CN107970436A - 新西兰大白兔腹主动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新西兰大白兔腹主动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模方法，包括：在球囊拉伤术+高胆固醇喂养12w的新西兰兔腹主动脉拟注射斑块的相近位置,在血管内超声引导下，以精细镊在血管外膜处压迫血管腔造成局部变形去除压迫管腔形状恢复来准确定位；向上述的斑块注射FGF‑2，VEGF‑A或者二者混合慢病毒；斑块注射部位用髂腰肌缝线和距髂动脉分叉的距离共同定位；继续高脂喂养8w即可。本发明能够有效的构建富含新生血管的斑块，成模率达100％。通过病理切片以及H&E化学染色证实，不论是VEGF‑A、FGF‑2还是VEGF‑A+FGF‑2混合组都可见斑块内富含新生血管，甚至可见新生血管已长入斑块的纤维帽部(图六)，与对照组注射生理盐水组相比差异达到统计学意义(P<0.05)。

Description

新西兰大白兔腹主动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模方法

技术领域

本发明属于动脉粥样硬化斑块造模领域，特别涉及新西兰大白兔腹主动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模方法。

背景技术

心脑血管疾病是人类健康的第一杀手，现已成为中老年人死亡和致残的主要原因，其中不稳定斑块的破裂并继发血栓形成是重要原因。而斑块内新生血管是斑块不稳定的重要特症之一。因为斑块内新生血管的管壁结构不完整仅有一层内皮细胞包绕而成，缺乏周细胞、结缔组织和基底膜的支撑，红细胞、炎性因子以及炎症细胞可以通过内皮间隙渗透到斑块内，导致斑块内出血及炎症反应增强，从而增加斑块的体积，导致斑块的破裂，最终导致急性心脑血管事件的发生。

体内研究(in vivo)是科学研究的主要途径之一，体内研究为富含新生血管的易损斑块提供坚实有效的研究途径。通过in vivo研究，我们可直接观察斑块内新生血管的发生发展，可通过影像方法直接动态观察新生血管对斑块易损性的影响并探索新的检测方法，还可直接研究血管新生使斑块易损的分子生物学机制，斑块组织学成分变化以及可筛选有效的抑制斑块内血管新生，逆转或者稳定易损斑块的药物。

现阶段很多的研究是通过采集临床上接受颈动脉内膜剥脱术(carotidendoarterectomy，CEA)治疗的病人的颈动脉斑块或者尸检来源的颈动脉斑块来进行研究。主要缺点有：

1.病例数偏少：入组病例数少，而且大多缺乏病理对照，现阶段国内的遗体捐献制度还并不完善，大众对于遗体捐献的认识度较低，所以尸源的标本并不能满足当前日益蓬勃的科学研究浪潮。

2.伦理审查严格：不管是遗体捐献还是接受CEA治疗的病人都必须告知本人以及家属，签署知情同意书，步骤繁琐，有时候甚至沟通困难。

3.获取标本时间周期长：为了保证足够的入组数量，就需要一直等待病号或者捐献者，时间难以把控，等待的时间长的需要几个月甚至几年。

4.不能进行干预性前瞻性的研究，只能进行回顾性研究：收集标本的时刻多为病发的时刻，所以只能向前追寻进行回顾性的研究，而不能进行前瞻性的干预研究。

动物疾病模型的建立是我们研究疾病病理特症以及发展最有效的途径和方法之一。现阶段斑块内新生血管模型的建立多使用常用的实验动物有猴、大鼠、小鼠、小型猪和鹌鹑等，现有方法存在的主要缺点有：

1.建模成功率低：其中大鼠没有胆囊对外源性胆固醇不能吸收转化，难以形成动脉粥样硬化斑块病变；经过大量文献的查阅，小鼠斑块内新生血管，多为外膜滋养(vasavasorum)血管的增多，目前为止并没有文献真正报道了验测到可靠的小鼠主动脉动脉粥样硬化斑块内部处于内中膜的新生血管。

2.成模周期长：小鼠，特别是apoE-/-小鼠，经过高胆固醇饮食喂养能够形成自发的动脉粥样硬化斑块，但是喂养周期长，通常将进20周龄以上才能形成成熟的斑块。

3.费用昂贵：猴与小型猪与人体的生理以及解剖有诸多相似之处，且经过高脂喂养能够形成斑块，是较为理想的动物模型，但是缺陷显而易见，则两种动物研究成本太大，不论从购买费用还是饲养成本来说都较为昂贵。大鼠小鼠等小型动物娇小的体型也限制了它的诸多应用，为了影像学技术的研究，必须配备价格昂贵的小型动物专用的超声机，CT机以及PET，价格动辄数十万以及上百万。

发明内容

为了克服上述不足，本发明提供一种新西兰大白兔腹主动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模方法，克服了现有造模方法成膜率低(一般在50％左右)，无法在斑块内形成新生血管的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种新西兰大白兔腹主动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模方法，包括：

向球囊拉伤术+高胆固醇喂养一段时间的新西兰大白兔的腹主动脉方向进IVUS探头，找到腹主动脉最大斑块的位置；

向上述的斑块注射FGF-2，VEGF-A或者二者混合慢病毒，继续高脂喂养一段时间，即得富含新生血管的动脉粥样硬化斑块。

优选的，所述球囊拉伤术+高胆固醇喂养一段时间的新西兰大白兔的具体培养方法为：新西兰大白兔体重1.2－1.4公斤，适应性普通饮食喂养1周后禁食禁水12小时术前准备，按照3wt％的异戊巴比妥1ml/kg麻醉实验动物后，行腹主动脉球囊拉伤术损伤腹主动脉表面血管内皮细胞，手术结束当天即开始行高胆固醇(1wt％纯胆固醇粉+99wt％普通饲料)喂养12周。

优选的，所述向腹主动脉方向进IVUS探头的具体步骤为：

1)将球囊拉伤术+高胆固醇喂养一段时间的新西兰大白兔用3wt％的异戊巴比妥麻醉后，平卧位，备皮消毒经股动脉进血管内超声(IVUS)探头；手术刀切开皮肤，分离股动脉，行股动脉穿刺术，由导丝引导向腹主动脉方向进IVUS探头，探头进13厘米左右到达肾动脉分叉处左右，连接IVUS超声机进行成像；

2)IVUS回撤装置启动，边回撤边寻找腹主动脉最大斑块的位置；

优选的，所述斑块内注射FGF-2，VEGF-A或者二者混合慢病毒的具体步骤为：兔腹部备皮消毒，麻醉状态下，手术刀沿腹白线切开大约7厘米，分离皮层肌层；用生理盐水沾湿无菌纱布两块，用纱布隔开肠子，寻找到腹主动脉的位置，在IVUS引导下，在拟注射斑块的相近位置以精细镊在血管外膜处压迫血管腔造成局部变形去除压迫管腔形状恢复来准确定位拟穿刺的血管外膜位置；根据血管内超声的定位用止血钳和眼科镊小心分离出斑块表面的筋膜，用胰岛素针抽取FGF-2，VEGF-A或者二者混合慢病毒各25-50微升，针尖可用持针器弯折45度，由血管外膜进针，行斑块内慢病毒的注射，注射前后血管内超声检查斑块情况，保证斑块内注射的成功。

优选的，缝合的具体步骤为：注射完毕在注射点旁缝合髂腰肌一针留线头，斑块注射部位用髂腰肌缝线和距髂动脉分叉的距离共同定位。关腹前取出纱布，清点纱布的数量，腹腔内倒入少量的无菌生理盐水，防止体液流失过多；后逐层缝合肌层与皮肤；纱布围腹缠绕三圈，防止清醒后的动物撕咬伤口；等待动物麻醉清醒之前，将其放在轻微加热的电热毯上，以维持动物体温，时刻观察动物的呼吸和心跳待其苏醒。

优选的，所述继续高脂喂养的时间为8周。

本发明还提供了一种新西兰大白兔腹主动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模用工具包，包括：血管内超声波诊断仪、FGF-2和/或VEGF-A慢病毒。

优选的，还包括：IVUS导管探头，MUD驱动马达、球囊、导丝、止血钳、持针器、眼科镊、剪刀、皮针、圆针、3号手术缝线、注射器、10ml注射器、头皮针、异戊巴比妥钠、利多卡因、肝素、青霉素、生理盐水。

本发明还提供了一种动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模用工具包，包括：血管内超声波诊断仪、FGF-2和/或VEGF-A慢病毒。

动脉粥样硬化斑块(atherosclerotic plaque)：脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，其特点是受累动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类的聚积、斑块内出血及血栓形成，进而导致纤维组织的增生以及钙质沉着，导致动脉管壁增厚变硬、血管腔狭窄。在动脉内膜积聚的脂质外观成黄色粥样(图1)。

易损斑块(vulnerable plaque)：指那些不稳定和有血栓形成倾向的斑块，主要包括破裂斑块、侵蚀性斑块和部分钙化结节性病变。特点包括：(1)较大的脂质核心；(2)薄的纤维帽；(3)炎性细胞的浸润；(4)新生血管的生长；(5)斑块内出血以及表面溃疡。

斑块内新生血管(plaque neovascularization)：是指内皮细胞在原有血管外膜滋养血管网的基础上通过芽生或者非芽生的形式生成新的毛细血管,随着斑块体积的不断增加而长入斑块内。

慢病毒(Lentivirus)载体：以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

本发明的有益效果

(1)本发明能够有效的构建富含新生血管的斑块，成模率达100％。通过病理切片以及H&E化学染色证实，不论是VEGF-A、FGF-2还是VEGF-A+FGF-2混合组都可见斑块内富含新生血管，甚至可见新生血管已长入斑块的纤维帽部(图6)，与对照组注射生理盐水组相比差异达到统计学意义(单因素方差分析，P<0.05)。

(2)本发明为未来研究斑块内血管新生及不稳定斑块的发生机制、检测方法和干预措施都提供了可靠的动物模型。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1是动脉粥样硬化斑块示意图；

图2是实验线路示意图；

图3是开腹分离肌层；

图4是斑块内注射器准备；

图5是斑块内注射操作图；

图6是H&E染色证实VEGF-A慢病毒斑块内注射组斑块内含有大量新生血管(管内有红细胞RBC)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

现阶段有大量的研究证实，斑块内新生血管与不稳定斑块的进展密切相关，不稳定斑块内大多都伴有病理性新生血管。血管新生一般包括有三种方式：(1)血管生成(angiogenesis)；(2)血管发生(vasculogenesis)；(3)小动脉形成(arteriogenesis)。

进行基础研究，开展动物实验是常用的手段，故研究富含新生血管的不稳定斑块，选择有效的动物模型的重要性是不言而喻，因为这是对斑块发生发展及不稳定机制进行研究，从而进一步为临床有效治疗措施提供理论依据的重要基础。

新生血管的密度受到促血管生长因子的调节，血管内皮细胞生长因子(Vascularendothelial growth factor,VEGF)家族中VEGF-A与成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowth factor，FGF)家族中FGF-2均是强有力的血管生成因子。VEGF-A能够特异性地促血管内皮细胞分裂增殖，不成熟血管新生，新生血管通透性增加，使血管内成分渗出，为血管内皮迁移以及血管形成提供基质。而FGF-2在促进血管生成、愈合伤口创伤和组织损伤中发挥了巨大的作用。

本申请研究发现：VEGF-A和FGF-2在血管生成中具有联合应用优势，二者都是血小板相关生长因子，能够共同维持血管内皮细胞的存活和增殖，低氧等刺激都会诱导它们的分泌增多，联合应用促血管生成作用加强；而且它们有协同的调节机制和因子，FGF-2能够通过旁分泌和自分泌的方式促进VEGF在内皮细胞中的表达。

慢病毒载体(Lentivirus)是以人免疫缺陷病毒(HIV-1)为基础改造获得的基因治疗载体,去除致病基因,同时减少辅助质粒与载体质粒的同源性,使慢病毒具有了生物安全性更好、滴度更高、导入外源片段的能力更强的特性。目前慢病毒系统已经广泛应用到基因过表达、RNA干扰、miRNA研究及基因敲除等功能研究的细胞实验和动物实验当中。

如本发明通过使用慢病毒包载VEGF-A载体选LV4，构建NM_001171626.1CDS区(1039-1614bp)过表达病毒以及FGF-2过表达病毒，病毒的包载交予专业病毒包装公司负责即可，简便易得。

实施例1

动物：新西兰大白兔1.2-1.4kg根据实验要求若干。

设备清单：血管内超声波诊断仪，IVUS导管探头，MUD驱动马达，3.5-4.0F的球囊×根据动物数量若干，导丝×根据动物数量若干。

手术器械：止血钳×4把，持针器×2把，眼科镊×4把，剪刀×1把，皮针×若干，圆针×根据动物数量若干，3号手术缝线×根据动物数量若干，注射器×根据动物数量若干，10ml注射器×根据动物数量若干，头皮针×根据动物数量若干。

药品准备：异戊巴比妥钠×根据动物数量若干，利多卡因×根据动物数量若干，肝素×根据动物数量若干，青霉素×根据动物数量若干，生理盐水×根据动物数量若干。

1)、新西兰大白兔体重1.2－1.4公斤，适应性普通饮食喂养1周后禁食禁水12小时术前准备，按照3wt％的异戊巴比妥1ml/kg麻醉实验动物后，行腹主动脉球囊拉伤术损伤腹主动脉表面血管内皮细胞，手术结束当天即开始行高胆固醇(1wt％纯胆固醇粉+99wt％普通饲料)喂养12周。

2)、新西兰大白兔3wt％的异戊巴比妥麻醉后，平卧位，备皮消毒经股动脉进血管内超声(IVUS)探头。手术刀切开皮肤，分离股动脉，行股动脉穿刺术，由导丝引导向腹主动脉方向进IVUS探头，探头进13厘米左右到达肾动脉分叉处左右，连接IVUS超声机进行成像(图2)。

3)、IVUS回撤装置启动，边回撤边寻找腹主动脉最大斑块的位置。

4)、开腹操作。兔腹部备皮消毒，在麻醉状态下，手术刀沿腹白线切开大约7厘米，分离皮层肌层(图3)。

5)、根据超声成像找到腹主动脉最大斑块的位置，进行定位。用生理盐水沾湿无菌纱布两块，用纱布隔开肠子，寻找腹主动脉的位置，在IVUS引导下，在拟注射斑块的相近位置以精细镊在血管外膜处压迫血管腔造成局部变形去除压迫管腔形状恢复来准确定位拟穿刺的血管外膜位置；根据血管内超声的定位用止血钳和眼科镊小心分离出斑块表面的筋膜，用胰岛素针抽取FGF-2，VEGF-A或者二者混合慢病毒各25-50微升，针尖可用持针器弯折45度，由血管外膜进针，行斑块内慢病毒的注射(图4，图5)，注射前后血管内超声检查斑块情况，保证斑块内注射的成功。注射完毕在注射点旁缝合髂腰肌一针留线头，采用斑块注射部位用髂腰肌缝线和距髂动脉分叉的距离共同定位。关腹前取出纱布，清点纱布的数量，腹腔内倒入少量的无菌生理盐水，防止体液流失过多。后逐层缝合肌层与皮肤。纱布围腹缠绕三圈，防止清醒后的动物撕咬伤口。等待动物麻醉清醒之前，将其放在轻微加热的电热毯上，以维持动物体温，时刻观察动物的呼吸和心跳待其苏醒。

6)、术后连续3天青霉素肌注，以预防术后感染。继续高脂喂养8周，即可获得富含新生血管的动脉粥样硬化斑块。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种新西兰大白兔腹主动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模方法，其特征在于，包括：

向球囊拉伤术和高胆固醇喂养一段时间的新西兰大白兔的腹主动脉方向进IVUS探头，找到腹主动脉最大斑块的位置；

向上述的斑块注射FGF-2，VEGF-A或者二者混合慢病毒，继续高脂喂养一段时间，即得富含新生血管的动脉粥样硬化斑块。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述球囊拉伤术和高胆固醇喂养一段时间的新西兰大白兔的具体培养方法为：新西兰大白兔体重1.2－1.4公斤，适应性普通饮食喂养1周后禁食禁水12小时术前准备，按照3wt％的异戊巴比妥1ml/kg麻醉实验动物后，行腹主动脉球囊拉伤术损伤腹主动脉表面血管内皮细胞，手术结束当天即开始行高胆固醇饲料(1wt％纯胆固醇粉和99wt％普通饲料充分混合制成)喂养12周。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述向腹主动脉方向进IVUS探头的具体步骤为：

1)将球囊拉伤术和高胆固醇喂养一段时间的新西兰大白兔用3wt％的异戊巴比妥麻醉后，平卧位，备皮消毒经股动脉进血管内超声(IVUS)探头；手术刀切开皮肤，分离股动脉，行股动脉穿刺术，由导丝引导向腹主动脉方向进IVUS探头，探头进13厘米左右到达肾动脉分叉处左右，连接IVUS超声机进行成像；

2)IVUS回撤装置启动，边回撤边寻找腹主动脉最大斑块的位置；

3)根据超声成像找到腹主动脉最大斑块的位置，进行定位。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在IVUS引导下，在拟注射斑块的相近位置以精细镊在血管外膜处压迫血管腔造成局部变形去除压迫管腔形状恢复来准确定位拟穿刺的血管外膜位置；根据血管内超声的定位用止血钳和眼科镊小心分离出斑块表面的筋膜，用胰岛素针抽取FGF-2，VEGF-A或者二者混合慢病毒各25-50微升，针尖可用持针器弯折45度，由血管外膜进针，行斑块内慢病毒的注射，注射前后血管内超声检查斑块情况，保证斑块内注射的成功。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缝合的具体步骤为：注射完毕在注射点旁缝合髂腰肌一针留线头，斑块注射部位用髂腰肌缝线和距髂动脉分叉的距离共同定位。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述继续高脂喂养的时间为8周。

7.一种新西兰大白兔腹主动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模用工具包，其特征在于，包括：血管内超声波诊断仪、FGF-2和/或VEGF-A慢病毒。

8.如权利要求7所述的工具包，其特征在于，还包括：IVUS导管探头，MUD驱动马达、球囊、导丝、止血钳、持针器、眼科镊、剪刀、皮针、圆针、3号手术缝线、注射器、10ml注射器、头皮针、异戊巴比妥钠、利多卡因、肝素、青霉素、生理盐水。

9.一种动脉粥样硬化斑块内新生血管的造模用工具包，其特征在于，包括：血管内超声波诊断仪、FGF-2和/或VEGF-A慢病毒。

10.如权利要求9所述的工具包，其特征在于，还包括：IVUS导管探头，MUD驱动马达、球囊、导丝、止血钳、持针器、眼科镊、剪刀、皮针、圆针、3号手术缝线、注射器、10ml注射器、头皮针、异戊巴比妥钠、利多卡因、肝素、青霉素、生理盐水。