CN107970226A - 一种纳米载体药物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种纳米载体药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种纳米载体药物及其制备方法和应用，所述纳米载体药物以聚乳酸‑羟基乙酸为载体，负载有NVP‑BEZ235和以二氢卟吩E6，并且以卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇对载体表面进行PEG化。本发明通过聚乳酸‑羟基乙酸作为载体，以二氢卟吩E6与NVP‑BEZ235结合作为治疗剂，可以实现光动力治疗与生物治疗的结合，协同作用来提高对于肿瘤细胞的杀伤作用。以卵磷脂和DSPE‑PEG对纳米颗粒表面进行PEG化，可延长血液循环时间，减少网状内皮组织的清除，进一步保证其治疗的效果，使得肿瘤治疗尤其是三阴性乳腺癌的治疗效果显著，具有广阔的应用前景。

Description

一种纳米载体药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米药物领域，涉及一种纳米载体药物及其制备方法和应用。
背景技术
三阴性乳腺癌(TNBC)因其极低的存活率，已严重威胁世界各地女性的身心健康。相比于其他类型的乳腺癌，TNBC因缺少独特的表面受体(ER-/PR-/HER2-)而难以实现分子靶向治疗，加之高转移率和晚期患者预后不良等疾病，使其治疗更具挑战性。如何有效治疗TNBC一直是肿瘤治疗中最活跃的研究领域，但仍有诸多障碍需要克服。到目前为止，仍无有效的药物经美国食品和药物管理局(FDA)批准用以TNBC的治疗。对TNBC进行创新有效的综合治疗迫在眉睫。靶向和抑制多种肿瘤生长的途径在提高治疗效果和降低药物毒性方面较单一疗法具有很大的优势。
磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)通路在TNBC中的突变明显高于其他类型乳腺癌。其通过一系列脂质和丝氨酸/苏氨酸激酶作用在增殖、凋亡、蛋白质翻译、DNA修复、生存和转型方面，从而刺激癌细胞增殖、生长和存活。NVP-BEZ235是一种PI3K和mTOR激酶的竞争抑制剂，其通过绑定ATP，崩裂抑制PI3K和mTOR激酶的活性，诱导肿瘤细胞发生I型(凋亡)和II型(自噬)程序化死亡，已进入临床I/II期研究试验。
光动力治疗(PDT)是一种有效且无侵性的肿瘤治疗策略，即利用光源触发位于肿瘤部位的光敏剂产生高毒性的活性氧自由基(ROS)，从而破坏肿瘤血管，导致肿瘤细胞的不可逆损伤。
因此，如何将光动力治疗与药物治疗结合来到达更好的三阴性乳腺癌治疗效果是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种纳米载体药物及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种纳米载体药物，所述纳米载体药物以聚乳酸-羟基乙酸为载体(PLGA)，负载有NVP-BEZ235和二氢卟吩E6(Ce6)，并且以卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)对载体表面进行PEG化。
在本发明中，所述纳米载体药物通过聚乳酸-羟基乙酸作为载体，以二氢卟吩E6与NVP-BEZ235结合作为治疗剂，可以实现光动力治疗与生物制剂治疗的结合，协同作用来提高对于肿瘤细胞的杀伤作用。以卵磷脂和DSPE-PEG对纳米颗粒表面进行PEG化，可延长血液循环时间，减少网状内皮组织(RES)的清除，进一步保证其治疗的效果。
优选地，所述纳米载体药物的平均粒径为80～130nm，例如80nm、85nm、88nm、90nm、95nm、98nm、100nm、110nm、120nm、125nm或130nm。
本发明所述纳米载体药物呈类球形，粒径分布均一。
优选地，所述纳米载体药物中NVP-BEZ235的载药率为0.05～0.07％，例如0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％等。
优选地，所述纳米载体药物中二氢卟吩E6的载药率为0.38～0.42％，例如0.38％、0.39％、0.40％、0.41％或0.42％。
另一方面，本发明提供一种如上所述的纳米载体药物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将NVP-BEZ235和二氢卟吩E6溶于有机溶剂中，得到药物溶液；
(2)将聚乳酸-羟基乙酸溶于有机溶剂中，得到载体溶液；
(3)将步骤(1)得到的药物溶液与步骤(2)得到的载体溶液混合，超声，形成油相溶液；
(4)将卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇溶于水中，得到水相溶液；
(5)将步骤(3)得到的油相溶液加入至步骤(4)得到的水相溶液中，搅拌，而后渗析除去有机溶剂，得到所述纳米载体药物的水体系。
本发明通过纳米沉淀法制得所述纳米载体药物，粒径均一，分散性好。
优选地，步骤(1)所述有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)和/或丙酮；
优选地，步骤(1)所述药物溶液中NVP-BEZ235的浓度为1～3mg/mL，例如1mg/mL、1.3mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL、2.2mg/mL、2.4mg/mL、2.6mg/mL、2.8mg/mL或3mg/mL。
优选地，步骤(1)所述药物溶液中二氢卟吩E6的浓度为0.5～2mg/mL，例如0.5mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.3mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL或2mg/mL。
优选地，步骤(2)所述有机溶剂为乙腈、丙酮或四氢呋喃中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(2)所述载体溶液的浓度为20～40mg/mL，例如20mg/mL、22mg/mL、25mg/mL、28mg/mL、30mg/mL、32mg/mL、34mg/mL、36mg/mL、38mg/mL或40mg/mL。
优选地，步骤(3)所述步骤(1)得到的药物溶液与步骤(2)得到的载体溶液混合的体积比为1:1～1:3，例如1:1、1:1.3、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.5、1:2.8或1:3。
优选地，步骤(4)所述水相溶液中卵磷脂的浓度为0.5～1.5mg/mL，例如0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL或1.5mg/mL。
优选地，步骤(4)所述水相溶液中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的浓度为0.5～1.5mg/mL；
优选地，步骤(5)利用注射泵将步骤(3)得到的油相溶液一次性加入至步骤(4)得到的水相溶液中。
优选地，步骤(5)所述搅拌在室温下进行；
优选地，步骤(5)所述搅拌的时间为1-5小时，例如1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时或5小时。
优选地，步骤(5)所述透析利用截留分子量为8000-14000(例如8000、9000、10000、11000、12000、13000或14000)的透析袋进行。
优选地，步骤(5)所述透析的时间为1-3天(例如1天、1.5天、2天、2.5天或3天等)，每4-6小时(例如4小时、4.5小时、5小时、5.5小时或6小时)更换透析液。
优选地，所述透析液为去离子水。
优选地，步骤(5)得到纳米载体药物的水体系后，经过离心纯化，而后纳米载体药物颗粒，而后将所述纳米载体药物颗粒重悬在去离子水中得到纳米载体药物的重悬液。
优选地，所述离心纯化时的离心转速为5000-10000rpm，例如5000rpm、5500rpm、6000rpm、6500rpm、7000rpm、7500rpm、8000rpm、8500rpm、9000rpm、9500rpm或10000rpm。
优选地，所述离心纯化的时间为5-15min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min。
优选地，所述离心纯化利用离心过滤装置进行，所述离心过滤装置的过滤管截留分子量为30000。
通过本发明的方法，在将步骤(3)得到的油相溶液加入至步骤(4)得到的水相溶液中后，在自组装动力驱动下，载体材料PLGA将药物NVP-BEZ235和二氢卟吩E6包载于其疏水内核中，并且在该过程中卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇对载体颗粒表面进行改性，表面PEG化，延长血液循环时间，减少网状内皮组织(RES)的清除，更有效地发挥其治疗作用。
另一方面，本发明提供了如上所述的纳米载体药物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为三阴性乳腺癌。
在三阴性乳腺癌的治疗中，二氢卟吩E6(Ce6)与肿瘤有很高的亲和力且很容易从正常组织中逃逸，在特定激光照射下，Ce6能产生足量的单线态氧(1O2)促使肿瘤细胞凋亡。NVP-BEZ235是一种PI3K和mTOR激酶的竞争抑制剂，其通过绑定ATP，崩裂抑制PI3K和mTOR激酶的活性，诱导肿瘤细胞发生I型(凋亡)和II型(自噬)程序化死亡，本发明纳米载体药物将二者结合以协同作用治疗三阴性乳腺癌。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过聚乳酸-羟基乙酸作为载体，以二氢卟吩E6与NVP-BEZ235结合作为治疗剂，可以实现光动力治疗与药物治疗的结合，协同作用来提高对于肿瘤细胞的杀伤作用。以卵磷脂和DSPE-PEG对纳米颗粒表面进行PEG化，可延长血液循环时间，减少网状内皮组织(RES)的清除，进一步保证其治疗的效果，使得肿瘤治疗尤其是三阴性乳腺癌的治疗效果显著，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1A为实施例1制备得到的纳米载体药物的水合粒径表征结果图；
图1B为实施例1制备得到的纳米载体药物的透射电镜图，其标尺为200nm；
图2A为NVP-DEZ235和Ce6孵育MDA-MB-231细胞株24小时后的细胞存活率结果图；
图2B为NVP-DEZ235和Ce6对MDA-MB-231细胞株孵育48小时后的细胞存活率结果图；
图3A为实施例8中不同实验条件处理期间小鼠的体重变化曲线；
图3B为实施例8中不同实验条件处理后从小鼠体内得到的肿瘤；
图3C为实施例8中利用NPs@NVP-Ce6在非光照和光照条件下对MDA-MB-231细胞小鼠治疗结束后的两天(未用NPs@NVP-Ce6处理的细胞作为对照，同样分为光照组和非光照组)的细胞肿瘤切片的共聚焦检测结果图，其中a图为非光照对照组，b图为光照对照组，c图为NPs@NVP-Ce6非光照组，d图为NPs@NVP-Ce6光照组，a图、b图、c图和d图的标尺均为50μm；
图4为对照组(光照和非光照)以及NPs@NVP-Ce6非光照组和NPs@NVP-Ce6光照组对MDA-MB-231细胞孵育48小时后的流式细胞检测结果图；
图5为MDA-MB-231细胞经NPs@NVP-Ce6处理并激光照射后继续孵育24小时和48小时的免疫印迹检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，所述纳米载体药物以聚乳酸-羟基乙酸为载体(PLGA)，负载有NVP-BEZ235和二氢卟吩E6(Ce6)，并且以卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)对载体表面进行PEG化。
制备方法如下：
(1)将0.5mg NVP-BEZ235和0.2mg Ce6溶于300μL DMSO中，得到药物溶液；
(2)将15mg聚乳酸-羟基乙酸溶于700μL乙腈中，得到载体溶液；
(3)将步骤(1)得到的药物溶液与步骤(2)得到的载体溶液混合，超声2min，形成油相溶液；
(4)将3mg卵磷脂和3mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇溶于5mL去离子水中，得到水相溶液；
(5)将步骤(3)得到的油相溶液一次性加入至步骤(4)得到的水相溶液中，室温避光搅拌1小时；
采用渗析除去有机溶剂。透析袋的截留分子量为8000，透析时间为1.5天，每6小时更换一次透析液。利用离心过滤装置(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)将所得的纳米颗粒进一步纯化。速率设置为8000rpm，时间为10min，过滤管截留分子量为30000。最后将纯化所得纳米粒子重分散在去离子水中得到所述纳米载体药物的水体系。
利用马尔文纳米粒度仪(Malvern Instruments，U.K)对本实施例制备得到的纳米载体药物水体系进行检测，纳米颗粒在去离子水中稀释到适当的浓度后用动态光散射进行测定，结果如图1A所示，并且利用透射电镜(HT7700,Hitachi,Japan)对表面形貌进行表征，结果如图1B所示。
由图1A的结果可以得知，NPs@NVP-Ce6的平均粒径为113.6±2.14nm，分布均一且外观呈球形。由图1B的结果可以得知，由TEM可观测到纳米颗粒呈现均一分布的球状，平均粒径为100nm。与水合粒径相比，由TEM观察所得纳米粒子尺寸较小，这可能是由于纳米颗粒在铜网上干燥收缩所致。
实施例2
在本实施例中，所述纳米载体药物以聚乳酸-羟基乙酸为载体(PLGA)，负载有NVP-BEZ235和二氢卟吩E6(Ce6)，并且以卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)对载体表面进行PEG化。
制备方法如下：
(1)将0.75mg NVP-BEZ235和0.5mg Ce6溶于300μL DMSO中，得到药物溶液；
(2)将20mg聚乳酸-羟基乙酸溶于700μL乙腈中，得到载体溶液；
(3)将步骤(1)得到的药物溶液与步骤(2)得到的载体溶液混合，超声4min，形成油相溶液；
(4)将5mg卵磷脂和5mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇溶于5mL去离子水中，得到水相溶液；
(5)将步骤(3)得到的油相溶液一次性加入至步骤(4)得到的水相溶液中，室温避光搅拌3小时。
采用渗析除去有机溶剂。透析袋的截留分子量为8000，透析时间为2天，每5小时更换一次透析液。利用离心过滤装置(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)将所得的纳米颗粒进一步纯化。速率设置为8000rpm，时间为10min，过滤管截留分子量为30000。最后将纯化所得纳米粒子重分散在去离子水中得到所述纳米载体药物的水体系。
实施例3
在本实施例中，所述纳米载体药物以聚乳酸-羟基乙酸为载体(PLGA)，负载有NVP-BEZ235和二氢卟吩E6(Ce6)，并且以卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)对载体表面进行PEG化。
制备方法如下：
(1)将1.2mg NVP-BEZ235和0.6mg Ce6溶于300μL DMSO中，得到药物溶液；
(2)将25mg聚乳酸-羟基乙酸溶于700μL乙腈中，得到载体溶液；
(3)将步骤(1)得到的药物溶液与步骤(2)得到的载体溶液混合，超声6min，形成油相溶液；
(4)将7.5mg卵磷脂和7.5mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇溶于5mL去离子水中，得到水相溶液；
(5)将步骤(3)得到的油相溶液一次性加入至步骤(4)得到的水相溶液中，室温搅拌5小时。
采用渗析除去有机溶剂。透析袋的截留分子量为8000，透析时间为3天，每4小时更换一次透析液。利用离心过滤装置(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)将所得的纳米颗粒进一步纯化。速率设置为8000rpm，时间为10min，过滤管截留分子量为30000。最后将纯化所得纳米粒子重分散在去离子水中得到所述纳米载体药物的水体系。
实施例4
在本实施例中，所述纳米载体药物以聚乳酸-羟基乙酸为载体(PLGA)，负载有NVP-BEZ235和二氢卟吩E6(Ce6)，并且以卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)对载体表面进行PEG化。
制备方法如下：
(1)将1mg NVP-BEZ235和0.5mg Ce6溶于400μL丙酮中，得到药物溶液；
(2)将24mg聚乳酸-羟基乙酸溶于600μL乙腈中，得到载体溶液；
(3)将步骤(1)得到的药物溶液与步骤(2)得到的载体溶液混合，超声6min，形成油相溶液；
(4)将6mg卵磷脂和6mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇溶于5mL去离子水中，得到水相溶液；
(5)将步骤(3)得到的油相溶液一次性加入至步骤(4)得到的水相溶液中，室温搅拌5小时。
采用渗析除去有机溶剂。透析袋的截留分子量为8000，透析时间为3天，每4小时更换一次透析液。利用离心过滤装置(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)将所得的纳米颗粒进一步纯化。速率设置为8000rpm，时间为10min，过滤管截留分子量为30000。最后将纯化所得纳米粒子重分散在去离子水中得到所述纳米载体药物的水体系。
对比例1
与实施例1不同之处仅在于，本对比例的纳米载体药物仅负载了二氢卟吩E6，而并没有负载NVP-BEZ235，即在制备方法中步骤(1)仅将二氢卟吩E6溶于DMSO中，得到药物溶液，其余均与实施例1相同，得到的纳米载体药物记为NPs@Ce6。
对比例2
与实施例1不同之处仅在于，本对比例的纳米载体药物仅负载了NVP-BEZ235，而并没有负载二氢卟吩E6(Ce6)，即在制备方法中步骤(1)仅将NVP-BEZ235溶于DMSO中，得到药物溶液，其余均与实施例1相同，得到的纳米载体药物记为NPs@NVP。
实施例5
在本实施例中对实施例1以及对比例1-2制备的纳米载体药物中Ce6和NVP-BEZ235体外释放进行检测，测试方法如下：
利用透析法对体外药物释放进行测定。向透析袋(截留分子量8000-14000)中加入1mL纳米粒子分散液，然后将该透析袋浸没在40mL pH为7.4、含有质量分数为0.5％吐温20的PBS释放液中，温度为37℃，摇晃速度为100rpm。在特定的时间点，每次从释放液中取出200μL并补充相同的释放液。取出的样品利用紫外分析仪和荧光分光仪对Ce6和NVP-BEZ235的释放进行测定。
实施例6
在本实施例中，对实施例1以及对比例1-2制备的纳米载体药物的NVP-DEZ235和Ce6的IC50进行检测，以确定两种药物的最佳使用量，方法如下：
(1)NVP-DEZ235的IC50的检测
MDA-MB-231细胞株经浓度为2.5-75μg/mL的NVP-DEZ235处理24小时和48小时，细胞毒性用CCK8来检测。
(2)Ce6的IC50检测
MDA-MB-231细胞株经浓度为2.5-75μg/mL的Ce6孵育4小时后，PBS清洗，加入无药物的培养基，在660nm激光下照射(10mW/cm2，10min)，继续孵育24小时和48小时后，用CCK8对细胞毒性进行检测。
24小时测试的结果如图2A所示，48小时测试的结果如图2B所示，从图2A和图2B可以得出，NVP-DEZ235的IC50为75μg/mL，Ce6的IC50为25μg/mL，由此说明了剂量依赖的细胞活力的下降。
实施例7
在本实施例中，考察纳米载体药物对于TNBC体外光动力/生物化疗的联合治疗，方法如下：
37℃下，MDA-MB-231细胞株经实施例1制备得到的纳米载体药物(记为NPs@NVP-Ce6)对比例1制备的纳米载体药物(记为NPs@Ce6)，和对比例2制备的纳米载体药物(记为NPs@NVP)避光处理4小时，其中Ce6和NVP-BEZ235浓度分别为25和75μg/mL。PBS洗3次，加入培养基后在660nm激光下照射(10mW/cm2，10min)。继续孵育24小时和48小时后，用CCK8对细胞毒性进行检测，没有处理的细胞作为对照。
光动力/化疗的联合治疗机理的研究
在进行光动力/化疗的联合治疗机理的研究中，MDA-MB-231细胞株经NPs@NVP-Ce6处理4小时，PBS洗，加入培养基后在660nm激光下照射(10mW/cm2，10min)，继续在37℃下孵育4小时。在进行共聚焦检测之前，分别用LysoTracker(green)和Hoechst 33342(blue)对细胞溶酶体和细胞核进行染色。
实施例8
在本实施例中，对实施例1制备得到的纳米载体药物在体内移植瘤模型中的抗肿瘤效果进行考察，方法如下：
NPs@NVP-Ce6的抗肿瘤效果在三阴性乳腺癌皮下移植瘤模型中进一步得到验证。其中利用MDA-MB-231细胞在NOD SCID小鼠上建立模型。通过尾静脉每两天治疗一次，共7次，小鼠重量、肿瘤体积和组织病理学特征同样得到记录测定。
如图3A所示，实验组(即NPs@NVP Ce6(L-)、NPs@NVP Ce6(L+)、NPs@Ce6(L-)、NPs@Ce6(L+)、NPs@NVP(L-)和NPs@NVP(L+))与对照组(Control(L-)和Control(L+))的小鼠体重均没有明显的变化，表明材料无明显毒性(其中(L-)表示非光照组，(L+)表示光照组)。图3B中对照组和NPs@Ce6非光照组(即NPs@NVP Laser(-))的肿瘤大小显著增加，在NPs@NVP光照组(即NPs@NVP Laser(+))、NPs@NVP无光照组(NPs@NVP Laser(-))、NPs@Ce6光照组(即NPs@Ce6Laser(+))中和NPs@NVP-Ce6非光照组(NPs@NVP Ce6 Laser(-))中，肿瘤的生长得到较好的抑制，在NPs@NVP-Ce6光照组(NPs@NVP Ce6 Laser(+))中，肿瘤的生长得到极好的抑制。图3C中，经对照组(光照和无光照)处理后肿瘤组织呈现出多形性、大水泡核、大量有丝分裂和较少的细胞间物质。与NPs@NVP-Ce6非光照组相比，NPs@NVP-Ce6光照组的肿瘤组织呈现出严重的弥散性坏死和凋亡以及更大的细胞间间隙。
实施例9
在本实施例中对纳米载体药物(即以上实施例1-4制备得到的纳米载体药物记为NPs@NVP-Ce6)中NVP-BEZ235和Ce6的协同治疗进行验证并利用流式细胞仪和免疫印迹对体外光动力/生物化疗的协同治疗进行研究。
细胞培养
将MDA-MB-231细胞接种到6孔板中，每孔细胞密度为1.0×105，孵育24h后，用NPs@Ce6，NPs@NVP和NPs@NVP-Ce6替代培养基，于37℃下避光孵育4h，未经处理的细胞作为对照。经PDT处理后的细胞于37℃下避光孵育24h或48h，收集的细胞用冰PBS(pH 7.4)清洗两次，随后从悬于1x Binding buffer中。室温中将细胞同膜联蛋白-V-FITC/碘化丙啶避光共孵育15min，轻微涡旋振荡后，相同条件下继续孵育15min。最后向每管中加入400μL 1 xBinding Buffer，采用流式细胞仪(Applied Biosystems,Life Technologies,Carlsbad,CA)进行测定。
如图4所示，经过24和48h的孵育，NPs@NVP光照组中凋亡细胞的百分比较低(分别为5.6％和6.4％)，这表明体外实验中，抑制增殖而非诱导凋亡引起肿瘤细胞的显著减少。NPs@Ce6光照组中凋亡细胞的百分比分别为19.3％和23.4％，NPs@NVP-ce6光照组中凋亡细胞所占百分比分别为30.2％和50.4％。这说明，经NPs@NVP-Ce6和光照处理的细胞中，约50％的细胞凋亡由Ce6引起，而另外50％则由NVP-BZE235和Ce6协同完成。
图5为MDA-MB-231细胞经NPs@NVP-Ce6处理并激光照射后继续孵育24小时和48小时的免疫印迹检测结果图(其中control为对照组，NPs@NVP-Ce6(即NPs@NVP BEZ235-Ce6)实验组24小时和48小时的的免疫印迹检测结果如图5所示)。此结果说明24小时后，Ce6促进p53和Caspase3的过表达，致使细胞凋亡，这与流式细胞仪中的检测结果相一致。在相同的孵育时间下，NVP-BEZ235致使PI3K/AKT/mTOR表达减少。在24小时后，NVP-BEZ235下调MDM2蛋白，令肿瘤细胞对Ce6更加敏感。24小时后细胞活力的下降可归因于Ce6引起的对NVP-BEZ235敏感细胞的凋亡。48小时后，NVP-BEZ235明显抑制P-mTOR，PI3K，P-AKT和P-S6蛋白的表达，从而降低细胞活力和其复制能力。在48小时后，NVP-BEZ235同时增加了LC3蛋白的表达，这是一种自噬诱导的指标。
本发明通过上述实施例来说明本发明的纳米载体药物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米载体药物，其特征在于，所述纳米载体药物以聚乳酸-羟基乙酸为载体，负载有NVP-BEZ235和二氢卟吩E6，并且以卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇对载体表面进行PEG化。
2.根据权利要求1所述的纳米载体药物，其特征在于，所述纳米载体药物的平均粒径为80～130nm。
3.根据权利要求1或2所述的纳米载体药物，其特征在于，所述纳米载体药物中NVP-BEZ235的载药率为0.05～0.07％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米载体药物，其特征在于，所述纳米载体药物中二氢卟吩E6的载药率为0.38～0.42％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的纳米载体药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将NVP-BEZ235和二氢卟吩E6溶于有机溶剂中，得到药物溶液；
(2)将聚乳酸-羟基乙酸溶于有机溶剂中，得到载体溶液；
(3)将步骤(1)得到的药物溶液与步骤(2)得到的载体溶液混合，超声，形成油相溶液；
(4)将卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇溶于水中，得到水相溶液；
(5)将步骤(3)得到的油相溶液加入至步骤(4)得到的水相溶液中，搅拌，而后渗析除去有机溶剂，得到所述纳米载体药物的水体系。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述有机溶剂为二甲基亚砜和/或丙酮；
优选地，步骤(1)所述药物溶液中NVP-BEZ235的浓度为1～4mg/mL；
优选地，步骤(1)所述药物溶液中二氢卟吩E6的浓度为0.5～2mg/mL。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述有机溶剂为乙腈、丙酮或四氢呋喃中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(2)所述载体溶液的浓度为20～40mg/mL。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述步骤(1)得到的药物溶液与步骤(2)得到的载体溶液混合的体积比为1:1～1:3；
优选的，步骤(4)所述水相溶液中卵磷脂的浓度为0.5～1.5mg/ml；
优选地，步骤(4)所述水相溶液中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的浓度为0.5～1.5mg/ml。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)利用注射泵将步骤(3)得到的油相溶液一次性加入至步骤(4)得到的水相溶液中；
优选地，步骤(5)所述搅拌在室温下进行；
优选地，步骤(5)所述搅拌的时间为1-5小时；
优选地，步骤(5)所述透析利用截留分子量为8000-14000的透析袋进行；
优选地，步骤(5)所述透析的时间为1-3天，每4-6小时更换透析液；
优选地，所述透析液为去离子水；
优选地，步骤(5)得到纳米载体药物的水体系后，经过离心纯化，而后纳米载体药物颗粒，而后将所述纳米载体药物颗粒重悬在去离子水中得到纳米载体药物的重悬液；
优选地，所述离心纯化时的离心转速为5000-10000rpm；
优选地，所述离心纯化的时间为5-15min；
优选地，所述离心纯化利用离心过滤装置进行，所述离心过滤装置的过滤管截留分子量为30000。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的纳米载体药物在制备治疗肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤为三阴性乳腺癌。
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