CN107974446A - 一种木霉菌高效产孢的诱变与筛选方法 - Google Patents

一种木霉菌高效产孢的诱变与筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种木霉菌高效产孢的诱变与筛选方法，属于微生物技术领域。具体步骤为：木霉菌发酵培养；菌悬液制备；木霉菌紫外诱变处理；分生孢子和厚垣孢子高产菌株筛选；遗传稳定性检测；诱变株原有性能测定。本发明所述方法简便易行，成本低，可同时获得分生孢子和厚垣孢子高产菌株，且诱变株遗传稳定性好，是木霉菌获得高效产孢的一种有效方法。同时，诱变株可保持原有菌株降解四环素类抗生素的功能。所得到的高产孢菌株，可用于孢子产品制备和菌剂研发，也可用于四环素类抗生素污染环境的修复。

Description

一种木霉菌高效产孢的诱变与筛选方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种通过紫外诱变方法获得木霉菌高效产孢子的方法，可以同时获得分生孢子和厚垣孢子高产菌株。
背景技术
木霉属菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目,丛梗孢科、粘孢菌类，是土壤微生物的优势种群，生长迅速，大多数对植物病菌具有拮抗作用。同时,还具有促进植物生长，提高营养利用效率,增强植物抗逆性和修复污染环境等功能。被用于生物防治、生物肥料、土壤改良剂和环境修复等领域。
木霉菌的分生孢子和厚垣孢子相对于菌丝体而言，具有易贮藏，抗逆性强，存活期长等特点,而被应用于实际生产中。目前，商品化的木霉制剂多以孢子制剂为主。然而，木霉菌中有些菌株产孢量极低，只能用其菌丝体来保存菌种和开发产品，制约了这些木霉菌的应用。在改善和提高这些木霉菌产孢量方面，已有的报道多是从优化培养基质和培养条件方面研究，提高孢子产量和活力。而用紫外方法诱变提高微生物孢子产量的研究，目前尚未见到报道。
本发明提供一种木霉菌高效产孢的诱变与筛选方法，对于木霉菌的产孢性能改良、长期保存和产品开发，具有重要科学和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过紫外诱变方法提高木霉菌高效产孢的方法。利用该方法可同时获得分生孢子和厚垣孢子高产菌株，且高产菌株产孢遗传稳定性好，可以用于菌种长期保存、菌剂制备和孢子产品开发等。同时，本发明所用的出发菌株木霉菌LJ245，经诱变后，仍保持原菌株降解四环素抗生素功能，可用于环境中四环素类抗生素的降解和生物修复。
本发明所提供的技术方案是通过以下步骤实现的：
1、木霉菌发酵培养
选取实验室保存的木霉菌LJ245(Trichoderma harzianum LJ245)作为出发菌株，该菌株几乎不产分生孢子。将该菌株接种到马铃薯或马丁氏液体培养基中活化培养2d-6d，得到发酵液。
马铃薯培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌20-30min。固体培养基添加琼脂10g-15g。
马丁氏培养基：KH2PO41.0g，MgSO47H2O 0.5g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌15-20min。固体培养基添加琼脂10g-15g。
2、菌悬液制备
取发酵液10mL于三角瓶中，并加入50颗玻璃珠，震荡10min-20min，然后用生理盐水按照1:10,1:100,1:1000比例，稀释成不同浓度，得到菌悬液。
3、木霉菌紫外诱变处理
取上述菌悬液2ml，置于9cm玻璃培养皿中，放到自制的紫外反应箱中，距离紫外灯20cm、30cm、40cm，分别照射0min、4min、8min、12min、16min、20min、24min、26min、30min，黑暗静止培养1-2d。
所用自制的紫外反应箱包括：(1)箱体，长宽高比例为15:13:20；(2)箱体内安置有紫外灯镇流器；(3)在箱体内安装有3个不同规格的紫外灯；(4)箱内设有可调距离的定位支架、固定座和载物托盘；(5)载物托盘高度调节旋钮；(6)紫外灯开关等；电源为220v。
4、分生孢子与厚垣孢子高产菌株筛选
将上述不同紫外诱变处理并在黑暗静止培养1-2d的菌液，各取100-200μL，分别涂布于含100mg/L金霉素的马丁氏固体培养基上，于25-35℃遮光培养，每隔24h观测菌落数量，确定适宜的诱变时间。同时观察固体平板中菌株降解金霉素透明圈大小，挑选对金霉素降解效果明显的菌株。在此基础上，观测不同诱变株的菌落形态特征，进一步筛选分生孢子和厚垣孢子高产菌株。
(1)分生孢子高产菌株筛选
根据上述不同诱变株菌落形态，挑选分生孢子产生量多的诱变株，在马铃薯或燕麦粉固体培养基上划线，置于25-35℃的恒温培养箱中，避光培养3d-7d。然后用无菌生理盐水将培养基表面的分生孢子冲洗下来，收集，然后稀释至一定浓度，利用血球计数板于显微镜下观察计数分生孢子数量。依据形态观察和分生孢子数量，筛选出分生孢子高产菌株LJ2451，其分生孢子产量与出发菌株相比可提高100-150倍。
(2)厚垣孢子高产菌株
根据上述不同诱变株菌落形态，挑选生物量大、菌落形态不同的菌株，分别接种到马铃薯或燕麦粉液体培养基中培养，得到不同诱变株的发酵液，用3-6层擦镜纸过滤后，在显微镜下利用血球计数板测量计数，统计不同诱变株产厚垣孢子的数量，依据厚垣孢子数量，筛选出高产厚垣孢子的菌株LJ2452、LJ2453、LJ2454和LJ2455，厚垣孢子产量与出发菌株相比提高18-299倍。
燕麦粉培养基：燕麦粉20g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌20-30min。固体培养基添加琼脂10g-15g。
本发明提供的方法，能同时筛选得到厚垣孢子高产菌株和分生孢子高产菌株。
5、高产孢菌株的遗传稳定性测定
将上述(1)中筛选得到的分生孢子高产菌株，接种到马铃薯或马丁氏固体培养基中传代培养6-11代，对每代取样测定分生孢子数量，发现菌株LJ2451的分生孢子产量稳定。
将上述(2)中筛选得到的厚垣孢子高产菌株，接种到燕麦粉或马铃薯液体培养基中传代培养6-11代，对每代取样测定厚垣孢子数量，发现诱变株厚垣孢子产量维持较高水平。
6、诱变株原有降解抗生素性能测定
将出发菌株LJ245与诱变得到的高产孢菌株，在马丁氏或马铃薯固体培养基上活化培养24-48h，然后分别接种到四环素类抗生素为唯一碳源的液体培养基中培养，每天取样测定四环素类抗生素生物降解效果，发现诱变菌株LJ2451、LJ2452和LJ2455降解四环素类抗生素活性优于出发菌株，这里所述四环素类抗生素是指金霉素。
有益效果
本发明的目的是提供一种促使木霉菌同时获得分生孢子和厚垣孢子高产菌株的紫外诱变方法。本发明的主要优点在于：
(1)对于不产分生孢子或产量极低的木霉菌菌株，可同时获得分生孢子和厚垣孢子高产诱变菌株，其与出发菌株相比，厚垣孢子产量最高可提高299倍，分生孢子产量可提高100-150倍。
(2)诱变菌株稳定性良好，经过多次传代，仍可保持较高的产孢量。
(3)本发明所采用的木霉菌菌株LJ245是本发明人前期筛选得到的具有降解四环素类抗生素功能菌株，该菌株保藏号为CGMCC NO.5753。该菌株诱变后的菌株仍具有降解四环素类抗生素的功能，个别诱变菌株降解四环素类抗生素的功能有所提高，这里所述四环素类抗生素，是指金霉素。
(4)本发明使用的自制紫外反应箱，可满足多种菌株、多种紫外诱变条件，可用于大部分的紫外诱变实验。
(5)本发明所采用的方法简单易行，成本低，诱变株产孢量高且稳定，是木霉菌获得高效产孢的一种有效方法。可用于木霉菌孢子制剂制备、菌种长久保藏、功能菌剂研发等方面，应用前景广阔。本发明所使用的方法还可拓展应用到其它科属微生物产孢量的改进方面。
附图说明
图1为出发菌株LJ245的菌落形态照。
图2为紫外反应箱结构简图。
图3为诱变株LJ2451的菌落形态图。
图4为诱变株LJ2451分生孢子显微形态图。
图5为诱变株厚垣孢子的显微形态图。
图6为诱变株不同传代厚垣孢子产量统计结果图。
具体实施方式
本发明的具体实施方式由以下实例加以说明，但本发明不局限于以下实施例。
实施例1：一种木霉菌高效产孢的诱变与筛选方法
本发明所述一种木霉菌诱变与高产孢菌株筛选方法，其特征在于包括以下步骤：木霉菌发酵培养→菌悬液制备→木霉菌紫外诱变处理→厚垣孢子和分生孢子高产菌株的筛选→遗传稳定性测定→诱变株原有降解抗生素性能测定。
1、木霉菌发酵培养
(1)实验材料准备
菌株来源：选取实验室前期筛选的木霉菌LJ245(Trichoderma harzianum LJ245)作为诱变材料，该菌株已于2012年2月14日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏号：CGMCC NO.5753。图1为出发菌株LJ245的菌落形态图。
马铃薯培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌20-30min。
马丁氏培养基：KH2PO41.0g，MgSO47H2O 0.5g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌15-20min。固体培养基添加琼脂10g-15g。
(2)木霉菌发酵培养
取试管斜面保存的木霉菌LJ245，接种于马铃薯或马丁氏或燕麦粉液体培养基中，于25℃-35℃，150r/min-200r/min振荡培养2d-6d，获得发酵液。
2、菌悬液制备
将上述得到的发酵液10mL于三角瓶中，并加入50颗玻璃珠，震荡10min-20min，然后用生理盐水按照1:10,1:100,1:1000比例，稀释得到不同的菌悬液。
3、木霉菌的紫外诱变处理
分别量取上述菌悬液2mL，置于直径为9cm的培养皿中，将培养皿盖打开，置于自制紫外反应箱中的载物托盘里，转动距离旋钮，调节培养皿与紫外灯之间的距离20cm、30cm、40cm，分别打开1-3支紫外灯，使用254nm、312nm和365nm中1个波段或多个波段组合，依次照射0min、4min、8min、12min、16min、20min、24min、26min、30min，每个处理重复3次。照射后，马上盖上培养皿盖，并用黑布包上取出，置于黑暗中培养1d-2d。
本发明中所使用的紫外反应箱自制加工，电源为220V，反应箱主要包括：(1)箱体，长宽高比例为15:13:20；(2)在箱体内安装有紫外灯镇流器；(3)箱体内部设置有与紫外灯镇流器相连接的紫外灯，共设置了3支25W的紫外灯，分别为254nm、312nm和365nm三个不同的波长；(4)箱内底部设有可调距离的定位支架、固定座和载物托盘；(5)载物托盘高低调节旋钮，用于调整载物托盘与紫外灯之间的距离；(6)紫外灯开关，可以根据需要，选择紫外灯使用数量。图2为紫外反应箱结构简图。
该仪器可以满足不同菌株、多种紫外诱变条件，可用于大部分的紫外诱变实验。
4、分生孢子和厚垣孢子高产菌株筛选
本发明提供的方法，能同时筛选得到厚垣孢子高产菌株和分生孢子高产菌株。
将上述不同紫外诱变处理并在黑暗静止培养1-2d的菌液，各取100-200μL，分别涂布于含100mg/L金霉素的马丁氏固体培养基上，于25-35℃遮光培养，每隔24h计数并观测菌落形态，确定适宜的诱变时间。挑选降解金霉素透明圈大，即对金霉素降解效果明显菌株。在此基础上，观测不同诱变株的菌落大小、菌丝形态、长势、质地以及分生孢子形成时间与颜色等，用于下一步分生孢子和厚垣孢子高产菌株筛选。
(1)分生孢子高产菌株筛选
根据上述不同诱变株菌落形态，挑选分生孢子产生量大的诱变株，在马铃薯或燕麦粉固体培养基上划线，置于25-35℃的恒温培养箱中，避光培养3d-7d。观察分生孢子的产生时间、产量及颜色变化等，挑选分生孢子明显且产量较高的菌株，使用无菌生理盐水将孢子从培养基表面冲洗下来，收集，然后稀释至一定浓度，利用血球计数板于显微镜下观察计数分生孢子数量。根据统计结果，筛选获得分生孢子高产菌株LJ2451，其分生孢子产量与出发菌株相比可提高100-150倍。图3为诱变株LJ2451的菌落形态图。图4为诱变株LJ2451分生孢子显微形态图。
燕麦粉培养基：燕麦粉20g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌20-30min。固体培养基添加琼脂10g-15g。
(2)厚垣孢子高产菌株的筛选
挑选生物量大、菌落形态各不同的菌落，分别接种到马铃薯液体培养基中，于25-35℃，150-200r/min的摇床中活化培养2d，然后按照10％-20％的接种量接种于燕麦粉或马铃薯液体培养基中培养，于25-35℃，150-200r/min的摇床中遮光振荡培养4d-8d，取2mL-4mL孢子悬液，置于装有10颗玻璃珠的5mL离心管中，于150-200r/min的摇床中遮光振荡10min-20min后取出，用3-6层擦镜纸过滤，去除菌丝，获得孢子悬液，置于显微镜下用血球计数板计数每毫升培养液中厚垣孢子的数量。
根据厚垣孢子统计结果，筛选得到高产厚垣孢子的菌株LJ2452、LJ2453、LJ2454和LJ2455，厚垣孢子产量相比出发菌株提高18-299倍。图5为诱变株厚垣孢子的显微形态图。
5、高产孢菌株的遗传稳定性测定
将上述4中得到的分生孢子高产菌株LJ2451接种到马丁氏或马铃薯固体培养基上，置于25-35℃的恒温培养箱中，避光培养，每隔2d-4d转接一次作为一代，经过11代划板传代培养，菌株LJ2451的分生孢子产量稳定。
同时，将上述4得到的厚垣孢子高产菌株LJ2452、LJ2453、LJ2454和LJ2455接种到燕麦粉或马铃薯液体培养基中，于25-35℃，150-200r/min的摇床中遮光振荡培养，每隔24h-48h转接一次作为一代，共获得11代。选取1、3、5、7、9、11代6个培养相同时间的不同代菌株的培养液，在显微镜下，用血球计数板计数每毫升培养液中厚垣孢子的数量。根据统计结果得到菌株LJ2452、LJ2453、LJ2454和LJ2455厚垣孢子产量都维持在较高水平。图6为诱变株不同传代厚垣孢子产量变化统计结果图。
可见，本发明提供的方法，不仅可以得到高产孢菌株，而且菌株的产孢遗传性能稳定。本发明所使用的方法还可拓展应用到其它科属微生物产孢量的改进方面。
6、诱变株原有降解抗生素性能测定
将出发菌株LJ245及诱变菌株LJ2451、LJ2452、LJ2453、LJ2454、LJ2455分别接种在马丁氏或PDA固体培养基上活化培养24-48h，然后，用直径约为8mm的打孔器挖取菌盘，按照3-8菌盘/瓶的接种量分别接种到浓度为100mg/L的以金霉素为唯一碳源的无机盐液体培养基中，在25-35℃,150-200r/min条件下，避光振荡培养，每隔1-2d取样测定培养液中四环素类抗生素的降解率。
无机盐培养基：(NH4)2NO41.0g，K2HPO40.5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl0.2g，CaCl20.1g，MnSO4·H2O 0.01g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1L，pH7.0，121℃灭菌15-20min。
测定结果显示，诱变后的菌株仍能较好降解四环素类抗生素，而且，诱变菌株LJ2451、LJ2452和LJ2455降解四环素类抗生素活性优于出发菌株。这里所述四环素类抗生素是指金霉素。

Claims (9)

1.一种木霉菌高效产孢的诱变与筛选方法，其特征在于，通过如下操作步骤实现：
(1)木霉菌发酵培养
选取实验室保存的木霉菌LJ245(Trichoderma harzianum LJ245)作为出发菌株，该菌株已于2012年2月14日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏号：CGMCC NO.5753，该菌株几乎不产分生孢子，将该菌株接种到马铃薯或马丁氏液体培养基中活化培养2d-6d，得到发酵液；
(2)菌悬液制备
取上述发酵液10mL于三角瓶中，并加入50颗玻璃珠，震荡10min-20min，然后用生理盐水按照1:10,1:100,1:1000比例，稀释成不同浓度，得到菌悬液；
(3)木霉菌的紫外诱变处理
取(2)中不同菌悬液，分别放到自制的紫外反应箱中，进行紫外照射诱变处理；
(4)分生孢子和厚垣孢子高产菌株筛选
取诱变后且经过暗培养后的菌株分别接种于固体培养基和液体培养基中进行培养，观察固体培养基上分生孢子产生情况，筛选出分生孢子高产菌株；统计液体培养基中厚垣孢子数量，比较分析不同诱变处理得到的菌株的产孢量，以筛选出具有高产厚垣孢子的菌株；
(5)诱变菌株遗传稳定性检测
将上述得到的分生孢子与厚垣孢子高产菌株分别接种到固体和液体培养基中，进行传代培养，并统计分生孢子与厚垣孢子的数量，得到遗传稳定性良好的诱变菌株；
(6)诱变株原有降解抗生素性能测定
菌株降解四环素类抗生素性能检测：将出发菌株与诱变菌株分别接种到四环素类抗生素为唯一碳源的液体培养基中培养，并测定抗生素降解率，获得诱变株降解抗生素性能；这里所述四环素类抗生素是指金霉素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中紫外诱变使用的孢子悬液量为2mL，置于直径为9cm的培养皿中，与紫外灯距离20cm、30cm、40cm，分别打开1-3支紫外灯，使用254nm、312nm和365nm中1个波段或多个波段组合，依次照射时间为0min、4min、8min、12min、16min、20min、24min、26min、30min，每个处理重复3次，照射后，用黑布包上取出，置于黑暗中培养1d-2d。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)中所用的自制紫外反应箱包括：(1)箱体，长宽高比例为15:13:20；(2)箱体内安置有紫外灯镇流器；(3)在箱体内安装有3个不同规格的紫外灯，可用于调节254nm、312nm和365nm三个不同的波长；(4)箱内设有可调距离的定位支架、固定座和载物托盘；(5)载物托盘高度调节旋钮；(6)紫外灯开关等；电源为220V。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中用的培养基为马铃薯或马丁氏或燕麦粉培养基，其配方分别为：马铃薯培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌20-30min，固体培养基添加琼脂10g-15g；马丁氏培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌15-20min，固体培养基添加琼脂10g-15g；燕麦粉培养基：燕麦粉20g，将其溶于1000mL蒸馏水中，115℃湿热灭菌15min-20min；固体培养基添加琼脂10g-15g。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：利用该方法能同时筛选得到厚垣孢子高产菌株和分生孢子高产菌株。
6.根据权利要求1所述的高产分生孢子菌株筛选方法，其特征在于：取不同紫外诱变处理并在黑暗静止培养1-2d的菌液，各取100-200μL，分别涂布于含100mg/L金霉素的马丁氏固体培养基上，于25-35℃遮光培养，每隔24h观测菌落形态，挑选降解金霉素透明圈大的菌落，以及分生孢子产生量多大菌落，在马铃薯或燕麦粉固体培养基上划线，置于25-35℃的恒温培养箱中，避光培养3d-7d；观察分生孢子的产生时间、产量及颜色变化等，挑选分生孢子明显且产量较高的菌株，然后用无菌生理盐水将培养基表面的分生孢子冲洗下来，收集，并于显微镜下观察计数分生孢子数量；根据统计结果，获得高产分生孢子的菌株高产菌株LJ2451，其分生孢子产量与出发菌株相比可提高100-150倍。
7.根据权利要求1所述的高产厚垣孢子菌株筛选方法，其特征在于：取不同紫外诱变处理并在黑暗静止培养1-2d的菌液，各取100-200μL，分别涂布于含100mg/L金霉素的马丁氏固体培养基上，于25-35℃遮光培养，每隔24h观测菌落形态，挑选降解金霉素透明圈大，形态不同、生长量的菌落，分别接种到马铃薯液体培养基中，于25-35℃，150-200r/min的摇床中活化培养2d，然后按照10％-20％的接种量接种于燕麦粉或马铃薯液体培养基中培养，于25-35℃，150-200r/min的摇床中遮光振荡培养4d-8d，取2mL-4mL孢子悬液，置于装有10颗玻璃珠的5mL离心管中，于150-200r/min的摇床中遮光振荡10min-20min后取出，用3-6层擦镜纸过滤，去除菌丝，获得孢子悬液，置于显微镜下用血球计数板计数每毫升培养液中厚垣孢子的数量；根据统计结果，筛选得到高产厚垣孢子的菌株。
8.根据权利要求1所述的高产孢菌株的遗传稳定性测定的方法，其特征在于：将上述6和7种得到的分生孢子和厚垣孢子高产菌株，分别接种到燕麦粉或马丁氏或马铃薯固体及液体培养基中，经传代获得11代，选取1、3、5、7、9、11代培养相同时间的不同代菌株的固体平板培养基和培养液，统计固体培养基中的分生孢子数量和液体培养基中厚垣孢子数量，根据统计结果，得到遗传稳定性良好的诱变菌株。
9.根据权利要求1所述的诱变株原有降解抗生素性能测定的方法，其特征在于：将出发菌株与诱变菌株接种在马丁氏或马铃薯固体培养基上活化培养24-48h，然后，用直径约为8mm的打孔器挖取菌盘，按照3-8菌盘/瓶的接种量分别接种到浓度为100mg/L的以金霉素为唯一碳源的无机盐液体培养基中，在25-35℃,150-200r/min条件下，避光振荡培养，每隔1-2d取样测定培养液中四环素类抗生素的降解率；得到诱变后的菌株仍能较好降解四环素类抗生素，而且，个别诱变菌株降解四环素类抗生素活性优于出发菌株；这里所述四环素类抗生素是指金霉素。
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