CN108017928A - 一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料及其制备方法 - Google Patents

一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料及其制备方法，该染料具有由聚乙二醇和羧基共修饰吲哚菁染料的不对称结构，分子两侧的吲哚环分别键合聚乙二醇和烷基链连接的羧基，两端吲哚环间由不同长度的共轭甲川链连接，其中聚乙二醇链保证了所述功能染料良好的水溶性以及生物亲和性，而羧基作为活性基团可以用于对含有氨基等活性基团的生物分子进行标记，本发明利用聚乙二醇修饰含有末端羧基的吲哚菁染料，使用柱层析方法分离提纯，降低产物分离成本，通时该染料在有机溶剂和水中都具有良好的溶解性，在生物分子荧光标记领域有广泛的应用前景。

Description

一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇和羧基共修饰的不对称吲哚菁荧光染料，该染料具有良好的水溶性，可用在水溶液中用于含有氨基生物分子的荧光标记，具体涉及一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料及其制备方法。
背景技术
吲哚菁类染料，其分子内部含有由甲川基(CH)n组成的共轭链，共轭链两端吲哚衍生物与共轭链组成一个大的共轭体系，属于近红外荧光染料，吸收和发射光谱位于近红外区550～950nm之间。近红外荧光检测在生物样品分析中有明显的优越性，可避免生物背景干扰。通过聚次甲基桥键长度的选择来调控吸光度和荧光波长，聚次甲基桥键越长其吸光度越高且发射波长可达到近红外区。
吲哚菁染料广泛用于多肽、蛋白质和核酸及其他生物分子的标记和检测。为了使菁染料与生物分子发生键合，通常在不对称菁染料的一端引入化学活性的羧基，能与生物分子中的氨基反应。生物大分子的标记一般都在水溶液中进行，水溶性菁染料在使用过程中无需添加有机助溶剂，即可应用于生物分子标记，荧光成像及其他荧光生物分析。为了增加染料的水溶性，现有的技术是在染料结构上接上强亲水性的磺酸基，例如磺酸基标记用菁染料sulfo-Cy3(三甲川)，sulfo-Cy5(五甲川)和sulfo-Cy7(七甲川)。其中，sulfo-Cy3和sulfo-Cy5是最常用的标记生物分子氨基的活性染料，此试剂可标记溶解蛋白，多肽和寡核苷酸/DNA，其中Cy5在红色区域有最大发射，许多电荷耦合阵列检测器在这个波长范围有最大灵敏度。另外，sulfo-Cy7的发射波长更长，可到760nm以上。带电荷的磺酸盐官能团能促进染料分子在水相中的溶解，能很好地标记偶联物；然而，不对称菁染料的合成副反应多，特别是磺酸基化的菁染料只溶于水，不溶于有机溶剂，分子极性很大，通常只能通过制备高效液相色谱提纯，导致市售产品价格很高。此外，磺酸基修饰的菁染料在水溶液中浓度较高时易发生团聚，故合成种类更多、稳定性更好、提纯更容易的水溶性用于生物分子荧光标记吲哚菁染料具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供聚乙二醇和羧基共修饰的不对称吲哚菁近红外荧光染料，该染料具有良好的水溶性，可在水溶液中用于含有氨基生物分子的荧光标记，具体技术方案如下：
一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料，该染料分子两侧的吲哚环分别键合聚乙二醇和烷基链连接的羧基，两侧吲哚环之间由不同长度的共轭甲川链连接，所述羧基修饰的聚乙二醇化吲哚菁染料在水溶液中与含有氨基的生物分子反应，用作生物分子荧光标记，所述该染料分子结构通式为：
其中，x表示不同链长的聚乙二醇重复单元，选自10～30之间的整数，
y表示碳链的长短，选自0～2中包含端值之间的整数，
z表示共轭甲川链的长短，选自1～3中包含端值之间的整数。
一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料的制备方法，具体步骤如下：
(1)称量干燥过的聚乙二醇单甲醚并溶解到无水有机溶剂中，在N2惰性气体的保护下加入三乙胺碱性催化剂后，在0～10℃温度范围内加入甲磺酰氯，保温搅拌反应12h，过滤除去不溶物，滤液减压除去有机溶剂，得白色固体，加入四氢呋喃溶解该固体并将溶液缓慢加入到冷乙醚中，有白色沉淀产生，过滤得沉淀继续用四氢呋喃溶解，冷乙醚沉淀，重复3～4次，除去未反应的甲磺酰氯原料；将干燥后的甲磺酰基保护的聚乙二醇单甲醚加入有机溶剂，同时加入过量的LiBr并加热回流搅拌24h，过滤除去体系中的无机盐，减压除去有机溶剂得白色固体；加入四氢呋喃溶解该固体，并将溶液缓慢加入该溶液到大量冷乙醚中，有沉淀产生，沉淀过滤后继续用四氢呋喃溶解，大量冷乙醚沉淀，重复3～4次，可得中间体A，以上合成步骤反应式表达如下：
其中，
(2)将上述反应步骤(1)中获取的中间体A与2,3,3-三甲基-3H吲哚加入有机溶剂中，于100～110℃下反应12h，停止反应后将反应液加入大量冷乙醚中，有灰色沉淀产生，过滤可得灰白色滤饼，烘干后用硅胶柱层析提纯可得中间体B，以上合成步骤由反应式表达如下：
(3)ω-溴代羧酸与2,3,3-三甲基-3H吲哚加入有机溶剂中，于100～110℃下反应8～12h，停止反应后将反应液加入大量冷乙醚中，有灰色沉淀产生，过滤可得灰白色滤饼，烘干后用硅胶柱层析提纯可得中间体C，以上合成步骤由反应式表达如下：
(4)将上述步骤(3)中获取的中间体C和甲川缩合剂加入到有机溶剂中，所述有机溶剂选自冰醋酸、醋酸酐、异丙醇、乙腈中任意一种，在N2保护下加热到反应，反应停止后冷却到室温，将中间体B溶于少量吡啶并加入到该反应液中，在常温下搅拌反应，蒸出大部分溶剂后加入少量四氢呋喃溶解该产物，并将溶液加入到冷乙醚中产生沉淀，产品用硅胶柱层析梯度洗脱分离提纯，制得可用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料，以上合成步骤反应式表达如下：
进一步的，所述步骤(4)中用于合成三甲川或五甲川吲哚菁染料，其步骤为将中间体C和三甲川或五甲川缩合剂加入到有机溶剂中，在N2保护下加热到80～120℃反应0.5～4h，反应停止后冷却到室温，将中间体B溶于少量吡啶并加入到该反应液中，在常温下搅拌反应1～2h，蒸出大部分溶剂后加入少量四氢呋喃溶解该产物，并将溶液加入到冷乙醚中产生沉淀，产品用硅胶柱层析梯度洗脱分离提纯，即得可用于生物分子标记的聚乙二醇化三甲川或五甲川吲哚菁染料。
进一步的，所述步骤(4)中用于合成七甲川吲哚菁染料，其步骤为将中间体C和七甲川缩合剂加入到有机溶剂中，在N2保护下加热到40～80℃反应0.5～4h，反应停止后冷却到室温，将反应液加入到大量冷乙醚中产生深红色沉淀，沉淀过滤后用硅胶柱层析进行分离提纯，可得棕色七甲川半菁产物中间体固体；将七甲川半菁中间体溶于少量吡啶，再将中间体B加入到以上反应液中，反应物在50℃温度下搅拌反应1h后冷却至室温，减压蒸出大部分溶剂后加入少量四氢呋喃溶解反应物，将溶液滴加到大量冷乙醚中，有沉淀产生，产品用硅胶柱层析梯度洗脱分离提纯，即得用于生物分子标记的聚乙二醇化七甲川吲哚菁染料。
进一步的，所述三甲川缩合剂是N,N’-二苯甲脒，所述五甲川缩合剂是丙二醛缩苯胺盐酸盐。
进一步的，所述七甲川缩合剂为戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐。
进一步的，所述步骤(1)中有机溶剂选自丙酮、乙醇、四氢呋喃、乙腈中任意一种，所述有机溶剂的用量是聚乙二醇单甲醚质量的5～20倍，所述甲磺酰氯、三乙胺碱性催化剂与聚乙二醇单甲醚摩尔比为1:1:2～5。
进一步的，所述步骤(2)中有机溶剂选自丙酮、乙醇、异丙醇、乙腈、甲苯、1,2-邻二氯苯中任意一种，所述有机溶剂的用量是2,3,3-三甲基-3H吲哚质量的5～20倍，所述2,3,3-三甲基-3H吲哚与中间体A摩尔比为1:1～1:2。
进一步的，所述步骤(3)中有机溶剂选自丙酮、乙醇、异丙醇、乙腈、甲苯、1,2-邻二氯苯中任意一种，所述有机溶剂的用量是溴代聚乙二醇质量的5～20倍，所述2,3,3-三甲基-3H吲哚与ω-溴代羧酸摩尔比为1:1～1:3。
进一步的，所述步骤(4)中所述有机溶剂的用量是中间体C质量的5～20倍，中间体C与甲川缩合剂的摩尔比为1:1～1:2，所述中间体B与反应中间半菁产物的摩尔比为1:1。
本发明与现有技术相比，有如下优点：
聚乙二醇键合到染料上修饰吲哚菁染料，可以使染料由疏水性转换为亲水性，在染料使用过程中无需添加有机助溶剂助溶，即可直接溶解在水中便于使用，同时染料分子键合的羧基可以直接在水溶液中与生物分子中的氨基反应，完成生物分子的荧光标记；现有的磺化水溶性菁染料Sulfo-Cy3，Sulfo-Cy5和Sulfo-Cy7极性很大，难以溶解于有机溶剂，使用传统柱层析分离方式难以进行提纯，通常使用制备高效液相色谱进行提纯，提纯成本高昂，而本发明涉及的聚乙二醇修饰的水溶性菁染料具有相对较小的极性，可以溶解于有机溶剂，通过硅胶柱层析的方式即可得到纯品，显著降低分离提纯成本；同时聚乙二醇大分子醚链结构可以从空间上抑制单线态氧对甲川链的进攻，提高染料在溶液状态的光稳定性；由于聚乙二醇是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相容性的高分子聚合物，使用聚乙二醇修饰吲哚菁染料可以显著提升产品的生物相容性，降低菁染料的生物毒性，在生物医学领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例2染料Cy3-PEG在水溶液中的吸收和荧光发射光谱。
图2为实施例3染料Cy5-PEG在水溶液中的吸收和荧光发射光谱。
图3为实施例4染料Cy7-PEG在水溶液中的吸收和荧光发射光谱。
具体实施方式
为进一步揭示本发明的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
(一)端基溴代聚乙二醇单甲醚PEG16Br的制备
向250mL的圆底烧瓶中加入干燥过的聚乙二醇单甲醚15g(20mmol，Mn＝750)，并加入150mL无水四氢呋喃溶剂溶解，在N2惰性气体的保护下加入三乙胺碱性催化剂4.04g(40mmol)，控温在0℃左右后缓慢滴加甲磺酰氯4.58g(40mmol)溶于20mL无水四氢呋喃的溶液，滴加完毕之后常温搅拌反应10小时，过滤除去不溶物后减压除去有机溶剂，得白色固体；加入20mL四氢呋喃溶解该固体，缓慢滴加该溶液到400mL冷乙醚中，有白色沉淀产生，倒掉乙醚溶液后将粘在壁上的白色固体继续用四氢呋喃溶解，冷乙醚沉淀，重复3～4次，通过反复沉淀可以除去未反应的甲磺酰氯原料，过滤后收集沉淀物并在50℃真空烘箱内干燥过夜；取干燥后的甲磺酰基保护的聚乙二醇单甲醚加入250mL的圆底烧瓶中，用100mL丙酮溶解，加入10g LiBr，加热回流搅拌24小时，过滤除去体系中的不溶的盐类，减压除去有机溶剂，得白色固体；加入20mL四氢呋喃溶解该固体，缓慢加入该溶液到300mL冷乙醚中，有白色沉淀产生，沉淀过滤后继续用四氢呋喃溶解，大量冷乙醚沉淀，重复3～4次，可得端基溴代的聚乙二醇单甲醚PEG16Br。其中，Yield:73％.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ3.80(2H,t),3.70～3.57(62H,m),3.54(2H,t),3.46(2H,t),3.37(3H,s)，上述合成步骤反应式表达如下：
(二)聚乙二醇修饰吲哚盐TMI-PEG16的制备
称取干燥后的PEG16-Br 12.2g(15mmol)以及2,3,3-三甲基-3H-吲哚1.59g(10mmol)加入到50mL反应瓶中，加入15mL邻二氯苯溶解，在N2保护的条件下加热到110℃反应8小时，反应停止后将反应液加入到大量冷乙醚中，有灰色沉淀产生，过滤可得灰白色滤饼，沉淀物用硅胶柱层析梯度洗脱分离提纯，可得聚乙二醇修饰的吲哚盐TMBI-PEG16。其中，Yield:53％.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.14(m,1H),7.93(m,1H),7.57～7.65(m,2H),5.18(t,2H),4.14(t,2H),3.41～3.86(m,66H),3.36(s,3H),3,18(s,3H),1.76(s,6H)，上述合成步骤反应式表达如下：
(三)羧基修饰吲哚盐TMI-COOH的制备
将3-溴丙酸1.53g(10mmol)以及2,3,3-三甲基-3H-吲哚1.59g(10mmol)加入到含10mL邻二氯苯的圆底烧瓶中，在N2保护条件下反应加热到110℃后反应12h后停止，冷却后滤饼用乙酸乙酯洗涤杂质，产品用硅胶柱层析梯度洗脱分离提纯。其中，Yield:78％.1HNMR(CDCl3,400MHz):δ8.09(m,1H),7.90(m,1H),7.60～7.74(m,2H),5.15(t,2H),3.34(s,3H),2.27(t,2H),1.76(s,6H)，上述合成步骤反应式表达如下：
(四)聚乙二醇和羧基共修饰三甲川吲哚菁染料Cy3-PEG的制备
称量化合物TMI-COOH 0.313g(1.0mmol)和N,N’-二苯甲脒0.235g(1.2mmol)放入含8mL醋酸酐的25mL圆底烧瓶中，N2保护下120℃反应30min；反应停止后冷却到室温，将TMI-PEG16 0.812g(1.0mmol)溶于4mL吡啶并加入到反应液中；反应物在25℃下搅拌反应1h，减压蒸出大部分溶剂后加入少量四氢呋喃溶解该产物并将溶液加入到100mL冷乙醚中，有深红色油状沉淀产生；产品用硅胶柱层析分离提纯，流动相从1％过渡到10％MeOH/CH2Cl2梯度洗脱，可得深红色固体产物Cy3-PEG。其中，Yield:43％.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.40(t,1H),7,42～7.30(m,4H),7.27～7.20(m,4H),7.16～7.10(m,4H),4.61(t,2H),4.51(t,2H),4.00(m,2H),3.41～3.82(m,66H),3.35(s,3H),2.77(t,2H),1.71～1.75(m,12H)。上述合成反应式表达如下：
上述步骤得到的聚乙二醇和羧基共修饰三甲川吲哚菁产物Cy3-PEG由于修饰PEG的增溶作用，在水溶液中及常规有机溶剂中都有良好的溶解性。图1为Cy3-PEG在水溶液中的可见-近红外吸收光谱和荧光光谱见。产品Cy3-PEG的最大吸收波长为550nm，在570nm处有最大荧光发射峰，其吸收及荧光发射光谱与商业化的磺酸基化三甲川菁染料Sulfo-Cy3类似。Cy3-PEG可以代替磺酸基化的Sulfo-Cy3，用作水溶液中标记生物分子氨基的活性染料，可用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。
实施例2
称量化合物TMI-COOH 0.313g(1.0mmol)和五甲川缩合剂丙二醛缩苯胺盐酸盐0.428g(1.2mmol)放入含10mL醋酸酐的50mL圆底烧瓶中，N2保护下120℃反应30min，反应停止后冷却到室温，将TMI-PEG16 0.812g(1.0mmol)溶于4mL吡啶并加入到反应液中，反应物在25℃温度下搅拌反应1h，蒸出大部分溶剂后加入少量四氢呋喃溶解该固体，加入到100mL冷乙醚中，有蓝色油状沉淀产生，产品用硅胶柱层析分离提纯，流动相从1％过渡到10％MeOH/CH2Cl2梯度洗脱，可得深紫色固体产物Cy5-PEG。其中，Yield:43％.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.10(t,2H),7,40～7.33(m,4H),7.22～7.19(m,2H),7,14～7.11(m,2H),6.93(t,1H),6.44(d,1H),6.34(d,1H),4.63(t,2H),4.50(t,2H),4.04(m,2H),3.40～3.84(m,66H),3.34(s,3H),2.74(t,2H),1.71～1.76(m,12H)，上述合成反应步骤表达式如下：
上述步骤得到的聚乙二醇和羧基共修饰五甲川菁产物Cy5-PEG由于修饰PEG的增溶作用，在水溶液中及常规有机溶剂中都有良好的溶解性。如图2所示，Cy5-PEG在水溶液中的可见-近红外吸收光谱和荧光光谱。产品Cy5-PEG的最大吸收波长为645nm，在663nm处有最大荧光发射峰，其吸收与荧光发射光谱与商业化的磺酸基化五甲川菁染料Sulfo-Cy5类似。Cy5-PEG可以代替磺酸基化的Sulfo-Cy5，用作水溶液中标记生物分子氨基的活性染料，用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。
实施例3
称量TMI-COOH 2.51g(8.0mmol)和七甲川缩合剂戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐3.36g(12mmol)放入含10mL醋酸酐和10mL吡啶的50mL圆底烧瓶中，N2保护下在50℃下加热反应30min，反应停止后冷却到室温，将反应液加入到200mL冷乙醚中产生深红色沉淀，沉淀过滤后用硅胶柱层析进行分离，流动相从1％过渡到10％MeOH/CH2Cl2梯度洗脱，可得棕色七甲川半菁产物中间体固体TMI-7。其中，Yield:76％.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.15(d,1H),7.91～7.80(m,1H),7.63～7.43(m,8H),7.18～7.14(m,3H),6.94(m,1H),5.40～5.32(m,1H),4.61(t,2H),2.82(t,2H),1.98(s,3H),1.73(s,6H)。
将半菁中间体TMI-7 0.741g(2.0mmol)溶于15mL吡啶，再将TMI-PEG16 1.620g(2.0mmol)加入到以上反应液中，反应物在50℃温度下搅拌反应1h后冷却至室温，蒸出大部分溶剂后加入少量四氢呋喃溶解反应物，将溶液滴加到到100mL冷乙醚中，有深绿色沉淀产生，产品用硅胶柱层析分离提纯，流动相从1％过渡到10％MeOH/CH2Cl2梯度洗脱，可得深紫色聚乙二醇和羧基共修饰七甲川吲哚菁染料Cy7-PEG。其中，Yield:35％.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.11～8.01(m,2H),7.82(m,1H),7.46-7.34(m,4H),7.26～7.19(m,4H),7.14～7.07(m,4H),6.87(m,1H),6.45～6.34(m,2H),4.61(t,2H),4.55(t,2H),4.03(m,2H),3.83～3.38(m,66H),3.31(s,3H),2.65(t,2H),1.70～1.81(m,12H)。上述合成步骤反应式表达如下：
上述步骤中得到的聚乙二醇和羧基共修饰七甲川菁产物Cy7-PEG由于修饰PEG的增溶作用，在水溶液中及常规有机溶剂中都有良好的溶解性。如图3所示，Cy7-PEG在水溶液中的可见-近红外吸收光谱和荧光光谱。产品Cy7-PEG的最大吸收波长为756nm，在776nm处有最大荧光发射峰，其吸收与荧光发射光谱与商业化的磺酸基化七甲川菁染料Sulfo-Cy7类似。血液和人体组织对700～1000nm的近红外光吸收和散射较低，所以七甲川菁染料的发射荧光容易透过生物组织用于活体荧光成像。Cy7-PEG可以代替磺酸基化的Sulfo-Cy7，用作水溶液中标记生物分子氨基的活性染料，特别适合于活体小动物体内荧光成像。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料，其特征在于：该染料分子两侧的吲哚环分别键合聚乙二醇、烷基链连接的羧基，两侧吲哚环之间由不同长度的共轭甲川链连接，所述羧基修饰的聚乙二醇化吲哚菁染料在水溶液中与含有氨基的生物分子反应，用作生物分子荧光标记，所述该染料分子结构通式为：
其中，x表示不同链长的聚乙二醇重复单元，选自10～30之间的整数，
y表示碳链的长短，选自0～2中包含端值之间的整数，
z表示共轭甲川链的长短，选自1～3中包含端值之间的整数。
2.一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)称量干燥过的聚乙二醇单甲醚并溶解到无水有机溶剂中，在N2惰性气体的保护下加入三乙胺碱性催化剂后，在0～10℃温度范围内加入甲磺酰氯，保温搅拌反应12h，过滤除去不溶物，滤液减压除去有机溶剂，得白色固体，加入四氢呋喃溶解该固体并将溶液缓慢加入到冷乙醚中，有白色沉淀产生，过滤得沉淀继续用四氢呋喃溶解，冷乙醚沉淀，重复3～4次，除去未反应的甲磺酰氯原料；将干燥后的甲磺酰基保护的聚乙二醇单甲醚加入有机溶剂，同时加入过量的LiBr后加热回流搅拌24h，过滤除去体系中的无机盐，减压除去有机溶剂得白色固体，加入四氢呋喃溶解该固体，并将溶液缓慢加入到大量冷乙醚中，有沉淀产生，沉淀过滤后继续用四氢呋喃溶解，大量冷乙醚沉淀，重复3～4次，可得中间体A，以上合成步骤反应式表达如下：
其中，
(2)将上述反应步骤(1)中获取的中间体A与2,3,3-三甲基-3H吲哚加入有机溶剂中，于100～110℃下反应12h，停止反应后将反应液加入大量冷乙醚中，有灰色沉淀产生，过滤可得灰白色滤饼，烘干后用硅胶柱层析提纯可得中间体B，以上合成步骤由反应式表达如下：
(3)ω-溴代羧酸与2,3,3-三甲基-3H吲哚加入有机溶剂中，于100～110℃下反应8～12h，停止反应后将反应液加入大量冷乙醚中，有灰色沉淀产生，过滤可得灰白色滤饼，烘干后用硅胶柱层析提纯可得中间体C，以上合成步骤由反应式表达如下：
(4)将上述步骤(3)中获取的中间体C和甲川缩合剂加入到有机溶剂中，所述有机溶剂选自冰醋酸、醋酸酐、异丙醇、乙腈中任意一种，在N2保护下加热到反应，反应停止后冷却到室温，将中间体B溶于少量吡啶并加入到该反应液中，在常温下搅拌反应，蒸出大部分溶剂后加入少量四氢呋喃溶解该产物，并将溶液加入到冷乙醚中产生沉淀，产品用硅胶柱层析梯度洗脱分离提纯，制得可用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料，以上合成步骤反应式表达如下：
。
3.根据权利要求2所述的一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中用于合成三甲川或五甲川吲哚菁染料，其步骤为将中间体C和三甲川或五甲川缩合剂加入到有机溶剂中，在N2保护下加热到80～120℃反应0.5～4h，反应停止后冷却到室温，将中间体B溶于少量吡啶并加入到该反应液中，在常温下搅拌反应1～2h，蒸出大部分溶剂后加入少量四氢呋喃溶解该产物，并将溶液加入到冷乙醚中产生沉淀，产品用硅胶柱层析梯度洗脱分离提纯，即得可用于生物分子标记的聚乙二醇化三甲川或五甲川吲哚菁染料。
4.根据权利要求2所述的一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中用于合成七甲川吲哚菁染料，其步骤为将中间体C和七甲川缩合剂加入到有机溶剂中，在N2保护下加热到40～80℃反应0.5～4h，反应停止后冷却到室温，将反应液加入到大量冷乙醚中产生深红色沉淀，沉淀过滤后用硅胶柱层析进行分离提纯，可得棕色七甲川半菁产物中间体固体；将七甲川半菁中间体溶于少量吡啶，再将中间体B加入到以上反应液中，反应物在50℃温度下搅拌反应1h后冷却至室温，减压蒸出大部分溶剂后加入少量四氢呋喃溶解反应物，将溶液滴加到大量冷乙醚中，有沉淀产生，产品用硅胶柱层析梯度洗脱分离提纯，即得用于生物分子标记的聚乙二醇化七甲川吲哚菁染料。
5.根据权利要求3所述的一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料的制备方法，其特征在于：所述三甲川缩合剂是N,N’-二苯甲脒，所述五甲川缩合剂是丙二醛缩苯胺盐酸盐。
6.根据权利要求4所述的一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料的制备方法，其特征在于：所述七甲川缩合剂为戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐。
7.根据权利要求2所述的一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中有机溶剂选自丙酮、乙醇、四氢呋喃、乙腈中任意一种，所述有机溶剂的用量是聚乙二醇单甲醚质量的5～20倍，所述甲磺酰氯、三乙胺碱性催化剂与聚乙二醇单甲醚摩尔比为1:1:2～5。
8.根据权利要求2所述的一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中有机溶剂选自丙酮、乙醇、异丙醇、乙腈、甲苯、1,2-邻二氯苯中任意一种，所述有机溶剂的用量是2,3,3-三甲基-3H吲哚质量的5～20倍，所述2,3,3-三甲基-3H吲哚与中间体A摩尔比为1:1～1:2。
9.根据权利要求2所述的一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中有机溶剂选自丙酮、乙醇、异丙醇、乙腈、甲苯、1,2-邻二氯苯中任意一种，所述有机溶剂的用量是溴代聚乙二醇质量的5～20倍，所述2,3,3-三甲基-3H吲哚与ω-溴代羧酸摩尔比为1:1～1:3。
10.根据权利要求3所述的一种用于生物分子标记的聚乙二醇化吲哚菁染料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述有机溶剂的用量是中间体C质量的5～20倍，中间体C与甲川缩合剂的摩尔比为1:1～1:2，所述中间体B与反应中间半菁产物的摩尔比为1:1。
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