CN108024542A

CN108024542A - 组合物

Info

Publication number: CN108024542A
Application number: CN201680043838.6A
Authority: CN
Inventors: N·米特; 许志平
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: University of Queensland UQ
Priority date: 2015-06-19
Filing date: 2016-06-17
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2036-06-17
Also published as: BR112017027356A2; EP3322295A1; DK3322295T3; CN108024542B; AU2016279912B2; BR112017027356B1; MY189214A; EP3322295A4; CO2018000429A2; US20180177185A1; MX2017016922A; EP3322295B1; AU2016279912A1; CA2989664A1; AR105084A1; WO2016201523A1; MX370604B; US10405539B2

Abstract

一方面，本发明涉及用于将dsRNA递送至在其消化道内具有碱性pH的昆虫的组合物，其中所述的组合物包含吸附在粘土复合物上的dsRNA，并且其中所述的粘土复合物配置为在碱性pH释放dsRNA。本发明的另一方面涉及包含本发明的组合物的制备物，递送双链RNA至昆虫的方法和保护作物对抗昆虫的方法。

Description

组合物

技术领域

本发明尤其涉及用于昆虫的组合物，制备这种组合物的方法，以及使用这种组合物的方法。

背景技术

应该清楚理解的是如果现有技术的公开在本发明中引用，则该引用不构成承认：所述的公开形成在澳大利亚或任何其他的国家的本领域公共常识的一部分。

以下讨论特别涉及保护植物对抗昆虫群体，并且特别地是对吃植物的昆虫群体的控制。然而，为了消除疑虑，本发明不限于植物的保护或对此类昆虫群体的控制。例如，下文所讨论的使用化学试剂用于控制昆虫的许多出版物也受到关注用于非农业昆虫控制。

用于对植物上的虫害控制的2种最普通的策略包括用于疾病抗性的繁殖和化学控制。特别地，化学控制常用于控制昆虫群体，但是化学试剂通常是昂贵的。此外，关于化学试剂对环境的潜在影响以及化学试剂在例如有待人类消耗的果实和蔬菜上的使用，受到了安全性的关注。后面这些问题是助长有机果实和蔬菜市场成长的因素。

其他关键因素是昆虫可以并且已经发展出对传统化学试剂杀昆虫剂的抗性。例如在澳大利亚的田地中，已经发展出杀昆虫剂抗性棉铃实夜蛾(Helicoverpa armigera，棉铃虫)的群体，并且这些抗性亚型代表了澳大利亚北部谷物地区(其包括昆士兰州的所有生产区域)的重要害虫。受棉铃实夜蛾影响的农作物包括卡诺拉油菜、鹰嘴豆、棉花、紫花苜蓿、玉蜀黍、小米和黍、绿豆、花生、高粱、大豆、向日葵和冬季谷物，包括小麦、大麦、燕麦、canary(加那利麦)和黑小麦。棉铃实夜蛾也是欧洲、亚洲和非洲地区盛行的主要农业害虫。其是高度杂食的，并且已经显示以47个科超过180个植物物种为食。尽管花费价值5亿美元的农药用于棉铃实夜蛾的控制，但是估计棉铃实夜蛾每年会导致20亿美元的农作物损害。然而，棉铃实夜蛾仅是鳞翅目的一个物种，该目是由娥和蝴蝶构成的第二大昆虫目。娥的幼虫期主要对多种具有经济价值的农作物产生损害，包括棉花、烟草、西红柿、玉米、高粱、紫花苜蓿、向日葵、豆类(pulses)和小麦。

减少在植物上使用化学杀昆虫剂的一项努力涉及转基因植物的研发。例如在过去二十年，转基因植物的采用已经有所增加，其中所述的转基因植物表达由来自细菌苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis(Bt))的基因编码的杀昆虫蛋白质。但是，合适的植物的利用性是有限的，并且例如棉铃实夜蛾的亚型已经发展出对单价和二价形式的Bt棉花的抗性。此外，转基因植物的大规模应用已经遇到了来自公众和管理机构的抵抗，并且研发转基因植物所需的成本、劳动和时间使其成为缺乏吸引力的选择。

RNAi或RNA干扰(还称为RNA沉默)已经用于昆虫中的基因研究，并且其在昆虫学中是有希望的，因为其提供了对基因表达的靶向特异性沉默。但是，在使用RNAi控制虫害对植物的影响中存在许多困难。

RNAi机制涉及首先将双链RNA(dsRNA)引入昆虫血腔中(例如通过吸收/注射/浸泡)，此后dsRNA通过内吞作用或者通过跨膜蛋白质开始进入昆虫细胞。接着，dsRNA通过核糖核酸酶III(RNaseIII)酶(称为Dicer)在昆虫细胞中被消化成长度为20-25个核苷酸的短的干扰RNA(siRNA)。然后siRNA展开，并且一条链(引导链)加载至RNA诱导沉默复合体(RISC)中。最后，RISC定位并与信使RNA(mRNA)结合，其包含与引导链互补的序列，使得靶基因的mRNA降解，最后导致细胞的死亡。

使用RNAi机制的主要困难是如何有效地将dsRNA递送至昆虫。具体而言，在昆虫中RNAi的大多数实验室研究使用的是将体外合成的dsRNA微注射至胚胎或血腔中。但是清楚的是，微注射作为递送机制不适用于大规模植物保护。另一种策略是通过提供混合于饮食中的dsRNA使昆虫吸收dsRNA，但是这意味着dsRNA进入了昆虫的消化道，特别地是中肠。由于中肠的pH和肠道核酸酶的存在，中肠的环境不利于dsRNA。能够降解dsRNA的核酸酶还可以存在于昆虫的唾液中(近期关于美国牧草盲蝽Lygus lineolaris的报告有Allen andWalker(2012)Saliva of Lygus lineolaris digests double stranded ribonucleicacids.Journal of Insect Physiology,58,391–396)。此外，研究表明系统性RNAi应答在衍生程度低的昆虫物种中更强劲，但是一些衍生程度高的双翅目昆虫和鳞翅目物种难以产生系统性RNAi。

另一个困难是如何将dsRNA提供给昆虫来吸收。dsRNA易受环境中的核酸酶的攻击，并且还易受紫外光的攻击，特别地是如果其必须作为植物表面上的局部应用时。例如，在一项研究中，dsRNA局部应用至植物用于对抗病毒进行保护，在应用后7天不能保护植物。此外，当在病毒感染后24小时应用dsRNA时，dsRNA不能保护植物对抗病毒(Tenllado,F.&J.R.Diaz-Ruiz,(2001)Double-stranded RNA-mediated interference with plantvirus infection.Journal Virology 75:12288-12297)。在另一项研究中，当将dsRNA加入昆虫食物中时，不同饮食中的dsRNA的水平降低，对于甲壳虫和娥而言，固体食物中dsRNA水平降低14％，3天后蚜液饮食中降低32％，并且6天后分别降低31％和56％(Whyard et al(2009)Ingested double stranded RNAs can act as species-specificinsecticides.Insect Biochemistry and Molecular Biology,39,824–832)。

将RNAi应用至昆虫(在已经鉴定有效的基因靶物之后)的主要挑战是在施用至昆虫之前dsRNA的稳定性，以及将dsRNA递送至昆虫。

因此，需要提供可以靶向昆虫群体的有效的备选方法，或者至少部分克服上文提及的至少一个缺点的或向消费者提供有用的或商业化选择的方法。

发明概述

在第一个方面中，本发明提供用于将dsRNA递送至在其消化道内具有碱性pH的昆虫的组合物，其中所述的组合物包含吸附在粘土复合物上的dsRNA，并且其中所述的粘土复合物配置为在碱性pH释放dsRNA。

有利的是，已经发现当dsRNA被吸附在粘土复合物上时，其是稳定的，并且所述的组合物保护dsRNA对抗UV光和核酸酶。例如有利的是，可以将组合物喷洒在农作物上，从而保护农作物对抗昆虫。此外，dsRNA保持吸附在粘土复合物上直到所述的组合物遇到碱性pH，例如在昆虫的消化道中。不希望被理论所束缚，预计一旦在昆虫的消化道中，dsRNA便逐渐从粘土复合物上释放，这意味着组合物在昆虫肠道中为dsRNA提供保护功能。当杀昆虫dsRNA用于喷洒在植物叶上的粘土复合物中时，已经显示显著比例的食用这些叶的昆虫不利地受到dsRNA的影响或者死亡。

因此，所述的组合物提供了用于将dsRNA递送至其消化道内具有碱性pH的昆虫中的系统。因此，dsRNA可以是用于昆虫的任何合适的dsRNA，并且不必局限于杀昆虫dsRNA。然而，在一个实施方案中，dsRNA不利地影响昆虫，并且dsRNA特别地是杀昆虫dsRNA。在该实施方案中，所述的组合物可以是杀昆虫组合物。所述的组合物可以用于保护植物。昆虫还可以是多种疾病(例如疟疾和登革热)的载体。因此，所述的组合物可以用于保护人类和动物对抗疾病。

如本发明所用，不利地影响昆虫的dsRNA可以包括导致昆虫死亡，或者影响昆虫的正常功能或行为，或者影响昆虫的生理学功能(包括绝育、病毒感染和降低的移动性)的dsRNA。

所述的组合物可以适用于任何类型的昆虫，只要该昆虫在其消化道具有碱性pH即可。在一个实施方案中，昆虫为咀嚼虫或咬虫。咀嚼虫或咬虫将在消耗涂敷有所述组合物的食物时吸收该组合物。在另一个实施方案中，昆虫为双翅目(Diptera)、鳞翅目(Lepidoptera)或鞘翅目(Coleoptera)。示例性的昆虫包括以下的一种或多种：

-双翅目的昆虫(特别地是苍蝇、蚊子、叮人的小虫或摇蚊)；特别地是实蝇科(Tephritidae)或果蝇科(Drosophilidae)；更特别地是实蝇科；甚至更特别地是果实蝇属(Bactrocera)或额实蝇属(Vidalia)的昆虫；最特别地是果蝇；

-鳞翅目的昆虫(特别地是娥或蝴蝶(包括毛虫))；特别地是：

○卷蛾科(Tortricidae)、夜蛾科(Noctuidae)、尺蛾科(Geometridae)、透翅蛾科(Sesiidae)、天蛾科(Sphingidae)、菜蛾科(Plutellidae)或螟蛾科(Pyralidae)的昆虫；

○夜蛾科的昆虫；特别地是铃夜蛾属(Helicoverpa)；最特别地是棉铃实夜蛾(Helicoverpa armigera，棉铃虫)；或者

○菜蛾科的昆虫；特别地是菜蛾属(Plutella)；最特别地是吊丝虫(Plutellaxylostella，小菜蛾)；

-鞘翅目的昆虫(特别例如象鼻虫或其他甲壳虫)；特别地是象虫总科(Curcullionoidea)的昆虫，更特别地是象甲科(Curculionidae)；最特别地是象鼻虫。

所述的昆虫可以是昆虫幼虫(例如对于鳞翅目而言，昆虫幼虫可以是毛虫)。所述的昆虫可以是植物的害虫(此类植物可以在下文中进一步定义)。在一个实施方案中，昆虫为鳞翅目，特别地是夜蛾科；特别地是铃夜蛾属；最特别地是棉铃实夜蛾。

昆虫在其消化道中具有碱性pH。为了消除疑虑，本发明中涉及昆虫消化道内pH的内容不意味整个消化道都具有该pH。所述的昆虫在其前肠(口凹(stomodeam))、中肠(中消化道(mesenteron))或后肠(尾肠)的一处或多处具有碱性pH；特别地是在中肠中。碱性pH可以是大于7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或11.0的pH。碱性pH可以是小于11.0、10.5、10.0、9.5或9.0的碱性pH。碱性pH可以是8.0至11.0、8.5至11.0、8.0至10.5、9.0至10.0、9.0至9.5、9.0至10.5、或9.0至11.0的pH。

所述的组合物可以是植物保护性组合物。该组合物可以用于保护任何合适类型的植物(或者农作物，包括多种植物)。所述的植物可以是有胚植物，特别地是种子植物，更特别地是被子植物(例如单子叶纲植物(monocotyledon或monocot)、双子叶植物或真双子叶植物(eudicotyledon或eudicot)或裸子植物。

示例性的单子叶植物包括以下目的植物：天门冬目(Asparagales)(包括石蒜科(Amaryllidaceae)(例如韭葱、洋葱、大蒜、青葱和韭黄)和天门冬科(Asparagaceae)(例如芦笋))；槟榔目(Arecales)(包括棕榈科(Arecaceae)(例如棕榈、例如椰子树))；薯蓣目(Dioscoreales)(包括薯蓣科(Dioscoreaceae)(例如山药))；禾本目(Poales)(包括凤梨科(Bromeliaceae)(例如菠萝)和禾本科(Poaceae)(包括玉米(玉蜀黍)、小麦、水稻、大麦、小米、高粱、燕麦和竹子))；以及姜目(Zingiberales)(包括芭蕉科(Musaceae)(包括香蕉)和姜科(Zingiberaceae)(包括姜和高良姜))。

示例性的真双子叶植物包括以下目的植物：

-伞形目(Apiales)(包括伞形科(Apiaceae)(例如欧洲防风草、胡萝卜和芹菜))；

-菊目(Asterales)(包括菊科(Asteraceae)(例如莴苣、洋蓟和向日葵))；

-十字花目(Brassicales)(包括十字花科(Brassicaceae)(例如花椰菜、甘蓝、羽衣甘蓝、菜花、抱子甘蓝、白菜、菜心、大头菜、小萝卜、芜青和油菜籽)和白花菜科(Capparaceae)(例如刺山柑))；

-石竹目(Caryophyllales)(包括苋科(Amaranthaceae)(例如菠菜、厚皮菜和甜菜)和蓼科(Polygonaceae)(例如大黄))；

-葫芦目(Cucurbitales)(包括葫芦科(Cucurbitaceae)(例如黄瓜、笋瓜(squash)、南瓜(pumpkin)、甜瓜、蜜瓜、绿皮密生西葫芦和西瓜))；

-杜鹃花目(Ericales)(包括猕猴桃科(Actinidiaceae)(例如猕猴桃)和杜鹃花科(Ericaceae)(例如蓝莓))；

-豆目(Fabales)(包括豆科(Fabaceae)(例如各种豆子、豌豆、大豆、绿豆、小扁豆、花生和苜蓿(紫花苜蓿)))；

-唇形目(Lamiales)(包括木犀科(Oleaceae)(例如橄榄))；

-金虎尾目(Malpighiales)(包括亚麻科(Linaceae)(例如亚麻))；

-锦葵目(Malvales)(包括锦葵科(Malvaceae)(例如棉花))；

-桃金娘目(Myrtales)(包括桃金娘科(Myrtaceae)(例如番石榴))；

-蔷薇目(Rosales)(包括大麻科(Cannabaceae)(例如大麻)、蔷薇科(Rosaceae)(例如草莓、苹果、梨、杏、李子、樱桃、桃子、树莓、扁桃和油桃)和桑科(Moraceae)(例如无花果))；

-无患子目(Sapindales)(包括芸香科(Rutaceae)(例如柑橘类，例如橙子、柠檬、葡萄柚、酸橙和柑橘)和无患子科(Sapindaceae)(例如荔枝))；

-茄目(Solanales)(包括旋花科(Convolvulaceae)(例如甘薯)和茄科(Solanaceae)(例如马铃薯、西红柿、茄子、胡椒(例如灯笼椒)和烟草))；以及

-葡萄目(Vitales)(包括葡萄科(Vitaceae)(例如葡萄))。

在一个实施方案中，所述的组合物用于保护经济农业农作物。示例性的农作物包括谷物、蔬菜(包括根和块茎)、水果、豆类、油料作物和纤维作物。谷物可以包括玉米(玉蜀黍)、水稻、小麦、大麦、高粱、小米和燕麦。蔬菜可以包括花椰菜、菜花、甘蓝、洋蓟、刺山柑、羽衣甘蓝、菠菜、莴苣、白菜、厚叶菜、菜心、韭葱、抱子甘蓝、大头菜、高良姜、姜、芹菜、大黄、芦笋、竹笋、马铃薯、甘薯、山药、大豆、绿豆、苜蓿、胡萝卜、欧洲防风草、甜菜、小萝卜、芜青、洋葱、青葱和大蒜。水果可以包括西红柿、葡萄、猕猴桃、浆果(包括草莓、蓝莓和树莓)、番石榴、梨、瓜(包括甜瓜、西瓜和蜜瓜)、柑橘类(包括橙子、柑橘、柠檬、酸橙和葡萄柚)、核果类(包括杏、油桃、李子、樱桃和桃子)、荔枝、菠萝、无花果、苹果、香蕉、黄瓜、笋瓜、绿皮密生西葫芦、南瓜、胡椒、茄子和鳄梨。豆类可以包括豆子(beans)、豌豆和小扁豆。油料作物可以包括可以取得油的农作物，例如棕榈、大豆、油菜籽、葵花籽、花生、棉花籽、棕仁、椰子和橄榄。纤维作物可以包括棉花、亚麻、大麻和竹子。农作物还可以是烟草或有花植物。

dsRNA可以是植物保护性dsRNA(或农作物保护性dsRNA)。植物保护性双链RNA(dsRNA)可以能够保护植物对抗昆虫(特别地是通过RNA干扰)。类似地，农作物保护性dsRNA可以能够保护农作对抗昆虫。dsRNA可以是杀昆虫dsRNA。昆虫可以如上文所述。

可以根据寻求的保护所对抗的昆虫来选择特定的dsRNA序列，并且本领域的技术人员可以容易地选择合适的序列。

有利的是，为了发生RNA干扰，RNA核苷酸序列必须与昆虫完美地匹配。因此，dsRNA可能是对靶物昆虫高度特异性的，由此限制对昆虫的扑食者、对环境或者对人在消耗时(例如在蔬菜和果实的情况下)的不利影响的可能性。

如本发明所用，术语“植物保护性”、“农作物保护性”等是指组合物/dsRNA能够预防或减轻昆虫对植物或农作物的影响。例如保护植物或农作物对抗昆虫的dsRNA可以杀死昆虫，不利地影响昆虫，或者可以阻止昆虫食用植物或农作物。

dsRNA的长度可以根据所寻求的保护所对抗的昆虫而改变。有利的是，昆虫中的RNase(Dicer样酶)将长的dsRNA序列切割成更小得多的片段，每个片段的长度通常为20-25个核苷酸。因此，可以使用例如100至3000个碱基对的长dsRNA序列，并且这些更长的序列可以在昆虫吸收dsRNA后被昆虫切割成所述的更小的片段。据信，这些更小的核苷酸片段(例如21个核苷酸)涉及RNA干扰机制。

单一的dsRNA构建体可以通过将得自多种昆虫或遗传靶物的特定的序列组合而改造，其中所述的特定的序列能够靶向多种有机体或遗传靶物(对于相同的昆虫，包括多种遗传靶物)，因为每种昆虫都将dsRNA序列切割成更短的片段。例如，单一的dsRNA构建体可以用于靶向3种不同的昆虫或遗传靶物。dsRNA可以靶向至少2种昆虫或遗传靶物，更特别地靶向2至10种昆虫或遗传靶物，甚至更特别地靶向4至8种昆虫或遗传靶物。

因此，dsRNA的长度可以是20或21至3000个碱基对；特别地长度为21至2500，或者21至2000个碱基对；更特别地长度为80至1750，80至1500，或者80至1200个碱基对；最特别地长度为100至1200，或者250至1200个碱基对。有利的是，这种更长的dsRNA序列的使用提供了序列被切割成与所需的昆虫匹配的核苷酸序列从而影响(例如杀死)昆虫的更高得多的可能性。此外，生产靶向多种昆虫或多种遗传靶物的一种更长的dsRNA构建体，而不是制备单个的构建体和配制物，可以是较廉价的。因此，dsRNA可以是靶向多种昆虫或多种遗传靶物(例如在单一的昆虫中)的dsRNA构建体。

备选地，dsRNA可以是多种dsRNA(或者2种或更多种dsRNA)。在所述的多种dsRNA中，每种dsRNA序列可以具有不同的遗传靶物，靶向不同的昆虫，或者靶向不同遗传靶物/昆虫的组合。因此，在一个实施方案中，dsRNA为用于靶向多种昆虫或遗传靶物的多种dsRNA。

预计无论所述的序列如何，所述的粘土复合物都能够吸附不同长度的dsRNA序列。

在一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的电子传递链(ETC)，特别地是昆虫的Rieske基因。在另一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的电压依赖性通道，特别地是昆虫的电压依赖性阴离子通道(VDAC)，更特别地是昆虫的线粒体外膜中的VDAC。在另一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的肌肉，特别地是昆虫的精氨酸激酶(AK)基因和SERCA(肌浆网/内质网Ca²⁺-ATPase)基因。AK基因主要涉及能量代谢，而SERCA基因涉及在内质网中的钙摄取。在另一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的肠道，特别地是昆虫的谷胱甘肽转移酶(GTT)基因。GTT基因在化合物的脱毒作用中是重要的。在另一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的体壁和附属器官，特别地是昆虫的乙酰胆碱酯酶(AchE)基因。AchE基因在生长和发育中是重要的。在另一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的细胞内受体，特别地是昆虫的耐烯虫酯(Met)受体。在另一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的GTPase水解酶，特别地是昆虫的Rab4bGTPase。在另一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的保幼激素酯酶。在另一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的线粒体，特别地是昆虫的NV2基因。NV2基因在电子传递链(ETC)中起重要作用。在另一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的肠道，特别地是昆虫的前肠，更特别地是昆虫的酚氧化酶基因。酚氧化酶基因涉及化合物的脱毒作用。在另一个实施方案中，dsRNA靶向昆虫的外皮和表皮，特别地是昆虫的组织蛋白酶L基因。组织蛋白酶L基因在蜕皮过程中起重要作用。

因此，在一个实施方案中，dsRNA靶向以下组中的至少一种：昆虫的电

子传递链(ETC)、昆虫的电压依赖性通道、昆虫的肌肉、昆虫的肠道、昆虫的体壁和/或附属器官、昆虫的细胞内受体、昆虫的GTPase水解酶、昆虫的保幼激素酯酶、昆虫的线粒体以及昆虫的外皮和/或表皮。

在另一个实施方案中，dsRNA包括与SEQ ID NO.1、2和4-14的任意一项(更特别地SEQ ID NO.1或2)所示的序列互补或者至少部分互补的链(反义或正义)。如本发明所用，“至少部分互补”的链是指dsRNA的一条链与所述的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。应该理解的是该定义考虑了RNA使用U替代T，T是在DNA中出现。

在另一个实施方案中，dsRNA的链的至少一部分(反义或正义)与SEQ IDNO.1、2和4-14的任意一项(更特别地SEQ ID NO.1或2)所示的序列互补或者至少部分互补。如本发明所用，“至少部分互补”的链的至少一部分是指dsRNA的一条链的至少一部分与所述的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。应该理解的是该定义考虑了RNA使用U替代T，T在DNA中出现。

在另一个实施方案中，dsRNA包括或者至少包括与SEQ ID NO.1、2和4-14的任意一项(更特别地SEQ ID NO.1或2)所示的序列的片段互补或者至少部分互补的链(反义或正义)的一部分。仅举例说明，片段可以包含与SEQ ID NO.1、2和4-14的任意一项(更特别地SEQ ID NO.1或2)所示的序列互补或者至少部分互补的序列的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

dsRNA可以以任何合适的方式生产。例如，dsRNA可以通过试剂盒在体外生产，或者通过噬菌体(例如通过丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)dsRNA噬菌体)在体外或在体内生产，或者使用有机体的专门菌株在体内生产，特别地是使用细菌(例如大肠杆菌(E.coli)的菌株)。通常，体外方法适用于更小规模的dsRNA生产。对于大规模生产而言，体内生产方法是优选的。使用的dsRNA可以是粗细菌提取物。

dsRNA可以是任何合适的形式，并且是任何合适的序列。dsRNA可以包括任何合适的修饰。例如，dsRNA可以包含一个或多个经修饰的磷酸酯基团、经修饰的核酸/核苷酸、经修饰的糖和/或经修饰的5或3引物末端。dsRNA中可以存在的示例性经修饰基团包括例如肌苷、甲基肌苷、假尿苷、吗啉、锁核酸、肽(例如肽核酸(PNA))、生物素、胆固醇、荧光团、放射性核和金属。dsRNA还可以以dsRNA构建体的形式存在。此类修饰可以增强dsRNA的稳定性和/或寿命。

粘土复合物可以包含粘土。粘土可以是阴离子粘土。粘土可以包含多个带正电荷的层或片。但是在优选的实施方案中，粘土为阳离子粘土。粘土可以包含多个带负电荷的层或片。粘土可以是基于二氧化硅的粘土。粘土可以是膨胀性粘土。粘土可以是膨润土。粘土可以包含蒙脱石、基本上由蒙脱石组成或者由蒙脱石组成。

粘土可以具有电荷密度为10至400毫摩尔当量电荷/100g粘土(meq/100g)，特别地是20至300meq/100g的电荷密度，更特别地是30至250meq/100g、40至200、50至200、70至150、80至120、90至110或者大约100meq/100g的电荷密度。

粘土可以包含多种粘土颗粒。粘土颗粒可以具有粒径的z-平均值是多至5μm，更特别地是多至1μm，最特别地是多至750nm或多至500nm。在一个实施方案中，粘土颗粒可以具有粒径的z-平均值是20-800nm的范围，更特别地是100-800nm或250-650nm，甚至更特别地是大约450nm。

当粘土包含多个带负电荷的层或片时，其他的带负电荷的组分必须能够形成包含粘土和dsRNA两者的组合物(因为dsRNA携带负电荷(这是由于磷酸酯基团))。

因此，在一个实施方案中，粘土复合物包含具有多个带正电荷的基团的分子(或者带正电荷的分子)，特别地是在pH为5.0至7.0的溶液中。所述的分子可以用于与阳离子粘土和与dsRNA复合。所述的分子可以吸附在粘土上。所述的分子可以是高分子，特别地是聚合物。所述的分子可以是树枝状聚合物。该聚合物可以是共聚物或嵌段共聚物。

带正电荷的基团中的正电荷可以位于(或者至少部分地位于)氮原子和/或过渡金属上；特别地是氮原子上。

带正电荷的基团可以是带正电荷的胺(包括伯胺、仲胺、叔胺或季胺)，亚胺(包括一级亚胺和二级亚胺)，胍基团，或芳香族氨基。示例性胺包括烷基胺、烷基氨基烷基或烷基氨基(烷基)烷基(其中各个烷基基团可以独立地选自C_1-12烷基，特别地是C_1-6烷基，更特别地是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基)；以及含氮饱和杂环(实例包括具有1至10个碳原子的含氮饱和杂环；特别地是吡咯烷基、吡唑烷基、哌啶基、吗啉基和奎宁环基)。示例性亚胺包括烷基亚胺和烷基亚氨基烷基(其中各个烷基基团可以独立地选自C_1-12烷基，特别地是C_1-6烷基，更特别地是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基)。示例性胍基团为烷基胍基基团(其中烷基可以独立地选自C_1-12烷基，特别地是C_1-6烷基，更特别地是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基)。示例性芳香族氨基可以包括芳香族含氮杂环；特别地是具有1至10个碳原子的芳香族含氮杂环；更特别地是咪唑基、三唑基或嘌呤基。所述的分子或带正电荷的基团可以可任选地被至少一个(特别地是多个)pKa修饰性基团取代，如下文所述。pKa修饰性基团在所述的分子中带正电荷的基团(例如包含氮原子的基团)的偕位或相邻。

如本发明所用，术语“烷基”或“亚烷基”是指直链或支化的饱和烃基团。烷基基团可以具有特定数量的碳原子，例如C_1-12烷基是指在线性或支化排列中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子的烷基基团。除非另外定义，术语“烷基”可以是C_1-12烷基或C_1-6烷基。合适的烷基基团的实例可以包括但不限于甲基、乙基、丙基(正丙基和异丙基)、丁基(正丁基、异丁基和叔丁基)、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、4-甲基丁基、2-乙基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、环戊基、环己基和环庚基。

所述的分子可以是具有多个带正电荷的基团(或者2个或更多个带正电荷的基团)的分子，其中所述的基团选自胺、亚氨基、胍基和芳香族氨基基团中的一个或多个。如本发明所用，术语“带正电荷的基团”、“带正电荷的分子”或其他是指在pH 5.0至7.0具有正电荷的基团或分子。

不希望被理论所束缚，据信所述的组合物可以在例如带负电荷的粘土、带正电荷的分子和带负电荷的dsRNA之间通过静电相互作用形成。因此，如果分子中带正电荷的基团的正电荷被中和(例如由于昆虫消化道中的碱性pH)，则所述的组合物解离，从而释放dsRNA。因此，可以选择具有多个带正电荷的基团的特定分子用于特定的昆虫，并且可以操纵或选择分子中带正电荷的基团的pKa从而控制昆虫中dsRNA的释放。例如，如果昆虫消化道中的pH为大约10.5，则预计与包含具有pKa为10.5的带正电荷的基团的分子的组合物相比，包含具有pKa为9.0的带正电荷的基团的分子的组合物在昆虫的消化道中更快速且更完全地释放dsRNA。

因此，带正电荷的基团的pKa可以高于7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或11.0。带正电荷的基团的pKa可以低于11.0、10.5、10.0、9.5或9.0。带正电荷的基团的pKa可以是8.0至11.0、8.5至11.0、8.0至10.5、9.0至10.0、9.0至9.5、9.0至10.5或者9.0至11.0。

此外，在pH高于7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或11.0，可以从所述的组合物释放dsRNA。在pH低于11.0、10.5、10.0、9.5或9.0，可以从所述的组合物释放dsRNA。在pH为8.0至11.0、8.5至11.0、8.0至10.5、9.0至10.0、9.0至9.5、9.0至10.5或者9.0至11.0，可以从所述的组合物释放dsRNA。如果带正电荷的基团的pKa为例如9.0，则预计可以在pH 9.0从包含具有那些带正电荷的基团的分子的组合物释放dsRNA。

具有多个带正电荷的基团的分子可以是任何合适的类型。在一个实施方案中，所述的分子为聚合物。该聚合物的分子量高于200，特别地是高于400，更特别地是高于600。所述的聚合物的分子量为400至100,000，特别地是600至80,000。所述的聚合物的分子量为10,000至50,000；特别地是10,000至40,000；更特别地是大约15,000或大约33,000。

所述的聚合物可以是使用至少一种单体形成的共聚物或嵌段共聚物，其中所述的至少一种单体提供至少一个带正电荷的基团。所述的聚合物还可以是通过仅一种单体形成的均聚物，其中所述的仅一种单体提供至少一个带正电荷的基团。

所述的聚合物可以具有多个带正电荷的氮原子(带正电荷的基团可以是带正电荷的氮原子)。氮原子的pKa可以如上文中针对正电荷基团所述的那样。所述的聚合物可以是支化的或线性的聚合物。所述的聚合物可以是或者包括可任选地取代的聚亚烷基胺(可以称为聚亚烷基亚胺)。示例性的聚亚烷基胺可以是聚亚己基胺(可以称为聚亚己基亚胺)，聚亚戊基胺(可以称为聚亚戊基亚胺)，聚亚丁基胺(可以称为聚亚丁基亚胺)，聚亚丙基胺(可以称为聚亚丙基亚胺)或聚亚乙基胺(可以称为聚亚乙基亚胺)；特别地是聚亚乙基胺。聚亚乙基胺包括pKa值为10.5至11.0的氨基基团，因此预计在pH为大约或高于10.5时释放dsRNA。

用于聚亚烷基胺的可任选的取代基可以是pKa修饰性基团或多个pKa修饰性基团。因此，所述的聚合物可以是被多个pKa修饰性基团取代的聚亚烷基胺。所述的pKa修饰性基团可以是吸电子基团或供电子基团。pKa修饰性基团可以在聚合物中氨基基团的偕位或相邻。示例性的吸电子基团可以包括含羰基基团(例如酯(包括-CO-O-烷基基团)和羧酸(包括-CO-OH基团))，硝基基团，氰基基团，质子化的氨基基团(例如四烷基取代的氮)和硫酸酯基团。pKa修饰性基团还可以包括-烷基、-OH、醚(包括-O-烷基基团)和胺(包括-NH-烷基和-N(烷基)-烷基基团)，其中所述的烷基基团可以可任选地被-OH、-O-烷基、-卤素(包括-F、-Cl、-Br或-I)、-CO-烷基、-CO-O-烷基、-O-CO-烷基、-NH-烷基、-N(烷基)₂、-CO-NH-烷基和-NH-CO-烷基中的一个或多个取代。

在一个实施方案中，所述的聚合物为被pKa修饰性基团取代的聚亚烷基胺，其中所述的pKa修饰性基团在聚合物中胺基团的偕位或相邻。所述的聚合物可以是被羟基基团或-O-烷基基团取代的聚亚烷基胺，其中所述的羟基基团或-O-烷基基团在聚合物中胺基团的偕位或相邻。所述的聚合物可以是乙氧基化的聚亚乙基胺。乙氧基化的聚亚乙基胺包括pKa值为大约9.0-9.5的氨基基团。为了消除疑虑，聚亚烷基胺可以包括胺和亚胺基团中的之一或两者。例如，乙氧基化的聚亚乙基胺可以包括以下单元的一个或多个：-NH(CH₂CH₂OH)、-N(CH₂CH₂OH)₂和-N(CH₂CH₂OH)-。

所述的聚合物可以是基于聚亚烷基的；特别地是基于聚亚己基的、基于聚亚戊基的、基于聚亚丁基的、基于聚亚丙基的或基于聚亚乙基的；最特别地是基于聚亚乙基的。基于聚亚烷基的聚合物可以包括在pKa修饰性基团(特别地是吸电子基团)的偕位或相邻的带正电荷的基团。在一个实施方案中，基于聚亚烷基的聚合物中的亚烷基基团(特别地是亚乙基基团)可以被氨基基团取代，并且可任选地与氨基基团相邻是吸电子基团。所述的聚合物可以是基于聚亚乙基的，其中基于聚亚乙基的聚合物中的亚乙基基团被氨基基团取代，并且可任选地被与氨基基团相邻的吸电子基团取代。氨基基团可以是二烷基氨基基团；更特别地是二乙基氨基或二甲基氨基基团，最特别地是二甲基氨基基团。吸电子基团可以是亚烷基酯(-R-COO-)、亚烷基醚(-R-O-)或亚烷基-羰基(-R-CO-)；更特别地是亚乙基-CO-O-基团。吸电子基团可以衍生自甲基丙烯酸酯。在示例性的实施方案中，所述的聚合物可以是或者包括聚二烷基氨基烷基甲基丙烯酸酯。在另一个示例性的实施方案中，所述的聚合物可以是聚(2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)(或pDMAEMA)。pDMAEMA包括pKa值为大约7.0-7.5的烷基化的氨基基团。在另一个示例性的实施方案中，所述的聚合物可以是聚(2-(二乙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(或pDEAEMA)。pDEAEMA具有与pDMAEMA相似的pKa值。

所述的聚合物可以是包含二烷基氨基烷基甲基丙烯酸酯(例如2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯或DMAEMA)的均聚物、共聚物或嵌段共聚物。包含二烷基氨基烷基甲基丙烯酸酯的共聚物或嵌段共聚物还可以包括二级二烷基氨基烷基甲基丙烯酸酯、聚亚烷基氧化物(例如聚亚乙基氧化物或PEO)或聚烷基丙烯酰胺(例如聚(N-异丙基丙烯酰胺)或PNIPAM)。示例性的共聚物或嵌段共聚物包括pDMAEMA-pDEAEMA、pDMAEMA-PEO和pDMAEMA-PNIPAM。在此类聚合物中，氨基基团的pKa可以改变，从而使dsRNA在不同的pH释放。

所述的组合物可以包含多至40wt％dsRNA，特别地多至30wt％dsRNA，更特别地多至25wt％或20wt％dsRNA。所述的组合物可以包含超过0.5wt％dsRNA；特别地超过1wt％dsRNA、2wt％dsRNA、3wt％dsRNA、4wt％dsRNA或7wt％dsRNA；更特别地超过5wt％dsRNA。所述的组合物可以包含0.5至30wt％dsRNA、1至30wt％dsRNA、5至30wt％dsRNA或5至20wt％dsRNA；更特别地5至25wt％dsRNA或7至25wt％dsRNA；最特别地大约8至25wt％dsRNA。

当具有多个带正电荷的氮基团的分子存在于所述的组合物中时，该组合物中N:P的比值(即，分子中氮(N):dsRNA(P)中的磷)可以是至少1、2或3，特别地是至少4，更特别地是至少5。在所述的组合物中N:P的比值可以是小于30、小于20、小于10或者小于7；特别地小于6。在所述的组合物中的N:P的比值可以是3-7，特别地是4-6，更特别地是大约5。

在其中粘土复合物包含粘土和具有多个带正电荷的基团的分子的组合物中，粘土:分子/dsRNA(或者粘土:分子)的质量比可以是1:1至10:1，特别地3:1至8:1，更特别地4:1至7:1或者5:1至7:1，最特别地为大约6:1或者大约5:1。粘土:分子:dsRNA的质量比可以是大约5:1:2。

不希望被理论所束缚，在所述的组合物中不同组分的加载比例可以影响dsRNA的释放。例如在相同的碱性pH，预计包含更高比例的带正电荷的基团的组合物比包含更低比例的带正电荷的基团的组合物更缓慢地释放dsRNA(这是因为碱基具有更高量的待中和的正电荷)。

在一个实施方案中，所述的组合物的粒径的z-平均值是多至5000nm，特别地是多至3000nm，更特别地是多至2500nm。在另一个实施方案中，所述的组合物的粒径的z-平均值为至少50nm、100nm、250nm或500nm，特别地是至少1000nm，更特别地是至少1500nm，最特别地是至少2000nm。在一个实施方案中，所述的组合物的粒径的z-平均值是大约2100nm。所述的组合物的粒径的z-平均值是50nm至5μm，特别地是100nm至1μm。所述的组合物的理想粒径可以根据待应用该组合物的食物而改变。

在另一个实施方案中，所述的组合物具有正的zeta电位，特别地是大于0.5mV的zeta电位。在另一个实施方案中，所述的组合物的zeta电位是小于25mV，特别地是小于15mV，更特别地是小于10mV，甚至更特别地是小于5mV。在另一个实施方案中，所述的组合物的zeta电位是大约1.3mV。

如本发明所用，术语“吸附在粘土复合物上的dsRNA”等包括其中dsRNA吸附在粘土复合物的表面上的环境，其中dsRNA被插入在粘土复合物层之间的环境，以及其中dsRNA被吸附到具有多个带正电荷的基团的分子上的环境，其中dsRNA/分子被吸附在粘土表面上或粘土层之间。因此，术语“吸附的”包括吸附在粘土或粘土复合物的表面上，以及插入在粘土或粘土复合物层之间。

不希望被理论所束缚，据信当dsRNA被吸附在粘土复合物上时，便向dsRNA提供一些保护对抗RNases和U.V.光，并由此dsRNA显著地更稳定。因此，据信粘土复合物对吸附的dsRNA起到保护性涂层的作用。

有利的是，预计当dsRNA被吸附在粘土复合物上时，dsRNA基本上不降解，甚至在储存超过60天时。当dsRNA被吸附在粘土复合物上时，粘土复合物有利地保护dsRNA对抗RNase和UV光。

在第二个方面中，本发明涉及制备物，其包含本发明的第一个方面的组合物。内容允许的话，本发明的第二个方面的特征如同本发明的第一个方面那样描述。

所述的制备物可以包含一种本发明的第一个方面的组合物，或者多种本发明的第一个方面的组合物。例如，可以向使用者提供多重组合物(例如固体或粉末形式)，其均靶向一种害虫。例如，如果使用者希望在喷洒农作物时靶向3种害虫，使用者可以混合3种组合物和流体从而制备用于喷洒的单一制备物。

所述的制备物可以是任何合适的形式。例如，所述的制备物可以是固体、软膏、凝胶、乳膏、粉末、糊剂、悬液、胶体、泡沫或气溶胶的形式，特别地是悬液或胶体。所述的制备物的固体形式可以包括粉尘、粉末、粒子、团块、药丸、锭剂、片剂、填充膜(包括种子涂层)等，其可以是水分散性的(“可润湿的”)。在一个实施方案中，所述的制备物为浓缩物的形式，特别地是胶体或悬液形式的浓缩物。

在一个实施方案中，所述的制备物为混杂的，特别地是包含分散于流动相中的固相。固相可以包含所述的组合物。流动相可以是例如液体、气体、或自由流动的固体或者它们的组合；特别地是液体；更特别地是水性液体；最特别地是水。所述的水可以是无菌的或非无菌的。固相可以以任何合适的方式分散于流动相中。这取决于固相和流动相的性质。

根据制备物的形式，所述制备物可以包含多种其他的试剂。示例性的试剂包括但不限于以下类型的成分中的一种或多种：稀释剂、载体、赋形剂、悬浮试剂、凝聚试剂、碱、缓冲剂、苦味试剂、香料、防腐剂、推进剂、触变试剂、表面活性剂、防冻试剂和着色试剂。技术人员可以选择合适的试剂。

所述的制备物还可以包含一种或多种其他的活性成分。如本发明所定义，活性成分是向植物保护提供益处的成分。活性成分可以是例如杀昆虫剂、农药、杀真菌剂、抗生素、引虫剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或杀线虫剂。

当所述的制备物为胶体或悬液的形式时，其可以包含多至30％w/w、多至20％w/w、多至10％w/w、多至5％w/w、多至2％w/w、多至1％w/w、少于1％w/w、少于0.1％(少于1mg/ml)或少于0.01％w/w(少于0.1mg/ml)的组合物。所述的制备物可以是在应用于昆虫食物、植物或农作物之前需要稀释的浓缩形式。应用于昆虫食物、植物或农作物的制备物可以包含少于1％w/w、少于0.1％(少于1mg/ml)或少于0.01％w/w(少于0.1mg/ml)的组合物。

在另一个实施方案中，当所述的制备物是胶体或悬液的形式时，其可以包含多至100mg/L的组合物；特别地是多至50mg/L；更特别地多至20mg/L或多至10mg/L；最特别地少于10mg/L。在一个实施方案中，胶体或悬液中所述的组合物的浓度为1-100mg/L。

所述的制备物可以配制用于以任何合适的方式施用至植物或植物的任何部分。例如，所述的配制物可以配制用于施用至植物的叶、茎、根、果实、蔬菜、谷粒和/或豆类。在一个实施方案中，所述的制备物配制用于施用至植物的叶，并且特别地可喷洒在植物的叶上。所述的制备物可喷洒到植物上。所述的制备物可以以所计量的剂量施用至植物。所述的制备物可以配制用于施用至植物，例如通过喷洒，通过刷擦或者通过另一种敷抹器。所述的制备物可以配制用于通过喷洒(包括通过细雾)、滴注和/或灌溉施用至植物。

所述的制备可以是悬液的形式，在这种情况下，所述的组合物可喷洒到植物上。悬液可以是基本上稳定的。如本发明所使用的，“基本上是稳定的”悬液是以下这种悬液：其中对于待喷洒至植物上的悬液而言，一旦形成，固相便保持足以分散于(即，不能明显的聚集)于流动相(特别地是液相，更特别地是水)中。在一个实施方案中，在悬液形成后至少24小时内，特别地是在悬液形成后至少5天内，更特别地在悬液形成后至少10、15、20或30天内，最特别地在悬液形成后至少60天内，固相保持分散于流动相中。如果悬液不是基本上稳定的，则固相可以聚集，导致在将悬液喷洒于植物上时，在设备中堵塞，或者备选地导致变化量的固相材料被应用在给定的区域中，造成植物的不完全保护。

在第三个方面中，本发明提供了制备本发明的第一个方面的组合物的方法。该方法可以包括将dsRNA吸附在粘土复合物上的步骤。该方法可以包括以下步骤：将具有多个带正电荷的基团的分子吸附在粘土上，从而形成粘土复合物；以及将dsRNA吸附在所述的粘土复合物上。所述的方法可以包括以下步骤：将dsRNA吸附在具有多个带正电荷的基团的分子上；以及将dsRNA/分子吸附在粘土上。

有利的是，已经发现将dsRNA加载于分子上并且然后将dsRNA/分子加载于粘土上，提供了在组合物中明显更高加载的dsRNA。此外，这种方法还提供改善的释放参数。在一个实施方案中，所述的分子具有多个带正电荷的氮基团。在这个实施方案中，在dsRNA/分子中，N:P比值(即，分子中的氮(N):dsRNA(P)中的磷)可以是至少1、2或3，特别地是至少4，更特别地是至少5。在这个实施方案中，在dsRNA/分子中，N:P比值可以是小于30、小于20、小于10或者小于7，特别地是小于6。在这个实施方案中，在dsRNA/分子中，N:P比值可以是3-7，特别地是4-6，更特别地是为大约5。

将dsRNA吸附在分子上的步骤可以包括通过摇动或倒置在水性溶液中使dsRNA与分子接触或温育。该步骤可以在低于25℃，特别地是低于15℃，更特别地是低于10℃，最特别地是低于5℃实施。该步骤可以在冰上实施。该步骤可以在大约pH 7实施。

将dsRNA/分子吸附到粘土上的步骤可以包括通过摇动或倒置在水性溶液中使dsRNA/分子与粘土接触或温育。该步骤可以在低于25℃，特别地是低于15℃，更特别地是低于10℃，最特别地是低于5℃实施。该步骤可以在冰上实施。该步骤可以在大约pH 7实施。在一个实施方案中，通过所述的方法形成的组合物包括粘土、具有多个带正电荷的基团的分子以及dsRNA。在这个实施方案中，粘土:分子/dsRNA(或者粘土:分子)的质量比可以是1:1至10:1，特别地是3:1至8:1，更特别地是4:1至7:1或5:1至7:1，最特别地是大约6:1或大约5:1。

本发明的第三个方面的特征可以如上文中针对第一个方面所述。

在第四个方面中，本发明涉及将dsRNA递送至在其消化道内具有碱性pH的昆虫中的方法，该方法包括将本发明的第一个方面的组合物或本发明的第二个方面的制备物施用(或应用)至昆虫食物。

所述的组合物可以施用至任何昆虫食物。此类食物可以包括植物和植物部分(例如包括果实和蔬菜)，而且还可以包括合成的昆虫食物源、昆虫饵料或水诱捕器(watertraps)。在一个实施方案中，昆虫食物为植物(包括植物的部分)。有利的是，昆虫可以在吸收食物的同时吸收所述的组合物。将所述的组合物施用至昆虫食物的步骤可以涉及将所述的组合物或制备物喷洒、滴或倾倒在食物上，或者将所述的组合物或制备物刷擦在食物上。

在第五个方面中，本发明涉及保护农作物对抗在其消化道具有碱性pH的昆虫的方法，该方法包括将本发明的第一个方面的组合物或本发明的第二个方面的制备物施用(或应用)至农作物的步骤。农作物可以包括多种上文定义的植物。将所述的组合物或制备物施用至农作物的步骤可以涉及将所述的制备物或组合物施用至农作物中植物的叶、茎、根、果实、蔬菜、谷粒和/或豆类。所述的步骤可以涉及将所述的组合物或制备物喷洒在农作物上，特别地是在农作物中植物的叶上。所述的步骤可以涉及将所述的组合物或制备物刷擦在农作物上，特别地是在农作物中植物的叶上。所述的步骤可以涉及通过喷洒、滴注或灌溉将所述的组合物或制备物施用至农作物。

在第五个方面的一个实施方案中，dsRNA是杀昆虫dsRNA。在这个实施方案中，所述的组合物是杀昆虫组合物。

如果内容允许的话，本发明的第四个和第五个方面的特征可以如本发明的第一个和第二个方面所述。

在第六个方面中，当应用至植物时，本发明提供了第一个方面的组合物或第二个方面的制备物。第六个方面的特征可以如上文中针对第一个和第二个方面所述。

本发明的第四个至第六个方面的其他特征可以如下文所述。

在一个实施方案中，所述的组合物或制备物一旦应用至植物或农作物，便能够保护植物或农作物至少15天，特别地是至少20天，更特别地是至少25天，最特别地是至少30天。在另一个实施方案中，所述的组合物一旦施用至植物或农作物，便能够保护植物或农作物2至8周，特别地是3至6周，最特别地是4至5周。所述的组合物一旦施用至植物或农作物，则可以以10-30％/周的速度，特别地是15-25％/周，更特别地是15-20％/周的速度降解。保护的持续时间可以受到例如植物或农作物上的降雨量的影响。因此，在较干燥的气候下，预计保护的持续时间增加，而在更湿润的气候提供更短的保护持续时间。

所述的组合物还可以以任何合适的浓度施用至植物或昆虫食物，并且有利的是组合物中的dsRNA在相对低的浓度可以是有效的。在一个实施方案中，可以施用低于100μgdsRNA/植物，特别地是低于50μg，更特别地是低于40、30、20、10或5μg，最特别地是低于1μg或0.5μg dsRNA/植物。当将所述的组合物施用至植物的叶时，可以将低于100μg dsRNA/叶施用至植物，特别地是低于50μg，更特别地是低于40、30、20、10或5μg，最特别地是将低于1μg或0.5μg或0.1μg dsRNA/叶施用至植物。

所述的组合物或制备物可以包含有效量的dsRNA。术语“有效量”是指施用足够量的dsRNA以影响靶向的昆虫。

在第七个方面中，本发明提供了吸附在具有多个带正电荷的基团的分子上的dsRNA。本发明的第七个方面的特征可以如本发明的第一个方面所述。

在第八个方面中，本发明提供了具有吸附在粘土上的多个带正电荷的基团的分子。本发明的第八个方面的特征可以如本发明的第一个方面所述。

在第九个方面中，本发明提供了制备本发明的第二个方面的制备物的方法。该方法可以包括混合本发明的第一个方面的组合物与流体(例如液体、特别地是水性液体)的步骤。该方法还可以包括混合所述的组合物与一种或多种其他的活性试剂或其他的试剂的步骤，如本发明的第二个方面所定义。本发明的第九个方面的特征可以如本发明的第二个方面所述。

在第十个方面中，本发明提供了吸附在粘土复合物上的双链RNA。本发明的第十个方面的特征可以如本发明的第一个方面所述。

在第十一个方面中，本发明提供了包含以下的试剂盒：

(i)粘土复合物(或者粘土和具有多个带正电荷的基团的分子)；以及

(ii)dsRNA；

其中所述的dsRNA吸附在所述的粘土复合物上。

在该方面的一个实施方案中，所述的粘土复合物(或者粘土和具有多个带正电荷的基团的分子)和/或双链RNA以固体或液体(特别地是水性)形式提供。粘土复合物(或者粘土和具有多个带正电荷的基团的分子)和/或dsRNA可以根据它们的形式包含多种其他的试剂。示例性的试剂包括但不限于以下类型的成分中的一种或多种：稀释剂、载体、赋形剂、悬浮试剂、凝聚试剂、碱、缓冲剂、苦味试剂、香料、防腐剂、推进剂、表面活性剂、触变试剂、防冻试剂和着色试剂。技术人员可以选择合适的试剂。

所述的试剂盒还可以包含一种或多种其他的活性成分。如本发明所定义，活性成分是向植物提供益处的成分。活性成分可以是例如杀昆虫剂、农药(pesticide)、杀真菌剂、抗生素、引虫剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或杀线虫剂。

第十一个方面的特征可以如本发明的第一个方面所述。

在第十二个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含吸附在粘土复合物上的dsRNA，并且其中所述的粘土复合物包含pKa大于7.5的带正电荷的基团。第十二个方面的特征可以如上文中针对本发明的第一个方面所述。

在第十三个方面中，本发明提供了一种包含粘土复合物和带负电荷的活性试剂的组合物。所述的带负电荷的活性试剂可以是dsRNA或化学试剂(包括杀昆虫剂)。本发明的第十三个方面的特征可以如本发明的第一个方面所述。

在第十四个方面中，本发明提供了不利地影响昆虫或昆虫群体的方法，该方法包括将本发明的第一个或第十三个方面的组合物施用至昆虫或昆虫群体的步骤。施用组合物的步骤可以包括将所述的组合物施用(或应用)至用于被昆虫或昆虫群体(或该群体中的个体)消耗的昆虫食物。本发明的第十四个方面的特征如上文中针对本发明的第一个方面所述。昆虫食物可以如本发明的第四个方面所述。

本发明范围内，本发明的所述的任意特征都可以与本发明所述的其他特征的任意一个或多个以任意的组合方式组合。

附图简述

参照以下附图，描述本发明的多个实施方案，其中：

图1A提供了在不同的dsRNA:BEN-PEI加载比例的膨润土-聚亚乙基亚胺-dsRNA组合物(BEN-PEI-dsRNA)的凝胶阻滞图像，其中聚亚乙基亚胺(PEI)的分子量为60000；

图1B提供了在不同的dsRNA:BEN-PEI加载比例的膨润土-聚亚乙基亚胺-dsRNA组合物(BEN-PEI-dsRNA)的凝胶阻滞图像，其中聚亚乙基亚胺(PEI)的分子量为800；

图2A提供了在不同pH从膨润土-聚亚乙基亚胺-dsRNA组合物(BEN-PEI-dsRNA)释放dsRNA的凝胶阻滞图像，其中聚亚乙基亚胺(PEI)的分子量为60000；

图2B提供了在不同pH从膨润土-聚亚乙基亚胺-dsRNA组合物(BEN-PEI-dsRNA)释放dsRNA的凝胶阻滞图像，其中聚亚乙基亚胺(PEI)的分子量为800；

图3提供了N:P比值(N：PEI中的胺，P：dsRNA中的磷)为1、2、3、4和5的dsRNA-etPEI复合物的凝胶电泳图像；

图4A提供了从dsRNA-etPEI复合物释放dsRNA的凝胶电泳图像，其中N/P比值为3(即，NP3；N：PEI中的胺，P：dsRNA中的磷)；

图4B提供了从dsRNA-etPEI复合物释放dsRNA的凝胶电泳图像，其中N/P比值为4(即，NP4；N：PEI中的胺，P：dsRNA中的磷)；

图5示出当加入体积增加的NaOH时，etPEI溶液的pH的变化；

图6A提供了凝胶电泳图像，其中在pH 8.0和8.5，在N:P比值为3(N：PEI中的胺，P：dsRNA中的磷；表示为BReP3)的膨润土-etPEI-dsRNA复合物中，研究游离dsRNA的存在情况；

图6B提供了凝胶电泳图像，其中在pH 8.0和8.5，在N:P比值为4和5(N：PEI中的胺，P：dsRNA中的磷；表示为BReP4和BReP5)的膨润土-etPEI-dsRNA复合物中，研究游离dsRNA的存在情况；

图7提供了凝胶电泳图像，其显示dsRNA从BReP4以pH依赖的方式释放的图谱；

图8提供了凝胶电泳图像，其显示dsRNA从BReP5以pH依赖的方式释放的图谱；

图9提供了凝胶电泳图像，其显示dsRNA从BReP6以pH依赖的方式释放的图谱；

图10A是膨润土的扫描电镜图像；

图10B是BEN-etPEI的扫描电镜图像；

图11示出膨润土、etPEI、etPEI-dsRNA复合物和BEN-etPEI-dsRNA的粒径分布；

图12为凝胶电泳图像，其示出在高盐Nuclease A生物测定法中，在BReP5中dsRNA的核酸酶保护；

图13为使用DEPC水、BEN-etPEI、裸Rieske dsRNA和BReP5饲养的棉铃实夜蛾的死亡率的照片。死亡的幼虫用红色箭头指示；

图14提供了幼虫对涂敷DEPC水、BEN-etPEI、裸Rieske dsRNA和BReP5的烟草(Nicotiana tabacum)叶消化12天的作用的统计数据；

图15提供了N:P比值为1/2、1、2和3(N：pDMAEMA中的胺；P：dsRNA中的磷)的dsRNA-pDMAEMA复合物的凝胶电泳图像，其中pDMAEMA的分子量为33000；

图16提供了从膨润土-pDMAEMA-dsRNA(BPR)复合物释放dsRNA的凝胶阻滞图像，其中N/P比值为1(即，NP1，N：pDMAEMA中的胺，P：dsRNA中的磷)，并且膨润土:pDMAEMA的质量比为5:1(即，BPR5)，其中pDMAEMA的分子量为33,000；

图17为凝胶电泳图像，其示出在低盐Nuclease A生物测定法中，在BPR5中dsRNA的核酸酶保护；

图18为在GFP dsRNA(作为对照)、膨润土-pDMAEMA(BP)、VDACdsRNA和膨润土-pDMAEMA-VDAC(BP VDAC)上连续饲养3天(每天一次)的棉铃实夜蛾幼虫中VDAC的相对转录物水平的图。数据表示为平均值±SD；以及

图19为在GFP dsRNA(作为对照)、膨润土-pDMAEMA(BP)、RieskedsRNA和膨润土-pDMAEMA-Rieske(BP Rie)上连续饲养3天(每天一次)的棉铃实夜蛾幼虫中Rieske的相对转录物水平的图。数据表示为平均值±SD。

本发明的优选的特征、实施方案和变体可以通过以下实施例来理解，其中所述的实施例提供了本领域那些技术人员实施本发明的足够的信息。以下实施例不应该视为以任何方式限定本发明的以上概述的范围。

实施例

用于局部应用dsRNA的靶物

用于本发明的组合物的靶物或者在本发明的组合物中使用的dsRNA基因序列包括(除非另外陈述，以下序列意在靶向棉铃实夜蛾)：

◆Rieske基因-Rieske基因表达与电子传递链(ETC)有关的铁硫簇，当该基因被RNAi靶向时，导致昆虫死亡。用于Rieske基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ IDNO.1中提供(300bp)：

CGCATACACCAGCTGAAAAGGTGTTGGTGCACCCCTTGCCAAAAACCTCGACTGTGGAGTCACTGCATGGATCCCTGCCTATCCAGGGCTTGAAGGCCAGAGTAAACGGTCGCGTTTTGTTAAATATTTCTGGGGATTTACGACGAAAAATCGTGTTACATAACACCTTGTCACTTCTAGGGCCAAGCCATGTACGTTTCGCGCATACCGACATCAGCTACCCCGACTTCTCGGCGTACCGTCGCAAGGAGACGCAGGATCCCACCTCAAGGGCTAACGACAACGTCGATGGACGTCAGT

◆电压依赖性阴离子通道(VDAC)-VDAC是在线粒体外膜中形成孔的完整膜蛋白质。VDAC的作用是作为小分子的一般扩散孔，所述小分子例如ATP、磷酸肌酐和小的离子。它们还显示涉及凋亡通路。用于VDAC基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.2中提供(232bp)：

GCGCTAGACGCCGACGCGTCTCTGCATGCCAAGGTCAACAACAAATCTCTCATTGGTCTTGGATACCAACAGAAGTTGCGCCCAGGCGTGACTTTGACAATTTCTGCTGCTATCGATGGCCAGAACTTCAACGCTGGTGGACACAAAGTGGGTGTCGCCCTGGAGCTCGAGCCCTAAGTACACAGAGGCGCTTCGGCTTTTAGTCCTGTAGATAATACATAATGCCACACTG

◆绿色荧光蛋白(GFP)-在一些试验中，GFP用作阴性对照。用于GFP的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.3中提供(339bp)：

AGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGA

◆对照-RNAi试剂盒对照(500bp)。

◆精氨酸激酶(AK)基因-靶向AK基因可以影响昆虫的肌肉。AK基因主要涉及能量代谢。用于AK基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.4中提供(200bp)：

GATGACAGGCTTGGTTTCCTGACTTTCTGCCCCACCAACTTGGGAACCACCGTGCGTGCCTCCGTGCACATCAAGCTGCCCAAGCTGGCTGCCGACAAGGCCAAGCTGGAGGAGATCGCATCCAAGTACCACCTGCAGGTGCGCGGAACCCGCGGCGAGCACACCGAGGCTGAGGGCGGCGTCTACGACATCTCCAACAA

◆肌浆网/内质网Ca²⁺-ATPase(SERCA)基因-靶向SERCA基因可以影响昆虫的肌肉。SERCA基因涉及内质网中钙的摄取。用于SERCA基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.5中提供(231bp)：

TTCCTTGAATTCGAAATTACTGGCTCCACCTACGAACCCATTGGTGACGTTTACCTGAAGGGACAGAAGATCAAGGCCGCTGAATTCGATGCTCTGCACGAACTTGGTACCATTTGCGTTATGTGCAATGACTCCGCTATTGATTTCAACGAATTCAAACAGGCTTTCGAAAAGGTCGGTGAGGCCACTGAAACCGCTCTTATCGTCCTCGCTGAGAAAATGAACCCCTTC

◆谷胱甘肽转移酶(GTT)基因-靶向GTT基因可以影响昆虫的肠道。

GTT基因在化合物的脱毒作用中是重要的。用于谷胱甘肽S转移酶基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.6中提供(300bp)：

GAAAGCAGATGAGGCTCTGCTCAAGAAGCTGGAGGAAGCTCTGCACTTCCTCAACACATTCCTCGAAGGTCAGAAGTACGCTGCGGGTGACAAACTGACCTTGGCAGACCTCAGTCTCGTGGCGACTGTGTCCACTATAGACGCCGTCGACATCAGCCTGAAGGAATATCCCAATGTTGAAAAGTGGTTCGAGCTGGTGAAAGCGACTGCCCCGGGATACCAGGAAGCAAATGAAGCTGGCCTTAAAGCATTCAGAGCTATGGTAGCGCAGTTAAAAGCTAAAACTGAATTGTAAGTGTA

◆乙酰胆碱酯酶(AchE)基因-靶向AchE基因可以影响昆虫的体壁和附属器官。AchE基因在生长和发育中是重要的。用于AchE基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.7中提供(310bp)：

GAGTGGAGACTCAACGAAGATCAATTGGCCGGTGCACACGGCGTCCGGGCGTGAATACCTGTCCTTAGCAGTCAACTCCAGCTCCATAGGCCACGGGCTGAGGGTCAAGGAGTGCGCCTTCTGGCAGAAGTACTTGCCACAGTTGATGGCTGCCACCAATAAGCCAGAACCTCCGAAGAATTGCACGAACAGCGCAGCGCCCGTCAAGGTCCCGTACGAAATCTTCGGCGTGGGCGTCGTGATAGCTACGGGCTTAGCCAAGACAACGTGGTTCAAGTACATCATATGAGTTCATTATGTGGTCTAAGAG

◆保幼激素酯酶基因-用于保幼激素酯酶基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.8中提供(309bp)：

CCACCAAGATCTACACGGACCAGAATATTTGGTCAGCAAGAATGCCATCGTCATCACATTTAATTACAGATTGAACGTCTTCGGTTTCCTGTCCATGAATACGACAAAAATCCCCGGCAACGCTGGTCTCCGAGACCAGGTGACCCTGTTGCGCTGGGTGCAGAGAAATGCTAAGCATTTCGGAGGAGACCCCAACAACGTCACCATAGCGGGGCAGAGCGCTGGTGCAGCAGCCGCGCATCTATTGACTCTGTCTAAAGCTGCTAAAGGTCTTTTCAAAAGAGCAATCTTGATGAGCGGAACAGGAAT

◆耐烯虫酯(Met)受体基因-Met受体是昆虫中的细胞内受体。用于

Met受体基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.9中提供(375bp)：

GCCGCATAGATGGCATTCTAAGGCGTTCCGATAAAGCCACATCAAATGGTGTTCAGGATGAGCAAATTATAAGAAGGCAAAGAGTAAGAACTAATAGAACATTTTCATCCAGTGGGAATGATGTTGTTTTTATTGGTATGATTCATGTTCTATCCAGTGCAATGCCACCTCGAATTCTACCCCCTACAGCCTATTCAGAATACTGGACGAGACATTTGATTGATGGTCGTATCGTTCAGTGTGACCAGAGTATATCATTAGCAATTGGCTACATGACAGAAGAAGTTACTGGAACATCTGCTTTCGTCTTCATGCACAAAGATGATGTCCGCTGGGTAATTTGTGTATTACGACAAATGTATGATGAGAGCCGGG

◆Rab4b GTPase基因-Rab4b GTPase是GTPase水解酶。用于Rab4bGTPase基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.10中提供(313bp)：

AGGACATGGAGGAATCAAGAGAAGTCACTTTTACAGAAGCTAGTCAATTTGCCCAAGAAAATGAATTGATGTTTCTTGAAACCAGTGCTAAAACAGGTGAAAATGTAGAAGAAGCTTTCTTGAAATGTTCCAAAACAATTTTGGCTAAAATTGAAACAGGTGAATTAGATCCCGAGCGAATAGGTTCAGGCATTCAATATGGGACTGGGACCTCTAAAAGGCTTAGCGCGCCCAAGAAACCTGCAAGAAGTCCATCTGATTGTGCTTGTCATGTATAACATTATTTCTTGGATACATAGAATGCATGATCTGC

◆酚氧化酶基因-靶向酚氧化酶基因可以影响昆虫的前肠。酚氧化酶基因涉及化合物的脱毒作用。用于酚氧化酶基因(酚氧化酶亚基2)的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.11中提供(242bp)：

ACGATTCCGTTCGAACAGACGTTCCGTGACCTCTCTGTTCAGAGCAACGACCCTCGCCGCCCCAACTTGGCCGAGTTCAACTTCTGCGGTTGCGGCTGGCCCCAGCACATGTTGGTCCCCAAGGGTACTGAGGCGGGCGCCGCCTACCAGTTGTTCGTTATGCTTTCGAACTACGATCTTGACAGCGTGGAACAACCTGACGGCTCACAGTTGAGCTGCGTCGAAGCTTCCAGTTTCTGCGG

◆组织蛋白酶L基因-靶向组织蛋白酶L基因可以影响昆虫的外皮和表皮。组织蛋白酶L基因在蜕皮过程中起重要作用。用于组织蛋白酶L基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.12中提供(280bp)：

GGTGGAGGACAAGTTCCGCATGAAGATCTACCTGGAGAACAAGCACCGCATCGCCAAGCACAACCAGCGCTTCGAGCAGGGCGCCGTCAGCTACAAGCTGCGCCCCAACAAGTACGCCGACATGCTCAGCCACGAGTTCGTGCACGTCATGAACGGCTTCAACAAGACCCTCAAGCACCCGAAGGCCGTGCACGGCAAGGGTCGCGAGTCCCGGCCCGCCACGTTCATCGCGCCGGCGCACGTCACCTACCCCGACCACGTGGACTGGCGCAAGAAGGGC

◆NV2基因-靶向NV2基因可以影响昆虫的线粒体。NV2基因在电子传递链(ETC)中起重要作用。用于NV2-1基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.13中提供(374bp)：

GCCACAAGCGTGGTGCCATGATCCCACTGCTCGACCTGGCTCAGCGTCAGGCTGGAGGTTGGCTGCCGATATCTGCCATGCATAAAGTAGCTGAAATCCTCAAACTTCCTCGCATGAGAGTTTATGAGGTTGCTACGTTCTACACTATGTTTATTAGACGACCAATCGGCAAGTACCATATCCAAGTTTGCACGACAACTCCTTGCTGGCTCCGAGGTTCTGATGCTATCCTGAAAGCTCTCACTGAGGGTACACAATGCCATGTTGGAGGAAACAGCCCTTGTGGCAAGTTCTCTATTTCTGAGGTTGAATGCCTTGGTGCCTGTGTTAATGCTCCTATGATTCAAGTCAACGATGATTACTACGAAGACCTG

用于NV2-2基因的cDNA序列(其对应于RNA序列)在以下SEQ ID NO.14中提供(255bp)：

GGTTGAATGCCTTGGTGCCTGTGTTAATGCTCCTATGATTCAAGTCAACGATGATTACTACGAAGACCTGTCAGTAGATGACACAAAGGAAATTATTGAAAAGCTCAAAAGGGACGAGAAACCGAAAGCTGGCCCTAGGAGCGGCAGATTCGCCTCAGAACCCTTGGGAGGACTCACTTCTCTCACCGAAGAACCTACAGGCCCCGGTTTTGGACTACAACCCGGCCTCAAGGCCTAGAACAAAAAGTTTCCGTT

以下试验详细描述了组合物中Rieske基因、VDAC基因、GFP和对照的用途。但是，预计上述序列的任意一种都可以用于所述的组合物。

双链RNA(dsRNA)的制备

将Rieske基因序列克隆至pGEM-T-Easy载体中，测序并用于体外dsRNA合成。将T7启动子序列加入至基因特异性引物(下文提供)中。使用PCR合成用于dsRNA合成的T7DNA模板(300bp)。使用MEGAscript T7Transcription Kit进行dsRNA合成，并通过Trizol提取方法纯化。使用NanoDrop 1000分析dsRNA浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳(1％)检查完整性。所用的引物序列如下(T7序列具有下划线)：

SEQ ID NO.15：TAATACGACTCACTATAGGGAGTCGGGGTAGCTGATGTCG

SEQ ID NO.16：TAATACGACTCACTATAGGGAGGCAAGTTCATCGGTGGTT

此外，由AgroRNA公司(Seoul,South Korea)通过体外转录方法合成Rieske和VDAC序列。Rieske序列为300bp(序列保守区)，并且VDAC序列为232bp(序列保守区)，如上文所概括。

实施例1—膨润土-聚亚乙基亚胺-dsRNA(BEN-PEI-dsRNA)组合物

通常，通过在过量的PEI溶液中过夜(～16hrs)混合分散的膨润土，然后洗掉过量的PEI并分散所收集的BEN-PEI来制备膨润土-聚亚乙基亚胺(BEN-PEI)。将dsRNA与分散的BEN-PEI以变化的dsRNA:BEN-PEI质量比混合，经过凝胶测试从而确定dsRNA与BEN-PEI的最佳加载比例。聚亚乙基亚胺(PEI)购自Sigma Aldrich，并且分子量为60,000和800。

BEN-PEI的制备

使用分子量为60,000和分子量为800的两种PEI制备BEN-PEI。首先，通过过夜搅动将1g膨润土(假定的阳离子交换容量(CEC)为100meq/100g)分散于20mL去离子水中。接着，将0.5g的50％PEI溶液(分子量为60,000或800)分散于10mL去离子水中，并且在搅动的同时使用1.0M HCl将pH调节至6-7。在猛烈搅动的同时，接着将分散的PEI溶液滴加至膨润土溶液中。将该膨润土PEI溶液在50℃搅动过夜。

然后收集膨润土-聚亚乙基亚胺(BEN-PEI)复合物，并使用高速离心进行5次洗涤(10000g，5min；20000g，10min；20000g，15min；20000g，15min；20000g，15min)。将洗涤的BEN-PEI复合物分散于100mL去离子水中。

对于BEN-PEI(60,000分子量)的质量浓度为11.7mg/ml，对于BEN-PEI(800分子量)的质量浓度为8.3mg/ml。通过将10mL超声处理的膨润土或膨润土-PEI(BEN-PEI)悬液进行离心(4,000rpm，20min)来测定质量浓度。弃去所得的上清液，并且将团块(pellet)进行真空干燥(2hrs)，然后进行风干(16hrs)。将干燥的团块称重用于计算质量浓度。

加载dsRNA在BEN-PEI上

通过将500ng MEGAscript对照dsRNA(500bp)与BEN-PEI(60,000和800分子量)以质量比1:1、1:10和1:20直至1:140和1:150进行混合来测定质量加载比，即，与完全dsRNA结合Ben-PEI的比例。所得的混合物经过定轨摇动(20min)，然后进行凝胶电泳(1.0％)。

如图1A和1B所示，由于BEN-PEI相对于dsRNA的量增加(即，质量比从1:1至1:100)，游离dsRNA的底部条带的强度变为更弱的强度，表明形成更多的BEN-PEI-dsRNA复合物。dsRNA与BEN-PEI的完全结合显示为大约～1:80(图1A，PEI MW 60,000)和～1:115(图1B，PEI MW 800)。在这些比例，所有的dsRNA均与Ben-PEI结合，从而没有游离的dsRNA在凝胶上向下迁移。这表明根据PEI的分子量，BEN-PEI能够在dsRNA:BEN-PEI质量比为1:80-1:115完全加载dsRNA；因此dsRNA的加载容量在固体系统中为大约1wt％。

从BEN-PEI-dsRNA组合物以pH依赖的方式释放dsRNA

通过在具有完全的dsRNA结合的质量比制备BEN-PEI-dsRNA溶液进行pH释放测试(如上述段落中所讨论：对于BEN-PEI-dsRNA而言，质量比为1:100(其中PEI的分子量为60,000)；对于BEN-PEI-dsRNA而言，质量比为1:120(其中PEI的分子量为800))。将所得的悬液在13,000rpm离心15min，并对上清液进行电泳(1.0％)来检查游离dsRNA的缺乏情况，之后弃去上清液。将团块再次悬浮于pH 2-12.5的20μL水性溶液中，并且定轨摇动30min。随后使用凝胶电泳(1.0％)来检测从BEN-PEI-dsRNA组合物的dsRNA释放，并且结果在图2中提供。

如图2A和2B所示，dsRNA释放是pH依赖的，并且在pH 11基本上从所述的组合物释放。但是，在最终的混合溶液中的pH低于初始值。这意味着dsRNA释放在pH低于11.0且高于10.5开始。

实施例2—膨润土-乙氧基化的聚亚乙基亚胺-dsRNA(BEN-etPEI-dsRNA或BReP)组合物

替代PEI，在所述的组合物中使用不同的聚合物：80％乙氧基化的支化的聚亚乙基亚胺(etPEI)。该聚合物的分子量为70,000，并且得自Sigma Aldrich。

dsRNA-etPEI的制备

首先，使用去离子水将35％w/w(密度＝1.05g/mL)的80％-乙氧基化的支化的PEI(etPEI)溶液稀释1,000倍，然后在搅动的同时，使用1.0M HCl将pH调节至7-7.5。然后，将etPEI的质量浓度调节至0.35mg/mL。

将Rieske dsRNA(500ng，昆虫特异性基因，300bp，1.1μg/uL)加入etPEI溶液中，并且N:P比值(N：PEI中的胺，P：dsRNA中的磷)为1、2、3、4、5、10和20(在本发明中表示为NP1、NP2、NP3、NP4、NP5、NP10和NP20)。然后，将混合物在冰上温育15分钟，并且通过倒置逐渐混合。使用凝胶电泳来检测在dsRNA-etPEI混合溶液中是否存在游离的dsRNA，并且这些结果在图3中提供。

图3中提供的图像证明一些游离dsRNA存在于NP2(dsRNA-etPEI)溶液中，并且极少量的游离dsRNA存在于NP3(dsRNA-etPEI)溶液中。dsRNA与etPEI的完全结合发生在NP4和NP5溶液中。对于3、4和5的N:P摩尔比而言，dsRNA/etPEI的质量比分别为接近1.41、1.05和0.84。

从dsRNA-etPEI以pH依赖的方式释放dsRNA

制备NP3和NP4(dsRNA-etPEI)溶液，然后将它们在相同体积的缓冲剂中混合。缓冲剂溶液的pH为8.0至10.5。将混合物摇动30分钟，然后使用凝胶电泳来检测从dsRNA-etPEI复合物的dsRNA释放。结果在图4A(对于NP3)和4B(对于NP4)中提供。

如图4A和4B所示，在NP3复合物中存在一些游离dsRNA，而在NP4中几乎没有游离dsRNA。NP3和NP4dsRNA-etPEI复合物均在pH 9.5和10释放相当大量的加载的dsRNA。NP3dsRNA-etPEI复合物大概在pH 8.5-9.0开始释放dsRNA，而NP4dsRNA-etPEI复合物在pH9.5开始释放dsRNA。该实验表明在pH 9.0-9.5开始dsRNA释放，而在pH 9.5-10释放相当大量的dsRNA，并且在pH 10.5最大的释放。

etPEI的pKa

测定80％乙氧基化的支化的聚亚乙基亚胺(etPEI)的pKa。首先，制备0.1mol/LHCl、etPEI和NaOH的溶液。将10mL的0.1mol/L HCl和10mL的0.1mol/L etPEI混合，并记录pH。在搅动的同时向etPEI溶液中加入0.5mL的0.1mol/L NaOH，并记录pH；重复该步骤直至pH开始急剧升高。在搅动的同时向etPEI溶液中加入0.1mL的0.1mol/L NaOH，并记录pH；重复该步骤直至pH的升高减慢。然后重复之前的2个步骤，直至溶液的pH为11-11.5。结果在图5中提供。这表明etPEI的pKa是大约9.0-9.5。

BEN-etPEI-dsRNA(BReP)组合物的制备

使用膨润土(BEN)以不同的BEN:etPEI质量比固定化所制备的dsRNA-etPEI样品，然后检测在不同的pH值从BEN-dsRNA-etPEI(BReP)的dsRNA释放。

BReP的制备

首先，通过搅动5分钟将膨润土(0.5g)分散于100mL去离子水中，然后将该悬液稀释成最终质量浓度为5μg/μL。接着，如上文所述制备N:P比值为3、4和5(即，NP3、NP4和NP5)的dsRNA-etPEI混合物。

将膨润土悬液与dsRNA-etPEI混合物(NP3、NP4和NP5)以膨润土:etPEI质量比为6:1进行混合，从而形成BEN-etPEI-dsRNA复合物(在NP3、NP4和NP5下，即，BReP3、BReP4和BReP5)。将混合物在冰上温育15分钟，并且通过倒置逐渐混合，然后使用凝胶电泳来检测游离dsRNA的存在情况。

如图6A和6B所示，在pH 8.0-8.5，BReP3释放一些dsRNA(图6A)，BReP4释放少量的dsRNA(图6B)，而BReP5几乎不释放dsRNA(图6B)。与图3、4A和4B中的凝胶图像相比，在BReP3和BReP4中存在比在NP3和NP4中更多的游离dsRNA。不希望被理论所束缚，据信这是因为膨润土片携带负电荷，这些负电荷可以中和etPEI中的一些正电荷，并且对etPEI中正电荷的中和可以导致dsRNA的释放。预计这种作用在etPEI-dsRNA(例如NP5)中，在更高的N:P比值时降低，而对于BReP5而言，似乎在etPEI中具有足够的正电荷从而减弱了这种作用。

从BReP以pH依赖的方式释放dsRNA

如上文所述，制备BReP4和BReP5悬液。然后，将该悬液与相同体积的缓冲剂混合。缓冲剂溶液的pH为8.5至10.0。将混合物摇动30分钟，然后使用凝胶电泳来检测从BReP4和BReP5复合物的dsRNA释放。结果在图6和7中提供。

如图7所示，少量的游离dsRNA存在于BReP4复合物中以及dsRNA-etPEI(NP4)中。从BReP4以pH依赖的方式释放dsRNA似乎开始于pH 8.5，这与图6B所示一致。这种释放在pH9.0和9.5变得更明显，并且大部分的dsRNA在pH 10.0释放。

如图8所示，存在于BReP5和dsRNA-etPEI(NP5)中的一定量的游离dsRNA为最低量。从BReP5几乎全部释放dsRNA在pH 9.5突然发生，并且在pH 10.0几乎完全释放。

此外，制备BReP6以测试pH依赖的释放行为。如上文BReP4和BReP5所述，制备BReP6，不同之处在于etPEI-dsRNA中的N:P比值(N：etPEI中的胺，P：dsRNA中的磷)为6(即，NP6)。如图9所示，在BReP6中和在dsRNA-etPEI(NP6)制备物中，未观察到游离dsRNA的量。从BReP6的dsRNA最低释放开始于pH 10.0。

总结

BReP4、BReP5和BReP6能够携带大量的dsRNA。例如，对于BReP3、BReP4、BReP5和BReP6而言，质量比BEN:dsRNA:etPEI分别为6:1.41:1、6:1.05:1、6:0.84:1、和6:0.70:1。这意味着在BReP4、BReP5和BReP6中，dsRNAwt％分别为16.7％、13.0％、10.7％和9％。

BReP5和BReP6中的dsRNA几乎与BEN-etPEI完全结合，从而形成BEN-dsRNA-etPEI复合物，其在pH 6-9是稳定的，没有加载的dsRNA的任何明显释放。对于BReP5和BReP6而言，dsRNA分别在pH 9.5和10.0开始释放。在BReP4中，在pH 7.0-8.5存在少量游离dsRNA。对于BReP4而言，在pH 8.5-9.0开始dsRNA释放，并且在pH 10.0下完全释放。

物理化学性质

在JEOL JSM-6300(JEOL，Tokyo，Japan)中记录扫描电镜(SEM)图像，从而研究膨润土和膨润土-etPEI样品(与上文讨论的膨润土-PEI样品类似地制备)的形态学和粒径。将所有的样品都滴在硅晶片上，以避免在涂敷过程中浸入碳膜中。如图10A(对于膨润土而言)和10B(对于BEN-etPEI而言)所示，BEN-etPEI形成了大的堆叠的聚集体(其对于叶上抗性是阴性的)。

在Nanosizer Nano ZS设备(Malvern Instruments)上，测量膨润土、BEN-etPEI-dsRNA(NP5，如上文所述)、etPEI和etPEI-dsRNA(NP5)的粒径分布和zeta电位。图11示出膨润土、etPEI、etPEI-dsRNA复合物和BEN-etPEI-dsRNA的粒径分布，并且粒径的z-平均值分别为～450、～7.4、～750和～2110nm。测量膨润土、BEN-etPEI复合物、etPEI(pH调节至～7)、etPEI-dsRNA和BEN-etPEI-dsRNA的zeta电位，并且分别为-32、-25、18、0.5和1.3mV。

实施例3—核酸酶保护测定法

如上文所述，将Rieske dsRNA(500ng)以N:P比值(N：PEI中的胺；P：dsRNA中的磷)为5(NP5)加载在etPEI上。然后，将NP5复合物以质量比为1:6加载在膨润土上，从而制备BReP5。使用二乙基焦碳酸酯(DEPC)水将混合物的最终体积调节至10μl。加入高盐核酸酶A(2μl)，并将混合物在37℃温育20分钟。加入pH 10的缓冲剂(8μl)来从BReP5复合物释放dsRNA，并检查dsRNA释放。将溶液加载在琼脂糖凝胶(1％)上，并记录凝胶图像。如图12所示，在核酸酶A存在下，降解裸dsRNA。与此形成强烈的对比，BReP5中的dsRNA被保护而对抗核酸酶A的降解，并且在pH 10被释放。实施例4—使用BReP5的昆虫饲养测定法

昆虫的养育

在人工饲料上，将棉铃实夜蛾的新生幼虫饲养4天，随后用在叶饲养测定法中。在27±2℃、65±5％相对湿度和16:8h的光暗循环的受控条件下，养育所述的幼虫。

叶饲养测定法

选择烟草(1个月的植物)叶用于昆虫饲养测定法。所述的测定法包括4组随机分配的昆虫和叶，并且每组8个重复。各组如下：DEPC水(阴性对照)、BEN-etPEI、裸Rieske dsRNA和BReP5。

为了进行测定法，将单一的嫩叶置于petri-平板中的湿润的滤纸上。使用涂料刷将组合物在每个叶的两面上展开。所用的组合物如下：裸dsRNA：50μg/100μL DEPC水；BReP5：对应于50μg dsRNA/100μL；BEN-etPEI：以6:1的膨润土:etPEI—相同质量的BReP5，于100μL中；或者水：100μL。将4天大的幼虫转移至petri-平板，并且使用经过各自处理的第一新鲜的叶饲养3天，然后使用相似处理的第二新鲜的叶再重复饲养3天。在处理饲养的第6天后，将幼虫更换成标准的人工饮食用于进一步的生长。

如图13所示，在仅使用DEPC的处理组中，未观察到死亡。在仅使用BEN-etPEI处理的组中，1只幼虫死亡，并且1只幼虫的生长明显受到影响。相比之下，裸dsRNA处理组显示单个死亡。相反，BReP5处理显示4只幼虫死亡，并且1只幼虫还显示延迟的生长。统计数据也在图14中提供，并且显示在BReP5处理组中的死亡率明显高于其他组。

实施例5—膨润土-pDMAEMA-dsRNA(BEN-pDMAEMA-dsRNA)组合物

pDMAEMA

pDMAEMA为聚(2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)，其结构如下文所示。pDMAEMA为pKa 7.0-7.5的pH敏感性聚合物。pDMAEMA可以通过可逆加成断裂链转移(RAFT)自由基聚合作用以预定的分子量和窄的分子量分布而容易地合成。在一个实施方案中，pDMAEMA的平均分子量为15,000道尔顿。然而，在本实施例中，pDMAEMA的分子量为33,000。可以根据Fournier D etal.,(2007)Macromolecules,40,915-920中概括的方法制备pDMAEMA。

dsRNA-pDMAEMA的制备

将pDMAEMA粉末溶解于去离子水中，并且在搅动的同时，使用1.0MHCl将pH调节至6-6.5。然后将pDMAEMA的质量浓度调节至4mg/mL。

将对照dsRNA(500ng，MEGAscript RNAi试剂盒，1μg/μL)以N:P比值(N：pDMAEMA中的胺，P：dsRNA中的磷)为0.5、1、2和3(在本发明中表示为NP1/2、NP1、NP2和NP3)加入pDMAEMA溶液中。将混合物在室温(RT)温育5分钟，并且通过倒置逐渐混合。使用凝胶电泳来检查在dsRNA-pDMAEMA溶液中是否存在游离dsRNA，并且结果在图15中提供。

图15中提供的图像证明一些游离dsRNA存在于NP1/2(dsRNA-pDMAEMA)溶液中。dsRNA与pDMAEMA的完全结合发生在NP1、NP2和NP3溶液中。

N:P比值为1，意味着pDMAEMA:dsRNA的质量比为大约1:2。这是因为pDMAEMA中的单体单元的分子量为157(并且该单元仅具有1个氮原子)，并且DNA中单一的碱基-糖-磷酸单元的平均分子量为大约330(该单元包含1个磷原子)。Ben-pDMAEMA-dsRNA具有大约63wt％Ben、13wt％pDMAEMA和25wt％dsRNA。

dsRNA-pDMAEMA-BEN的制备

通过搅动，将膨润土(0.5g)在80mL去离子水中分散5分钟，然后将该悬液稀释至最终质量浓度为5μg/μL。将dsRNA加入pH 6.0的pDMAEMA溶液中，从而制备N:P比值为1(NP1)的dsRNA-pDMAEMA混合物。然后，以膨润土:pDMAEMA质量比为5:1将膨润土悬液与dsRNA-pDMAEMA混合物(NP1)混合，从而形成BEN-pDMAEMA-dsRNA复合物(在NP1，即，BPR5)。将混合物在冰上温育15分钟，并通过倒置逐渐混合。

从dsRNA-pDMAEMA-BEN以pH依赖的方式释放dsRNA

在pH 8、8.5、9、9.5、10、10.5和11，制备一系列BPR5的缓冲剂溶液(如上文所述制备)。使用相同体积的缓冲剂制备各溶液。将混合物在室温(RT)温育5分钟，并通过倒置逐渐混合，然后运行凝胶电泳，从而检查从dsRNA-pDMAEMA-膨润土复合物的dsRNA释放。结果在图16中提供。

如图16所示，NP1dsRNA-pDMAEMA-膨润土复合物大概在pH 8.0开始释放dsRNA，并且在pH 8.5-11释放大量的dsRNA。

实施例6—核酸酶保护测定法

如上文所述，将对照dsRNA(500ng)以N:P比值(N：pDMAEMA中的胺；P：dsRNA中的磷)为1(NP1)加载在pDMAEMA上。然后，将NP1复合物以质量比为1:5加载在膨润土上，从而制备BPR5。使用二乙基焦碳酸酯(DEPC)水将混合物的最终体积调节至10μL。加入高盐核酸酶A(0.125ng)，并将混合物在37℃温育20分钟。加入pH 10的缓冲剂(8μl)，从而从BPR5复合物释放dsRNA，并检查dsRNA的释放。将溶液加载在琼脂糖凝胶(1％)上，并记录凝胶图像。如图17所示，在核酸酶A存在下，降解裸dsRNA。与此形成强烈的对比，BPR5中的dsRNA被保护而对抗核酸酶A的降解，并且在pH 10被释放。

实施例7—饲养生物测定法

在水、膨润土-pDMAEMA(膨润土聚合物或BP)、绿色荧光蛋白(GFP–阴性对照)、Rieske、VDAC、膨润土-pDMAEMA-Rieske(BP-Rieske)和膨润土-pDMAEMA-VDAC(BP-VDAC)上饲养棉铃实夜蛾的新出现的新生幼虫。如上文对dsRNA-pDMAEMA-BEN中所概括的那样，制备BP-Rieske和BP-VDAC，其中N:P比值为1(pDMAEMA中的氮:dsRNA中的磷)，并且膨润土:pDMAEMA的质量比为5:1。将溶液应用在人工饮食块(～1cm²)的表面上，使得60μg dsRNA被应用在各块上(体积100μL)，并使溶液渗透进入饲料块中。随后，将所得的块喂给棉铃实夜蛾的新出现的新生幼虫。将溶液3次喂给幼虫，并且连续喂养之间间隔为24小时。在应用dsRNA溶液时，使用新的人工饮食块。

在饲养实验过程中，在得自各处理组的15只幼虫首次dsRNA暴露(DPE)后3天，将这15只幼虫一起合并于液氮中。根据相对转录物分析基因沉默作用。

RT-PCR分析

为了通过棉铃实夜蛾幼虫饲养来评价基于纳米颗粒的RNAi方法在沉默Rieske和VDAC基因中的效力，由AgroRNA公司(Seoul，South Korea)合成用于Rieske(300bp–序列保守区)和VDAC(232bp–序列保守区)的dsRNA。

由15只合并的幼虫提取总的RNA，并根据制造商的说明书进行TriSure试剂(Bioline)和DNAse(Thermo Fisher)处理。使用100ng的总RNA以20μL实施实时反应。使用编码核糖体蛋白质的基因(L27，RPL27)作为内参。使用sensifast SYBR No-ROX一步法试剂盒(Bioline)进行实时PCT(RT-PCR)，并使用2^-ΔΔCT方法评价在使用人工饮食上饲养的棉铃实夜蛾中Rieske和VDAC相对于GFP的转录物水平。合成与dsRNA区域不重叠的引物对，用于通过定量实时PCR检查对基因转录物的抑制。所用的引物的序列如下：

SEQ ID NO.17(Rieske):CCGCAAACGAGATTAGCACC

SEQ ID NO.18(Rieske):ACTTCGGCGGCTACTACTG

SEQ ID NO.19(VDAC):GACTGCGGTATTAGCATGAAG

SEQ ID NO.20(VDAC):CAGAGAACACTTGAAGATACTG

SEQ ID NO.21(RPL27):ACAGGTATCCCCGCAAAGTGC

SEQ ID NO.22(RPLS27):GTCCTTGGCGCTGAACTTCTC

图18和19显示使用膨润土-pDMAEMA-Rieske(BP-Rieske)或膨润土-pDMAEMA-VDAC(BP-VDAC)饲养棉铃实夜蛾幼虫有效地在幼虫中触发RNAi。与GFP dsRNA饲养的幼虫相比，BP-Rieske和BP-VDAC分别将转录物水平抑制42.8％和79.4％。但是，裸VDAC dsRNA抑制转录物水平为22.6％，而裸Rieske dsRNA不显著地抑制转录物水平。

在本说明书和权利要求书中(如果有)，词语“包括”及其衍生词(包括单数形式的“包括”和复数形式的“包括”)包含每一个所陈述的整数，但是不排除包含一个或多个其他的整数。

在整个说明书中，所提及的“一个实施方式”或“实施方式”是指与该实施方案相关描述的具体特性、结构或特征被包含在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中的多处出现的短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”不必全都指相同的实施方案。此外，具体的特性、结构或特征可以以任何合适的方式结合在一个或多个组合中。

根据法令，以或多或少特定于结构或方法特性的语言来描述本发明。应该理解的是，本发明不限于所示的或所描述的特定特性，这是因为本发明所述的手段包含对本发明进行实施的优选的形式。因此，要求保护本发明以任何形式或修改在本领域那些技术人员适当解释的所附权利要求书(如果有)的合适范围内。

优点

本发明的优点可以包括：

-大尺寸的dsRNA可以包含在所述的组合物中；

-所述的组合物中的dsRNA可以被保护而对抗核酸酶和U.V.光；

-具有多个带正电荷的基团的分子可以用作“pH控制”开关，从而在碱性pH从所述的组合物中释放dsRNA(例如，对于鳞翅目昆虫而言，这种情况在中肠中发生)；

-在被喷洒在昆虫食物上后，dsRNA应该在几周内是可利用的；

-所述的组合物具有导致食用喷洒有或包含所述的组合物的食物源的昆虫死亡的能力；

-dsRNA对靶物有机体是高度特异性的，并且是生态友好的。所述的组合物不应该影响不被所述的组合物所靶向的物种；

-所述的组合物可以以相对低的成本容易地制备；

-所述的组合物可以具有高的dsRNA加载能力；

-所述的组合物可以具有低的毒性；以及

-所述的组合物可以容易地分散用于喷洒、滴注或通过灌溉应用。

序列表

<110> The University of Queensland

<120> 组合物

<130> IIC173153

<141> 2016-06-17

<150> AU 2015902373

<151> 2015-06-19

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 1

cgcatacacc agctgaaaag gtgttggtgc accccttgcc aaaaacctcg actgtggagt 60

cactgcatgg atccctgcct atccagggct tgaaggccag agtaaacggt cgcgttttgt 120

taaatatttc tggggattta cgacgaaaaa tcgtgttaca taacaccttg tcacttctag 180

ggccaagcca tgtacgtttc gcgcataccg acatcagcta ccccgacttc tcggcgtacc 240

gtcgcaagga gacgcaggat cccacctcaa gggctaacga caacgtcgat ggacgtcagt 300

<210> 2

<211> 232

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 2

gcgctagacg ccgacgcgtc tctgcatgcc aaggtcaaca acaaatctct cattggtctt 60

ggataccaac agaagttgcg cccaggcgtg actttgacaa tttctgctgc tatcgatggc 120

cagaacttca acgctggtgg acacaaagtg ggtgtcgccc tggagctcga gccctaagta 180

cacagaggcg cttcggcttt tagtcctgta gataatacat aatgccacac tg 232

<210> 3

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 绿色荧光蛋白

<400> 3

aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 60

accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc 120

tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca 180

tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc 240

actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc 300

tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgaga 339

<210> 4

<211> 200

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 4

gatgacaggc ttggtttcct gactttctgc cccaccaact tgggaaccac cgtgcgtgcc 60

tccgtgcaca tcaagctgcc caagctggct gccgacaagg ccaagctgga ggagatcgca 120

tccaagtacc acctgcaggt gcgcggaacc cgcggcgagc acaccgaggc tgagggcggc 180

gtctacgaca tctccaacaa 200

<210> 5

<211> 231

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 5

ttccttgaat tcgaaattac tggctccacc tacgaaccca ttggtgacgt ttacctgaag 60

ggacagaaga tcaaggccgc tgaattcgat gctctgcacg aacttggtac catttgcgtt 120

atgtgcaatg actccgctat tgatttcaac gaattcaaac aggctttcga aaaggtcggt 180

gaggccactg aaaccgctct tatcgtcctc gctgagaaaa tgaacccctt c 231

<210> 6

<211> 300

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 6

gaaagcagat gaggctctgc tcaagaagct ggaggaagct ctgcacttcc tcaacacatt 60

cctcgaaggt cagaagtacg ctgcgggtga caaactgacc ttggcagacc tcagtctcgt 120

ggcgactgtg tccactatag acgccgtcga catcagcctg aaggaatatc ccaatgttga 180

aaagtggttc gagctggtga aagcgactgc cccgggatac caggaagcaa atgaagctgg 240

ccttaaagca ttcagagcta tggtagcgca gttaaaagct aaaactgaat tgtaagtgta 300

<210> 7

<211> 310

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 7

gagtggagac tcaacgaaga tcaattggcc ggtgcacacg gcgtccgggc gtgaatacct 60

gtccttagca gtcaactcca gctccatagg ccacgggctg agggtcaagg agtgcgcctt 120

ctggcagaag tacttgccac agttgatggc tgccaccaat aagccagaac ctccgaagaa 180

ttgcacgaac agcgcagcgc ccgtcaaggt cccgtacgaa atcttcggcg tgggcgtcgt 240

gatagctacg ggcttagcca agacaacgtg gttcaagtac atcatatgag ttcattatgt 300

ggtctaagag 310

<210> 8

<211> 309

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 8

ccaccaagat ctacacggac cagaatattt ggtcagcaag aatgccatcg tcatcacatt 60

taattacaga ttgaacgtct tcggtttcct gtccatgaat acgacaaaaa tccccggcaa 120

cgctggtctc cgagaccagg tgaccctgtt gcgctgggtg cagagaaatg ctaagcattt 180

cggaggagac cccaacaacg tcaccatagc ggggcagagc gctggtgcag cagccgcgca 240

tctattgact ctgtctaaag ctgctaaagg tcttttcaaa agagcaatct tgatgagcgg 300

aacaggaat 309

<210> 9

<211> 375

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 9

gccgcataga tggcattcta aggcgttccg ataaagccac atcaaatggt gttcaggatg 60

agcaaattat aagaaggcaa agagtaagaa ctaatagaac attttcatcc agtgggaatg 120

atgttgtttt tattggtatg attcatgttc tatccagtgc aatgccacct cgaattctac 180

cccctacagc ctattcagaa tactggacga gacatttgat tgatggtcgt atcgttcagt 240

gtgaccagag tatatcatta gcaattggct acatgacaga agaagttact ggaacatctg 300

ctttcgtctt catgcacaaa gatgatgtcc gctgggtaat ttgtgtatta cgacaaatgt 360

atgatgagag ccggg 375

<210> 10

<211> 313

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 10

aggacatgga ggaatcaaga gaagtcactt ttacagaagc tagtcaattt gcccaagaaa 60

atgaattgat gtttcttgaa accagtgcta aaacaggtga aaatgtagaa gaagctttct 120

tgaaatgttc caaaacaatt ttggctaaaa ttgaaacagg tgaattagat cccgagcgaa 180

taggttcagg cattcaatat gggactggga cctctaaaag gcttagcgcg cccaagaaac 240

ctgcaagaag tccatctgat tgtgcttgtc atgtataaca ttatttcttg gatacataga 300

atgcatgatc tgc 313

<210> 11

<211> 242

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 11

acgattccgt tcgaacagac gttccgtgac ctctctgttc agagcaacga ccctcgccgc 60

cccaacttgg ccgagttcaa cttctgcggt tgcggctggc cccagcacat gttggtcccc 120

aagggtactg aggcgggcgc cgcctaccag ttgttcgtta tgctttcgaa ctacgatctt 180

gacagcgtgg aacaacctga cggctcacag ttgagctgcg tcgaagcttc cagtttctgc 240

gg 242

<210> 12

<211> 280

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 12

ggtggaggac aagttccgca tgaagatcta cctggagaac aagcaccgca tcgccaagca 60

caaccagcgc ttcgagcagg gcgccgtcag ctacaagctg cgccccaaca agtacgccga 120

catgctcagc cacgagttcg tgcacgtcat gaacggcttc aacaagaccc tcaagcaccc 180

gaaggccgtg cacggcaagg gtcgcgagtc ccggcccgcc acgttcatcg cgccggcgca 240

cgtcacctac cccgaccacg tggactggcg caagaagggc 280

<210> 13

<211> 374

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 13

gccacaagcg tggtgccatg atcccactgc tcgacctggc tcagcgtcag gctggaggtt 60

ggctgccgat atctgccatg cataaagtag ctgaaatcct caaacttcct cgcatgagag 120

tttatgaggt tgctacgttc tacactatgt ttattagacg accaatcggc aagtaccata 180

tccaagtttg cacgacaact ccttgctggc tccgaggttc tgatgctatc ctgaaagctc 240

tcactgaggg tacacaatgc catgttggag gaaacagccc ttgtggcaag ttctctattt 300

ctgaggttga atgccttggt gcctgtgtta atgctcctat gattcaagtc aacgatgatt 360

actacgaaga cctg 374

<210> 14

<211> 255

<212> DNA

<213> 棉铃实夜蛾

<400> 14

ggttgaatgc cttggtgcct gtgttaatgc tcctatgatt caagtcaacg atgattacta 60

cgaagacctg tcagtagatg acacaaagga aattattgaa aagctcaaaa gggacgagaa 120

accgaaagct ggccctagga gcggcagatt cgcctcagaa cccttgggag gactcacttc 180

tctcaccgaa gaacctacag gccccggttt tggactacaa cccggcctca aggcctagaa 240

caaaaagttt ccgtt 255

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rieske引物1

<400> 15

taatacgact cactataggg agtcggggta gctgatgtcg 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rieske引物2

<400> 16

taatacgact cactataggg aggcaagttc atcggtggtt 40

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rieske引物3

<400> 17

ccgcaaacga gattagcacc 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rieske引物4

<400> 18

acttcggcgg ctactactg 19

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VDAC引物1

<400> 19

gactgcggta ttagcatgaa g 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VDAC引物2

<400> 20

cagagaacac ttgaagatac tg 22

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPL引物

<400> 21

acaggtatcc ccgcaaagtg c 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPLS27引物

<400> 22

gtccttggcg ctgaacttct c 21

Claims

1.一种用于将双链RNA递送至在其消化道内具有碱性pH的昆虫的组合物，其中所述的组合物包含吸附在粘土复合物上的双链RNA，并且其中所述的粘土复合物配置为在所述的碱性pH释放所述的双链RNA。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述的双链RNA为杀昆虫双链RNA。

3.权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述的昆虫是双翅目、鳞翅目或鞘翅目的。

4.权利要求1至3的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物为植物保护性组合物。

5.权利要求4所述的组合物，其中所述的双链RNA为杀昆虫双链RNA，并且所述的杀昆虫双链RNA能够通过RNA干扰而保护植物对抗昆虫。

6.权利要求1至5的任意一项所述的组合物，其中所述的双链RNA靶向以下组中的至少一种：昆虫的电子传递链(ETC)、昆虫的电压依赖性通道、昆虫的肌肉、昆虫的肠道、昆虫的体壁和/或附属器官、昆虫的细胞内受体、昆虫的GTPase水解酶、昆虫的保幼激素酯酶、昆虫的线粒体以及昆虫的外皮和/或表皮。

7.权利要求1至6的任意一项所述的组合物，其中所述的粘土复合物包括阳离子粘土。

8.权利要求1至6的任意一项所述的组合物，其中所述的粘土复合物包括膨润土。

9.权利要求1至8的任意一项所述的组合物，其中所述的粘土复合物包括具有2个或更多个带正电荷的基团的分子。

10.权利要求9所述的组合物，其中所述的具有2个或更多个带正电荷的基团的分子为具有2个或更多个带正电荷的氮原子的聚合物。

11.权利要求10所述的组合物，其中所述的聚合物为基于聚亚乙基的，其中所述的基于聚亚乙基的聚合物中的亚乙基基团被氨基基团取代，并且任选地被与所述的氨基基团相邻的吸电子基团取代。

12.权利要求10或权利要求11所述的组合物，其中所述的聚合物中的氮:所述的双链RNA中的磷的比值为至少4；并且其中粘土:聚合物的质量比为3:1至8:1。

13.包含权利要求1至12的任意一项所述的组合物的制备物。

14.权利要求13所述的制备物，其中所述的制备物包含液相和固相，所述的固相包含权利要求1至12的任意一项所述的组合物；并且其中所述的制备物是可喷洒在植物上的。

15.一种将双链RNA递送至其消化道内具有碱性pH的昆虫的方法，该方法包括向昆虫食物施用权利要求1至12的任意一项所述的组合物或者权利要求13或权利要求14所述的制备物。

16.权利要求15所述的方法，其中所述的昆虫食物为植物、植物部分、合成的昆虫食物源、昆虫饵料或水诱捕器。

17.一种保护农作物对抗在其消化道内具有碱性pH的昆虫的方法，该方法包括向农作物施用权利要求1至12的任意一项所述的组合物或者权利要求13或权利要求14所述的制备物的步骤。

18.权利要求17所述的方法，其中通过喷洒、滴注或灌溉向农作物施用权利要求1至12的任意一项所述的组合物或者权利要求13或权利要求14所述的制备物。

19.一种制备权利要求9至12的任意一项所述的组合物的方法，该方法包括以下步骤：

a.使所述的双链RNA吸附在所述的具有2个或更多个带正电荷的基团的分子上；以及

b.使所述的双链RNA/分子吸附在所述的粘土上。

20.一种试剂盒，其包含：

a.粘土复合物；以及

b.双链RNA；

其中所述的双链RNA可吸附在所述的粘土复合物上，从而形成权利要求1至12的任意一项所述的组合物。