BR112017027356B1 - Composição e seu método de preparação, preparação agrícola para proteção de plantas contra insetos, métodos para distribuição de rna de dupla fita a um inseto e para proteção de uma colheita contra um inseto, e kit - Google Patents

Composição e seu método de preparação, preparação agrícola para proteção de plantas contra insetos, métodos para distribuição de rna de dupla fita a um inseto e para proteção de uma colheita contra um inseto, e kit Download PDF

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Abstract

composição. a presente invenção refere-se, em um aspecto, à uma composição para distribuição de rna duplo filamentoso para um inseto, que tem um ph básico dentro do seu canal alimentar, em que a composição compreende rna de filamento duplo, absorvido em um complexo de argila, e em que o complexo de argila é configurado para liberar o rna duplo filamentoso no ph básico. outros aspectos da invenção referem-se às preparações, incluindo a composição da invenção, métodos de distribuição de rna duplo filamentoso para um inseto, e métodos de proteger uma colheita contra um inseto.

Description

CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção se refere, inter alia, às composições para insetos, aos métodos de preparar tais composições, e aos métodos de usar tais composições.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[002] Será claramente compreendido que, se uma publicação da técnica anterior é referida aqui no presente, essa referência não constitui uma admissão de que a publicação faz parte do conhecimento geral comum na técnica, na Austrália, ou em qualquer outro país.
[003] A discussão abaixo, especialmente, se refere à proteção de plantas contra populações de insetos, e especialmente ao controle de populações de insetos que comem plantas. Entretanto, para evitar dúvidas, a presente invenção não é limitada à proteção de plantas, ou ao controle de tais populações de insetos. Por exemplo, muitas das questões com agentes químicos, para controle de insetos discutidas abaixo, são também de interesse para controle de inseto não agrícola.
[004] Duas das estratégias mais comuns, para o controle de pra gas de insetos em plantas, incluem reprodução para resistência a doenças e controle químico. Controle químico em particular é frequentemente usado para controlar populações de insetos, mas agentes químicos são muitas vezes dispendiosos. Além do mais, existem preocupações de segurança, em relação ao impacto em potencial dos agentes químicos, no ambiente, e o uso de agentes químicos em, por exemplo, frutas e vegetais a serem consumidos pela população. Essas últimas questões são fatores que têm contribuído para o crescimento do mercado de frutas e vegetais orgânicos.
[005] Um fator crítico adicional, é que os insetos podem e têm de senvolvido resistência aos agentes inseticidas químicos tradicionais. Por exemplo, na Austrália, populações do campo de Helicoverpa armi- gera (Lagarta que ataca algodoeiro) resistentes à inseticida se desenvolveram, e esses sub-tipos resistentes representam uma praga significativa na região de grãos do norte da Austrália (que abrange todas as áreas de produção de Queensland). Colheitas afetadas pelo H. armi- gera incluem canola, grão de bico, algodão, alfafa, milho, milhos moídos (painças) e panicums, brotos de feijão, amendoins, sorgo, sojas, girassóis e cereais de inverno, incluindo trigo, cevada, aveias, alpiste e triti- cale. H. armigera é também uma principal praga endêmica agrícola para a Europa, Ásia e África. É altamente polifagoso e tem mostrado se alimentar mais do que 180 espécies de planta em 47 famílias. Foi estimado que a H. armigera causa US$2 bilhões, por ano, em prejuízo de colheitas, a despeito da despesa de US$500 milhões em valor de pesticidas para controle deles. Entretanto, H. armigera é apenas uma espécie da ordem de Lepidópteros, que é o segundo maior tipo de inseto, compreendendo traças e borboletas. O estágio de larva das traças causa maior prejuízo para muitas colheitas economicamente valiosas, incluindo algodão, tabaco, tomate, milho, sorgo, alfafa, girassol, legumes e trigo.
[006] Um esforço para reduzir o uso de inseticidas químicos em plantas, tem envolvido o desenvolvimento de plantas transgênicas. Por exemplo, durante as duas últimas décadas tem havido um aumento na adoção de plantas transgênicas, que expressam proteínas inseticidas codificadas por genes da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt). Entretanto, a disponibilidade de plantas apropriadas é limitada, e sub tipos de H. armigera, por exemplo, desenvolveram resistência à ambas, formas de toxinas única e dupla de algodão Bt. Além do mais, a aplicação de plantas transgênicas, tem encontrado resistência do público e de agências reguladoras, e o custo, laboriosidade e tempo necessário para desenvolver plantas transgênicas torna essa uma opção não atraente.
[007] Interferência de RNAi, ou RNA (também conhecido como si lenciando RNA), tem sido usada para pesquisa genética em insetos, e tem sido promissora em entomologia, pois fornece alvo específico silenciando expressão de gene. Entretanto, existem muitas dificuldades para usar RNAi para controlar o impacto das pragas de inseto nas plantas.
[008] O mecanismo de RNAi envolve primeiro introduzir RNA (dsRNA) de dupla fita na insemineira (haemoel) do inseto (por exemplo, através de ingestão/injeção/embebendo), depois do que a dsRNA prossegue para entrar as células do inseto através de endocitose, ou através de proteínas de transmembrana. Em seguida, dsRNA é digerido dentro das células do inseto, por uma enzima de ribonuclease III (RNaseIII), conhecida como Dicer, em curta interferência de RNAs (siRNAs) de 2025 nucleotídeos de comprimento. As siRNAs são depois desprendidas e uma tira (a tira guia) é carregada no complexo silencioso induzido de RNA (RISC). Por último, o RISC localiza e liga ao mensageiro RNAs (mRNAs), contendo sequências complementares para a tira guia, resultando em degradação de mRNA do gene alvo, finalmente levando para a morte da célula.
[009] Uma dificuldade maior no uso do mecanismo de RNAi, é como eficazmente distribuir dsRNA para insetos. Em particular, a maioria dos estudos de laboratório, de RNAi em insetos, utilizaram microin- jeação in vitro de dsRNAs sintetizadas, em embriões, ou a hemocoel (insemineira). Claramente, entretanto, microinjeção como um mecanismo de distribuição, não é viável para proteção de planta em larga escala. Outra estratégia é para insetos ingerir o dsRNA, provendo ele misturado na dieta, mas isto significa que o dsRNA entra no canal alimentar do inseto, e especialmente no intestino médio. O ambiente do intestine médio é hostil para dsRNA, devido o pH do intestino médio e a presença de nucleases do intestino. Nucleases capazes de degradar o dsRNA podem também estar presentes na saliva dos insetos (como recentemente reportado por Allen e Walker (2012), para o percevejo de planta manchada Lygus lineolaris. Saliva de Lygus lineolaris digere ácidos rubonucleicos de duplo filamento. Journal of Insect Physiology (Jornal de Fisiologia de Inseto), 58, 391-396). Além do mais, a pesquisa indica que as respostas de RNAi podem ser mais fortes em menos espécies de insetos derivados, mas algumas espécies mais derivadas, Dipteran e Lepidopteran, podem ser refratárias ao RNAi sistêmico.
[0010] Outra dificuldade é como prover o dsRNA para ingestão em insetos. dsRNA é vulnerável às nucleases no ambiente, e também à luz ultravioleta, especificamente se ela tem que ser provida como aplicação tópica, na superfície da planta. Por exemplo, em um estudo dsRNA, topicamente aplicado a uma planta para proteção contra vírus, não pode proteger as plantas 7 dias depois da aplicação. Além do mais, quando dsRNA foi aplicado, 24 horas depois da infecção viral, o dsRNA não foi capaz de proteger as plantas contra o vírus (Tenllado, F. & J.R. DiazRuiz, (2001). RNA de dupla fita, mediou interferência com infecção de vírus da planta. Journal Virology 75: 12288-12297). Em outro estudo, quando o dsRNA foi adicionado para alimentos de insetos, os níveis de dsRNA, em diferentes dietas, baixaram em 14% nos alimentos sólidos para besouros e traças, e por 32% na dieta fluida de pulgão, depois de 3 dias, e por 31% e 56% depois de 6 dias, respectivamente (Whyard et al (2009) RNAs de duplas fitas ingeridos, podem atuar como inseticidas de espécies específicas. Insect Biochemistry and Molecular Biology (Bioquímica de Inseto e Biologia Molecular), 39, 824-832).
[0011] Desafios maiores para a aplicação de RNAi em insetos (de pois de genes alvos eficazes terem sido identificados), são a estabilidade de dsRNA, antes da administração para o inseto, e a distribuição de dsRNA para o inseto.
[0012] Consequentemente, existe uma necessidade de prover uma abordagem alternativa eficaz, que permita marcar populações de insetos, ou uma abordagem que, pelo menos parcialmente, supere pelo menos uma das desvantagens mencionadas acima, ou que forneça ao consumidor uma escolha útil ou comercial.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0013] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma composição para distribuição de dsRNA, para um inseto que tem um pH básico, dentro de seu canal alimentar, em que a composição compreende dsRNA absorvidos em um complexo de argila, e em que o complexo de argila é configurado para liberar o dsRNA no pH básico.
[0014] Vantajosamente, foi constatado que, quando dsRNA é ab sorvido sobre o complexo de argila, é estável e a composição protege o dsRNA da luz UV e de nucleases. A composição, vantajosamente, pode ser pulverizada em colheitas, por exemplo, para proteger a colheita contra os insetos. Além do mais, o dsRNA permanece absorvido no complexo de argila, até a composição encontrar um pH básico, tal como dentro do canal alimentar de insetos. Sem querer estar preso pela teoria, é esperado que, uma vez no canal alimentício de insetos, o dsRNA será progressivamente liberado do complexo de argila, o que significa que a composição provê uma função protetora para o dsRNA, dentro do intestino do inseto. Quando o dsRNA inseticida é usado, em uma composição de argila pulverizada nas folhas das plantas, foi mostrado que uma proporção significativa de insetos, comendo essas folhas, são adversamente afetados pelo dsRNA ou morrem.
[0015] A composição, dessa maneira, provê um sistema para distri buição de dsRNA, para insetos que têm um pH básico, dentro de seu canal alimentar. O dsRNA, dessa maneira, pode ser qualquer dsRNA apropriado para uso com insetos, e não necessita ser limitado à dsRNA inseticidas. Entretanto, em uma modalidade, a distribuição de dsRNA afeta adversamente o inseto, e é especialmente dsRNA de inseticida. Nessas modalidades, a composição pode ser uma composição inseticida. A composição pode ser para proteger plantas. Insetos podem também ser transportadores de várias doenças (tais como malaria e febre da dengue). A composição, dessa maneira, pode ser para uso na proteção de seres humanos e animais contra doença.
[0016] Como usado aqui no presente, o dsRNA que adversamente afeta um inseto pode incluir dsRNA, que causa mortalidade de inseto, ou afeta a função ou comportamento normal daquele inseto, ou afeta a função fisiológica do inseto, incluindo esterilização, infecção viral de mobilidade diminuída.
[0017] A composição pode ser apropriada para qualquer tipo de in seto, desde que o inseto tenha um pH básico, dentro de seu canal alimentar. Em uma modalidade, o inseto é um inseto de mastigação ou de uma mordida. Um inseto de mastigação ou mordida vai ingerir a composição, mediante o consumo de um alimento revestido com a composição. Em outra modalidade, o inseto do tipo Diptera, Lepidoptera ou Coleoptera. Insetos exemplares incluem um ou mais dos a seguir: - Insetos da ordem Diptera (especialmente moscas, mosquitos, borrachudos ou maruins); especialmente insetos da família Tephritidae ou Drosophilidae; mais especialmente da família Tephriti- dae; anda mais especialmente do gênero Bactrocera ou Vidalia; mais especialmente moscas de fruta; - Insetos do tipo ordem Lepidoptera (especialmente traças ou borboletas (incluindo lagartas)); especialmente: o Insetos das famílias Tortricidae, Noctuidae, Geometridae, Sesiidae, Sphingidae, Plutellidae ou Pyralidae; o Insetos da família Noctuidae; especialmente do gênero Helicoverpa; mais especialmente Helicoverpa armigera (lagarta que ataca o algodão); ou o Insetos da família Plutellidae; especialmente do gênero Plutella; mais especialmente Plutella xilostella (traça Diamondback); - Insetos da ordem Coleoptera (especialmente exemplo gor- goleiros e ou outros besouros); especialmente insetos da superfamília Curculionoidea, mais especialmente da família Curculionidae, mais especialmente gorgoleiros.
[0018] O inseto pode ser uma larva de inseto (por exemplo, para o tipo Lepidoptera, a larva de inseto pode ser lagarta). O inseto pode ser uma praga para plantas (tais plantas podem ser como adicionalmente definidas abaixo). Em uma modalidade, o inseto é da ordem Lepidop- tera, especialmente da família Noctuidae; especialmente do gênero He- licoverpa; mais especialmente Helicoverpa armigera.
[0019] O inseto tem um pH básico dentro do seu canal alimentar. Para evitar dúvida, quando é feito referência, aqui no presente, a um pH dentro do canal alimentar de um inseto, não significa que o canal alimentar inteiro tem aquele pH. O inseto pode ter um pH básico, dentro de um ou mais de seu intestino anterior (canal alimentar (de insetos)), intestino do meio (mesentério) ou intestino posterior (proctódio); especialmente dentro do intestino do meio. O pH básico pode ser um pH maior do que 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5 ou 11.0. O pH básico pode ser um pH básico menos do que 11.0, 10.5, 10.0, 9.5, ou 9.0. O pH básico pode ser um pH de 8.0 a 11.0, 8.5 a 11.0, 8.0 a 10.5, 9.0 a 10.0, 9.0 a 9.5, 9.0 a 10.5 ou 9.0 a 11.0.
[0020] A composição pode ser uma composição de proteção da planta. A composição pode ser para proteger qualquer tipo de planta apropriado (ou colheita, incluindo uma pluralidade de plantas). A planta pode ser um embriófito, especialmente um espermatófito, mais especialmente uma angiosperma (tal como um monocotiledonio (ou monocot), dicotiledono ou eudicotiledonio (eudicot)) ou uma gimnosperma.
[0021] Monocotiledonios exemplares incluem plantas da ordem: As- paragales (incluindo Amarillidaceae (tais como alho-porro, cebola, alho, chalotas e cebolhinhas), e Asparagaceae (tais como aspargos)); Areca- les (incluindo Arecaceae (tais como palmeiras, por exemplo, palmeira de coco)); Dioscoreales (incluindo Dioscoreaceae (tal como inhame)); Poales (incluindo Bromeliaceae (tal como abacaxi) e Poaceae (incluindo milho (milho), trigo, arroz, cevada, painço (milho moído), sorgo, aveias e bambu)); e Zingiberales (incluindo Musaceae (incluindo banana) e Zin- giberaceae (incluindo gengibre e rizoma-de-galanga)).
[0022] Eudicotiledonios exemplares incluem plantas da ordem: - Apiales (incluindo Apiaceae (tais como parsnip, cenoura e aipo)); - Asterales (incluindo Asteraceae (tais como alface, alcachofra e girassol)); - Brassicales (incluindo Brassicaceae (tais como brócoli, repolho, couve galega, couve flor, couve-de-bruxelas, bok choy, choi sum, kohlrabi, rabanete, nabo e colza) e Capparaceae (tais como alcaparras)); - Caryophillales (incluindo Amaranthaceae (tais como gespi- nafre, chard and beet) and Poligonaceae (tais como ruibarbo)); - Cucurbitales (incluindo Cucurbitaceae (tais como cucumber, abóbora, abóbora-moranga, melão da rocha, melão, zuquini e melancia)); - Ericales (incluindo Actinidiaceae (tais como kiwi) and Ericaceae (tais como mistilo)); - Fabales (incluindo Fabaceae (tais como vários feijões, ervilha, soja, brotos de feijão, lentilha, amendoim e alfalfa (lucerne))); - Lamiales (incluindo Oleaceae (tais como oliva)); - Malpighiales (incluindo Linaceae (tal como linhaça)); - Malvales (incluindo Malvaceae (tal como algodão)); - Myrtales (incluindo Myrtaceae (tal como goiaba)); - Rosales (incluindo Cannabaceae (tal como cânhamo), Ro- saceae (tais como morango, maçã, pera, abricó, ameixa, cereja, pêssego, framboesa, amêndoa e nectarina) e Moraceae (tail como figo)); - Sapindales (incluindo Rutaceae (tais como citros, por exemplo, laranja, limão, toronja, lima e mandarin) e Sapindaceae (tal como litchi); - Solanales (incluindo Convolvulaceae (tal como batata doce) e Solanaceae (tais como batata, tomate, beringela, pimentas (tal como capsicum) e tabaco)); e - Vitales (incluindo Vitaceae (tal como uva)).
[0023] Em uma modalidade, a composição é para proteção de co lheitas agrícolas comerciais. Colheitas exemplares incluem cereais, vegetais (incluindo raízes e tubérculos), frutas, legumes, oleaginosase colheita de fibras. Cereais podem incluir milho (milho), arroz, trigo, cevada, sorgo, milho moído e aveias. Vegetais podem incluir brócoli, couve flor, repolho, alcachofras, alcaparras, couve galega, espinafre, alface, bok choy, chard, choi sum, alho-porro, couve-de-bruxelas, kohlrabi, rizoma de galanga, gengibre, aipo, ruibarbo, aspargo, brotos de bambu, batatas, batatas doces, inhames, sojas, brotos de feijão, alfalfa, cenouras, pastinagas, beterrabas, rabanetes, nabos, cebolas, chalotas e alho. Frutas podem incluir tomates, uvas, kiwi, bagas (incluindo morangos, mistilos e framboesas), goiaba, ervilhas, melões (incluindo melões da rocha, melões e melancias), citreos (incluindo laranjas, manda- rinas, limões, toronjas), fruto de caroço/drupa (incluindo abricós, necta- rinas, ameixas, cerejas e pêssegoes), lychees, abacaxis, figos, maçãs, bananas, pepinos, abóbora, zuquinis, abóboras, pimentas, beringelas e abacates. Legumes podem incluir feijões, ervilhas e lentilhas. Óleos de colheita podem incluir colheitas das quais o óleo pode ser obtido, tais como palmeiras, soja, colzas, sementes de girassol, amendoim, sementes de algodão, grãos de palmeiras, cocos e olivas. Colheitas de fibras podem incluir algodão, linho, cânhamo e bambu. A colheita pode também ser tabaco ou uma planta florescente.
[0024] O dsRNA pode ser dsRNA protetor de planta (ou dsRNA pro tetor de colheita). O RNA (dsRN) de dupla fitaprotetor de planta, pode ser capaz de proteger uma planta (especialmente através de interferência de RNA) contra insetos. Similarmente, o dsRNA protetor de colheita, pode ser capaz de proteger uma colheita contra insetos. O dsRNA pode ser dsRNA inseticida. Insetos podem ser como descrito acima.
[0025] Uma sequência de dsRNA específica pode ser selecionada com base no inseto contra o qual a proteção é procurada, e um sequência apropriada pode ser prontamente selecionada pela pessoa versada.
[0026] Vantajosamente, a fim da interferência de RNA ocorrer, a se quência de nucleotídeos de RNA deve combinar com o inseto perfeitamente. Consequentemente, o dsRNA é provável de ser altamente específico para o inseto alvo, limitando a possibilidade de efeitos adversos em predadores para o inseto, no ambiente ou nas pessoas na hora do consumo (no caso de vegetais e frutas, por exemplo).
[0027] Como usado aqui no presente, o termo "protetor de planta", "protetor e colheita" e similares, significa que a composição/dsRNA é capaz de prevenir ou melhorar o impacto de um inseto em uma planta ou colheita. Por exemplo, dsRNA que protege uma planta ou colheita, contra um inseto, pode matar o inseto, adversamente afetar o inseto, ou pode impedir o inseto de se alimentar na planta ou colheita.
[0028] O comprimento do dsRNA pode variar, dependendo do(s) in- seto(s) contra o(s) qual(quais) a proteção é procurada. Vantajosamente, RNases em insetos (enzimas do Tipo Dicer) vão penetrar por muito tempo nas sequências de dsRNA, em fragmentos muito menores, cada um dos quais é tipicamente 20-25 nucleotídeos de comprimento. Dessa maneira, sequências de dsRNA longas, por exemplo, 100 a 3000 pares de base, podem ser usadas, e essas sequências mais longas deverão ser divididas em tais fragmentos menores, pelo inseto, depois do inseto ingerir o dsRNA. Acredita-se que esses fragmentos de nucleotídeo menores (por exemplo, 21 nucleotídeos) são envolvidos no mecanismo de interferência de RNA.
[0029] Um único traçado de dsRNA pode ser engenheirado pela combinação de sequências específicas de múltiplos insetos, ou alvos genéticos, que poderão marcar múltiplos organismos ou alvos genéticos (incluindo múltiplos alvos genéticos para o mesmo inseto), quando cada inseto dividir a sequência de dsRNA em fragmentos mais curtos. Por exemplo, um único constrututo de dsRNA poderá ser usado para marcar três insetos diferentes ou alvos genéticos. O dsRNA pode marcar, pelo menos, dois insetos ou alvos genéticos, mais especialmente de 2 a 10 insetos ou alvos genéticos, anda mais especialmente de 4 a 8 insetos ou alvos genéticos.
[0030] O dsRNA pode, dessa maneira, ser de 20 ou 21 a 3000 pares de base em comprimento; especialmente de 21 a 2500, ou de 21 a 2000 pares de base em comprimento; mais especialmente de 80 a 1750, de 80 a 1500, ou de 80 a 1200 pares de base em comprimento; mais especialmente de 100 a 1200, ou de 250 a 1200 pares de base em comprimento. Vantajosamente, o uso de tais sequências de dsRNA maiores, provê uma probabilidade muito maior, da sequência que está sendo dividida para uma sequência de nucleotídeos, que vai combinar com o inseto desejado, de afetar (por exemplo, matar) o inseto. Além disso, ela pode ser menos dispendiosa para produzir um construto de dsRNA mais longo, que alveja múltiplos insetos ou múltiplos alvos genéticos, em vez de fazer construtos e formulações individuais. Dessa maneira, o dsRNA pode ser um construto de dsRNA que alveja múltiplos insetos, ou múltiplos alvos genéticos (por exemplo dentro de um único inseto).
[0031] Alternativamente, o dsRNA pode ser uma pluralidade de dsRNAs (ou dois ou mais dsRNAs). Cada sequência de dsRNA, na dita pluralidade de dsRNAs, pode ter um alvo genético diferente, marcar um inseto diferente, ou marcar uma combinação de diferentes alvos gené- ticos/insetos. Consequentemente, em uma modalidade o dsRNA é uma pluralidade de dsRNAs para marcar uma pluralidade de insetos ou alvos genéticos.
[0032] Espera-se que o complexo de argila seja capaz de absorver sequências de dsRNA de uma variedade de comprimentos, independente da sequência.
[0033] Em uma modalidade, o dsRNA alveja a cadeia de transporte de elétrons (ETC) de um inseto, especialmente o gene Rieske de um inseto. Em outra modalidade, o dsRNA alveja um canal dependente de voltagem, de um inseto, especialmente um canal aniônico dependente de voltagem (VDAC) de um inseto, mais especialmente um VDAC, na membrana externa mitocondrial de um inseto. Em outra modalidade, o dsRNA alveja os músculos de um inseto, especialmente o gene Arginine Kinase (AK) e o gene SERCA (sarco/retículo endoplásmico Ca2+- ATPase) de um inseto. O gene AK é principalmente envolvido no metabolismo de energia, enquanto que o gene SERCA é envolvido na absorção de cálcio no retículo endoplásmico. Em outra modalidade, o dsRNA alveja o intestino de um inseto, especialmente o gene Glutationa Transferase (GTT) de um inseto. O gene GTT é importante na desintoxicação de compostos. Em outra modalidade, o dsRNA alveja a parede do corpo e apêndices de um inseto, especialmente o gene Acetilcolinesterase (AchE) de um inseto. O gene AchE é importante no crescimento e desenvolvimento. Em outra modalidade, o dsRNA alveja um receptor intracelular de um inseto, especialmente o receptor tolerante de meto- preno (Met) de um inseto. Em outra modalidade, o dsRNA alveja uma enzima de hidrolase de GTPase de um inseto, especialmente o Rab4b GTPase de um inseto. Em outra modalidade, o dsRNA alveja uma esterase de hormônio juvenil de um inseto. Em outra modalidade, o dsRNA alveja a mitocondria de um inseto, especialmente o gene NV2 de um inseto. O gene NV2 desempenha um papel importante na cadeia de transporte de elétron (ETC). Em outra modalidade, o dsRNA alveja o intestino de um inseto, especialmente o intestino anterior de um inseto, mais especialmente o gene de profenoloxidase de um inseto. O gene de profenoloxidase é envolvido em desintoxicação de compostos. Em outra modalidade, o dsRNA alveja a cutícla e epiderme de um inseto, especialmente o gene de catepsina L de um inseto. O gene de catepsina L desempenha um papel importante no processo de muda.
[0034] Dessa maneira, em uma modalidade o dsRNA alveja pelo menos um do grupo consistindo em: a cadeia transportadora de elétron (ETC) de um inseto, um canal dependente da voltagem de um inseto, um músculo de um inseto, um intestino de um inseto, uma parede de corpo e/ou apêndices de um inseto, um receptor intracelular de um inseto, uma enzima de hidrolase de GTPase de um inseto, uma esterase de hormônio juvenil de um inseto, a mitocondria de um inseto, e a cutí-cula e/ou epiderme de um inseto.
[0035] Em outra modalidade, o dsRNA inclui um filamento (anti-sen tido ou no sentido) que é complementar para, ou pelo menos parcialmente complementar, para uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 2 e 4-14; mais especialmente SEQ ID NOs. 1 ou 2. Como usado aqui no presente, um filamento que é "pelo menos parcialmente complementar" significa que um filamento do dsRNA tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, com a sequência. Será percebido que esta definição leva em consideração que o RNA usa um U em vez de um T, como encontrado no DNA.
[0036] Em uma modalidade adicional, pelo menos uma porção de um filamento do dsRNA (antisentido ou sentido) é complementar para ou, pelo menos parcialmente complementar, para uma sequência como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 2 e 4-14; mais especialmente SEQ ID NOs. 1 ou 2. Como usada aqui no presente, pelo menos uma porção de um filamento, que é "pelo menos parcialmente complementar", significa que pelo menos uma porção de um filamento do dsRNA tem, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência. Deverá ser evidente que esta definição leva em consideração que o RNA usa um U em vez de um T, como encontrado no DNA.
[0037] Em uma modalidade adicional, o dsRNA inclui, ou pelo me nos inclui, uma porção de um filamento (antisentido ou sentido), que é complementar para, ou pelo menos parcialmente complementar, para um fragmento de uma sequência, como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 2 e 4-14; mais especialmente SEQ ID NOs. 1 ou 2. A título de exemplo somente, um fragmento pode incluir pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de uma sequência que é complementar a, ou pelo menos parcialmente complementar a, sequência como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 2 e 4-14; mais especialmente SEQ ID NOs. 1 ou 2.
[0038] O dsRNA pode ser produzido de qualquer maneira apropri ada. Por exemplo, o dsRNA pode ser produzido in vitro, através de um kit, in vitro ou in vivo através de um bacteriófago (tal como através de um bacteriófago de Pseudomonas syringae de dsRNA), ou in vivo usando uma tensão de organismo especializada, especialmente usando uma bactéria (tal como uma tensão de E. coli). Tipicamente, métodos in vitro são apropriados para produção de dsRNA de escala menor. Para produção em larga escala, os métodos de produção in vivo são preferidos. O dsRNA usado pode ser um extrato bacteriano bruto.
[0039] O dsRNA pode ser em qualquer forma apropriada, e ser de qualquer sequência apropriada. O dsRNA pode incluir quaisquer modificações apropriadas. Por exemplo, o dsRNA pode incluir um ou mais grupos de fosfato modificado, ácidos nucleicos/nucleotídeos modificados, açúcares modificados e/ou 5 ou 3 extremidades principais modificadas. Grupos modificados exemplares, que podem estar presentes no dsRNA incluem, por exemplo, inosina, metilinosina, pseudo-uridina, morflina, ácidos nucleicos bloqueados, peptídeos (tais como ácidos nu- cleicos de peptídeo (PNA)), biotina, colesterol, fluorofores, radionuclí- deos e metais. O dsRNA pode também ser na forma de um construto de dsRNA. Tais modificações podem intensificar a estabilidade e/ou longevidade do dsRNA.
[0040] O complexo de argila pode incluir uma argila. A argila pode ser uma argila aniônica. A argila pode incluir uma pluralidade de cama das ou folhas positivamente carregadas. Entretanto, em uma modalidade preferida, a argila é uma argila catiônica. A argila pode incluir uma pluralidade de camadas, ou folhas negativamente carregadas. A argila pode ser uma argila baseada em sílica. A argila pode ser uma argila de tumefação. A argila pode ser bentonita. A argila pode incluir, consistir essencialmente de, ou consistir em montmorilonita.
[0041] A argila pode ter uma densidade de carga de 10 a 400 de carga milimolar equivalente por 100 g de argila (meq/100 g), especialmente uma densidade de carga de 20 a 300 meq/100 g, mais especialmente uma densidade de carga de 30 a 250, de 40 a 200, de 50 a 200, e 70 a 150, de 80 a 120, de 90 a 110, ou cerca de 100 meq/100 g.
[0042] A argila pode incluir uma pluralidade de partículas de argila. As partículas de argila podem ter um valor médio z de tamanho de partícula de até 5 μm, mais especialmente até 1 μm, mais especialmente até 750 nm ou até 500 nm. Em uma modalidade, as partículas de argila podem ter um valor médio z, do tamanho de partícula, dentro da faixa de 20-800 nm, mais especialmente 100-800 nm ou 250-650 nm, ainda mais especialmente cerca de 450 nm.
[0043] Quando a argila inclui uma pluralidade de camadas ou folhas negativamente carregadas, um componente adicional positivamente carregado é necessário para permitir a formação de uma composição incluindo ambos, a argila e o dsRNA (quando o dsRNA carega uma carga negativa (devido aos grupos de fosfato)).
[0044] Dessa maneira, em uma modalidade, o complexo de argila inclui uma molécula, que tem uma pluralidade de grupos positivamente carregados (ou uma molécula positivamente carregada), especialmente em uma solução em que o pH é de 5,0 a 7,0. A molécula pode ser para complexar com uma argila catiônica e com dsRNA. A molécula pode ser adsorvida na argila. A molécula pode ser uma macromolécula, especialmente um polímero. A molécula pode ser um dendrímero. O polímero pode ser um co-polímero ou um bloco de co-polímero.
[0045] A carga positiva em grupos positivamente carregados, pode ser localizada (ou pelo menos parcialmente localizada) em um átomo de nitrogênio e/ou um metal de transição; especialmente um átomo de nitrogênio.
[0046] O grupo positivamente carregado pode ser uma amina posi tivamente carregada (incluindo aminas primária, secundária, terciária ou quaternária), uma imina (incluindo iminas primária e secundária), um grupo guanidina, ou um grupo amino aromático. Aminas exemplares incluem alquilamina, alquilamin-oalquila ou alquilamino(alquil)alquila (em que cada grupo alquila pode ser independentemente selecionado de C112 alquila, especialmente C1-6 alquila, mais especialmente metila, etila, propila, butila, pentila ou hexila); e um anel heterocícllco saturado contendo nitrogênio (exemplos incluem um anel heterocícllco saturado, contendo nitrogênio tendo de 1 a 10 átomos de carbono; especialmente pirrolidinila, pirazolidinila, piperidinila, morfolinila e quinuclidinila). Imina exemplares incluem uma alquilimina e um alquiliminoalquila (em que cada grupo alquila pode ser independentemente selecionado de C1-12 alquila, especialmente C1-6 alquila, mais especialmente metila, etila, propila, butila, pentila ou hexila). Um grupo guanidina exemplar é um grupo alquilguanidino ((em que a alquila pode ser independentemente selecionada de C1-12 alquila, especialmente C1-6 alquila, mais especialmente metila, etila, propila, butila, pentila ou hexila). Grupos amino aromático exemplares podem incluir nitrogênio aromático contendo heterocíclos; especialmente nitrogênio aromático contendo heterociclos tendo de 1 a 10 átomos de carbono; mais especialmente imidazolila, triazolila ou pu- rinila. A molécula ou grupos positivamente carregados podem ser opcionalmente substituídos com pelo menos um (e especialmente uma pluralidade) de grupos modificando pKa, como descrito abaixo. Os grupos modificando pKa podem ser geminais ou vicinais, para os grupos posi-tivamente carregados (taism como grupos incluindo átomos de nitrogênio) na molécula.
[0047] Como usado aqui no presente, o termo "alquila" ou "alqui- leno" se refere a uma cadeia reta ou grupo hidrocarboneto saturado ramificado. O grupo alquila pode ter um número de átomos de carbono especificado, por exemplo, C1-12 alquila se refere à grupos alquila tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 átomos de carbono em um arranjo linear ou ramificado. A menos que definido de outra maneira, o termo "alquila" pode ser C1-12alquila ou C1-6alquila. Exemplos de grupos al-quila apropriados podem incluir, mas não são limitados a, metila, etila, propila (n-propila e i-propila), butila (n-butila, i-butila e t-butila), n-pentila, 2-metilbutila, 3-metilbutila, 4-metilbutila, 2-etilpropila, n-hexila, 2- metilpentila, 3-metilpentila, 4-metilpentil, 2-etilbutil, 3-etilbutila, heptila, octila, nonila, decila, undecila, dodecila, ciclopentila, cicloexila e cicloep- tila.
[0048] A molécula pode ser uma molécula tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados (ou dois ou mais grupos positivamente carregados), em que os grupos são selecionado de uma ou mais de amina, imina, guanido, e grupos amino aromáticos. Como usados aqui no presente, os termos "grupos positivamente carregados", "molécula positivamente carregada" ou similares, se referem a um grupo ou molécula com uma carga positiva em pH 5,0 a 7,0.
[0049] Sem querer estar preso pela teoria, acredita-se que a com posição pode formar através de interações eletrostáticas entre, por exemplo, uma argila carregada negativamente, uma molécula carregada positivamente, e um dsRNA carregado negativamente. Consequentemente, se as cargas positivas dos grupos positivamente carregados na molécula são neutralizadas (por exemplo, devido ao pH básico dentro do canal alimentar dos insetos), a composição se dissocia, liberando o dsRNA. Dessa maneira, moléculas específicas, tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados, podem ser selecionadas para uso com insetos específicos, e a pKa dos grupos positivamente carregados na molécula, pode ser manipulada ou selecionada para controlar a liberação de dsRNA no inseto. A título de exemplo, se o pH dentro de um canal alimentar de insetos, é cerca de 10.5, então uma composição incluindo uma molécula com grupos positivamente carregados, tendo uma pKa de 9,0, deverá ser esperada liberar dsRNA no canal alimentar de insetos, mais rapidamente e completamente que uma composição incluindo uma molécula com grupos positivamente carregados, tendo uma pKa de 10,5.
[0050] Dessa maneira, a pKa dos grupos positivamente carregados pode ser maior do que 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5 ou 11.0. A pKa dos grupos positivamente carregados podem ser menos do que 11.0, 10.5, 10.0, 9.5, ou 9.0. A pKa do grupo positivamente carregados pode ser de 8.0 a 11.0, 8.5 a 11.0, 8.0 a 10.5, 9.0 a 10.0, 9.0 a 9.5, 9.0 a 10.5 ou 9.0 a 11.0.
[0051] Além do mais, o dsRNA pode ser liberado da composição em um pH de mais do que 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5 ou 11.0. O dsRNA pode ser liberado da composição em um pH de menos do que 11.0, 10.5, 10.0, 9.5, ou 9.0. O dsRNA pode ser liberado da composição em um pH de 8.0 a 11.0, 8.5 a 11.0, 8.0 a 10.5, 9.0 a 10.0, 9.0 a 9.5, 9.0 a 10.5 ou 9.0 a 11.0. Se a pKa dos grupos positivamente carregados é, por exemplo, 9.0, então deverá ser esperado que o dsRNA deverá ser liberado de uma composição incluindo uma molécula com aqueles grupos positivamente carregados em um pH de 9.0.
[0052] A molécula tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados, pode ser de qualquer ordem apropriada. Em uma modalidade, a molécula é um polímero. O polímero pode ter um peso molecular de mais do que 200, especialmente mais do que 400, mais especialmente mais do que 600. O polímero pode ter um peso molecular de 400 a 100,000, especialmente de 600 a 80,000. O polímero pode ter um peso molecular de 10,000 a 50,000; especialmente de 10,000 a 40,000; mais especialmente cerca de 15,000 ou cerca de 33,000.
[0053] O polímero pode ser um co-polímero ou um co-polímero de bloco formado com, pelo menos, um monômero provendo pelo menos um grupo positivamente carregado. O polímero pode também ser um homopolímero, formado por somente um monômero provendo pelo menos um grupo positivamente carregado.
[0054] O polímero pode ter uma pluralidade de átomos de nitrogênio positivamente carregados (os grupos positivamente carregados podem ser átomos de nitrogênio positivamente carregados). A pKa dos átomos de nitrogênio pode ser como descrita acima, para os grupos positivamente carregados. O polímero pode ser um polímero linear ou ramificado. O polímero pode ser ou incluir uma polialquilenoamina opcionalmente substituída (pode ser conhecido como polialquilenoimina). Uma polialquiloneamina exemplar pode ser poliexilenoamina (pode ser conhecida como poliexilenoimina), polipentilenoamina (pode ser conhecida como polipentilenoimina), polibutilenoamina (pode ser conhecida como polibutilenoimina), polipropilenoamina (pode ser conhecida como polipropilenoimina) ou polietilaenoamina (pode ser conhecida como po- lietilenoimina); especialmente polietilenoamina. Polietilenoaminas inclu- emgrupos amino tendo valores pKa de 10.5 a 11.0 e, desse modo, deverá ser esperado liberar dsRNA em um pH de cerca de ou mais do que 10.5.
[0055] Os substituintes opcionais para a polialquilenoamina, podem ser grupos modificando pKa ou uma pluralidade de grupos modificando pKa. Dessa maneira, o polímero pode ser uma polialquilenoamina substituída por uma pluralidade de grupos modificando pKa. Os grupos modificando pKa podem ser grupos retirando elétron ou grupos doando elétron. Os grupos modificando pKa, podem ser geminais ou vicinais para os grupos amina no polímero. Os grupos exemplares retirando elétrons podem incluir grupos contendo carbonila (tais como ésteres (incluindo grupos -CO-O-alquila) e ácidos carboxílicos (incluindo um grupo - CO-OH)), grupos nitro, grupos ciano, grupos amino protonado (tais como um nitrogênio tetra-alquila substituída) e grupos de sulfato. Os grupos modificando pKa podem também incluir -alquila, -OH, éteres (incluindo grupos -O-alquila), e aminas (incluindo -NH-alquila e grupos - N(alquil)-alquila), em que os grupos alquila podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais de -OH, -O-alquila, -halo (incluindo -F, - Cl, -Br de -I), -CO-alquila, -CO-O-alquila, -O-CO-alquila, -NH-alquila, - N(alquila)2, -CO-NH-alquila e -NH-CO-alquila.
[0056] Em uma modalidade, o polímero é uma polialquilenoamina substituída com grupos geminal ou vicinal, modificando pKa para grupos amina no polímero. O polímero pode ser uma polialquilenoamina substituída com grupos hidroxila ou grupos -O-alquila vicinal, para os grupos amina no polímero. O polímero pode ser polietilenoamina etoxilada. Po- lietilenoamina etoxilada inclui grupos amino, tendo valores de pKa de cerca de 9.0 - 9.5. Para evitar dúvida, uma polialquilenoamina pode incluir um ou ambos os grupos amina e imina. Por exemplo, polietilenoa- mina etoxilada pode incluir uma ou mais das unidades a seguir: - NH(CH2CH2OH), -N(CH2CH2OH)2, e -N(CH2CH2OH)-.
[0057] O polímero pode ser baseado em polialquileno; especial mente baseado em polihexileno, baseado em polipentileno, baseado em polibutileno, baseado em polipropileno ou baseado em polietileno; mais especialmente baseado em polietileno. O polímero baseado em polial- quileno pode incluir um grupo geminal ou vicinal, positivamente carregado para um grupo modificando pKa (especialmente um grupo etirando elétron). Em uma modalidade, o grupo alquileno (especialmente um grupo etileno) no polímero baseado em polialquileno, pode ser substituído por um grupo amino, e opcionalmente vicinal para o grupo amino é um grupo retirando elétron. O polímero pode ser baseado em polietileno, em que o grupo etileno, no polímero baseado em polietileno, é substituído por um grupo amino, e opcionalmente substituído por um grupo retirando elétron vicinal para o grupo amino. O grupo amino pode ser um grupo dialquilamino; mais especialmente um grupo dietilamino ou dime- tilamino; mais especialmente um grupo dimetilamino. O grupo retirando elétron pode ser um alquilenoéster (-R-COO-), alquilenoéter (-R-O-) ou alquileno-carbonila (-R-CO-); mais especialmente um grupo etileno-CO- O-). O grupo retirando elétron pode ser derivado de um metacrilato. Em uma modalidade exemplar, o polímero pode ser ou incluir a polidialqui- laminoalquilmetacrilato. Em uma modalidade exemplar adicional, o polímero pode ser poli(2-dimetilaminoetila metacrilato) (ou pDMAEMA). pDMAEMA inclui grupos amino alquilato, tendo valores de pKa de cerca de 7.0-7.5. Em outra modalidade exemplar, o polímero pode ser poli(2- (dietilaamino)etila metacrilato) (ou pDEAEMA). pDEAEMA tem valores similares de pKa para pDMAEMA.
[0058] O polímero pode ser um homopolímero, co-polímero ou co- polímero em bloco, incluindo um dialquilaminoalquilmetacrilato (tal como um 2-(dimetilamino)etila metacrilato ou DMAEMA). O co-polímero ou co-polímero em bloco, incluindo um dialquilaminoalquilmetacrilato, pode também incluir um segundo dialquilaminoalquilmetacrilato, um po- lialquilenóxido (tal como polietilenóxido ou PEO), ou uma polialquilacri- lamida (tal como poli(N-isopropilacrilamida) ou PNIPAM). Co-polímeros ou co-polímeros em bloco exemplares, incluem pDMAEMA-pDEAEMA, pDMAEMA-PEO, e pDMAEMA-PNIPAM. Em tais polímeros, a pKa do grupo amino pode variar, permitindo o dsRNA ser liberado em pHs diferentes.
[0059] A composição pode incluir até 40% em peso de dsRNA, es pecialmente até 30% em peso de dsRNA, mais especialmente até 25% em peso, ou 20% em peso de dsRNA. A composição pode incluir mais de 0,5% em peso de dsRNA; especialmente mais de 1 % em peso de dsRNA, 2% em peso de dsRNA, 3% em peso de dsRNA, 4 % em peso de dsRNA ou 7% em peso de dsRNA; mais especialmente mais do que 5 % em peso de dsRNA. A composição pode incluir de 0,5 a 30% em peso de dsRNA, de 1 a 30% em peso de dsRNA, de 5 a 30% em peso de dsRNA, ou de 5 a 20 % em peso de dsRNA; mais especialmente de 5 a 25 % em peso de dsRNA, ou de 7 a 25% em peso de dsRNA; mais especialmente, cerca de 8 a 25% em peso de dsRNA.
[0060] Quando uma molécula, tendo uma pluralidade de grupo ni trogênio positivamente carregados, está presente na composição, a proporção de N:P na composição (isto é, os nitrogênios na molécula (N): o fosfóro no dsRNA(P)) pode ser, pelo menos, 1, 2, ou 3, especialmente pelo menos 4, mais especialmente pelo menos 5. A proporção de N:P na composição pode ser menos do que 30, menos do que 20, menos do que 10, ou menos do que 7; especialmente menos do que 6. A proporção de N:P na composição pode ser de 3-7, especialmente de 4-6, mais especialmente cerca de 5.
[0061] Em uma composição em que o complexo de argila inclui uma argila e uma molécula, tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados, a proporção da massa de argila: molécula/dsRNA (ou de argila : molécula) pode ser de 1:1 a 10:1, especialmente de 3:1 a 8:1, mais especialmente de 4:1 a 7:1 ou 5:1 a 7:1, mais especialmente cerca de 6:1 ou cerca de 5:1. A proporção de massa de argila : molécula : dsRNA pode ser cerca de 5:1:2.
[0062] Sem querer estar preso pela teoria, a proporção de carrega mento de diferentes componentes, na composição, pode afetar a liberação de dsRNA. Por exemplo, no mesmo pH básico, uma composição, incluindo uma proporção maior de grupos positivamente carregados, seria esperado liberar dsRNA mais lentamente do que uma composição incluindo uma proporção menor de grupos positivamente carregados (quando a base tem uma quantidade maior de cargas positivas para neutralizar).
[0063] Em uma modalidade, a composição tem um valor médio z, de tamanho de partícula de até 5000 nm, especialmente até 3000 nm, mais especialmente de até 2500 nm. Em outra modalidade, a composição tem um valor médio z-, de tamanho de partícula de pelo menos 50 nm, 100 nm, 250 nm ou 500 nm, especialmente pelo menos 1000 nm, mais especialmente pelo menos 1500 nm, mais especialmente pelo menos 2000 nm. Em uma modalidade, a composição tem um valor médio z de tamanho de partícula de cerca de 2100 nm. A composição pode ter um valor médio z de tamanho de partícula de 50 nm a 5 μm, especialmente de 100 nm a 1 μm. O tamanho de partícula ideal da composição, pode variar dependendo ao alimento para o qual a composição deve ser aplicada.
[0064] Em outra modalidade, a composição tem um potencial zeta positivo, especialmente um potencial zeta de mais do que 0,5 mV. Em outra modalidade, a composição tem um potencial zeta de menos do que 25 mV, especialmente menos do que 15 mV, mais especialmente menos do que 10 mV, ainda mais especialmente menos do que 5 mV. Em uma modalidade adicional, a composição tem um potencial zeta de cerca de 1,3 mV.
[0065] Como usado aqui no presente, o termo "dsRNA absorvido em um complexo de argila" e similares, incluem circunstâncias em que o dsRNA é absorvido na superfície do complexo de argila, circunstâncias em que o dsRNA é intercalado entre as camadas do complexo de argila, e circunstâncias em que o dsRNA é absorvido na molécula tendo uma pluralidade de grupo positivamente carregados, em que o dsRNA/molécula é absorvido na superfície de uma argila, ou entre camadas de argila. Dessa maneira, o termo "absorvido" inclui ambas, absorção na superfície da argila, ou complexo de argila, como também intercalação entre argila ou camadas de complexo de argila.
[0066] Sem querer estar preso pela teoria, acredita-se que, quando o dsRNA é absorvido no complexo de argila, é concedido ao dsRNA alguma proteção contra RNases e luz U.V., e desse modo o dsRNA é significativamente mais estável. Desse modo, acredita-se que o complexo de argila atua como um revestimento protetor para o dsRNA absorvido.
[0067] Vantajosamente, espera-se que, quando o dsRNA é absor vido no complexo de argila, o dsRNA substancialmente não degrada, mesmo quando armazenado por mais de 60 dias. Quando o dsRNA é absorvido no complexo de argila, o complexo de argila vantajosamente protege o dsRNA contra RNase e luz Ultra Violeta.
[0068] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere à uma preparação, incluindo a composição do primeiro aspecto da presente invenção. O contexto permitindo, características do segundo aspecto da presente invenção podem ser como descritas para o primeiro aspecto da presente invenção.
[0069] A preparação pode incluir uma composição do primeiro as pecto da presente invenção, ou uma pluralidade de composições do primeiro aspecto da presente invenção. Por exemplo, podem ser providas múltiplas composições para um usuário (por exemplo, em forma de sólido ou pó) em que cada um alveja uma praga de inseto. Se o usuário quer marcar três pragas de inseto, quando borrifando uma colheita, por exemplo, o usuário pode misturar três composições e um fluido, para preparar uma única preparação para borrifar.
[0070] A preparação pode ser em qualquer forma apropriada. Por exemplo, a preparação pode ser na forma de um sólido, unguento, gel, creme, pó, pasta, suspensão, coloide, espuma ou aerossol; especialmente uma suspensão ou um coloide. Formas sólidas da preparação podem incluir poeiras, pós, grânulos, esferas, pílulas, pastilhas, comprimidos, películas cheias (incluindo revestimentos de semente) e similares, que podem ser dispersáveis na água ("podem ser molhadas"). Em uma modalidade, a preparação é na forma de um concentrado, especialmente um concentrado na forma de um coloide ou suspensão.
[0071] Em uma modalidade a preparação és heterogênea, especi almente compreendendo uma fase sólida dispersa dentro de uma fase fluida. A fase sólida pode compreender a composição. A fase fluida pode ser, por exemplo, um líquido, um gás, ou um sólido de fluição livre, ou uma combinação dos mesmos; especialmente um líquido; mais especialmente um líquido aquoso; mais especialmente água. A água pode ser estéril ou não estéril. A fase sólida pode ser dispersa dentro da fase fluida, de qualquer maneira apropriada. Isto vai depender da natureza da fase sólida e da fase líquida.
[0072] Dependendo da forma de preparação, a preparação pode in cluir uma variedade de outros agentes. Agentes exemplares incluem, mas não são limitados a um ou mais dos ingredientes na ordem a seguir: diluentes, transportadores, excipientes, agentes de suspensão, agentes de aglomeração, bases, tampões, agentes de amargar, fragrâncias, conservantes, propulsores, agentes tixotrópicos, tensoativos, agentes anti-congelamento, e agentes de coloração. Agentes apropriados podem ser selecionados por uma pessoa versada.
[0073] A preparação pode também incluir um ou mais de outros in gredientes ativo. Um ingrediente ativo, como definido aqui no presente, é um ingrediente que provê benefício para a proteção da planta. O ingrediente ativo pode ser, por exemplo, um inseticida, um pragacida, um fungicida, um antibiótico, um inseto atraente, um agente anti-parasítico, um agente anti-viral, ou um nematicida.
[0074] Quando a preparação é na forma deum coloide ou suspen são, ela pode incluir a composição em até 30% em peso/peso, até 20% em peso/peso, até 10% em peso/peso, até 5% em peso/peso, até 2% em peso/peso, até 1% em peso/peso, menos do que 1% em peso/peso, menos do que 0,1% (menos do que 1 mg/mL) ou menos do que 0,01% em peso/peso (menos do que 0,1 mg/mL). A preparação pode ser em uma forma concentrada que requer diluição, antes da aplicação para um alimento do inseto, planta ou colheita. A preparação para aplicação para um alimento de inseto, planta ou colheita, pode incluir a composição m menos do que 1% em peso/peso, menos do que 0,1% (menos do que 1 mg/mL) ou menos do que 0,01% em peso/peso (menos do que 0,1 mg/mL).
[0075] Em outra modalidade, quando a preparação é na forma de um coloide ou suspensão, ela pode incluir a composição em até 100 mg/L; especialmente até 50 mg/L; mais especialmente até 20 mg/L, ou até 10 mg/L; mais especialmente menos do que 10 mg/L. Em uma modalidade, a concentração da composição em um coloide ou suspensão é de 1-100 mg/L.
[0076] A preparação pode ser formulada para administração para uma planta, ou para qualquer parte de uma planta, de qualquer maneira apropriada. Por exemplo, a preparação pode ser formulada para administração para as folhas, tronco, raízes, fruta, vegetais, grãos e/ou legumes da planta. Em uma modalidade, a preparação é formulada para administração para as folhas da planta, e é especialmente borrifável sobre as folhas da planta. A preparação pode ser borrifável sobre a planta. A preparação pode ser administrada para a planta, como uma dose medida. A preparação pode ser formulada para administração para a planta, por exemplo, por borrifar, por escova ou por outro aplicador. A preparação pode ser formulada para administração para a planta borrifando (incluindo através de um esguicho fino), alimentação por gotas e/ou irrigação.
[0077] A preparação pode ser na forma de uma suspensão, caso em que a composição pode ser borrifável na planta. A suspensão pode ser substancialmente estável. Como usada aqui no presente, uma suspensão "substancialmente estável" é uma suspensão em que, uma vez formada, a fase sólida permanece suficientemente dispersa (isto é, não agrega significativamente), na fase fluida (especialmente uma fase líquida, mais especialmente água) para a suspensão a ser pulverizada sobre uma planta. Em uma modalidade, a fase sólida permanece dis-persa na fase fluida por pelo menos 24 horas, depois da suspensão ser formada, especialmente pelo menos 5 dias depois da suspensão estar formada, mais especialmente pelo menos 10, 15, 20 ou 30 dias depois da suspensão estar formada, mais especialmente pelo menos 60 dias depois da suspensão estar formada. Se a suspensão não é substancialmente estável, então a fase sólida pode agregar primeiro às obstruções no equipamento, quando a suspensão é borrifada nas plantas, ou alternativamente primeiro para as quantidades variáveis do material da fase sólida, sendo aplicado na dada área, resultando em proteção incompleta para as plantas.
[0078] Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê um mé todo de preparar a composição, do primeiro aspecto da presente invenção. O método pode incluir a etapa de absorver o dsRNA sobre um complexo de argila. O método pode incluir as etapas de: absorver uma molécula que tem uma pluralidade de grupos positivamente carregados sobre uma argila, para formar um complexo de argila; e absorvendo dsRNA no complexo de argila. O método pode incluir as etapas de ab-sorver dsRNA em uma molécula, tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados; e absorver dsRNA/molécula sobre uma argila.
[0079] Vantajosamente, foi constatado que carregando o dsRNA na molécula, e depois carregando dsRNA/molécula sobre a argila, provê significativamente carregamento mais alto de dsRNA na composição. Além do mais, este método também provê parâmetros de liberação melhorados. Em uma modalidade, a molécula tem uma pluralidade de grupos de nitrogênio positivamente carregados. Nessa modalidade, no dsRNA/molécula a proporção de N:P (isto é, os nitrogênios na molécula (N): o fosfóro nos dsRNA(P)) podem ser pelo menos 1, 2 ou 3, especi-almente pelo menos 4, mais especialmente pelo menos 5. Nessa modalidade, no dsRNA/molécula a proporção de N:P pode ser menos do que 30, menos do que 20, menos do que 10, ou menos do que 7, especialmente menos do que 6. Nessa modalidade, no dsRNA/molécula, a proporção de N:P pode ser de 3-7, especialmente de 4-6, mais especialmente cerca de 5.
[0080] A etapa de absorção de dsRNA, na molécula pode incluir contatar ou incubar o dsRNA, com a molécula em uma solução aquosa com agitação ou inversão. Esta etapa pode ser realizada abaixo de 25°C, especialmente abaixo de 15°C, mais especialmente abaixo de 10°C, mais especialmente abaixo de 5°C. Esta etapa pode ser realizada em gelo. Esta etapa pode ser realizada em cerca de pH 7.
[0081] A etapa de absorção de dsRNA/molécula em uma argila, pode incluir contatar ou incubar o dsRNA/molécula, com a argila em uma solução aquosa, com agitação ou inversão. Esta etapa pode ser realizada abaixo de 25°C, especialmente abaixo de 15°C, mais especialmente abaixo de 10°C, mais especialmente abaixo de 5°C. Esta etapa pode ser realizada em gelo. Esta etapa pode ser realizada em cerca de pH 7. Em uma modalidade, a composição formada pelo método inclui uma argila, uma molécula tendo uma pluralidade de grupos positiva-mente carregados, e dsRNA. Nesta modalidade, a proporção de massa de argila : molécula/dsRNA (ou de argila : molécula) pode ser de 1:1 a 10:1, especialmente de 3:1 a 8:1, mais especialmente de 4:1 a 7:1 ou de 5:1 a 7:1, mais especialmente cerca de 6:1 ou cerca de 5:1.
[0082] Características do terceiro aspecto da presente invenção, podem ser como descritas acima para o primeiro aspecto.
[0083] Em um quarto aspecto, a presente invenção se refere a um método de distribuir dsRNA para um inseto, que tem um pH básico dentro do seu canal alimentar, o método compreendendo administrar (ou aplicar) a composição do primeiro aspecto, ou a preparação o segundo aspecto da presente invenção para um alimento de inseto.
[0084] A composição pode ser administrada para qualquer alimento de inseto. Tais alimentos podem incluir plantas e partes de plantas (incluindo frutas e vegetais, por exemplo), mas também podem incluir fontes de alimento sintético de inseto, iscas de inseto ou armadilhas de água. Em uma modalidade, o alimento do inseto é uma planta (incluindo partes de plantas). Vantajosamente, o inseto pode ingerir a composição, enquanto ingere o alimento. A etapa de administrar a composição para um alimento de inseto, pode envolver borrifar, gotejar ou despejar a composição ou preparação no alimento, ou escovando a composição ou preparação no alimento.
[0085] Em um quinto aspecto, a presente invenção se refere a um método de proteção da colheita contra um inseto, tendo um pH básico dentro do seu canal alimentar, o método compreendendo a etapa de administrar (ou aplicar) para uma colheita, a composição do primeiro aspecto, ou a preparação do segundo aspecto da presente invenção. A colheita pode incluir uma pluralidade de plantas, como definido acima. A etapa de administrar a composição ou preparação, para a colheita, pode envolver administrar a preparação ou composição para as folhas, caule, raízes, fruta, vegetais, grãos e/ou legumes das plantas, dentro da colheita. A etapa pode envolver borrifar a composição ou preparação na colheita, especialmente nas folhas das plantas da colheita. A etapa pode envolver escovar a composição ou preparação na colheita, especialmente sobre as folhas das plantas dentro da colheita. A etapa pode envolver administrar a composição ou preparação para colheita, borrifando, alimentando por gotejamento ou irrigação.
[0086] Em uma modalidade do quinto aspecto, o dsRNA é inseticida dsRNA. Nesta modalidade, a composição é uma composição de inseticida.
[0087] Características do quarto e quinto aspectos, da presente in venção, podem ser as descritas para o primeiro e segundo aspectos da presente invenção, o contexto permitindo.
[0088] Em um sexto aspecto, a presente invenção provê a compo sição do primeiro aspecto, ou uma preparação do segundo aspecto, quando aplicado para uma planta. Características do sexto aspecto podem ser as descritas acima, para o primeiro e segundo aspectos.
[0089] Características adicionais do quarto e sexto aspectos da pre sente invenção, podem ser como descrito abaixo.
[0090] Em uma modalidade, a composição ou preparação, uma vez aplicada a uma planta ou colheita, é capaz de proteger a planta ou colheita, por pelo menos 15 dias, especialmente pelo menos 20 dias, mais especialmente pelo menos 25 dias, mais especialmente pelo menos 30 dias. Em uma modalidade adicional, a composição, uma vez administrada para uma planta ou colheita, é capaz de proteger a planta ou colheita por de 2 a 8 semanas, especialmente de 3 a 6 semanas, mais especialmente de 4 a 5 semanas. Uma vez administrada à uma planta ou colheita, a composição pode degradar em uma proporção de 10-30% por semana, especialmente 15-25% por semana, more especialmente em uma proporção de 15-20% por semana. A duração da proteção pode ser afetada, por exemplo, pela quantidade de precipitação atmosférica sobre a planta ou colheita. Dessa maneira, em um clima mais seco, é esperado que a duração da proteção seria aumentada, enquanto que uma duração mais curta da proteção pode ser provida em um clima mais úmido.
[0091] A composição pode também ser administrada para a planta ou alimento de inseto em qualquer concentração apropriada, e vantajosamente o dsRNA na composição pode ser eficaz em concentrações relativamente baixas. Em uma modalidade, menos do que 100 μg de dsRNA por planta pode ser administrada, especialmente menos do que 50 μg, mais especialmente menos do que 40, 30, 20, 10 ou 5 μg, mais especialmente menos do que 1 μg, ou 0,5 μg de dsRNA por planta. Quando a composição é administrada para a folha da planta, menos do que 100 μg de dsRNA por folha pode ser administrado para a planta, especialmente menos do que 50 μg, mais especialmente menos do que 40, 30, 20, 10 ou 5 μg, mais especialmente menos do que 1 μg, ou 0,5 μg, ou 0,1 μg de dsRNA por folha, é administrado para a planta.
[0092] A composição ou preparação pode incluir uma quantidade eficaz de dsRNA. O termo "quantidade eficaz" significa que uma quantidade suficiente de dsRNA é administrada, de modo a afetar o inseto alvejado.
[0093] Em um sétimo aspecto, a presente invenção provê dsRNA absorvidos em uma molécula, tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados. Características do sétimo aspecto da presente invenção, podem ser como descritas para o primeiro aspecto da presente invenção.
[0094] Em um oitavo aspecto, a presente invenção provê uma mo lécula tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados, absorvidos em uma argila. Características do oitavo aspecto da presente invenção, podem ser como descritas para o primeiro aspecto da presente invenção.
[0095] Em um nono aspecto, a presente invenção provê um método de preparar a preparação do segundo aspecto da presente invenção. Esse método pode incluir a etapa de misturar a composição do primeiro aspecto da presente invenção com um fluido, tal como um líquido, especialmente um líquido aquoso. O método pode também incluir a etapa de misturar a composição com um ou mais outros agentes ativos, ou outros agentes, como definido no segundo aspecto da presente invenção. Características do nono aspecto da presente invenção podem ser como descrito para o segundo aspecto da presente invenção.
[0096] Em um décimo aspecto, a presente invenção provê RNA de filamento duplo, absorvido sobre um complexo de argila. Características do décimo aspecto da presente invenção, podem ser como descritas para o primeiro aspecto da presente invenção.
[0097] Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção provê um kit compreendendo: (i) Um complexo de argila (ou uma argila e uma molécula, tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados); e (ii) dsRNA; em que o dsRNA é absorvível no complexo de argila.
[0098] Em uma modalidade deste aspecto, o complexo de argila (ou a argila e a molécula, tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados), e/ou o RNA de dupla fita é provido em uma forma de sólido ou líquido (especialmente aquoso). O complexo de argila (ou a argila e a molécula, tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados), e/ou o dsRNA pode, dependendo da forma deles, incluem uma variedade de outros agentes. Agentes exemplares incluem, mas não são limitados a, um ou mais das ordens de ingredientes a seguir: dilu- entes, transportadores, excipientes, agentes de suspensão, agentes de aglomeração, bases, tampões, agentes de amargor, fragrâncias, conservantes, propulsores, tensoativos, agentes tixotrópicos, agentes anti- congelamento, e agentes coloração. Agentes apropriados podem ser selecionado por uma pessoa versada.
[0099] O kit pode também incluir um ou mais outros ingredientes ativos. Um ingrediente ativo, como definido aqui no presente, é um ingrediente que provê benefício para uma planta. O ingrediente ativo pode ser, por exemplo, um inseticida, um pragacida, um fungicida, um antibiótico, um atraente de inseto, um agente anti-parazítico, um agente anti-viral, ou um nematicida.
[00100] Características do décimo primeiro aspecto podem ser como descritas para o primeiro aspecto da presente invenção.
[00101] Em um décimo segundo aspecto, a presente invenção provê uma composição compreendendo dsRNA absorvidos em um complexo de argila, e em que o complexo de argila inclui grupos positivamente carregados, tendo um pKa de mais do que 7,5. Características do décimo segundo aspecto, podem ser como descritas acima para o primeiro aspecto da presente invenção.
[00102] Em um décimo terceiro aspecto, a presente invenção provê uma composição compreendendo um complexo de argila e um agente ativo negativamente carregado. O agente ativo negativamente carregado pode ser dsRNA, ou um agente químico (incluindo inseticidas). Características do décimo terceiro aspecto da presente invenção, podem ser como descritas para o primeiro aspecto da presente invenção.
[00103] Em um décimo quarto aspecto, a presente invenção provê um método de adversamente afetar um inseto ou população de insetos, o método compreendendo a etapa de administrar a composição do primeiro ou décimo terceiro aspecto da presente invenção, para o inseto ou população de insetos. A etapa de administrar a composição pode incluir administrar (ou aplicar) a composição para um alimento de inseto, para consumo pelo inseto, ou população de insetos, (ou indivíduos dentro daquela população). Características do décimo quarto aspecto da presente invenção, podem ser como descritas acima para o primeiro aspecto da presente invenção. O alimento de inseto pode ser como descrito para o quarto aspecto da presente invenção.
[00104] Qualquer uma das características descritas aqui no presente, podem ser combinadas em qualquer uma combinação com qualquer uma ou mais de outras características descritas aqui no presente, dentro do escopo da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00105] Várias modalidades da invenção serão descritas com referência aos desenhos a seguir, em que:
[00106] Figura 1A provê uma imagem de retardação de gel de composições de bentonita - polietilenoimina - dsRNA (BEN-PEI-dsRNA) em diferentes proporções de carregamento de dsRNA:BEN-PEI, em que a polietilenoimina (PEI) tem um peso molecular de 60.000;
[00107] Figura 1B provê uma imagem de retardação de gel de composições de bentonita - polietilenoimina - dsRNA (BEN-PEI-dsRNA), em diferentes proporções de carregamento de dsRNA:BEN-PEI, em que a polietilenoimina (PEI) tem um peso molecular de 800;
[00108] Figura 2A provê uma imagem de retardação de gel de liberação de composições de dsRNA de bentonita - polietilenoimina - dsRNA (BEN-PEI-dsRNA) em vários pH, em que a polietilenoimina (PEI) tem um peso molecular de 60.000;
[00109] Figura 2B provê uma imagem de retardação de gel de dsRNA de liberação de composições de bentonita - polietilenoimina - dsRNA (BEN-PEI-dsRNA) em vários pH, em que a polietilenoimina (PEI) tem um peso molecular de 800;
[00110] Figura 3 provê uma imagem de eletroforese de gel de complexos de dsRNA-etPEI com proporções de N:P de 1, 2, 3, 4 e 5 (N: amina em PEI e P: fosfato em dsRNA);
[00111] Figura 4A provê uma imagem de eletroforese de gel de liberação de dsRNA de um complexo de dsRNA-etPEI, com uma proporção de N/P de 3 (isto é, NP3; N: amina em PEI e P: fosfato em dsRNA);
[00112] Figura 4B provê a uma imagem de eletroforese de gel de liberação de um complexo de dsRNA-etPEI, com uma proporção de N/P de 4 (isto é, NP4; N: amina em PEI e P: fosfato in dsRNA);
[00113] Figura 5 ilustra a mudança no pH de uma solução de etPEI quando os volumes de NaOH crescendo são adicionados;
[00114] Figura 6A provê uma imagem de eletroforese de gel em que a presença de dsRNA livre é investigada, em um complexo de Bentonita - etPEI - dsRNA, com uma proporção de N:P de 3 (N: amina em PEI e P: fosfato em dsRNA; mostrada em BReP3) em pH 8,0 e 8,5;
[00115] Figura 6B provê uma imagem de eletroforese de gel, em que a presença de dsRNA livre é investigada em um complexo de Bentonita - etPEI - dsRNA, com proporções de N:P de 4 e 5 (N: amina em PEI e P: fosfato em dsRNA; mostrado em BReP4 e BReP5) em pH 8,0 e 8,5;
[00116] Figura 7 provê uma imagem de eletroforese de gel mos trando o perfil de liberação dependente de pH de dsRNA de BReP4;
[00117] Figura 8 provê uma imagem de eletroforese de gel mostrando o perfil de liberação dependente de pH de dsRNA de BReP5;
[00118] Figura 9 provê uma imagem de eletroforese de gel mostrando o perfil de liberação dependente de pH de dsRNA de BReP6;
[00119] Figura 10A é uma imagem de microscópio de elétro varredura de bentonita;
[00120] Figura 10B é uma imagem de microscópio de elétro de varredura de BEN-etPEI;
[00121] Figura 11 ilusta a distribiução de tamanho de partícula de complexo de bentonita, etPEI, etPEI-dsRNA e BEN-etPEI-dsRNA;
[00122] Figura 12 é uma imagem de eletroforese de gel, ilustrando a proteção de nuclease de dsRNA em BReP5, em um bioensaio de alto sal de Nuclease A;
[00123] Figura 13 é uma fotografia ilustrando a mortalidade de H. ar- migera dsRNA e BReP5, alimentado com água DEPC, BEN-etPEI, Rieske exposto. A larva morta foi indicada por setas vermelhas;
[00124] Figura 14 provê dados estatísticos para o efeito no dia 12 da ingestão de dsRNA e BReP5, pela larva de folhas de Nicotiana tabacum, revestidas com água DEPC, BEN-etPEI, Rieske despido;
[00125] Figura 15 provê uma imagem de eletroforese de gel de complexos de dsRNA - pDMAEMA, com proporções de N:P de 1/2, 1, 2, e 3 (N: amina em pDMAEMA e P: fosfato em dsRNA), em que pDMAEMA tem peso molecular de 33, 000;
[00126] Figura 16 provê uma imagem de retardação de gel de liberação de dsRNA o complexo de bentonita - pDMAEMA - dsRNA (BPR) com uma proporção de N/P de 1 (isto é, NP1, N: amina em pDMAEMA e P: fosfato em dsRNA), e uma proporção de massa de bento- nita:pDMAEMA de 5:1 (isto é, BPR5), em que pDMAEMA tem peso molecular de 33, 000;
[00127] Figura 17 é uma imagem de eletroforese de gel ilustrando a proteção de nuclease de dsRNA em BPR5, em bioensaio de Nuclease A de sal baixo;
[00128] Figura 18 é um gráfico de níveis de transcrição relativos de VDAC, em larva de Helicoverpa armigera alimentada continuamente por 3 dias (uma vez por dia) em GFP dsRNA (como controle), bentonita- pDMAEMA (BP), VDAC dsRNA, e bentonita-pDMAEMA-VDAC (BP VDAC). Os dados são apresentados como meios ± SD; e
[00129] Figura 19 é um gráfico de níveis de transcrição relativos, de Rieske em larva Helicoverpa armigera, continuamente alimentada por 3 dias (uma vez por dia) em GFP dsRNA (como controle), bentonita- pDMAEMA (BP), Rieske dsRNA e bentonita-pDMAEMA-Rieske (BP Rie). Os dados são apresentados como meios ± SD.
[00130] Características preferidas, modalidades e variações da invenção, podem ser discernidas a partir dos Exemplos a seguir, que provêm informação suficiente para aqueles versados na técnica, para realizar a invenção. Os Exemplos a seguir não são considerados commo limitando do escopo do anterior Sumário da Invenção, de maneira alguma.
EXEMPLOS Alvos para aplicação tópica de dsRNA
[00131] Alvos para a composição da presente invenção ou sequências de gene de dsRNA, para uso na composição da presente invenção, incluem (a menos que de outra maneira estabelecido, as sequências abaixo são destinadas a marcar Helicoverpa armigera): • Gene de Rieske - O gene de Rieske se expressa em um grupo de enxofre de ferro, envolvido na cadeia transportadora de elétron (ETC) que, quando alvejada pelo RNAi, causa mortalidade em insetos. A sequência de cDNA usada para o gene de Rieske (que corresponde à sequência de RNA) é provida em SEQ ID NO. 1 abaixo (300bp): CGCATACACCAGCTGAAAAGGTGTTGGTGCACCCCTTGCCAAAAA CCTCGACTGTGGAGTCACTGCATGGATCCCTGCCTATCCAGGGCT TGAAGGCCAGAGTAAACGGTCGCGTTTTGTTAAATATTTCTGGGG ATTTACGACGAAAAATCGTGTTACATAACACCTTGTCACTTCTAGG GCCAAGCCATGTACGTTTCGCGCATACCGACATCAGCTACCCCGA CTTCTCGGCGTACCGTCGCAAGGAGACGCAGGATCCCACCTCAA GGGCTAACGACAACGTCGATGGACGTCAGT • Canais Aniônicos Dependentes de Voltagem (VDAC) - VDACs são proteínas de membrana integral, formando poros na membrana externa mitocondrial. VDACs atuam como poros de difusão geral para moléculas pequenas, tais como ATP, fosfocreatina, e íons pequenos. Eles também mostraram estar envolvidos em vias apoptótica. A sequência de cDNA usada para o gene de VDAC (que corresponde às sequências de RNA) é provida em SEQ ID NO. 2 abaixo (232bp): GCGCTAGACGCCGACGCGTCTCTGCATGCCAAGGTCAACAACAA ATCTCTCATTGGTCTTGGATACCAACAGAAGTTGCGCCCAGGCGT GACTTTGACAATTTCTGCTGCTATCGATGGCCAGAACTTCAACGCT GGTGGACACAAAGTGGGTGTCGCCCTGGAGCTCGAGCCCTAAGT ACACAGAGGCGCTTCGGCTTTTAGTCCTGTAGATAATACATAATGC CACACTG • Proteína Fluorescente Verde (GFP) - GFP foi usada como um controle negativo, em alguns experimentoos. A sequência de cDNA usada para GFP (que corresponde à sequência de RNA) é provida em SEQ ID NO. 3 abaixo (339bp): AGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAG GGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTT CAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACT ACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACG GCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCA GCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGC GACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCA GTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGA • Controle - Controle de kit de MEGAscript® RNAi (500 bp). • Gene de Arginina Cinase (AK) - marcar o gene de AK pode afetar os músculos de um inseto. O gene de AK é principalmente envolvido em metabolismo de energia. A sequência de cDNA para o gene de AK (que corresponde à sequência de RNA) é provida em SEQ ID NO. 4 abaixo (200bp): GATGACAGGCTTGGTTTCCTGACTTTCTGCCCCACCAACTTGGGA ACCACCGTGCGTGCCTCCGTGCACATCAAGCTGCCCAAGCTGGC TGCCGACAAGGCCAAGCTGGAGGAGATCGCATCCAAGTACCACC TGCAGGTGCGCGGAACCCGCGGCGAGCACACCGAGGCTGAGGG CGGCGTCTACGACATCTCCAACAA • Gene de Sarco/retículo endoplásmico Ca2+-ATPase (SERCA) - marcar o gene SERCA pode afetar os músculos de um inseto. O gene de SERCA é envolvido na ingestão de cálcio, no retículo endoplásmico. A sequência de cDNA para o gene de SERCA (que corresponde à sequência de RNA) é provida na SEQ ID NO. 5 abaixo (231bp): TTCCTTGAATTCGAAATTACTGGCTCCACCTACGAACCCATTGGTG ACGTTTACCTGAAGGGACAGAAGATCAAGGCCGCTGAATTCGATG CTCTGCACGAACTTGGTACCATTTGCGTTATGTGCAATGACTCCG CTATTGATTTCAACGAATTCAAACAGGCTTTCGAAAAGGTCGGTGA GGCCACTGAAACCGCTCTTATCGTCCTCGCTGAGAAAATGAACCC CTTC • Gene de Transferase de Glutationa (GTT) - marcar o gene de GTT pode afetar o intestino de um inseto. O gene de GTT é importante na desentoxicaçãn de compostos. A sequência de cDNA para o gene de S-transferase de Glutationa (que corresponde à sequência de RNA) é provido na SEQ ID NO. 6 abaixo (300bp): GAAAGCAGATGAGGCTCTGCTCAAGAAGCTGGAGGAAGCTCTGC ACTTCCTCAACACATTCCTCGAAGGTCAGAAGTACGCTGCGGGTG ACAAACTGACCTTGGCAGACCTCAGTCTCGTGGCGACTGTGTCCA CTATAGACGCCGTCGACATCAGCCTGAAGGAATATCCCAATGTTG AAAAGTGGTTCGAGCTGGTGAAAGCGACTGCCCCGGGATACCAG GAAGCAAATGAAGCTGGCCTTAAAGCATTCAGAGCTATGGTAGCG CAGTTAAAAGCTAAAACTGAATTGTAAGTGTA • Gene de Acetilcolinesterase (AchE) - alvejando o gene de AchE pode afetar a parede do corpo e apêndices de um inseto. O gene de AchE é importante no crescimento e desenvolvimento. AS sequência de cDNA para o gene de AchE (que corresponde à sequência de RNA) é provido na SEQ ID NO. 7 abaixo (310bp): GAGTGGAGACTCAACGAAGATCAATTGGCCGGTGCACACGGCGT CCGGGCGTGAATACCTGTCCTTAGCAGTCAACTCCAGCTCCATAG GCCACGGGCTGAGGGTCAAGGAGTGCGCCTTCTGGCAGAAGTAC TTGCCACAGTTGATGGCTGCCACCAATAAGCCAGAACCTCCGAAG AATTGCACGAACAGCGCAGCGCCCGTCAAGGTCCCGTACGAAAT CTTCGGCGTGGGCGTCGTGATAGCTACGGGCTTAGCCAAGACAA CGTGGTTCAAGTACATCATATGAGTTCATTATGTGGTCTAAGAG • Gene de Esterase de Hormônio Juvenil - A sequência de cDNA, para o gene de esterase de hormônio juvenil (que corresponde à sequência de RNA), é provido na SEQ ID NO. 8 abaixo (309bp): CCACCAAGATCTACACGGACCAGAATATTTGGTCAGCAAGAATGC CATCGTCATCACATTTAATTACAGATTGAACGTCTTCGGTTTCCTG TCCATGAATACGACAAAAATCCCCGGCAACGCTGGTCTCCGAGAC CAGGTGACCCTGTTGCGCTGGGTGCAGAGAAATGCTAAGCATTTC GGAGGAGACCCCAACAACGTCACCATAGCGGGGCAGAGCGCTG GTGCAGCAGCCGCGCATCTATTGACTCTGTCTAAAGCTGCTAAAG GTCTTTTCAAAAGAGCAATCTTGATGAGCGGAACAGGAAT • Gene receptor de tolerante de metopreno (Met) - o receptor de Met é um receptor intracelular no inseto. A sequência de cDNA para o gene receptor de Met (que corresponde à sequência de RNA) é provido em SEQ ID NO. 9 abaixo (375bp): GCCGCATAGATGGCATTCTAAGGCGTTCCGATAAAGCCACATCAA ATGGTGTTCAGGATGAGCAAATTATAAGAAGGCAAAGAGTAAGAA CTAATAGAACATTTTCATCCAGTGGGAATGATGTTGTTTTTATTGGT ATGATTCATGTTCTATCCAGTGCAATGCCACCTCGAATTCTACCCC CTACAGCCTATTCAGAATACTGGACGAGACATTTGATTGATGGTC GTATCGTTCAGTGTGACCAGAGTATATCATTAGCAATTGGCTACAT GACAGAAGAAGTTACTGGAACATCTGCTTTCGTCTTCATGCACAAA GATGATGTCCGCTGGGTAATTTGTGTATTACGACAAATGTATGATG AGAGCCGGG • Gene de Rab4b GTPase - Rab4b GTPase é uma enzima de hidro- lase de GTPase. A sequência de cDNA para o gene de Rab4b GTPase (que corresponde à sequência de RNA) é provida na SEQ ID NO. 10 abaixo (313bp): AGGACATGGAGGAATCAAGAGAAGTCACTTTTACAGAAGCTAGTC AATTTGCCCAAGAAAATGAATTGATGTTTCTTGAAACCAGTGCTAA AACAGGTGAAAATGTAGAAGAAGCTTTCTTGAAATGTTCCAAAACA ATTTTGGCTAAAATTGAAACAGGTGAATTAGATCCCGAGCGAATAG GTTCAGGCATTCAATATGGGACTGGGACCTCTAAAAGGCTTAGCG CGCCCAAGAAACCTGCAAGAAGTCCATCTGATTGTGCTTGTCATG TATAACATTATTTCTTGGATACATAGAATGCATGATCTGC • Gene de Profenoloxidase - alvejando o gene de profenoloxidase pode afetar o intestino anterior de um inseto. O gene de profenoloxidase é envolvido na desintoxicação de compostos. A sequência de cDNA para o gene de profenoloxidase (subunidade de profenoloxidase 2) (que corresponde à sequência de RNA) é provida na SEQ ID NO. 11 abaixo (242bp): ACGATTCCGTTCGAACAGACGTTCCGTGACCTCTCTGTTCAGAGC AACGACCCTCGCCGCCCCAACTTGGCCGAGTTCAACTTCTGCGGT TGCGGCTGGCCCCAGCACATGTTGGTCCCCAAGGGTACTGAGGC GGGCGCCGCCTACCAGTTGTTCGTTATGCTTTCGAACTACGATCT TGACAGCGTGGAACAACCTGACGGCTCACAGTTGAGCTGCGTCG AAGCTTCCAGTTTCTGCGG • Gene de Catepsina L - marcar o gene de catepsina L, pode afetar a cutícula e a epiderme de um inseto. O gene de catepsina L desempenha um papel importante no processo de muda. A sequência de cDNA, para o gene de catepsina L (que corresponde à sequência de RNA) é provida na SEQ ID NO. 12 abaixo (280bp): GGTGGAGGACAAGTTCCGCATGAAGATCTACCTGGAGAACAAGC ACCGCATCGCCAAGCACAACCAGCGCTTCGAGCAGGGCGCCGTC AGCTACAAGCTGCGCCCCAACAAGTACGCCGACATGCTCAGCCA CGAGTTCGTGCACGTCATGAACGGCTTCAACAAGACCCTCAAGCA CCCGAAGGCCGTGCACGGCAAGGGTCGCGAGTCCCGGCCCGCC ACGTTCATCGCGCCGGCGCACGTCACCTACCCCGACCACGTGGA CTGGCGCAAGAAGGGC • Gene de NV2 - marcar o gene de NV2 pode afetar a mitocondria de um inseto. O gene de NV2 desempenha um papel importante na cadeia transportadora de elétron (ETC). A sequência de cDNA, para o gene de NV2-1 (que corresponde à sequência de RNA) é provida na SEQ ID NO. 13 (374bp) abaixo: GCCACAAGCGTGGTGCCATGATCCCACTGCTCGACCTGGCTCAG CGTCAGGCTGGAGGTTGGCTGCCGATATCTGCCATGCATAAAGTA GCTGAAATCCTCAAACTTCCTCGCATGAGAGTTTATGAGGTTGCTA CGTTCTACACTATGTTTATTAGACGACCAATCGGCAAGTACCATAT CCAAGTTTGCACGACAACTCCTTGCTGGCTCCGAGGTTCTGATGC TATCCTGAAAGCTCTCACTGAGGGTACACAATGCCATGTTGGAGG AAACAGCCCTTGTGGCAAGTTCTCTATTTCTGAGGTTGAATGCCTT GGTGCCTGTGTTAATGCTCCTATGATTCAAGTCAACGATGATTACT ACGAAGACCTG
[00132] A sequência de cDNA para o gene NV2-2 (que corresponde à sequência de RNA), é provida na SEQ ID NO. 14 (255bp) abaixo: GGTTGAATGCCTTGGTGCCTGTGTTAATGCTCCTATGATTCAAGTC AACGATGATTACTACGAAGACCTGTCAGTAGATGACACAAAGGAA ATTATTGAAAAGCTCAAAAGGGACGAGAAACCGAAAGCTGGCCCT AGGAGCGGCAGATTCGCCTCAGAACCCTTGGGAGGACTCACTTC TCTCACCGAAGAACCTACAGGCCCCGGTTTTGGACTACAACCCGG CCTCAAGGCCTAGAACAAAAAGTTTCCGTT
[00133] Os experimentoos abaixo detalham o uso do gene de Rieske, o gene de VDAC, GFP e o Controle (MEGAscript®) na composição. Entretanto, é esperado que qualquer uma das sequências acima pode ser usada para composição.
Preparação de RNA De Dupla Fita (dsRNA)
[00134] A sequência de genes de Rieske foi clonada no vetor pGEM- T-Easy, sequenciada e usada para síntese de dsRNA in vitro. As sequências de promotor T7, foram adicionadas aos principais específicos de gene (providos abaixo). O gabarito de T7 DNA (300 bp) para a síntese de dsRNA foi sintetizado usando PCR. A síntese de dsRNA foi realizada usando o Kit de Transcrição MEGAscript T7, e purificada pelo protocolo de extração de Trizol. A concentração de dsRNA foi analisada usando NanoDrop 1000, e a integridade foi verificada por eletroforese de gel de agarose (1%). As sequências principais usadas foram como a seguir (sequência T7 sublinhada): SEQ ID NO. 15: TAATACGACTCACTATAGGGAGTCGGGGTAGCTGATGTCG SEQ ID NO. 16: TAATACGACTCACTATAGGGAGGCAAGTTCATCGGTGGTT
[00135] As sequências de Rieske e VDAC foram também sintetizadas por um método de transcrição in vitro, pela companhia AgroRNA (Seul, Coreia do Sul). A sequência de Rieske é 300 bp (região de sequência conservada) e a sequência de VDAC é 232 bp (região de sequência conservada), como delineado acima.
EXEMPLO 1 - COMPOSIÇÃO DE BENTONITA - POLIETILENOIMINA - dsRNA (BEN-PEI-dsRNA)
[00136] Em geral, bentonita - polietilenoimina (BEN-PEI), foi preparada primeiro misturando bentonita dispersa em excesso de solução de PEI, durante a noite (~16 horas), seguida por lavagem do excesso de PEI, e dispersando BEN-PEI coletado. dsRNA foi misturado com o BEN- PEI disperso, em proporções variadas de massa de dsRNA:BEN-PEI, que foi submetido ao teste de gel, para determinar a melhor proporção de carregamento de dsRNA e BEN-PEI. Polietilenoimina (PEI) foi comprado de Sigma Aldrich, e tinha um peso molecular de 60.000 e 800.
Preparação de BEN-PEI
[00137] BEN-PEI foi preparado, usado PEI com ambos, um peso molecular de 60.000 e um peso molecular de 800. Primeiro, 1 g de bento- nita (suposta Capacidade de Troca de Cátion (CEC) foi 100 meq/100g) foi dispersa em 20 mL de água desionizada, por agitação durante a noite. Em seguida, 0,5 g de 50% de uma solução de PEI (peso molecular de 60.000 ou 800) foi dispersa em 10 mL de água desionizada, e o pH foi ajustado para 6-7, usando 1,0 M HCl enquanto agitando. Enquanto agitando vigorosamente, a solução de PEI dispersa foi depois adicionada, gota a gota, na solução de bentonita. A solução de PEI de bentonita foi agitada durante a noite a 50°C.
[00138] O complexo de bentonita - polietilenoimina (BEN-PEI), foi depois coletado e lavado cinco vezes, usando centrifugação de alta velocidade (10000 g, 5 min; 20000 g, 10 min; 20000 g, 15 min; 20000 g, 15 min; 20000 g, 15 min). O complexo de BEN-PEI lavado, foi disperso em 100 mL de água desionizada.
[00139] A concentração de massa foi 11.7 mg/mL para BEN-PEI (60.000 em peso molecular) e 8,3 mg/mL para BEN-PEI (800 em peso molecular). A concentração de massa foi determinada pela centrifugação (4.000 rpm, 20 min) de 10 mL de bentonita sonicada, ou suspensão de bentonita-PEI (BEN-PEI). A sobrenadante resultando foi descartada, e o vácuo-seco de peletes (2 horas), seguida pela secagem no ar (16 horas). A pelete seca foi pesada, para o cálculo da concentração de massa.
Carregando dsRNA sobre BEN-PEI
[00140] A proporção de carregamento de massa, isto é, a proporção da ligação completa de dsRNA com Ben-PEI, foi determinada misturando 500 ng MEGAscript controle de dsRNA (500 bp), com BEN-PEI (60.000 e 800 de peso molecular), em proporções de massa de 1:1, 1:10, e 1:20 até 1:140 e 1:150. As misturas resultantes foram submetidas à agitação orbital (20 min), seguida por eletroforese de gel (1,0%).
[00141] Como ilustrado nas Figuras 1A e 1B, como a quantidade de BEN-PEI relativa ao dsRNA aumentado (isto é, a proporção de massa de 1:1 para 1:100), a intensidade da banda de fundo, para dsRNA livre, se tornou mais fraca em intensidade, indicando a formação de mais complexos de BEN-PEI-dsRNA. A ligação complete de dsRNA com BEN-PEI, foi mostrada ser em torno de ~1:80 (Figura 1A, PEI MW 60,000) e ~1:115 (Figura 1B, PEI MW 800). Nestas proporções, todo o dsRNA foi associado com Ben-PEI, não deixando dsRNA livre para migrar para baixo do gel. Isto ilustra que BEN-PEI é capaz de completamente carregar dsRNA, em uma proporção de massa de dsRNA:BEN- PEI de 1:80-1:115, dependendo do peso molecular de PEI; desse modo, a capacidade de carregamento de dsRNA é cerca de 1 % em peso no sistema sólido.
Liberação Dependente de pH de dsRNA das composições de BEN-PEI- dsRNA
[00142] O teste de liberação de pH foi realizado preparando soluções de BEN-PEI-dsRNA, na proporção de massa com associação completa de dsRNA (como discutido no parágrafo anterior: 1:100 para BEN-PEI- dsRNA (em que PEI tem um peso molecular de 60.000) e 1:120 para BEN-PEI-dsRNA (em que PEI tem um peso molecular de 800)). As suspensões resultantes foram centrifugadas em 13.000 rpm por 15 minutos, e a sobrenadante foi submetida a eletroforese (1,0%) para verificar a ausência de dsRNA livre, antes de descartar a sobrenadante. As pe- letes foram re-suspensas em 20 μL de soluções aquosas, variando de pH 2-12.5, e agitação orbital por 30 minutos. A eletroforese de gel (1,0%) foi depois usada para examinar a liberação de dsRNA da composição de BEN-PEI-dsRNA, e os resultados são providos na Figura 2.
[00143] Como ilustrado nas Figuras 2A e 2B, a liberação de dsRNA foi pH dependente e foi substancialmente liberado das composições em pH 11. Entretanto, o pH na solução misturada final, deverá ser mais baixo do que o valor inicial. Isto significa que dsRNA liberado começaria em um pH mas baixo do que 11,0, porem mais alto do que 10.5.
EXEMPLO 2 - COMPOSIÇÃO DE BENTONITA - ETHOXILATED POLIETILAENEIMINE - dsRNA (BEN-etPEI-dsRNA ou BReP)
[00144] Um polímero diferente foi usado na composição, em vez de PEI: 80% de polietilenoimina ramiificada etoxilada (etPEI). Este polímero tem um peso molecular de 70.000, e está disponível de Sigma Aldrich.
Preparação de dsRNA-etPEI
[00145] Primeiro, 35% em peso/peso (densidade = 1.05 g/mL) de 80% de solução de PEI ramificado etoxilado (etPEI), foi diluída 1.000 vezes com água desionizada, e o pH foi ajustado para 7-7,5, usando 1,0 M HCl enquanto ajustando. A concentração de massa de etPEI foi depois ajustada para 0,35 mg/mL.
[00146] Rieske dsRNA (500 ng, gene específico de inseto, 300 bp, 1,1 μg/uL) foi adicionado para soluções de etPEI com proporções de N:P (N: amina em PEI e P: fosfato em dsRNA) de 1, 2, 3, 4, 5, 10 e 20 (denotou NP1, NP2, NP3, NP4, NP5, NP10 e NP20, aqui no presente). As misturas foram depois incubadas em gelo por 15 minutos, com mistura progressiva por inversão. Eletroforese de gel foi usada para examinar se havia dsRNA livre nas soluções misturadas de dsRNA- etPEI, e esses resultados são providos na Figura 3.
[00147] A imagem provida na Figura 3, confirmou que algum dsRNA livre estava presente na solução de NP2 (dsRNA-etPEI), e uma quantidade muito mínima de dsRNA livre estava presente nasolução de NP3 (dsRNA-etPEI). A ligação complete de dsRNA com etPEI, ocorreu nas soluções de NP4 e NP5. Para a proporção molar de N:P de 3, 4, e 5, a proporção de massa de dsRNA/etPEI foi perto de 1,41, 1,05, e 0,84, respectivamente.
Liberação Dependente de pH de dsRNA de dsRNA-etPEI
[00148] Soluções de NP3 e NP4 (dsRNA-etPEI) foram preparadas, e depois misturadas no mesmo volume de tampão. As soluções de tampão tinham um pH de 8,0 a 10,5. As misturas foram sacudidas por 30 minutos, e depois a eletroforese de gel foi usada para examinar a liberação de dsRNA dos complexos de dsRNA-etPEI. Os resultados são providos nas Figuras 4A (para NP3) e 4B (para NP4).
[00149] Como mostrado nas Figuras 4A e 4B, havia algum dsRNA livre nos complexos de NP3, enquanto quase nenhuma dsRNA livre em NP4. Ambos, complexos de NP3 e NP4 dsRNA-etPEI, liberaram quantidade substancial de dsRNA carregado no pH 9,5 e 10. Complexos de NP3 dsRNA-etPEI começaram a liberar dsRNA em, provavelmente, pH 8,5-9,0, enquanto complexos de NP4 dsRNA-etPEI começaram a liberar dsRNA em pH 9,5. Este experimento ilustra quea liberação de dsRNA iniciou no pH 9,0-9,5, e que uma quantidade substancial de dsRNA foi liberada no pH 9,5-10 e mais liberada no pH 10,5.
pKa of etPEI
[00150] A pKa de 80% de polietilenoimina ramificada toxilada (etPEI) foi determinada. Primeiro, foram preparadas soluções de 0,1 mol/L HCl, etPEI, e NaOH. 10 mL de 0,1 de mol/L HCl e 10 mL de 0,1 mol/L etPEI foram misturados, e o pH gravado. Para a solução de etPEI foram adicionados 0.5 mL de 0,1 mol/L NaOH, enquanto agitando, e o pH gravado; esta etapa foi repetida até o pH começar a aumentar repentinamente. Para a solução de etPEI foram adicionados 0,1 mL 0,1 de mol/L NaOH, enquanto agitando o pH gravado; esta etapa foi repetida até o aumento do pH desacelerar. As duas etapas anteriores foram depois repetidas até o pH da solução ser 11-11.5. Os resultados são providos na Figura 5. Isto ilustra que etPEI tem uma pKa de cerca de 9,0-9,5.
Preparação da Composição de BEN-etPEI-dsRNA (BReP)
[00151] As amostras de dsRNA-etPEI prepradas, foram imobilizadas com bentonita (BEN) em diferentes proporções de massa de BEN:etPEI, e depois a liberação de dsRNA de BEN-dsRNA-etPEI (BReP), em diferentes valores de pH, foi examinada.
Preparação de BReP
[00152] Primeiro, bentonita (0,5 g) foi dispersa em 100 mL de água desionizada, através de agitação por 5 minutos, e esta suspensão foi depois diluída para uma concentração de massa final de 5 μg/μL. Em seguida, misturas de dsRNA-etPEI em uma proporção de N:P de 3, 4 e 5 (isto é, NP3, NP4 e NP5) foram preparadas como descrito acima.
[00153] A suspensão de bentonita foi misturada com as misturas de dsRNA-etPEI (NP3, NP4 e NP5), em uma proporção de massa de ben- tonita:etPEI de 6:1, para formar complexos de BEN-etPEI-dsRNA (em NP3, NP4 e NP5 - isto é, BReP3, BReP4 e BReP5). As misturas foram incubadas em gelo, por 15 minutos, com progressivamente misturando por inversão, e depois eletroforese de gel foi usada para examinar a presença de dsRNA livre.
[00154] Como ilustrado nas Figuras 6A e 6B, em pH 8,0-8,5 BReP3 liberou algum dsRNA (Figura 6A), BReP4 liberou uma pequena quantidade de dsRNA (Figura 6B), e BReP5 liberou quase nenhum dsRNA (Figura 6B). Em comparação com as imagemns de gel nas Figuras 3, 4A e 4B, tem muito mais dsRNA livre em BReP3 e BReP4, do que em NP3 e NP4. Sem querer estar preso pela teoria, acredita-se que isso é por causa das folhas de bentonita portarem cargas negativas, que podem neutralizar algumas cargas positivas em etPEI, e a neutralização de cargas positivas muda em etPEI, podendo resultar em liberação de dsRNA. Este efeito é esperado diminuir em proporções deN:P mais altas em etPEI-dsRNA (tais como NP5), e para BReP5 parece que há bastante cargas positivas em etPEI para melhorar este efeito.
Lliberação Dependentede pH de dsRNA de BReP
[00155] Suspensões de BReP4 e BReP5 foram preparadas, como descrito acima. As suspensões foram depois misturadas com o mesmo volume de tampão. As soluções de tampão têm um pH de 8a5 a 10,0. As misturas foram sacudidas por 30 minutos, e depois a eletroforese de gel foi usada para examinar a liberação de dsRNA dos complexos de BReP4 e BReP5. Os resultados são providos nas Figuras 6 e 7.
[00156] Como mostrado na Figura 7, uma pequena quantidade de dsRNA livre, estava presente no complexo de BReP4, e no dsRNA- etPEI (NP4). A liberação dependente de pH, de dsRNA de BReP4, pareceu começar no pH 8,5, consistente com aquela mostrada na Figura 6B. A liberação se tornou mais significativa em pH 9,0 e 9,5, com a maioria de dsRNA liberada em pH 10,0.
[00157] Como mostrado na Figura 8, a quantidade de dsRNA livre presente em BReP5 e dsRNA-etPEI (NP5) era mínima. A liberação total perto de dsRNA, de BReP5, ocorreu abruptamente no pH 9,5, com uma liberação quase completa no pH 10,0.
[00158] BReP6 foi também preparado para testar o comportamento do pH de liberação dependente. BReP6 foi como preparado acima para BReP4 e BReP5, exceto que a proporção de N:P (N: amina em etPEI e P: fosfato em dsRNA), no etPEI -dsRNA, foi 6 (isto é, NP6). Como mostrado na Figura 9, nenhuma quantidade do dsRNA live foi observada nas preparações do BReP6 e do dsRNA-etPEI (NP6). A liberação mínima de dsRNA de BReP6 começou em pH 10,0.
Sumário
[00159] BReP4, BReP5 e BReP6 foram capazes de levar uma grande quantidade de dsRNA. Por exemplo, a proporção de massa de BEN:dsRNA:etPEI foi 6:1.41:1, 6:1.05:1, 6:0.84:1, e 6:0.70:1 para BReP3, BReP4, BReP5 e BReP6, respectivamente. Isto significa que o dsRNA % em peso foi 16,7%, 13,0%, 10,7% e 9% em BReP4, BReP5, e BReP6, respectivamente.
[00160] dsRNA em BReP5 e BReP6 foram quase completamente associados com BEN-etPEI, para formar os complexos de BEN-dsRNA- etPEI, os quais foram estáveis em pH 6-9, sem qualquer liberação obvia de dsRNA carregado. dsRNA iniciou para liberar em pH 9,5 e 10,0, para BReP5 e BReP6, respectivamente. Houve uma pequena quantidade de dsRNA livre em BReP4 em pH 7,0-8,5. Para BReP4, a liberação de dsRNA iniciou no pH 8,5-9,0, e completou no pH 10,0.
Propriedades Fisicoquímicas
[00161] Imagens do Microscópio de Elétron de Varredura (SEM) foram gravadas em um JEOL JSM-6300 (JEOL, Tóquio, Japão) para investigar a morfologia e tamanho de partícula de amostras de bentonita e bentonita-etPEI (preparadas analogamente às amostras de bentonita- PEI discutidas acima). Todas as amostras foram abaixadas em wafers de sílica, para evitar imersões em película de carbono durante o reves-timento. Como ilustrado nas Figuras 10A (para bentonita) e 10B (para BEN-etPEI), BEN-etPEI forma grandes agregados empilhados (que é negativo para a residência em folha).
[00162] A distribuição do tamanho de partícula e o potencial zeta de bentonita, BEN-etPEI-dsRNA (NP5, como descrito acima), etPEI e etPEI-dsRNA (NP5), foram medidos em um instrumento Nanosizer Nano ZS (Instrumentos Malvern). A Figura 11 mostra a distribuição do tamanho de partícula de bentonita, etPEI, complexo de etPEI-dsRNA, e BEN-etPEI-dsRNA, e o valor da média z dos tamanhos de partícula, que são ~450, ~7.4, ~750 e ~2110 nm, respectivamente. Os potenciais de zeta de bentonita, complexo BEN-etPEI, etPEI (pH ajustado para ~7), etPEI-dsRNA, e BEN-etPEI-dsRNA, foram medidos e foram -32, -25, 18, 0.5,e 1.3 mV, respectivamente.
EXEMPLO 3 - ENSAIO DE PROTEÇÃO DE NUCLEASE
[00163] DsRNA de Rieske (500 ng) foi carregado em etPEI a umas proporções de N:P (N: amina em PEI, e P: fosfato em dsRNA) de 5 (NP5), como mencionado acima. Complexos de NP5 for a depois carregados em bentonita, em uma proporção de massa de 1:6 pra fazer BReP5. O volume final da mistura foi ajustado para 10 μL, usando água de dietilpirocarbonato (DEPC). Nuclease de sal alto A (2 μL), foi adicio-nada e a mistura incubada a 37° C, por 20 minutos. Um tampão em pH 10 (8 μL) foi adicionado para liberar e verificar a liberação de dsRNA dos complexos de BReP5. Soluções foram carregadas em gel de agarose (1%), e imagem do gel gravada. Como mostrado na Figura 12, dsRNA exposto foi degradado na presença de Nuclease A. Em um contraste repentino, dsRNA em BReP5 foi protegido da degradação por Nuclease A, e liberado em pH 10.
EXEMPLO 4 - ENSAIO ALIMENTANDO INSETO USANDO BReP5 Criando Insetos
[00164] Neonatos de Helicoverpa armigera foram alimentados em dieta artificial por 4 dias, e foram subsequentemente usados no ensaio de alimentação de folha. As larvas foram criadas sob condições controladas de 27 ± 2°C, 65 ± 5% de umidade relativa, e 16:8 horas de ciclo de luz e escuro.
Ensaio de Alimentação de Folha
[00165] Folhas de Nicotiana tabacum (planta com 1 mês de idade) foram selecionadas para o ensaio de alimentação de inseto. O ensaio incluiu quatro grupos de insetos e folhas randomicamente repartidos, com 8 reproduções para cada grupo. Os grupos foram: água DEPC (controle negativo), BEN-etPEI, Rieske dsRNA e BReP5 desprotegidos.
[00166] Para realizar o ensaio, a única folha tênder foi colocada em um papel de filtro úmido, em uma placa de Petri. A composição foi borrifada em ambos os lados de cada folha, usando um pincel. As composições usadas foram: dsRNA exposto: 50 μg/100 μL de água DEPC; BReP5: correspondendo a 50 μg dsRNA/100 μL; BEN-etPEI: a 6:1 de bentonita:etPEI - a mesm massa que a de BReP5 em 100 μL; ou água: 100 μL. Larvas com quatro dias de nascidas foram transferidas para placas Petri, e alimentadas com as primeiras folhas frescas com respectivos tratamentos por três dias, e depois repetido com as segundas folhas frescas tratadas similarmente por outros três dias. Depois do sexto dia de alimentação de tratamento, as larvas foram mudadas da dieta artificial padrão para crescimento adicional.
[00167] Como ilustrado na Figura 13, nenhuma mortalidade foi observada na água DEPC tratando somente o grupo. No grupo tratado com BEN-etPEI, somente uma larva foi morta e uma larva foi obviamente afetada no crescimento. Comparativamente, o grupo de tratamento dsRNA desprotegido, mostrou uma única mortalidade. Por contraste, o tratamento de BReP5 mostrou mortalidade em quatro larvas, com uma larva também mostrando crescimento retardado. Os dados estatísticos são também apresentados na Figura 14, e mostram a proporção de mortalidade no grupo tratado BReP5 ser obviamente maior do que em outros grupos.
EXEMPLO 5 - COMPOSIÇÃO DE BENTONITA - pDMAEMA - dsRNA (BEN-pDMAEMA-dsRNA) pDMAEMA
[00168] pDMAEMA é poli(2-dimetilaminoetila metacrilato), da estrutura mostrada abaixo. pDMAEMA é um polímero de pH-sensitivo, como uma pKa de 7,0-7,5. pDMAEMA pode ser prontamente sintetizada por polimerização radical de cadeia de transferência de fragmentação de adição reversível (RAFT), com peso molecular pré-determinado, e distribuição de peso molecular estreita. Em uma modalidade, pDMAEMA tem uma média de peso molecular de 15.000 Dalton. Entretanto, neste exemplo o pDMAEMA tem um peso molecular de 33.000. pDMAEMA pode ser preparado de acordo com o método delineado em Fournier D et al., (2007) Macromoléculas, 40, 915-920.
Preparação de dsRNA-pDMAEMA
[00169] Pó de pDMAEMA foi dissolvido em água desionizada, e o pH foi ajustado para 6-6,5, usando 1,0 M HCl enquanto agitando. A concentração de massa de pDMAEMA foi depois ajustada para 4 mg/mL.
[00170] O controle dsRNA (500 ng, MEGAscript RNAi kit, 1μg/μL) foi adicionado às soluções de pDMAEMA, com proporções de N:P (N: amina em pDMAEMA e P: fosfato em dsRNA) de 0,5, 1, 2, e 3 (mostrados em NP1/2, NP1, NP2, e NP3 aqui no presente). A mistura foi incubada a temperatura ambiente (RT) por 5 minutos, com progressivamente misturando por inversão. Eletroforese de gel foi usada para exa-minar se há dsRNA nas soluções de dsRNA-pDMAEMA, e os resultados são providos na Figura 15.
[00171] A imagem provida na Figura 15 confirma que algum dsRNA livre estava presente na solução de NP1/2 (dsRNA-pDMAEMA). A ligação completa de dsRNA with pDMAEMA ocorreu nas soluções de NP1, NP2 e NP3.
[00172] Uma proporção de N:P de 1, significa que a proporção de massa de pDMAEMA:dsRNA é cerca de 1:2. Isto é porque o peso molecular da unidade monoméica, em pDMAEMA, é 157 (e esta unidade tem somente um átomo de nitrogênio), e a média de peso molecular de uma única unidade de base-açúcar-fosfato, no DNA, é cerca de 330 (esta unidade inclui um átomo de fósforo). Ben-pDMAEMA-dsRNA pode ter aproximadamente 63 % em peso de Ben, 13 % em peso de pDMAEMA e 25 % em peso de dsRNA.
Preparação de dsRNA-pDMAEMA-BEN
[00173] Bentonita (0,5 g) foi dispersa em 80 mL de água desionizada, através de agitação por 5 minutos, e esta suspensão foi depois diluída para uma final concentração de massa de 5 μg/μL. O dsRNA foi adicionado na solução de pDMAEMA, em pH 6,0, para fazer as misturas de dsRNA-pDMAEMA, na proporção de N:P de 1 (NP1). A suspensão de bentonita foi depois misturada com as misturas de dsRNA-pDMAEMA (NP1), em uma proporção de massa de bentonita:pDMAEMA de 5:1, para formar complexos de um BEN-pDMAEMA-dsRNA (em NP1 - isto é, BPR5). As misturas foram incubadas em gelo por 15 minutos, com progressivamente misturar por inversão.
Liberação Dependente de pH de dsRNA de dsRNA-pDMAEMA-BEN
[00174] Uma série de soluções de tampão de BPR5 (como preparado acima) foi preparada em pH 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5 e 11. Cada uma das soluções foi preparada com o mesmo volume de tampão. A mistura foi incubada a temperatura ambiente (RT) por 5 minutos, com progressivamente misturando por inversão, e depois eletroforese de gel foi conduzida para examinar a liberação de dsRNA dos complexos de dsRNA- pDMAEMA-bentonita. O resultado é provido na Figura 16.
[00175] Como mostrado na Figura 16, NP1 os complexos de dsRNA- pDMAEMA-bentonita, começaram a liberar dsRNA, provavelmente em pH 8,0, e que uma substancial quantidade de dsRNA foi liberada em um pH de 8,5-11.
EXEMPLO 6 - ENSAO DE PROTEÇÃO DE NUCLEASE
[00176] O controle de dsRNA (500 ng) foi carregado em pDMAEMA em uma proporção de N:P (N: amina em pDMAEMA e P: fosfato em dsRNA) de 1 (NP1), como mencionado acima. Complexos de NP1 foram depois carregados em bentonita, em uma proporção de massa de 1:5 para fazer BPR5. O volume final da mistura foi ajustado para 10 ML, usando água de dietilapirocarbonato (DEPC). Nuclease A de sal alto (0,125 ng) foi adicionado e a mistura incubada a 37° C por 20 minutos. Um tampão de pH 10 (8 μL) foi adicionado para libera e verificar a liberação de dsRNA dos complexos de BPR5. Soluções foram carregadas em gel de agarose (1%) e a imagem de gel gravada. Como mostrado na Figura 17, dsRNA desprotegidos foram degradados na presença de Nuclease A. Em um contraste repentino, dsRNA em BPR5 foram protegidos da degradação por Nuclease A, e liberado em pH 10.
EXEMPLO 7 -BIO-ENSAIO DE ALIMENTAÇÃO
[00177] Neonatos de Helicoverpa armigera, recentemente emergidos, foram alimentados em água, bentonita-pDMAEMA (polímero de bentonita ou BP), Proteína Fluorescente Verden (GFP - controle negativo), Rieske, VDAC, bentonita-pDMAEMA-Rieske (BP-Rieske) e bento- nita-pDMAEMA-VDAC (BP-VDAC). BP-Rieske e BP-VDAC foram preparados como esboçado acima, para dsRNA-pDMAEMA-BEN, com uma proporção de N:P de 1 (nitrogênio em pDMAEMA : fósforo em dsRNA), e uma proporção de massa de bentonita:pDMAEMA de 5:1.. Soluções for a aplicadas na superfície de cubos de dieta artificial (~1 cm2), de tal maneira que 60 μg dsRNA foi aplicada para cada cubo (um volume de 100 μL), e as soluções foram deixadas passar nos cubos de dieta. Os cubos resultantes foram subsequentemente alimentados para neonatos de Helicoverpa armigera recentemente emergidos. Soluções foram alimentadas para as larvas três vezes, com um intervalo de 24 horas entre alimentação consecutiva. Novos cubos de dieta artificial foram usados, na hora da aplicação das soluções de dsRNA.
[00178] Durante o experimento de alimentação, 15 larvas de cada um dos grupos de tratamento, foram coaguladas juntas em nitrogênio líquido, 3 dias depois de suas primeiras exposições de dsRNA (DPE). Os efeitos do gene silenciando foram analisados em termos de transcrições relativas.
Anállise de RT-PCR
[00179] Para avaliar a eficácia do método de RNAi, baseado em na- nopartícula, silenciando ambos os genes de Rieske e VDAC, através de alimentação de larvas de H. armigera, dsRNAs para Rieske (300 bp - conservada a região de sequência) e VDAC (232 bp - conservada a região de sequência), foram sintetizados através da companhia AgroRNA (Seul, Coréia do Sul).
[00180] O RNA total foi extraído de 15 larvas coaguladas, e os tratamentos de reagente TriSure (Biolina) e DNAse (Thermo Fisher) foram realizados as per os instrutores do fabricante. Reação em tempo real foi realizada em 20 ML, usando 100 ng de RNA total. Um gene codificando proteína ribossomal (L27, RPL27) foi usado como uma referência interna. O tempo real PCT (RT-PCR) foi realizado com um kit de uma etapa de sensifast SYBR No-ROX (Biolina), e o método 2-ΔΔCT foi uado para avaliar os níveis de transcrição de Rieske e VDAC relativos ao GFP, no alimento de H. armigera, dietas artificiais. Pares principais sem sobreposição com regiões de dsRNA, foram sintetizados para examinar a supressão de gene transcrito pelo PCR de tempo real quantitativo. As sequências dos princípios usados foram como a seguir. SEQ ID NO. 17 (Rieske): CCGCAAACGAGATTAGCACC SEQ ID NO. 18 (Rieske): ACTTCGGCGGCTACTACTG SEQ ID NO. 19 (VDAC): GACTGCGGTATTAGCATGAAG SEQ ID NO. 20 (VDAC): CAGAGAACACTTGAAGATACTG SEQ ID NO. 21 (RPL27): ACAGGTATCCCCGCAAAGTGC SEQ ID NO. 22 (RPLS27): GTCCTTGGCGCTGAACTTCTC
[00181] Figuras 18 e 19 mostram que a alimentação das larvas de H. armigera, com bentonita-pDMAEMA-Rieske (BP-Rieske) ou bentonita- pDMAEMA-VDAC (BP-VDAC), eficazmente dispararam RNAi nas larvas. O BP-Rieske e o BP-VDAC reprimiram o nível de transcrição por 42,8% e 79,4%, respectivamente, em comparação às larvas alimentadas de GFP dsRNA. Entretanto, VDAC dsRNA desprotegidos reprimiram o nível de transcrição por 22,6%, e o Rieske dsRNA desprotegido não suprimiu o nível de transcrição significativamente.
[00182] No presente relatório descritivo e reivindicações (se alguma), a palavra ‘compreendendo’ e seus derivados, incluindo ‘compreende’ e ‘compreendem’, incluem cada um dos números inteiros estabelecidos, mas não exclui a inclusão de um ou mais números inteiros adicionais.
[00183] Referência ao longo de todo este relatório descritivo, à ‘uma modalidade’ ou ‘a modalidade’, significa que uma característica particular, estrutura, ou característica descrita em conexão com a modalidade, é incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Desse modo, a evidência das frases ‘em uma modalidade’ ou "na modalidade’, em vários lugares ao longo de todo o relatório descritivo, não são necessariamente todas se referindo à mesma modalidade. Além do mais, as características particulares, estruturas, ou características podem ser combinadas em qualquer maneira apropriada, em uma ou mais combinações.
[00184] De conformidade com o estatuto, a invenção foi descrita em linguagem mais ou menos específica para as características estruturais ou metódicas. Deve ser compreendido que a invenção não é limitada às características especificas, mostradas ou descritas, uma vez que os meios descritos aqui no presente, compreendem formas preferidas de colocar a invenção em efeito. A invenção é, dessa maneira, reivindicada em qualquer uma de suas formas ou modificações, dentro escopo apropriado das reivindicações em anexo (se alguma) apropriadamente interpretadas por aqueles versados na técnica.
VANTAGENS
[00185] As vantagens da presente invenção podem incluir: - dsRNA de um tamanho grande pode ser incluído na composição; - o dsRNA na composição pode ser protegido de nucleases e luz U.V.a - a molécula tendo uma pluralidade de grupos positivamente carregados, pode atuar como uma chave de ‘controle de pH’ para liberar o dsRNA da composição, em um pH alcalino (por exemplo, para insetos Lepidopteros, isto ocorre no intestino médio); - depois de ser pulverizado em um alimento de inseto, o dsRNA deverá ficar viável por semanas; - a composição tem a capacidade de provocar mortalidade de insetos, se alimentando em fontes de alimento pulverizadas com ou compreendendo a composição; - dsRNA é altamente específico para um organismo alvo e é ecologicamente favorável. A composição não deve afetar espécies que não são alvejadas pela composição; - a composição pode ser preparada facilmente em um custo relativamente baixo; - a composição pode ter uma alta capacidade de carregamento de dsRNA; - a composição pode ter uma baixa toxicidade; e - a composição pode ser prontamente dispersa por borrifar, alimentação em gotas ou aplicação através de irrigação.

Claims (19)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende RNA de fita dupla adsorvido em um complexo de argila, sendo que o complexo de argila inclui: (a) uma argila catiônica, que compreende montmorilonita e compreende uma pluralidade de camadas ou folhas negativamente carregadas; e (b) uma molécula que inclui uma pluralidade de grupos positi-vamente carregados, os referidos grupos positivamente carregados sendo positivamente carregados em uma solução com um pH entre 5,0 e 7,0; (i) os referidos grupos positivamente carregados apresentam um pKa superior a 7,5; ou (ii) a referida molécula é um polímero, que é ou inclui um polidialquilaminoalquilmetacrilato; sendo que a composição inclui de 0,5% em peso a 30% em peso de RNA de fita dupla; e sendo que a razão em massa de argila para molécula é de 1:1 a 10:1.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o RNA de fita dupla é RNA inseticida de fita dupla.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o RNA inseticida de fita dupla é inseticida para insetos da ordem Diptera, Lepidoptera ou Coleoptera.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição de proteção à planta.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a argila catiônica é bentonita.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula que compreende uma pluralidade de grupos positivamente carregados é um polímero que apresenta dois ou mais átomos de nitrogênio positivamente carregados.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o polímero é baseado em polietileno, em que o grupo etileno, no polímero baseado em polietileno, é substituído por um grupo amino e, opcionalmente, substituído por um grupo de retirada de elétron vicinal ao grupo amino.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a razão de nitrogênio no polímero para o fósforo no RNA de fita dupla é de pelo menos 4.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a razão em massa de argila catiônica para molécula é de 3:1 a 8:1.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende de 5 a 30% em peso de RNA de fita dupla.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os referidos grupos positivamente apresentam um pKa superior a 7,5.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição tópica.
13. Preparação agrícola para proteção de plantas contra insetos, caracterizada pelo fato de que compreende: a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, uma fase aquosa, e uma fase sólida.
14. Método para distribuição de RNA de fita dupla a um inseto que apresenta um pH básico dentro do seu canal alimentar, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, para um alimento para insetos.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o alimento para insetos é uma planta, uma parte da planta, uma fonte de alimento sintético de insetos, uma isca de inseto ou uma armadilha de água.
16. Método para proteção de uma colheita contra um inseto, que apresenta um pH básico dentro seu canal alimentar, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para uma colheita.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada à colheita por borrifação, alimentação por gotejamento ou irrigação.
18. Método para preparação de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) adsorção do RNA de fita dupla na molécula que compreende uma pluralidade de grupos positivamente carregados; e (b) adsorção de RNA de fita dupla/molécula na argila catiô- nica.
19. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: a. RNA de fita dupla, e b. um complexo de argila, o qual inclui: (a) uma argila catiônica, que compreende montmorilonita e compreende uma pluralidade de camadas ou folhas com carga negativa; e (b) uma molécula, que inclui uma pluralidade de grupos po-sitivamente carregados, os referidos grupos positivamente carregados sendo positivamente carregados em uma solução apresentando um pH de 5,0 a 7,0; e (i) os referidos grupos positivamente carregados apresentam um pKa superior a 7,5; ou (ii) a referida molécula é um polímero, que é ou inclui um polialquilaminoalquilmetacrilato; sendo que a razão em massa de argila para molécula é de 1:1 a 10:1; sendo que o RNA de fita dupla é absorvível no complexo de argila para formar a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; e sendo que a composição inclui de 0,5% em peso a 30% em peso de RNA de fita dupla.
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