同细胞和/或组织中HBV转录和复制所需的相关宿主因子的方式。这些宿主因子鉴定将允许新干预手段的产生以及基于细胞的筛选方法的研发，这对于HBV疗法的研发至关重要。
在这方面，本公开的优势涉及鉴定可能影响或调控HBV复制效率的若干因子。在一个实施方案中，这些因子包括但不限于转录因子、信号通路因子、蛋白结合因子和蛋白成熟因子。
特别地，编码这些因子的基因可以被靶向以影响或调控HBV复制效率。表1列出了可能影响HBV复制效率的因子的示例性、非限制性实施例和相关基因靶标。表1中列出的所有基因ID均在已知基因或蛋白质数据库公开，所述基因或蛋白质数据库可用于获得关于每个基因ID的进一步信息，例如它们的序列、位置、家族和功能。这些基因或蛋白质数据库可以包括但不限于HUGO基因命名委员会(HGNC)、NCBI GeneBank或Uniprot。
表1
在一个实施方案中，提供了调控细胞中HBV复制的方法。特别地，所述方法包括使所述细胞与调控至少一种因子表达的至少一种剂接触，所述至少一种因子选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A。
在可替代的实施方案中，所述细胞可以与调控至少一种因子表达的至少一种剂接触，所述至少一种因子选自由以下组成的组：C1orf131、ETS1、FSTL1、HNF4A、INHBA、KCTD12、MAK16、NOSTRIN、PNPT1、PTCD3、SEMA4G、SNAI2、SNRPD1、SUSD1、WDR43、ZFHX4、ALDH2、ALDH5A1、B3GNT2、CHUK、DDX18、EPT1、ERMP1、GCNT3、GSR、HMGCS1、NAE1、PDSS1、PPID、SMURF2、TANC2、BCAR3、C16orf70、C9orf100、EPB41L5、HSPA14、HSPA9、LRP12、NSMCE4A、NUP35、PSMD11、RNF43、EXOC6、FUZ、STOML2、WASF2、ARHGAP12、MYO9B、TBC1D14、FLVCR1、SLC39A14、GPX2、IDH1和FAM35A。
在一个实施方案中，细胞中的HBV复制可以被抑制。在一些实施方案中，所述至少一种剂可以选自由以下组成的组：化合物、小分子、寡核苷酸、蛋白质、肽、订书肽、拟似肽(peptidomimetic)、抗体和抗原结合分子。所述寡核苷酸可以是siRNA或shRNA。
所述至少一种因子可以选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8和HNF4α9。在一个实施方案中，所述至少一种因子可以是SNAI2或SOX7。
在一个实施方案中，所述至少一种剂可以是siRNA。在一个实施方案中，所述siRNA减少细胞中SNAI2和SOX7表达，以致相对于无siRNA的细胞中的HBV复制，所述细胞中HBV复制增加。在另一实施方案中，siRNA降低HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8和HNF4α9的表达，以致相对于无siRNA的细胞中的HBV复制，所述细胞中HBV复制降低。
在一些实施方案中，所述细胞可以选自由肝细胞、结肠细胞、胃细胞、血细胞和肺细胞组成的组。
在一个实施方案中，所述方法可在体外进行。
在一些实施方案中，细胞可以来源于选自以下的细胞系：HepG2、HuH6、HuH7、HuH4、PLC/PRF/5、Kato III、AGS、HCT116、Caco-2、HL-60、HEK293和A549。
本文所描述方法中，所述接触步骤可包括在至少一种剂存在下培养细胞。
本公开还提供了至少一种剂在制备用于治疗受试者中的HBV感染的药物中的用途，其中至少一种剂调控至少一种因子的活性，所述至少一种因子选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A.
本公开还提供了至少一种剂在制备用于治疗受试者中的与HBV感染相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述至少一种剂调控至少一种因子的活性，所述至少一种因子选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A。
在一些实施方案中，所述疾病或病症可以是肝脏疾病。在另一实施方案中，所述疾病、紊乱或病症指黄疸、肝脏炎症、肝纤维化、炎症、肝硬化、肝功能衰竭、弥漫性肝细胞炎性疾病、噬血细胞综合征，血清性肝炎、HBV病毒血症、脂肪肝、肝细胞癌、肝疾病相关的移植、肾小球肾炎、血脂异常、造血系统恶性肿瘤或胰腺炎。
在一个实施方案中，所述至少一种剂抑制HBV复制。在一些实施方案中，所述至少一种剂可以选自由以下组成的组：化合物、小分子、寡核苷酸、蛋白质、肽、订书肽、拟似肽、抗体和抗原结合分子。所述寡核苷酸可以是siRNA或shRNA。
在一些实施方案中，所述至少一种因子可以选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8和HNF4α9。在一个实施方案中，所述至少一种因子可以是SNAI2或SOX7。
本公开还提供了来源于SOX7或SNAI2的至少一种肽在制备用于抑制HBV复制或治疗受试者中的HBV感染的药物中的用途。在另一个实施方案中，所述至少一种肽可以选自本文公开的任何一种因子。
在一个实施方案中，本文所描述的至少一种肽可以包括肽类似物(analogue)、经修饰的肽或由SOX7/SNAI2编码的天然蛋白质的肽衍生物。天然蛋白质的类似物或功能等效物可以是保留天然蛋白质的活性和功能的肽分子，或者也可以是，例如拟似肽。肽衍生物或变体可以是与参考蛋白或肽的序列等同的肽，即100％一致，或者与参考序列相比可包括一定整数个氨基酸的改变使得同一性小于100％，例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％等同。这种改变选自由以下组成的组：至少一个氨基酸的缺失、置换，包括保守和非保守性替换或插入。经修饰的肽可以是衍生自经引入置换基团或功能性基团的肽或蛋白的分子，所述置换基团或功能性基团通常不存在于天然发生的氨基酸中。拟似肽或肽拟似物(mimic)可包括具有或多或少类似于参考肽或蛋白质的功能结构的合成化合物，但也可以包含骨架中的非肽键或D-氨基酸。一般情况下，拟似肽可以充当天然蛋白的替代物，被设计为模拟蛋白质的功能和活性。拟似肽的一示例包括但不限于订书肽，所述订书肽是包括合成的支撑(“brace”)(“订书(staple)”)如订书烃的肽。
在一个实施方案中，所述至少一种肽可以衍生自SOX7或SNAI2编码的天然蛋白质的DNA结合域。相应地，在一个实施方案中，所述至少一种肽可以衍生自选自由以下组成的组的肽：Slug-ZF1s(SEQ ID NO:215)、Slug-ZF2s(SEQ ID NO:216)、Slug-ZF3s(SEQ ID NO:217)、Slug-ZF4s(SEQ ID NO:218)、Slug-ZF5s(SEQ ID NO:219)、Sox7-H1s(SEQ ID NO:220)和Sox7-H2s(SEQ ID NO:221)。
在一个实施方案中，所述至少一种肽可以衍生自选自由Slug-ZF4s(SEQ ID NO:218)、Slug-ZF5s(SEQ ID NO:219)、Sox7-H1s(SEQ ID NO:220)和Sox7-H2s(SEQ ID NO:221)组成的组的肽。
在一个实施方案中，所述至少一种肽可以是订书肽。在另一个实施方案中，所述订书肽可以包含订书烃。
在一个实施方案中，所述至少一种肽可以被配制成适合于施用至受试者的方便模式的组合物。在一个实施方案中，所述至少一种肽可以被配制成包括药学上可接受的载体的药物组合物。
本公开还提供了用于抑制HBV复制或治疗受试者中HBV感染的方法，包括给予受试者至少一种衍生自SOX7或SNAI2的肽。
在一个实施方案中，所述至少一种肽可以衍生自选自以下组成的组的肽：Slug-ZF1s(SEQ ID NO:215)、Slug-ZF2s(SEQ ID NO:216)、Slug-ZF3s(SEQ ID NO:217)、Slug-ZF4s(SEQ ID NO:218)、Slug-ZF5s(SEQ ID NO:219)、Sox7-H1s(SEQ ID NO:220)和Sox7-H2s(SEQ ID NO:221)。
在一个实施方案中，所述至少一种肽可以衍生自选自由Slug-ZF4s(SEQ ID NO:218)、Slug-ZF5s(SEQ ID NO:219)、Sox7-H1s(SEQ ID NO:220)和Sox7-H2s(SEQ ID NO:221)组成的组的肽。
在一个实施方案中，所述至少一种肽可以是订书肽。在另一实施方案中，所述订书肽可以包括订书烃。
订书烃的序列、结构及位置可以因功能不同而不同，并由本领域的熟知的技术合成或从商业公司如GenScript获得。正如本领域技术人员所知晓的，只要不破坏包括订书烃的肽与核酸的相互作用，订书烃的序列、结构和位置可以变化，所述核酸例如DNA。
特别地，订书烃可以在每个肽之内的特异的残基位点附着2个残基。本文描述的所述残基位点可以对应全长天然蛋白质的氨基酸序列中的残基位点。例如，第一烃附着的残基位置表示为“i”，随后第二烃附着可位于离“i”至少2个或更多个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述订书烃可以附着在“i”和“i+4”或“i”和“i+7”残基位点，其中+4或+7表示第二烃附着位于从“i”起氨基酸位置的数目。
本领域已知的是，一旦肽被订书烃装订(stapled)，在附着位置的原始氨基酸可以用非天然氨基酸替换。所述非天然氨基酸包括但不限于S-戊烯基丙氨酸、S-辛烯基丙氨酸、R-辛烯基丙氨酸或R-戊烯基丙氨酸。在一个实施方案中，所述订书烃可附着于“i”和“i+4”残基位点，其中在“i”和“i+4”二者的位点的氨基酸可以是S-戊烯基丙氨酸。在另一个实施方案中，所述订书烃可附着于“i”和“i+7”残基位点，其中“i”和“i+7”二者的位点的氨基酸可以选自R-辛烯基丙氨酸、S-戊烯基丙氨酸、S-辛烯基丙氨酸或R-戊烯基丙氨酸。特别地，在“i”位点的氨基酸可以是R-辛烯基丙氨酸或S-辛烯基丙氨酸，且在“i+7”位点的氨基酸可以是S-戊烯基丙氨酸或R-戊烯基丙氨酸。
在一个实施方案中，订书肽可以包括附着于Slug锌指结构(ZF)的订书烃，附着位置如下：在ZF1s(订书锌指结构1)的F130和A134、在ZF2s(订书锌指结构2)的L171和I178、在ZF3s(订书锌指结构3)的P197和Q201、在ZF4s(订书锌指结构4)的R229和Q233或者在ZF5s(订书锌指结构5)的M253和H257(图9a)。
在一个实施方案中，所述订书肽包括附着于Sox7螺旋结构(H)的订书烃，附着位置如下：在H1s(订书螺旋结构1)的V54和D58或在H2s(订书螺旋结构2)的L75和S82(图9d)。
在一个实施方案中，所述至少一种肽可以被配制成适合用于施用至受试者的方便模式。在一个实施方案中，所述至少一种肽可以被配制成包括药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，所述至少一种肽可以被配制成适合用于注射施用的组合物。在另一实施方案中，所述至少一种肽可被并入纳米颗粒复合物中以便于施用。
本公开还提供了治疗受试者中HBV感染的方法，包括向受试者施用调控选自由以下组成的组的至少一种因子的活性的至少一种剂：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A。
本公开还提供了治疗受试者中与HBV感染相关的疾病或病症的方法，包括向受试者施用调控选自由以下组成的组的至少一种因子的活性的至少一种剂：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A。
在一些实施方案中，所述疾病或病症可以是肝脏(liver)疾病。在另一个实施方案中，所述疾病、紊乱或病症是黄疸、肝炎、肝纤维化、炎症、肝硬化、肝功能衰竭、弥漫性肝细胞炎性疾病，噬血细胞综合征，血清性肝炎、HBV病毒血症，脂肪肝，肝细胞癌，肝病相关的移植、肾小球肾炎、血脂异常、造血系统恶性肿瘤或胰腺炎。
在一个实施方案中，所述至少一种剂抑制HBV复制。在一些实施方案中，所述至少一种剂可以选自由以下组成的组：化合物、小分子、寡核苷酸、蛋白质、肽、订书肽、拟似肽、抗体和抗体结合分子。
所述寡核苷酸可以是siRNA或shRNA。在一些实施方案中，所述至少一种因子可以选自由SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8和HNF4α9组成的组。在一些实施方案中，所述至少一种因子可以是SNAI2或SOX7。
本公开范围内，术语“施用(administering)”及该术语的变形(包括“施用(administer)”和“施用(administration)”)包括通过任何适当方式接触、应用、递送或提供如本文所描述的剂、肽、化合物或组合物至生物体或表面。施用的方便模式可以包括注射(皮下注射、静脉注射等)、口服施用、吸入、经皮应用、局部乳膏/凝胶/粉末或直肠施用。依据施用途径，所述剂可以被涂覆以材料，以保护该化合物免受酶、酸和其他自然条件的作用，所述酶、酸和其他自然条件可以使化合物的治疗活性失活。所述剂也可以被肠胃外或腹腔内地施用。
本文描述的所述剂、肽、化合物或组合物的分散剂可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备。在一般贮存和使用条件下，药物制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。
适合注射的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性情况下)或分散剂和用于无菌注射溶液或分散剂的临时制备的无菌粉末。理想情况下，该组合物在生产和储存的条件下是稳定的，且可以含防腐剂以保持组合物稳定，免受如细菌和真菌等微生物的污染作用。
在一个实施方案中，如本文描述的剂、肽、化合物或组合物可口服施用，例如与惰性稀释剂或可吸收的可食用载体。所述剂、肽、化合物或组合物可被并入纳米复合物中。或者，本文描述的所述剂、肽、化合物或组合物以及其他成分也可以被包裹在硬或软壳明胶胶囊中、压缩成片剂或者直接并入个人饮食中。对于口服施用治疗，本文描述的所述剂、肽、化合物或组合物可同辅料共同并入并用于可吸收片、口腔片(buccal tablets)、锭(troches)、胶囊、酏剂(elixirs)、悬浮液、糖浆、薄片(wafers)及其类似物。适当地，这样的组合物和配制剂可以包含按重量计至少1％的剂。当然，药物组合物和配制剂中式(I)和/或式(II)的化合物的百分比可以不同，并且，例如，可以适宜地在剂量单位的重量的约2％至约90％、约5％至约80％、约10％至约75％、约15％至约65％、约20％至约60％、约25％至约50％、约30％至约45％或约35％至约45％的范围。治疗有用组合物中化合物的量应为使得可获得合适剂量。
用语“药学上可接受的载体”意图包括溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂及类似物。这样的介质和剂在药物活性物质中的使用在本领域中是众所周知的。除常规介质或剂与该化合物不相容的情况外，其在治疗性组合物和在治疗和预防方法中的使用是计划中的。根据本公开，补充活性化合物也可以被并入到所述组合物中。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外施用的组合物，以便减轻剂量的释放和均一性负担。本文所用的“剂量单位形式”是指物理上离散的单位，适合于作为单一剂量用于要被治疗的个体；本文所描述的含预定量的剂、肽、化合物或组合物的每个单位均经过计算，以与所需药物载体共同产生合乎期望的治疗效果。本文所描述的剂、肽、化合物或组合物可以有效量与合适的药学上可接受的载体一起被配制用于方便且有效的施用，以可接受的剂量单位。在含有补充活性成分的组合物的情况下，剂量由参考所述成分的通常剂量和施用方式确定。在一个实施方案中，所述载体可以是口服施用载体。
药物组合物的另一种形式为适合用于口服施用的肠溶包衣粒剂、片剂或胶囊。本发明范围内还包括的延迟释放制剂。
本文所描述的剂、肽、化合物或组合物也可以以“前药”形式施用。前药是化合物的非活性形式，该化合物在体内转化为活性形式。
在一个实施方案中，如本文所描述的所述剂、肽、化合物或组合物可通过注射施用。在可注射溶液的情况下，所述载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。例如通过使用涂层诸如卵磷脂、通过在分散剂情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂可以维持合适的流动性。预防微生物的作用可以通过包含各种抗菌剂和/或抗真菌剂实现。合适的抗菌剂和/或抗真菌剂为本领域技术人员众所周知的，并包括例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、苯甲醇、抗坏血酸和硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下来制备：将本文所描述的剂、肽、化合物或组合物以所需的量按需与以上枚举的一种成分或成分组合并入到合适的溶剂中，随后过滤消毒来组合物。通常，通过将本文所描述的剂、肽、化合物或组合物并入含有基本分散介质和来自以上枚举的那些的其它所需成分的无菌载体中制备分散剂。
片剂、锭剂、丸剂和胶囊等还可包含以下：粘合剂(binder)如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；和甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精或调味剂如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当剂型单元为胶囊时，除了上述类型的材料外，其还可以含有液体载体。多种其它材料可以作为涂层存在，或者以其他方式修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以被虫胶、糖或其二者包被。糖浆或酏剂可以包含类似物，蔗糖作为甜味剂、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂、染料和调味剂如樱桃香料或橙味香料。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何原料均应为药学纯且在其使用量基本无毒。此外，所述类似物可被并入缓释制备剂和制剂中。
优选地，所述药物组合物还可以包括合适的缓冲液以最小化加酸水解。适当的缓冲剂为本领域技术人员熟知的，包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐及其混合物。
本文所描述的所述剂、肽、化合物或组合物的单独或多重施用可以被实行。本领域技术人员能够通过常规实验确定根据本公开的所述剂的有效且无毒剂量水平，并确定会适合于治疗疾病和/或感染的施用模式，如本文所描述的所述剂、肽、化合物或组合物适用于所述疾病和/或感染。
进一步地，对本领域技术人员来说显而易见的是，最佳疗程，例如给定天数期间每天给予本文所描述的剂、肽、化合物或组合物的剂量的数目可以使用常规疗程确定测试来确定。
一般地，每24小时的有效剂量范围可以是每公斤体重约0.0001mg至约1000mg；合适地，每公斤体重约0.001mg至约750mg；每公斤体重约0.01mg至约500mg；每公斤体重约0.1mg至约500mg；每公斤体重约0.1mg至约250mg；或每公斤体重约1.0mg至约250mg。更适当地，每24小时的有效剂量范围可以是每公斤体重约1.0mg至200mg；每公斤体重约1.0mg至约100mg；每公斤体重约1.0mg至约50mg；每公斤体重约1.0mg至约25mg；每公斤体重约5.0mg至约50mg；每公斤体重约5.0mg至约20mg；或每公斤体重约5.0mg至约15mg。
可选择地，有效剂量可高达约500mg/m2。例如，一般地，可预期有效剂量是在约25至约500mg/m2、约25至约350mg/m2、约25至约300mg/m2、约25至约250mg/m2、约50至约250mg/m2和约75至约150mg/m2的范围。
还提供了筛选用于调控HBV复制的至少一种剂的方法。所述方法包括a)将表达HBV病毒的细胞与所述至少一种剂接触，其中所述至少一种剂调节至少一种因子的表达，所述至少一种因子选自由以下组成的组：SNAI2、SOX7、HNF4α1、HNF4α2、HNF4α3、HNF4α7、HNF4α8、HNF4α9、ARID3A、ATF2、ATF3、ATF4、CALCOCO1、CHD3、CPD、CSNK2A2、CNOT11、DCP1A、DDX39B、DYRK1B、E2F6、E2F7、EPAS1、FOXN2、HIVEP2、HERPUD1、KPNA3、KANK2、LIN54、LSD1、NCL、PAK1IP1、PNPT1、POLR3E、PRDX3、PTP4A1、RNASEH2A、RHOB、RNF4、RNF43、SERBP1、SKA1、SMAD3、SRPK1、STAM、STRADB、SSB、STT3B、TFAP2A、TFAP2C、TFB2M、TRIM24、TRIM68、TRIM27、WDR54和ZNF518A；b)获得与所述至少一种剂接触的所述细胞的HBV表达谱；以及c)将b)中的所述细胞的HBV表达谱与对照细胞的HBV表达谱比较，所述对照细胞未已与所述至少一种剂接触，其中所述细胞中HBV病毒的表达相对于所述对照细胞的升高或降低表明所述至少一种剂对HBV复制的调控。
在一个实施方案中，所述至少一种剂可以选自由以下组成的组：化合物、小分子、寡核苷酸、蛋白质、肽、订书肽、拟似肽、抗体及抗原结合分子。在一个实施方案中，所述寡核苷酸可以是siRNA或shRNA。
在一个实施方案中，所述接触步骤包括用siRNA或shRNA转染所述细胞。
在一些实施方案中，所述细胞可以是HBV复制容许细胞或非容许细胞。
本文所公开的“容许(permissive)”细胞涉及允许病毒绕过其防御机制并复制的细胞。通常这发生在病毒已经调控了一种或几种细胞的内在防御时。存在本领域技术人员已知的用于确定或验证细胞或细胞系是否允许某种病毒的常规方法和技术。相反，本文公开的“非容许”细胞涉及不允许病毒绕过其防御并复制的细胞。
所述细胞可以选自由肝细胞、结肠细胞、胃细胞、血细胞、肾细胞和肺细胞组成的组。在一个实施方案中，所述细胞可以是肝细胞或非肝细胞。在另一个实施方案中，所述细胞可以源自HBV肝容许细胞系，如HepG2、HuH7、PLC/PRF/5或Hep3B。在另一个实施方案中，所述细胞可以源自非肝HBV容许细胞系，如Caco-2、Kato III、AGS或A549。在又一实施方案中，所述细胞可以源自非肝HBV非容许细胞系，如T24、5637、PC-3、Saos-2、FS-4或COLO316。
在一些实施方案中，所述细胞可以被包括在生物样品中。生物样品可以是组织样品或来自患者的细胞样品，所述细胞样品是已从病人获得、移除或分离的。生物样品的非限制性示例包括全血或其成分(如血浆、血清)、尿液、唾液淋巴液(saliva lymph)、胆汁、痰液、泪液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液(bronchioalveolar lavage fluid)、滑膜液、精液、腹水肿瘤液、母乳及脓液。在一个实施方案中，核酸样品自血液、羊水或口腔涂片。
本文所考虑的生物样品也可包括培养的生物材料，包括源自培养的细胞的样品，如来自培养的细胞或细胞团的培养基。相应地，生物样品可以指从整个有机体或其组织、细胞或成分部分的子集或一小部分(fraction)或一部分(portion)中制备的裂解物、匀浆或提取物。生物样品也可以在使用前被处理(modified)，例如一种或更多种组分的纯化、稀释和/或离心。在一些实施方案中，所述生物样品可以从HBV感染的受试者获得。
在一些实施方案中，所述细胞可以源自选自由HepG2、HuH6、HuH7、HuH4、PLC/PRF/5、Kato III、AGS、HCT116、Caco-2、HL-60、HEK293和A549组成的组的细胞系。
在一个实施方案中，所述接触步骤可以包括在促进HBV复制的合适培养基中培养所述细胞。在另一实施方案中，所述接触步骤可以包括用HBV复制子转染所述细胞。
在一个实施方案中，所述获得所述HBV表达谱的步骤可以包括测量一个或更多个HBV复制标志物。所述一个或更多个HBV复制标志物可以选自由HBV复制子的pgRNA水平、乙肝表面抗原水平和乙肝核心抗原水平组成的组。
在一些实施方案中，所述获得HBV表达谱的步骤可以包括对所述细胞中的所述至少一种因子的Western免疫印迹分析并测量所述至少一种因子的条带强度(bandintensity)。所述至少一种因子的条带强度可以针对对照进行标准化(normalized to acontrol)。在一些实施方案中，所述至少一种因子的条带强度与对照之间1％至35％或更大的相对差异可以表明所述至少一种剂对HBV复制的调控作用。
还提供了鉴定调控病毒的复制的至少一种因子的方法。所述方法包括：a)以包含可操作地连接至所述病毒的病毒启动子的筛选标志物的表达载体转染不同来源的至少两种细胞系；b)检测所述筛选标志物的表达，以将所述至少两种细胞系分为容许细胞系和非容许细胞系；c)以包含所述病毒的病毒复制子的表达构建体转染所述容许细胞系和非容许细胞系；d)在c)的所述容许细胞系和非容许细胞系中筛选所述至少一种因子的表达，并比较所述至少一种因子在所述容许细胞系和所述非容许细胞系中的表达，以鉴定至少一种候选因子，其中所述至少一种因子在所述容许细胞系和非容许细胞系之间的差异表达是鉴定至少一种候选因子的表征；e)将所述表达细胞复制子的容许细胞系与一剂接触，以敲除所述至少一种候选因子的表达；以及f)相对于未与所述剂接触的对照细胞系，比较e)的所述容许细胞系中的所述病毒复制子的前基因组RNA水平，其中相对于对照细胞系，所述容许细胞系中前基因组RNA水平的表达水平的降低或升高表明调控所述病毒复制的至少一种因子的鉴定。(图1)
在一个实施方案中，所述至少一种候选因子可以选自由转录因子、调节(regulate)因子、RNA加工因子和信号分子组成的组。
在另一个实施方案中，所述筛选标志物可以是绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶。
在一个实施方案中，所述剂可以是siRNA或shRNA。
本文说明性描述的发明可以在缺少本文没有特别公开的任何要素或多种要素、限制或多种限制的情况下实施。因此，例如“包括(comprisng)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等术语应被广义理解，并不受限制。此外，本文所用术语和表达已被用作描述性而非限制性术语，并且使用此类术语和表达并不意图排除所示出和所描述的特征或其部分的任何等同特征，但应认识到，可以在本发明所要求保护的范围内进行各种修改。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选实施方案和任选特征进行了具体公开，本领域技术人员可以采取本文公开的其中体现的本发明的修改和变化，并且这种修改和变化是被认为在本发明的范围内。
本文已经广泛地且一般性地描述了本发明。落入一般公开内容中的每个狭义物种和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括从其中移除任何主题的附带条件或负面限制的本发明的一般性描述，无论本文中是否具体列举了所摘取的材料。
其它实施方案处于所附权利要求和非限制性实施例的范围内。此外，当以马库什组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员会认识到，本发明也由此以马库什组的任何单个成员或成员的亚组的方式进行了描述。
具体实施方式
本发明的非限制性示例，包括最佳模式在内，都将通过参考具体实施例被进一步更加详细地描述，所述实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围，而仅仅是对本发明一般概念的阐述。
材料和方法
细胞和试剂
细胞系HepG2、HuH7、PLC/PRF/5、Hep3B、AGS、A549、PC-3、Saos-2和FS-4被维持在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco's modified Eagle's培养基(DMEM)中。Caco-2在补充有20％FBS的Eagle's最低必需培养基(EMEM)中生长，而T24、5637和COLO316在补充有10％FBS的RPMI-1640中生长。Kato III被维持在补充有20％FBS的DMEM中。
全部细胞在37℃含5％CO2的潮湿培养箱中生长，并按照制造说明培养。原代人肝细胞购自Triangle Research Labs且按照推荐条件培养。原代人组织总RNA购自Zyagen。
所用一抗如下：HBcAg兔多克隆抗体(Dako)、鼠HNF4α7/8/9单克隆抗体克隆H6939(R&D Systems)、鼠HNF4α1/2/3单克隆抗体克隆K9218(R&D Systems)、鼠Slug单克隆抗体克隆A-7(Santa Cruz Biotechnology)、羊Sox7多克隆抗体(R&D Systems)、羊lamin A/C多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)、鼠β-actin单克隆抗体(Santa CruzBiotechnology)、鼠albumin单克隆抗体克隆AL-01(Santa Cruz Biotechnology)、鼠transferrin单克隆抗体克隆D-9(Santa Cruz Biotechnology)。HRP缀合的二抗购自Dako。用于免疫荧光染色的荧光团缀合抗体(Alexa
488和Alexa
546)购自LifeTechnologies。
用于检测全长Slug的引物为Slug-F(5’-CGATGCTGTAGGGACCGC-3’(SEQ ID NO:222))和Slug-R(5’-TGGTCAGCACAGGAGAAAATGC-3’(SEQ ID NO:223))。用于检测全长Sox的引物对为Sox7-F(5’-TATGCTAGCATGGCTTCGCTGCTGG-3’(SEQ ID NO:224))和Sox7-R(5’-TAATCTAGACTATGACACACTGTAGCTGTTGTAG-3’(SEQ ID NO:225))。使用Nucleospin RNA kit(Machery Nagel)提取RNA，并100ng RNA被用于第一链cDNA的合成，按生产商的说明书使用AccuScript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit。
质粒
从HBV基因型A(nt 1535-1937)的1.1x序列克隆HBV复制子，并将其插入至pcDNA3.1+质粒的CMV启动子上游(图10b)。
因此，pgRNA的合成仅依赖于在HBVCP处(nt 1600-1860)的活性转录，并且在初始的通读转录后，产生的全长pgRNA在HBV多聚腺苷酸信号处终止。通过将HBVCP插入PGL3Basic(Promega)质粒KpnI和HindIII酶切位点产生HBVCP-Luc。通过将HBVCP-Luc中的荧光素酶编码序列与来自pTurboGFP-C质粒(Evrogen)的绿色荧光蛋白(GFP)编码序列交换来产生HBVCP-GFP。
通过将来自表2、3、4中列出的两步法PCR(聚合酶链式反应)的扩增产物插入pIVEX2.5d载体NotI和XmaI限制酶切位点，并使用NotI和XbaI限制酶切位点将其亚克隆至pcDNA3.1+，产生针对不同亚型的HNF4α过表达载体。使用来自HepG2的cDNA为模板以产生HNF4α扩增子。
表2–克隆和扩增引物
| 引物 | 序列 |
| NotI-HNF4α123-F | 5’TGAGCGGCCGCGATATGCGATCTC 3’(SEQ ID NO:1) |
| NotI-HNF4α789-F | 5’TGAGCGGCCGCGATATGGTCAGCG 3’(SEQ ID NO:2) |
| HNF4α1278-XmaI-R | 5’ATTCCCGGGATAACTTCCTGCTTGGTG 3’(SEQ ID NO:3) |
| HNF4α39-XmaI-R | 5’ATTCCCGGGAGCAACTTGCCCAAAGCG 3’(SEQ ID NO:4) |
| HNF4α17F | 5’AACGGACAGATGTCCACCCCTGAGACC 3(SEQ ID NO:5) |
| HNF4α17R | 5’GGTCTCAGGGGTGGACATCTGTCCGTT 3’(SEQ ID NO:6) |
| HNF4α28F | 5’AGCAACGGACAGATGTGTGAGTGGCC 3’(SEQ ID NO:7) |
| HNF4α28R | 5’GGCCACTCACACATCTGTCCGTTGCT 3’(SEQ ID NO:8) |
表3–克隆方案
表4
| 片段 | 正向引物 | 反向引物 |
| A | NotI-HNF4α123-F | HNF4α17-R |
| B | HNF4α17-F | HNF4α1278-XmaI-R |
| C | NotI-HNF4α123-F | HNF4α28-R |
| D | HNF4α28-F | HNF4α1278-XmaI-R |
| E | NotI-HNF4α123F | HNF4α39-XmaI-R |
| F | NotI-HNF4α789-F | HNF4α17-R |
| G | NotI-HNF4α789-F | HNF4α28-R |
| H | NotI-HNF4α789-F | HNF4α39-R |
人Slug和Sox7过表达构建体购自Origene公司。使用QuickChange II Site-Directed Mutagenesis kit(Agilent Technologies)通过定点突变产生携带HBVCP-Luc中的突变的质粒。
人类转录本阵列(HTA 2.0)
在10cm培养皿中接种细胞30小时直至50％汇合后，从其提取总RNA。只使用具有RIN(RNA完整数)＞9.8的优质RNA。根据制造商的方案将来自细胞系的经处理的cRNA杂交至Affymetrix人类转录本阵列2.0。使用
Expression ConsoleTM软件(1.3.1.187版本)以log2量表(scale)对基因水平和外显子水平二者分析的数据进行归一化。只有蛋白质编码基因被考虑用于评估。
使用主成分分析法(PCA)对全局基因表达谱进行评估。所得到的主成分被用作输入以通过k均值确定样本聚类拓扑。使用Limma软件包进行差异表达分析，并且以Benjamini和Hochberg针对多次测试调整P值。仅具有调整后的P值<0.05且|log2(倍数变化)|>0.5的基因被鉴定为差异表达。上述统计分析由R 3.1.1版本实施。
使用PANTHER分类系统(版本10.0)对差异表达的基因进行基因本体论(ontology)注释分析。微阵列数据在Gene Expression Omnibus以登录号GSE72779可获得。
验证测定(以HBV pgRNA读出(readout)的siRNA)
为了确定HBV的复制是否由表5和表8中列出的基因调控，进行过表达和siRNA敲低研究以确定HBVCP活性和pgRNA合成是否受到改变的基因表达的影响。
验证测定在HBV容许细胞中进行。在HBVCP活性测定中，50ng过表达构建体或10nMsiRNA与HBVCP-Luc(荧光素酶报告基因)共转染。将相对荧光与阴性siRNA对照或空载体对照比较，并于转染后48小时确定。在pgRNA测定中，以800ng全长HBV复制子共转染50ng过表达构建体或10nM siRNA，并将转染后72小时针对GAPDH加样对照标准化的pgRNA的相对量与空载体或阴性siRNA对照的相比较。
HBV复制测定
针对HBcAg的pgRNA测定和免疫荧光染色，将HepG2和Caco-2细胞以每孔1.0-1.5×105个细胞接种于24孔板中，并用100μl OPTI-MEM培养基中的800ng HBV复制子、1.1μl
2000(ThermoFisher Scientific)转染。当指示每个构建体每孔50ng时加入过表达构建体。以5.6μl
2000转染原代人肝细胞。Slug、Sox7特异性的
Select siRNA和阴性对照siRNA购自ThermoFisher Scientific，如无特殊说明以10nM的浓度共转染。于转染后24小时加入0.2％DMSO中的10μM肽。
转染后48-72小时对细胞进行分析。使用pgRNA-F(5'ACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAG3'(SEQ ID NO:9))和pgRNA-R(5'TTCTTTATAAGGGTCAATGTCCATGCCCC 3'(SEQ ID NO:10))引物与来自ExpandTM Long Template PCR System(Sigma Aldrich)的试剂扩增全长pgRNA。HBcAg免疫荧光染色在以下步骤之后进行：使用4％多聚甲醛固定20分钟后，用PBS中0.1％TritonX-100抗原修复10分钟，用封闭缓冲液(PBS中1％牛血清白蛋白)于4℃封闭过夜。封闭缓冲液中1：100稀释的一抗在室温被加入2小时，用PBS洗涤三次并与1：1000的二抗一起孵育1小时。DAPI被用于细胞核染色。
HBVCP活性测定
HBVCP转录活性的荧光素酶报告子测定如Promega推荐的进行。将密度为每孔3×104个细胞的细胞用160ng野生型或突变HBVCP-Luc构建体转染至具有0.22μl
2000的96孔黑色透明底的板中。除非另有说明，额外的过表达构建体以每孔每个构建体10ng共转染，且siRNA以10nM。
针对单独使用HBVCP-Luc的实验，转染30小时后裂解细胞并确定荧光，针对使用过表达或敲低的实验，转染后48小时裂解细胞并确定荧光。
涉及转录因子模拟物的实验中，除非另有说明，在转染后24小时加入在0.2％DMSO中的10μM肽。
还使用HBVCP-GFP构建体评估HBVCP转录活性，并通过流式细胞术分析，使用在12孔板中的单独的1.6μg HBVCP-GFP或与100ng过表达构建体一起、2.2μl Lipofectamine
并在转染后48小时收获。将细胞在PBS中洗涤两次，重悬于染色缓冲液(2％FBS、10mM EDTA的PBS)中，通过40μm的细胞过滤器，然后进行流式细胞术。使用BD FACSCanto II(BD Biosciences)获取数据并使用Flowjo v10进行分析。
凝胶迁移测定(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)
按指导使用NEPER(细胞核和细胞质提取试剂；ThermoFisher Scientific)从转染有空载体或过表达构建体的4.5×106个细胞(使用10cm培养皿中的30μg质粒、33μlLipofectamine 2000，转染后48小时)获得细胞核裂解物。
根据推荐，使用LightShiftTM化学发光EMSA试剂盒(ThermoFisher Scientific)在1-2μg poly-dIdC存在下以0.5ng生物素探针、2μg细胞核裂解物以20μl的反应进行EMSA。使DNA-蛋白质复合物在37℃形成45分钟，并用TBE缓冲系统在5％凝胶上进行电泳。
siRNA
订书肽
使用Clustal Omega进行多序列比对以鉴定Slug、其直系同源物和人Snail与Smuc之间以及Sox7、其直系同源物和人Sox17及Sox18之间的保守DNA结合结构域和残基。
使用CFSSP(Chou&Fasman Secondary Structure Prediction Server)和JPred4预测Slug的C2H2锌指结构域内的α-螺旋的相对位置，以鉴定在每个α-螺旋的-1、+2、+3和+6位置处的DNA结合残基。
用HeliQuest绘制螺旋轮图以确定DNA结合表面，从而可以以低破坏肽-DNA相互作用的可能性放置订书烃。除非另有说明，合成纯度>95％的肽(GeneScript)，溶解于DMSO中并与0.2％DMSO中终浓度为10μM的细胞一起孵育。按照制造商说明书中的推荐针对细胞增殖进行WST-1测定(Sigma-Aldrich)。
体内动物模型
如本领域技术人员容易理解和意识到的，由于HBV不会自然地感染非灵长类动物，所以没有用于HBV复制的常规小动物模型。就此而言，针对HBV最相关的小鼠模型涉及将原代人肝细胞注射到免疫受损的小鼠中。由于本文已经使用原代人肝细胞提供了数据，因此确定将肝细胞注射到小动物中将不会为本文得出和描述的结论提供显着的额外优势。
统计学分析
数据以平均值±s.e.m.表示，并进行未配对的Student’s t检验。P<0.05时认为是显著性的。
实施例1
使用一组肝和非肝细胞系，鉴定了影响HBV复制的效率的许多宿主因子。
通过使用siRNA敲低与这些因子相关的基因，显示可以调控由HBV核心启动子控制的转录活性以及整个HBV基因组的复制。适用于每个基因靶的siRNA以等摩尔混合物的形式用于下调基因(基因ID)。这支持了这些基因可以作为靶标起作用以研发可用于调控和控制HBV复制的干预的理论。
HBV转录筛选的研发
研发HBV核心启动子(HBVCP)-绿色荧光蛋白(GFP)构建体以用于转染不同的人类细胞系。随后，具有与HBVCP结合的宿主因子的细胞系将导致转录，如GFP增加的表达所证明的。使用该筛选方法，显示在用HBVCP-GFP构建体转染后，来自肝脏(n＝5)、结肠(n＝2)、胃(n＝2)、淋巴的(n＝1)，肺(n＝1)的细胞针对GFP呈阳性。
比较而言，对照CMV-GFP载体能够在所有测定的细胞系中产生GFP。这证明在非肝容许细胞系即KATOIII、AGS、HCT116、Caco-2、HL-60和A549中HBVCP的转录是真实的(图2和3)。
因此，在一组非肝细胞系中发现这种不寻常的共享特性是可以被利用以用于鉴定驱动HBV的转录和复制的宿主细胞因子的有力工具。
针对宿主因子的筛选
使用Affymetrix GeneChip Human Trancriptome Array 2.0分析各种细胞系的转录组图谱(transcriptomic profiles)，并鉴定容许细胞系(肝、结肠、胃、血液和肺)与非容许细胞系(膀胱、乳腺、前列腺、子宫颈、肺)之间差异表达的基因。
表5列出了在HBV复制容许(n＝11)和非容许(n＝6)之间具有最显著表达水平差异的50个基因。表5列出与HBV复制效率具有最显著相关性值的转录因子、RNA加工分子和信号分子。
因此，表5中列出的基因是在HBV容许细胞和HBV非容许细胞之间差异表达的基因的组，使用siRNA将其下调时导致改变的HBVCP活性。这表明可靶向所编码的转录因子或信号通路调控因子以用于控制HBV复制，所述转录因子或信号通路调控因子调节所鉴定到的基因或其产物的HBVCP活性。
表5
验证测定(以荧光素酶读出的siRNA)
用siRNA处理HepG2细胞并用HBVCP-萤光素酶构建体转染以评估这些因子在HBVCP活性中的功能性作用。表6概括了由检测到的荧光素酶表达水平(TBC＝待确认)反映的siRNA处理对HBVCP活性的结果和影响。
表6
验证测定(以HBV pgRNA读出的siRNA)
以HBV全长(1.1×)复制子转染各种细胞系，并评估其转染效率。
结果表明非肝细胞系，如Kato III(胃)、HCT116、Caco-2(结肠)能够支持HBV全长基因组的产生(图4)。
用siRNA处理HepG2细胞并用HBV复制子转染。因此，将由siRNA处理示出下调并与pgRNA降低的水平相关的基因与对照进行比较。结果表明完整的HBV病毒基因组的复制受到这些基因的影响(图5)。
表7显示通过过表达以及表达的抑制二者来测试每个靶标(显示为基因密码)。为了满足这些严格的标准，过表达的靶标应该增强HBV复制，并且靶标的下调将导致HBV复制的减少。在我们之前的50个基因的名单中，有靶标的80-90％不符合这个严格的标准。
因此，针对调控HBV复制的有希望的靶标的基因被识别为当被下调或过表达时调控HBVCP的活性和/或调控pgRNA的表达。就此而言，表6和表7中的基因示出符合这样的筛选标准，并因此具有开发用于调控HBV复制的剂/治疗剂的可能性。
表7
实施例2
HBV转录筛选的研发
为了鉴定组织限制性宿主转录因子，如在本文实施例1中所描述的，将由HBVCP驱动的GFP报告构建体转染至一组肝和非肝细胞系(n＝14，图6a)。令人惊讶的是，除了肝细胞系，结肠(Caco-2)、胃(Kato III、AGS)和肺(A549)细胞也是GFP阳性的。来自膀胱、前列腺、骨、卵巢和皮肤的其他非肝细胞具有可忽略的GFP表达。
所有非肝细胞缺乏白蛋白和转铁蛋白(图10a)，并且CMV-GFP对照为GFP阳性(图10b)。全病毒复制子(图10c)在容许的肝细胞和非肝细胞中转录pgRNA(图6b)并产生HBcAg(图10d)，表明支持HBV复制的宿主细胞环境类似地存在于肝细胞以及所选择的非肝细胞中。
宿主因子筛选
针对全部14个细胞系的转录组图谱(Affymetrix HTA2.0，(图11a))揭示了3种不同的细胞簇：肝HBV容许、非肝HBV容许和非肝HBV非允许(图6c)。在两种容许组合和非容许组合之间的差异基因表达特征显示54个重叠基因，如表8所示(图11b、12a)，其中仅SNAI2(图6d)和HNF4α在HBVCP内具有相应的DNA结合基序(图7c)，并且因此被选为进一步研究作为调控HBV复制的有希望的靶标。
因此，表8中所列的基因是指在HBV容许细胞和非容许细胞之间被差异性调节的基因，但他们的表达与细胞中HBV容许性的特性显著相关。
表8
实施例3
SNAI2(Snail)
SNAI2编码Slug，锌指转录因子的蜗牛蛋白家族的成员。它的同系物SNAI1(Snail)和SNAI3(Smuc/ZNF293)显示与HBV容许性无关(图13a)。Slug的表达在非容许细胞中高，而在容许细胞中低/不存在；并且这种模式在相应的原代人组织(primary human tissues)中也类似地展现(图6e)。
Slug结合与HBVCP的基础核心启动子(BCP)内的pgRNA起始子重叠的E-box识别基序(图6d)，表明Slug的结合可能干扰pgRNA的起始。当通过缺失6bp基序(图13b)或将其同源结合基序从“CAACTT”突变为“TTACGT”(其也由EMSA结合的丧失所确认)使得HBVCP的活性显示增加时，其HBVCP抑制作用被证实(图6f、图13c)。基序缺失使得HBVCP对Slug的过表达不敏感(图13d)，在野生型HBVCP中Slug的过表达导致剂量依赖性转录抑制(图6g、图13e)，但在CMV-GFP对照中不是这种情况(图6h)。
随着HBV容许细胞中Slug的过表达关闭HBcAg的表达(图6i)并显着降低原代人肝细胞中的pgRNA(图6j)，全病毒复制被有效抑制。综上所述，这些结果提供了有力证据表明Slug阻断在HBVCP的pgRNA起始、阻止HBV复制。
HNF4α及其亚型
HNF4α与Slug显示mRNA表达的互斥模式(图12b)，其在蛋白质水平上被验证(图7a)，表明它们以相反方式起作用。与其作为HBVCP激活剂的作用一致，将增强子II内肝细胞核因子4α(HNF4α)结合基序的5'-半位点“AGGTTA”突变减少了HBVCP处的转录(图14a)。
由于HNF4α各亚型在容许细胞和非容许的细胞之间差异表达(图14b、c、d)。对六种克隆的亚型的功能比较(图14e)揭示HNF4α3和HNF4α1在驱动HBVCP活性方面更有效力(图7b)，与HNF4α1是肝细胞中组成型显性亚型良好相关(图7a)。在非肝容许的Kato III、Caco-2和AGS中，较弱效力的HNF4α7/8/9亚型占优势。这种关系通过发现过表达的细胞核HNF4α亚型与其预期的HBcAg表达相关(图14f)而确认。
因此，不同组织中特异性HNF4α亚型的表达示出调控HBV转录的效率。
Sox7及与HNF4α的相互作用
位于HNF4α结合基序的3'末端的是另一个相反方向的基序，该相反方向的基序似乎结合SOX(SRY相关的HMG盒)家族转录因子Sox7(图7c)。Sox7是在容许细胞和非容许细胞之间差异表达的唯一亚组F成员(图15a)。在肝、结肠和胃的原代人体组织中确认了HBV容许细胞中的低Sox7表达(图15b)。
由于Sox7和HNF4α结合基序重叠一个核苷酸，因此Sox7可能影响HNF4α的结合。使用带有Sox7基序“TTTGTA”的EMSA探针，一突出的Sox7条带被捕获(pulled down)，当其突变为“TCCATA”时，其大大减少(图7d)。HNF4α在HNF4α缺陷的PC-3细胞中过表达时也被捕获。在HNF4α和Sox7结合位点之间插入的“ACT”间隔物减轻了空间结合干扰，使更多HNF4α结合“HNF4αN3Sox7”探针。
讨论
因此，示出因为容许细胞中的Sox7过表达以剂量依赖性方式减少了HBVCP处的转录，而在CMV-GFP对照中没有(图7e)，Sox7的结合干扰了HNF4α功能(图7e、f和图15c)。在结合基序被删除时看到了类似的结果(图15d)。由于转染有HBV复制子的容许细胞展示出HBcAg(图7g)和pgRNA(图7h)的缺失，Sox7过表达进一步抑制全病毒复制。因此Sox7与HBVCP上的HNF4α结合竞争以阻遏HBV转录。
实施例4
尽管Slug和Sox7是独立阻遏物，但是两种因子一起共表达导致更有效力且增强的HBV复制遏制(图8a、b)。
在原代人肝细胞中，因为几乎检测不到pgRNA，所以Slug和Sox7的共表达显着减少了全病毒复制(图8c)。鉴于Sox7仅在T24、5637和PC-3非容许细胞(图8d)中明显表达，这些双阳性细胞(Slug+Sox7+)可能对HBV复制具有更大的抗逆力(resilience)。与此相一致，PC-3中非活性的HBVCP不能单独由HNF4α过表达激活(图16a)。在HNF4α3存在下，单独的Slug或Sox7表达下调足以阻断HBVCP转录(图8e)，而只有当Slug和Sox7两者同时下调时才在HNF4α3存在下转录激活。
类似地，在5637细胞中，Slug和Sox7结合基序的同时突变提升了转录屏障，在HNF4α3存在下激活HBVCP(图16b)。
验证测定(siRNA)
作为其合作效应的进一步确认，在用Slug siRNA处理的PC-3(Sox7+)和Saos-2(Sox7-)细胞中过表达HNF4α3。只有Saos-2细胞系呈阳性反应(图8f)，表明HBV仅通过下调单一因子-Slug在Sox7-非容许细胞中容易地复制。事实上，用Slug siRNA处理的Sox7-非容许细胞合成了来自HBV复制子的pgRNA，而Sox7+细胞保持非容许(图8g)。
综上所述，这些结果显示单独的HNF4α不能在存在Sox7的情况下克服Slug阻遏信号，并且Slug和Sox7确定HBV非容许性以沉默HBV复制(图8h)。
SNAI2(Slug)和Sox7在HBV转录上的验证
为了验证宿主Slug和Sox7的功能性，从它们各自的DNA结合结构域产生短的订书肽以测试它们沉默HBV转录的能力。
Slug通过相对于其跨越slug的氨基酸残基128-264的5个C2H2锌指结构(ZF)内的α-螺旋的保守残基-1、+2、+3和+6来结合DNA(图17a)。具体地，组成每个锌指结构的氨基酸残基如下注释：ZF1＝128-150；ZF2＝159-181；ZF3＝184-207；ZF4＝213-235；ZF5＝241-264。
针对每个α-螺旋设计订书肽(图9a)，并通过比较使用HBVCP-Luc报道子中的IC50确定相对功能(图9b)。具体地，所使用的钉合肽的氨基酸序列如下：
●Slug-ZF1s＝127-YSTFSGLAKHKQLH-150(SEQ ID NO:215)；
●Slug-ZF2s＝166-KEYVSLGALKMHIRTH-181(SEQ ID NO:216)；
●Slug-ZF3s＝192-KAFSRPWLLQGHIRTH-207(SEQ ID NO:217)；
●Slug-ZF4s＝222-FADRSNLRAHLQTH-235(SEQ ID NO:218)；以及
●Slug-ZF5s＝250-FSRMSLLHKHEES-262(SEQ ID NO:219)。
这些Slug序列中的下划线指示了所述订书(staple)连接并交联的氨基酸残基。具体而言，Slug-ZF1中的订书将残基130和134交联；Slug-ZF2s中的订书将残基171和178交联；Slug-ZF3s中的订书交联残基197和201；Slug-ZF4s中的订书交联残基229和233；Slug-ZF5s中的订书将残基253和257交联。
所有肽通过抑制除Slug-ZF1s之外的HBVCP(图9b)处的转录来重演(recapitulate)Slug功能。值得注意的是，Slug-ZF4和Slug-ZF5s是强有效的多肽，其单独抑制HepG2中HBVCP转录至与天然Slug蛋白相似的程度(图9c)。他们特异性地作用于HBVCP，因为Slug基序的删除消除了其抑制效应(图17b)。由于非订书版本表现出较弱的转录抑制(图17c)，所以需要订书烃的功能。
Sox7通过其HMG-Box跨越氨基酸残基45-116结合DNA并含有3个α-螺旋(H1-H3)，其中H1＝残基51-64、H2＝残基71-85和H3＝残基88-107。
基于直向同源物与人Sox17和Sox18之间的Sox17-DNA晶体学数据和序列保守性，仅α-螺旋H1和H2对DNA具有高亲和力(图18a)，因此与H3相比，H1和H2可能与DNA结合更加相关。订书肽Sox7-H1s和Sox7-H2s(图9d)通过以剂量依赖性方式减少HBVCP的转录来独立地模拟Sox7功能(图9e)。具体地，所使用的订书肽的氨基酸序列如下：
Sox7-H1s＝51-AFMVWAKDERKRLA-64(SEQ ID NO:220)；以及
Sox7-H2s＝71-HNAELSKMLGKSWKA-85(SEQ ID NO:221)。
这些Sox7序列中的下划线指示了订书连接并交联的氨基酸残基。具体而言，Sox7-H1s中的订书交联残基54和58；并且Sox7-H2s中的订书交联残基75和82。
订书肽抑制转录至相似的程度(图9f)，但功能仍不如Sox7蛋白，可能表明两者对于重演Sox7功能是必需的。
因为非订合形式也不能抑制HBVCP转录(图19b)，肽订合(stapling)对于保持肽功能是必需的。
讨论
由于Slug和Sox7一起禁止HBV复制，所以模拟物Slug-ZF4s、Slug-ZF5s、Sox7-H1s和Sox7-H2s在一起使用时可以实现最大的抑制。模拟物的顺序添加证实了这一点，因为Slug模拟物胜过单独的Slug-ZF4s或Slug-ZF5s，添加Sox7-H2s进一步降低了HBVCP活性，当同时还添加Sox7-H1s时损失最大(图9g)。当评估抑制HBV复制的能力时，观察到单独使用Slug模拟物可以降低pgRNA，并且当将Sox7模拟物添加到用HBV复制子转染的原代人肝细胞和HBV容许细胞时，pgRNA显著地进一步降低至可忽略的水平(图9h)。这不是细胞毒性的结果，因为细胞的增殖能力与DMSO处理的对照没有区别(扩展数据图18c)。
因此，本文所描述的订书肽和模拟物能够在细胞系(图9c、e、f)和原代人肝细胞(图9g)中抑制HBV复制。特别地，对一些肽的HBV抑制程度与在HepG2肝细胞中过表达整个蛋白质是可比的。
就此而言，订书肽或模拟物仅需要对长度和订书位置进行微小改变来进行功能优化。此外，当以足以抑制HBV复制的浓度使用时，订书肽或模拟物对HepG2细胞没有细胞毒性(图18c)。值得注意的是，HepG2细胞通常是细胞毒性测定选择的细胞，因为它们具有解毒所需的大部分功能性酶，并仅次于原代人肝细胞。
虽然核苷/核苷酸类似物和干扰素可用于治疗HBV感染，但它们需要长期使用，因为它们不能将HBV复制抑制到足够低的免疫清除水平。因此，基于本文公开的发现和数据开发的订书肽或模拟物可使HBV复制最小化，使当前治疗剂更有效，因此产生减少患者对病毒清除的药物依赖性的优势。就此而言，本文所述的代表性订书肽或模拟物显示出显著的优势，因为它们几乎与天然完整蛋白质(例如Slug和Sox7)一样有效。就此而言，约13-14个氨基酸长度的特定肽序列看上去足够特异，因为它们具有抑制HBVCP所需的效力。
图9h显示来自Slug的2个片段和来自Sox7的2个片段被赋予非常高的抑制HBV转录的效力。这些实验用原代人肝细胞(以及细胞系)进行，其进一步支持和证实了它们在调控HBV复制中的相关性并且用于本文公开的方法和治疗性治疗中。总之，本发明阐明了Slug和Sox7是决定细胞支持HBV复制的能力的独立转录阻遏物。虽然HNF4α是提高病毒复制效率的激活剂，但只有当Slug和Sox7缺失时它才能起作用。由于有效的HBVCP激活剂HNF4α1优先在肝细胞中富集，因此本文公开的数据提供了主要在肝中的HBV复制的基本见解。使用源自Slug和Sox7的DNA结合结构域的订书肽和模拟物，已显示HBV复制通过抑制HBVCP活性和pgRNA转录而被成功沉默，表明新型的HBV治疗剂可通过本文所描述的靶向所鉴定的宿主因子来研发。此外，由于病毒依赖宿主因子进行复制，该宿主阻遏物分子模拟的途径也可以用于抑制其他病毒的复制。
SEQUENCE LISTING
<110> 新加坡科技研究局
<120> 乙型肝炎病毒复制的调控
<130> 9869SG3970
<150> SG 10201505551U
<151> 2015-07-15
<160> 225
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
tgagcggccg cgatatgcga tctc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 2
tgagcggccg cgatatggtc agcg 24
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attcccggga taacttcctg cttggtg 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 4
attcccggga gcaacttgcc caaagcg 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
aacggacaga tgtccacccc tgagacc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ggtctcaggg gtggacatct gtccgtt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
agcaacggac agatgtgtga gtggcc 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
ggccactcac acatctgtcc gttgct 26
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
acaccgcctc agctctgtat cgag 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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ttctttataa gggtcaatgt ccatgcccc 29
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<212> RNA
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<223> ARID3A siRNA 1
<400> 11
gagaucaacg gcaucaugu 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
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<220>
<223> ARID3A siRNA 2
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cuuacgagga gcaguuuaa 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARID3A siRNA 3
<400> 13
ucaaauaacu cguugccuu 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARID3A siRNA 4
<400> 14
gaaacuacag gccgugaug 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATF2 siRNA 1
<400> 15
gagaagagca gcuaacgaa 19
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<212> RNA
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caugguagcg gauugguua 19
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ggaaguacca uuggcacaa 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> ATF2 siRNA 4
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ugaggagccu ucuguugua 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> ATF3 siRNA 1
<400> 19
gagcuaagca gucguggua 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATF3 siRNA 2
<400> 20
gcaaagugcc gaaacaaga 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATF3 siRNA 3
<400> 21
agaagcagca uuugauaua 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATF3 siRNA 4
<400> 22
cgagaaagaa auaagauug 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> ATF4 siRNA 1
<400> 23
cagauuggau guuggagaa 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATF4 siRNA 2
<400> 24
cgacuuggau gcccuguug 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATF4 siRNA 3
<400> 25
gaagaacgag gcucuaaaa 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATF4 siRNA 4
<400> 26
gagauaggaa gccagacua 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CALCOCO1 siRNA 1
<400> 27
gugcagagau acuucgauu 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CALCOCO1 siRNA 2
<400> 28
ggacauccug agccggcaa 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CALCOCO1 siRNA 3
<400> 29
ugacagacuc agaggacga 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CALCOCO1 siRNA 4
<400> 30
ugucagaaag uaagcggga 19
<210> 31
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CHD3 siRNA 1
<400> 31
gaauaucccu gaauacgaa 19
<210> 32
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CHD3 siRNA 2
<400> 32
ccagaaugau gcucaauuu 19
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CHD3 siRNA 3
<400> 33
cauaagaggc ggaguaaga 19
<210> 34
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CHD3 siRNA 4
<400> 34
cguaugagcu gaucaccau 19
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CNOT11 siRNA 1
<400> 35
ggaugaacuu gcuuggcua 19
<210> 36
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CNOT11 siRNA 2
<400> 36
guguggagau caaacgaau 19
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CNOT11 siRNA 3
<400> 37
ggaaguugua aaucgacua 19
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CNOT11 siRNA 4
<400> 38
auucaguagg auacgagaa 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DCP1A siRNA 1
<400> 39
gcaagcuugu cgauauaua 19
<210> 40
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DCP1A siRNA 2
<400> 40
acucauggcu gauguggua 19
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DCP1A siRNA 3
<400> 41
acaagcaucu gacgguaga 19
<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DCP1A siRNA 4
<400> 42
ccaauucauu ccuaccauu 19
<210> 43
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DDX39B siRNA 1
<400> 43
guagaagacu cgcccauuu 19
<210> 44
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DDX39B siRNA 2
<400> 44
gggcuuggcu aucacauuu 19
<210> 45
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DDX39B siRNA 3
<400> 45
gaauggaugu ccugugcca 19
<210> 46
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DDX39B siRNA 4
<400> 46
gaacugcccg cauaucguc 19
<210> 47
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DYRK1B siRNA 1
<400> 47
gagaugaagu acuauauag 19
<210> 48
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DYRK1B siRNA 2
<400> 48
cgaaagaacu caggaagga 19
<210> 49
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DYRK1B siRNA 3
<400> 49
ggugaaagcc uaugaucau 19
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DYRK1B siRNA 4
<400> 50
ggaccuaccg cuacagcaa 19
<210> 51
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2F6 siRNA 1
<400> 51
caacggaccu aucgauguc 19
<210> 52
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2F6 siRNA 2
<400> 52
uagcauaugu gaccuauca 19
<210> 53
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2F6 siRNA 3
<400> 53
guaagcaacu gauggcauu 19
<210> 54
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2F6 siRNA 4
<400> 54
gaacagaucg ucauugcag 19
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2F7 siRNA 1
<400> 55
gcacacaucg ugagacguu 19
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2F7 siRNA 2
<400> 56
ugacuaaccu gccgcuuug 19
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2F7 siRNA 3
<400> 57
caaggacgau gcauuuaca 19
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2F7 siRNA 4
<400> 58
ggacuauucc gacccauug 19
<210> 59
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPAS1 siRNA 1
<400> 59
ggcagcaccu cacauuuga 19
<210> 60
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPAS1 siRNA 2
<400> 60
gagcgcaaau guacccaau 19
<210> 61
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPAS1 siRNA 3
<400> 61
gacaaggucu gcaaagggu 19
<210> 62
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPAS1 siRNA 4
<400> 62
gcaaagacau guccacaga 19
<210> 63
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXN2 siRNA 1
<400> 63
ccuuuagucu ucucauuua 19
<210> 64
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXN2 siRNA 2
<400> 64
ggaugaggua uaugaauuu 19
<210> 65
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXN2 siRNA 3
<400> 65
ggauuaagcc agauuuaca 19
<210> 66
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXN2 siRNA 4
<400> 66
caugaaagca cuaaucuuc 19
<210> 67
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIVEP2 siRNA 1
<400> 67
caucauggcu uccgauuau 19
<210> 68
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIVEP2 siRNA 2
<400> 68
cgaagcauau gaaaucuaa 19
<210> 69
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIVEP2 siRNA 3
<400> 69
gcacuuaaga ccuugugua 19
<210> 70
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIVEP2 siRNA 4
<400> 70
gggauaggau ucaacauug 19
<210> 71
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KANK2 siRNA 1
<400> 71
cgugcgaucu aucaugaaa 19
<210> 72
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 72
cagcucacag uacaacuua 19
<210> 73
<211> 19
<212> RNA
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<220>
<223> KANK2 siRNA 3
<400> 73
gacgagagcc cuacaucau 19
<210> 74
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KANK2 siRNA 4
<400> 74
gaacgggacu ugggcaugc 19
<210> 75
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LIN54 siRNA 1
<400> 75
aaauagugga ggcggaaaa 19
<210> 76
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LIN54 siRNA 2
<400> 76
gaacagggaa uguggguua 19
<210> 77
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LIN54 siRNA 3
<400> 77
gucaggagau gcuaaguua 19
<210> 78
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LIN54 siRNA 4
<400> 78
gugaaugcua ugaggcaaa 19
<210> 79
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL siRNA 1
<400> 79
gcaaagaagg uggucguuu 19
<210> 80
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL siRNA 2
<400> 80
gauaguuacu gaccgggaa 19
<210> 81
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL siRNA 3
<400> 81
caaaucugcu ccugaauua 19
<210> 82
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL siRNA 4
<400> 82
gaaagaagac gaaguuuga 19
<210> 83
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNPT1 siRNA 1
<400> 83
gacagaagua guauuguaa 19
<210> 84
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNPT1 siRNA 2
<400> 84
acagaaagau uauuggcua 19
<210> 85
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNPT1 siRNA 3
<400> 85
gaauguaagu ugugaggua 19
<210> 86
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNPT1 siRNA 4
<400> 86
aaucagagau acuggugua 19
<210> 87
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> POLR3E siRNA 1
<400> 87
uggauaaggc ugacgccaa 19
<210> 88
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> POLR3E siRNA 2
<400> 88
gggagcagau ugcgcugaa 19
<210> 89
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> POLR3E siRNA 3
<400> 89
cgacgagacc agcacguau 19
<210> 90
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> POLR3E siRNA 4
<400> 90
ccucgaugac cuacgauga 19
<210> 91
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNASEH2A siRNA 1
<400> 91
cgggaaaggc uguuugcga 19
<210> 92
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNASEH2A siRNA 2
<400> 92
aaauggagga cacggacuu 19
<210> 93
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNASEH2A siRNA 3
<400> 93
augcauugga ccagggcgu 19
<210> 94
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNASEH2A siRNA 4
<400> 94
agacccuauu ggagagcga 19
<210> 95
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNF4 siRNA 1
<400> 95
gcuaauacuu gcccaacuu 19
<210> 96
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNF4 siRNA 2
<400> 96
gaauggacgu cucaucguu 19
<210> 97
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNF4 siRNA 3
<400> 97
gacagagacg uauauguga 19
<210> 98
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNF4 siRNA 4
<400> 98
gcaauaaauu cuagacaag 19
<210> 99
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERBP1 siRNA 1
<400> 99
caaaauaagg accgggcaa 19
<210> 100
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERBP1 siRNA 2
<400> 100
aggcugagga agucgguaa 19
<210> 101
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERBP1 siRNA 3
<400> 101
gggugaagga ggcgaauuu 19
<210> 102
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERBP1 siRNA 4
<400> 102
gaaagaagga auaagacga 19
<210> 103
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SKA1 siRNA 1
<400> 103
gggaggacuu acucguuau 19
<210> 104
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SKA1 siRNA 2
<400> 104
auuauugggc uuucguaua 19
<210> 105
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SKA1 siRNA 3
<400> 105
ugaagaaccu gaacccgua 19
<210> 106
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SKA1 siRNA 4
<400> 106
guacaugaaa ucccgcuua 19
<210> 107
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMAD3 siRNA 1
<400> 107
caacaggaau gcagcagug 19
<210> 108
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMAD3 siRNA 2
<400> 108
gaguucgccu ucaauauga 19
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMAD3 siRNA 3
<400> 109
ggacgcaggu ucuccaaac 19
<210> 110
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMAD3 siRNA 4
<400> 110
uuagagacau caaguaugg 19
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNAI2 siRNA 1
<400> 111
ucucuccucu uuccggaua 19
<210> 112
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNAI2 siRNA 2
<400> 112
gcgaugccca gucuagaaa 19
<210> 113
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNAI2 siRNA 3
<400> 113
acagcgaacu ggacacaca 19
<210> 114
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNAI2 siRNA 4
<400> 114
gaaugucucu ccugcacaa 19
<210> 115
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX7 siRNA 1
<400> 115
agagcaacuu cccgcaaau 19
<210> 116
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX7 siRNA 2
<400> 116
gaaaauggga uugaguuaa 19
<210> 117
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX7 siRNA 3
<400> 117
caaagggacu cauacaauu 19
<210> 118
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX7 siRNA 4
<400> 118
gcauaacagu gugcugaaa 19
<210> 119
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SSB siRNA 1
<400> 119
ggucguagau uuaaaggaa 19
<210> 120
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SSB siRNA 2
<400> 120
gguuagaaga uaaagguca 19
<210> 121
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SSB siRNA 3
<400> 121
gagaccagua guuuaguaa 19
<210> 122
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SSB siRNA 4
<400> 122
gggaaguacu agaaggaga 19
<210> 123
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAM siRNA 1
<400> 123
gaacgaagau ccgauguau 19
<210> 124
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAM siRNA 2
<400> 124
ccacaaagau ccucacguu 19
<210> 125
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAM siRNA 3
<400> 125
ggaguuacgu ucccagcua 19
<210> 126
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAM siRNA 4
<400> 126
cauccagucu cuuaacuaa 19
<210> 127
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFAP2A siRNA 1
<400> 127
guauuaacau cccagauca 19
<210> 128
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFAP2A siRNA 2
<400> 128
cguaaagcug ccaacguua 19
<210> 129
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFAP2A siRNA 3
<400> 129
ccaccuagcc agggacuuu 19
<210> 130
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFAP2A siRNA 4
<400> 130
uaacaaggac aaccucuuc 19
<210> 131
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFAP2C siRNA 1
<400> 131
ccgauaaugu caaguacga 19
<210> 132
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFAP2C siRNA 2
<400> 132
acacuggagu cgccgaaua 19
<210> 133
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFAP2C siRNA 3
<400> 133
guaaaccagu ggcagaaua 19
<210> 134
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFAP2C siRNA 4
<400> 134
ggacaagauu ggguugaau 19
<210> 135
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFB2M siRNA 1
<400> 135
caaaugauuc cucgucaaa 19
<210> 136
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFB2M siRNA 2
<400> 136
accaagaacu uaacaccua 19
<210> 137
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFB2M siRNA 3
<400> 137
gaaacucgca uaugacuug 19
<210> 138
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFB2M siRNA 4
<400> 138
gaucggagau uggcugaga 19
<210> 139
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TP73 siRNA 1
<400> 139
gagacgagga cacguacua 19
<210> 140
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TP73 siRNA 2
<400> 140
gcaauaaucu cucgcagua 19
<210> 141
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TP73 siRNA 3
<400> 141
gaacuuugag auccugaug 19
<210> 142
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TP73 siRNA 4
<400> 142
ccaccauccu guacaacuu 19
<210> 143
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM24 siRNA 1
<400> 143
gagcauagau accaauuua 19
<210> 144
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM24 siRNA 2
<400> 144
gaagaacgcc aguugcuua 19
<210> 145
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM24 siRNA 3
<400> 145
gaucauagau acacuaauc 19
<210> 146
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM24 siRNA 4
<400> 146
uaacugugcc ugauuauua 19
<210> 147
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM27 siRNA 1
<400> 147
cggagagucu aaagcaguu 19
<210> 148
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM27 siRNA 2
<400> 148
gaaccagcuc gaccauuua 19
<210> 149
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM27 siRNA 3
<400> 149
gagaugggcg ugugcgaga 19
<210> 150
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM27 siRNA 4
<400> 150
uaagagaggc ucaguuaua 19
<210> 151
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM68 siRNA 1
<400> 151
gaagggaaau gaguaccga 19
<210> 152
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM68 siRNA 2
<400> 152
gaacuggggu uacaccugu 19
<210> 153
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM68 siRNA 3
<400> 153
gagagauccu gaagacuua 19
<210> 154
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIM68 siRNA 4
<400> 154
gaggaugucu ugauaaugu 19
<210> 155
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WDR54 siRNA 1
<400> 155
gcuaugaccu ugcggagau 19
<210> 156
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WDR54 siRNA 2
<400> 156
ccaacauugu acugagcga 19
<210> 157
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WDR54 siRNA 3
<400> 157
aggcuauggg aacggacaa 19
<210> 158
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WDR54 siRNA 4
<400> 158
gcucgcaacc ucacguauu 19
<210> 159
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZNF518A siRNA 1
<400> 159
cgauauagcc caaaugauu 19
<210> 160
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZNF518A siRNA 2
<400> 160
gcuaauauuc gcagcacua 19
<210> 161
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZNF518A siRNA 3
<400> 161
cuugcuaagu auucaguaa 19
<210> 162
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZNF518A siRNA 4
<400> 162
gcaaaggacg guacugcua 19
<210> 163
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HNF4a siRNA 1
<400> 163
gaccggauca gcacucgaa 19
<210> 164
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HNF4a siRNA 2
<400> 164
cggaagaacc acauguacu 19
<210> 165
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HNF4a siRNA 3
<400> 165
gggcuggcau gaagaagga 19
<210> 166
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HNF4a siRNA 4
<400> 166
ccaaguacau cccagcuuu 19
<210> 167
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPD siRNA 1
<400> 167
gaaauucgca ugaugucua 19
<210> 168
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPD siRNA 2
<400> 168
gaacuagguu gugugaaau 19
<210> 169
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPD siRNA 3
<400> 169
ggagaacaau cgugagucu 19
<210> 170
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPD siRNA 4
<400> 170
gcacaguugc uauaccuaa 19
<210> 171
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSNK2A2 siRNA 1
<400> 171
gaguuugggc uguauguua 19
<210> 172
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSNK2A2 siRNA 2
<400> 172
gggacaacau ucacggaaa 19
<210> 173
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSNK2A2 siRNA 3
<400> 173
gauagaucac caacagaaa 19
<210> 174
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSNK2A2 siRNA 4
<400> 174
uuaagcaacu cuaccagau 19
<210> 175
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HERPUD1 siRNA 1
<400> 175
cgacaguacu acaugcaau 19
<210> 176
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HERPUD1 siRNA 2
<400> 176
gggccaccgu uguuaugua 19
<210> 177
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HERPUD1 siRNA 3
<400> 177
ggcuucagcu uuccugguu 19
<210> 178
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HERPUD1 siRNA 4
<400> 178
gcggaugaau gcacaaggu 19
<210> 179
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KPNA3 siRNA 1
<400> 179
gucaaucucu gcaggaaua 19
<210> 180
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KPNA3 siRNA 2
<400> 180
gauaauggcc ggugaugaa 19
<210> 181
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KPNA3 siRNA 3
<400> 181
gaaaagauca gguugagua 19
<210> 182
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KPNA3 siRNA 4
<400> 182
acaaggaggu accuacaau 19
<210> 183
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAK1IP1 siRNA 1
<400> 183
cuagugugcc ucugcgaau 19
<210> 184
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAK1IP1 siRNA 2
<400> 184
uuuaaucagu ggagcggaa 19
<210> 185
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAK1IP1 siRNA 3
<400> 185
caucacagug guacaauaa 19
<210> 186
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAK1IP1 siRNA 4
<400> 186
gucgguuggu acagauaaa 19
<210> 187
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRDX3 siRNA 1
<400> 187
guagaucacc cauguguau 19
<210> 188
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRDX3 siRNA 2
<400> 188
gaacaucgca cucuuguca 19
<210> 189
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRDX3 siRNA 3
<400> 189
agacuacggu gugcuguua 19
<210> 190
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRDX3 siRNA 4
<400> 190
gagcuugaca aauuuauug 19
<210> 191
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTP4A1 siRNA 1
<400> 191
gauuguugau gacugguua 19
<210> 192
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTP4A1 siRNA 2
<400> 192
ccaaugcgac cuuaaacaa 19
<210> 193
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTP4A1 siRNA 3
<400> 193
gcaagcaacu ucuguauuu 19
<210> 194
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTP4A1 siRNA 4
<400> 194
gaaagaaggu auccauguu 19
<210> 195
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RHOB siRNA 1
<400> 195
gcauccaagc cuacgacua 19
<210> 196
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RHOB siRNA 2
<400> 196
cagaacggcu gcaucaacu 19
<210> 197
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RHOB siRNA 3
<400> 197
cgacgagcau guccgcaca 19
<210> 198
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RHOB siRNA 4
<400> 198
aagcacuucu gucccaaug 19
<210> 199
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNF43 siRNA 1
<400> 199
gcagaacaga aagcuauua 19
<210> 200
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNF43 siRNA 2
<400> 200
uaugaugugu ggauccuaa 19
<210> 201
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNF43 siRNA 3
<400> 201
ggagaaagcu auugcacag 19
<210> 202
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNF43 siRNA 4
<400> 202
gguggagucu gaaagauca 19
<210> 203
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SRPK1 siRNA 1
<400> 203
gaacauaacg gaccacugg 19
<210> 204
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SRPK1 siRNA 2
<400> 204
gauaccaugu gauccgaaa 19
<210> 205
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SRPK1 siRNA 3
<400> 205
gcagcuggcu ucacagauu 19
<210> 206
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SRPK1 siRNA 4
<400> 206
acacauaucu gcaugguau 19
<210> 207
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STRADB siRNA 1
<400> 207
gcaccaaaau ggcuguauu 19
<210> 208
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STRADB siRNA 2
<400> 208
gggauuacag caugugaau 19
<210> 209
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STRADB siRNA 3
<400> 209
aguaaauagu gaccgauua 19
<210> 210
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STRADB siRNA 4
<400> 210
gguauaaugu gaagucaga 19
<210> 211
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STT3B siRNA 1
<400> 211
gagcaucaac cuacgacuu 19
<210> 212
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STT3B siRNA 2
<400> 212
gaucacaaac cucgaguca 19
<210> 213
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STT3B siRNA 3
<400> 213
agaugaacau gcacgagua 19
<210> 214
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STT3B siRNA 4
<400> 214
acauagcacu ggugggaaa 19
<210> 215
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Slug-ZF1s
<400> 215
Tyr Ser Thr Phe Ser Gly Leu Ala Lys His Lys Gln Leu His
1 5 10
<210> 216
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Slug-ZF2s
<400> 216
Lys Glu Tyr Val Ser Leu Gly Ala Leu Lys Met His Ile Arg Thr His
1 5 10 15
<210> 217
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Slug-ZF3s
<400> 217
Lys Ala Phe Ser Arg Pro Trp Leu Leu Gln Gly His Ile Arg Thr His
1 5 10 15
<210> 218
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Slug-ZF4s
<400> 218
Phe Ala Asp Arg Ser Asn Leu Arg Ala His Leu Gln Thr His
1 5 10
<210> 219
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Slug-ZF5s
<400> 219
Phe Ser Arg Met Ser Leu Leu His Lys His Glu Glu Ser
1 5 10
<210> 220
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sox7-H1s
<400> 220
Ala Phe Met Val Trp Ala Lys Asp Glu Arg Lys Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 221
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sox7-H2s
<400> 221
His Asn Ala Glu Leu Ser Lys Met Leu Gly Lys Ser Trp Lys Ala
1 5 10 15
<210> 222
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Slug-F 引物
<400> 222
cgatgctgta gggaccgc 18
<210> 223
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Slug-R 引物
<400> 223
tggtcagcac aggagaaaat gc 22
<210> 224
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sox7-F 引物
<400> 224
tatgctagca tggcttcgct gctgg 25
<210> 225
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sox7-R 引物
<400> 225
taatctagac tatgacacac tgtagctgtt gtag 34
Claims (10)
1.一种抑制细胞中HBV复制的体外方法，包括：
使所述细胞与至少一种选自由以下组成的组的肽接触：Slug-ZF2s、Slug-ZF3s、Slug-ZF4s、Slug-ZF5s、Sox7-H1s和Sox7-H2s，其中Slug-ZF2s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 216所示，Slug-ZF3s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 217所示，Slug-ZF4s的氨基酸序列如SEQ IDNO: 218所示，Slug-ZF5s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 219所示，Sox7-H1s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 220所示，且Sox7-H2s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 221所示，
其中所述细胞选自由HepG2、Caco-2和原代人肝细胞组成的组；并且
其中所述至少一种肽是订书肽。
2.根据权利要求1所述的体外方法，其中所述接触步骤包括在所述至少一种肽的存在下培养细胞。
3.根据权利要求1所述的体外方法，其中所述至少一种肽是以下的组合：选自由Slug-ZF2s、Slug-ZF3s、Slug-ZF4s和Slug-ZF5s组成的组的至少一种肽，以及选自由Sox7-H1s和Sox7-H2s组成的组的至少一种肽。
4.根据权利要求3所述的体外方法，其中所述至少一种肽是Slug-ZF4s、Slug-ZF5s、Sox7-H1s和Sox7-H2s的组合。
5. 至少一种肽在制备用于治疗受试者中的HBV感染的药物中的用途，所述至少一种肽选自由以下组成的组：Slug-ZF2s、Slug-ZF3s、Slug-ZF4s、Slug-ZF5s、Sox7-H1s和Sox7-H2s，其中Slug-ZF2s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 216所示，Slug-ZF3s的氨基酸序列如SEQID NO: 217所示，Slug-ZF4s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 218所示，Slug-ZF5s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 219所示，Sox7-H1s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 220所示，且Sox7-H2s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 221所示，
其中所述至少一种肽抑制HBV复制；并且
其中所述至少一种肽是订书肽。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述至少一种肽是以下的组合：选自由：Slug-ZF2s、Slug-ZF3s、Slug-ZF4s和Slug-ZF5s组成的组的至少一种肽，以及选自由Sox7-H1s和Sox7-H2s组成的组的至少一种肽。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述至少一种肽是Slug-ZF4s、Slug-ZF5s、Sox7-H1s和Sox7-H2s的组合。
8. 至少一种肽在制备用于治疗受试者中的与HBV感染相关的疾病或病症的药物中的用途，所述至少一种肽选自由以下组成的组：Slug-ZF2s、Slug-ZF3s、Slug-ZF4s、Slug-ZF5s、Sox7-H1s和Sox7-H2s，其中Slug-ZF2s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 216所示，Slug-ZF3s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 217所示，Slug-ZF4s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 218所示，Slug-ZF5s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 219所示，Sox7-H1s的氨基酸序列如SEQ ID NO:220所示，且Sox7-H2s的氨基酸序列如SEQ ID NO: 221所示，
其中所述至少一种肽抑制HBV复制；
其中所述至少一种肽是订书肽；并且
其中所述疾病或病症是选自黄疸、肝炎、肝纤维化、炎症、肝硬化、肝功能衰竭、弥漫性肝细胞炎性疾病、噬血细胞综合征、血清性肝炎、HBV病毒血症、脂肪肝、肝细胞癌、肝病相关的移植、肾小球肾炎、血脂异常、造血系统恶性肿瘤或胰腺炎的肝脏疾病。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述至少一种肽是以下的组合：选自由：Slug-ZF2s、Slug-ZF3s、Slug-ZF4s和Slug-ZF5s组成的组的至少一种肽，以及选自由Sox7-H1s和Sox7-H2s组成的组的至少一种肽。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述至少一种肽是Slug-ZF4s、Slug-ZF5s、Sox7-H1s和Sox7-H2s的组合。
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Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US20210340501A1 (en) * | 2018-08-27 | 2021-11-04 | The Regents Of The University Of California | Methods to Control Viral Infection in Mammalian Cells |
| US10913951B2 (en) * | 2018-10-31 | 2021-02-09 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Silencing of HNF4A-P2 isoforms with siRNA to improve hepatocyte function in liver failure |
| EP3911736A4 (en) * | 2019-01-14 | 2022-11-30 | Agency for Science, Technology and Research | ADVANCED CELL-BASED SCREENING PLATFORM FOR ANTI-HBV THERAPEUTICS |
| WO2020206055A1 (en) * | 2019-04-02 | 2020-10-08 | Yale University | Methods of treatment of diseases and disorders associated with increased tet level, increased h19 level, increased level of tgf signaling, or any combination thereof |
| CN113456798B (zh) * | 2021-06-10 | 2022-03-25 | 武汉大学 | 新型冠状病毒SARS-CoV-2 NSP13基因的用途 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002094796A2 (en) * | 2001-05-18 | 2002-11-28 | Axxima Pharmaceuticals Ag | Benzo[g]quinoxaline derivatives as effective compounds against infectious diseases |
| WO2010127246A2 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Burnham Institute For Medical Research | Hnf4 modulators and methods of use |
| WO2011106106A2 (en) * | 2010-02-24 | 2011-09-01 | Oryzon Genomics, S.A. | Lysine demethylase inhibitors for diseases and disorders associated with hepadnaviridae |
| WO2013106548A1 (en) * | 2012-01-10 | 2013-07-18 | The Broad Institute, Inc. | Methods and cells for the production of viral vaccines |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996041020A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | Fluorescence resonance energy transfer screening assay for the identification of hiv-1 envelope glycoprotein-medicated cell |
| US7939115B2 (en) * | 2000-06-12 | 2011-05-10 | Access Business Group International Llc | Dietary supplement and related method |
| US20020045191A1 (en) * | 2000-09-15 | 2002-04-18 | Schneider Robert J. | Inhibition of the SRC kinase family pathway as a method of treating HBV infection and hepatocellular carcinoma |
| GB0108491D0 (en) | 2001-04-04 | 2001-05-23 | Gendaq Ltd | Engineering zinc fingers |
| AU2007318922C1 (en) * | 2006-11-07 | 2013-09-12 | Proteologics Ltd. | Pyrimidine derivatives as POSH and POSH-AP inhibitors |
| WO2012072713A2 (en) * | 2010-11-30 | 2012-06-07 | Oryzon Genomics, S.A. | Lysine demethylase inhibitors for diseases and disorders associated with flaviviridae |
| DE102011006992A1 (de) * | 2011-04-07 | 2013-05-08 | Kuka Roboter Gmbh | Verfahren und Handhabungssystem zum automatisierten Bewegen eines schwerkraftkompensierten Lastkörpers |
| WO2013139895A1 (en) | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Philip Morris Products S.A. | Diagnostic method |
| US20140025674A1 (en) * | 2012-07-19 | 2014-01-23 | International Business Machines Corporation | User-Specific Search Result Re-ranking |
| CN106413402B (zh) * | 2014-03-13 | 2020-10-30 | 美国印第安纳大学研究和技术公司 | 乙型肝炎核心蛋白变构调节剂 |
-
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| WO2010127246A2 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Burnham Institute For Medical Research | Hnf4 modulators and methods of use |
| WO2011106106A2 (en) * | 2010-02-24 | 2011-09-01 | Oryzon Genomics, S.A. | Lysine demethylase inhibitors for diseases and disorders associated with hepadnaviridae |
| WO2011106106A3 (en) * | 2010-02-24 | 2012-01-19 | Oryzon Genomics, S.A. | Lysine demethylase inhibitors for diseases and disorders associated with hepadnaviridae |
| WO2013106548A1 (en) * | 2012-01-10 | 2013-07-18 | The Broad Institute, Inc. | Methods and cells for the production of viral vaccines |
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Inhibition of hepatitis B Virus replication by hepatocyte nuclear factor 4-alpha specific short hairpin RNA;Fang He et al;《Liver International》;20120218;第32卷(第5期);第742-751页 * |
| 抑制LSD1 酶活性对HBV 模型小鼠的作用;朱轶晴等;《上海交通大学学报（医学版）》;20131231;第33卷(第12期);第1555-1559页 * |
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