CN107955062B

CN107955062B - 一种合成多肽及其合成方法和应用

Info

Publication number: CN107955062B
Application number: CN201711441206.8A
Authority: CN
Inventors: 梁明; 尹西拳; 马忠华; 任娇艳
Original assignee: Infinitus China Co Ltd
Current assignee: Infinitus China Co Ltd
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN107955062A

Abstract

本发明涉及多肽技术领域，公开了一种合成多肽及其合成方法和应用。本发明所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；或在SEQ ID NO：1所示序列上经过取代、缺失或添加一个或两个以上氨基酸并具备抗UV损伤活性的多肽。本发明提供了一种新型的活性七肽，其孵育后的皮肤细胞在高剂量紫外UVA照射损伤下的存活率提高了20%，细胞周期G2期升高，呈现出旺盛的生长、增殖状态。本发明的合成多肽可用于各种美容护肤产品及医用产品，减少紫外线对人体组织的危害，起到保护皮肤、延缓衰老的作用。

Description

一种合成多肽及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及多肽技术领域，特别涉及一种合成多肽及其合成方法和应用。

背景技术

研究表明皮肤衰老的元凶并不是自然老化，更多的是由于光老化引起的。光老化是由于皮肤长期受到日光照射所引起的损害，表现为皮肤粗糙、增厚、松弛、深而粗的皱纹，局部有过度的色素沉着或毛细血管扩张，甚至可能出现各种良性或恶性肿瘤（如日光角化病、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤等）。日光中，紫外线的分类有 UVA、UVB、UVC。其中UVC因为波长较短，在大气中就已经被臭氧层给吸收、散射，无法到达地面。UVB的波长居三者之中，波长仅能达到肌肤的表皮。而波长较长的UVA，波长320～420nm，又称为长波黑斑效应紫外线，超过98%能穿透臭氧层和云层到达地球表面，会深入肌肤的深层，伤害肌肤的真皮层，破坏弹性纤维和胶原蛋白纤维而造成皮肤晒黑、肌肤老化。因此，长波紫外线UVA在皮肤光老化过程中起着主要作用。

目前，女性的护肤品和防晒霜产品研究多围绕抑制UVA损伤进行活性物质研究。物理防晒的有效成分只有两种，Zinc Oxide (氧化锌)和Titanium Dioxide (二氧化钛)，Zinc Oxide是一种非常好的防晒成分，其物理性粉体能反射散射紫外线UVA、UVB，安全度高，超过5%的高浓度时起效。化学防晒主要有：Avobenzone、Mexoryl SX、Octocrylene和Ensulizole等。

肽是构成蛋白质的结构和功能片段，大量的研究业已表明，具有多种生物学功能的肽已成为世界范围内研究的热点。活性肽具有主动吸收、吸收速度快、吸收完整等优点，并且它的生理功能优于氨基酸和蛋白质。化学合成的活性肽在皮肤光老化中的作用极少有报道，并且其具体的作用机理尚需要进一步研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成多肽及其合成方法，使得所述多肽具有显著抗UV损伤活性；

本发明的另外一个目的在于提供编码上述合成多肽的基因；

本发明的另外一个目的在于提供上述合成多肽在制备抗UV损伤的产品和/或预防皮肤老化的产品中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种合成多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；或在SEQ ID NO：1所示序列上经过取代、缺失或添加一个或两个以上氨基酸并具备抗UV损伤活性的多肽。

其中，SEQ ID NO：1所示氨基酸序列肽序如下：

NH₂-Thr¹-Gly²-Val³-Leu⁴-Thr⁵-Val⁶-Met⁷-COOH

Thr为苏氨酸，Gly为甘氨酸，Val为缬氨酸，Leu为亮氨酸，Met为甲硫氨酸。

本发明合成多肽在UV损伤Hacat（人永生化表皮细胞）细胞模型上验证了其在0.05-0.5mM下对受UV照射损伤皮肤的保护作用。多肽孵育后皮肤细胞在高剂量紫外UVA照射损伤下的存活率提高了20%，细胞周期G2期升高，呈现出旺盛的生长、增殖状态。

基于上述优异的试验结果，本发明提出了所述合成多肽在制备抗UV损伤的医用产品和/或预防皮肤老化的美容护肤品中的应用。除通过合成方法获得所述合成多肽，本发明还可以通过成熟的基因工程技术获得，例如编码基因接入到载体中并转入到大肠杆菌中进行表达，然后对目标多肽进行分离纯化，因此本发明还提出了编码所述合成多肽的基因。

在所述应用中，所述预防皮肤老化的美容护肤品为乳剂、霜剂、精华液或面膜；所述抗UV损伤的医用产品为凝胶、敷料、冻干粉、膏剂、颗粒剂、丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液或糖浆剂。

根据所述应用，一种抗UV损伤的医用产品，包括本发明所述合成多肽和医药上可接受的辅料。作为优选，该医用产品的剂型或产品形式为凝胶、敷料、冻干粉、膏剂、颗粒剂、丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液或糖浆剂。但医用产品的剂型并非限定于此，本领域技术人员认为可行的剂型或产品形式均在本发明的保护范围之内。

本发明同时也提供了一种预防皮肤老化的美容护肤品，包括本发明所述合成多肽和美容产品可接受的辅料，作为优选，该美容护肤品的产品形式为乳剂、霜剂、精华液或面膜。但美容护肤品的产品形式并非限定于此，本领域技术人员认为可行的产品形式均在本发明的保护范围之内。

此外，本发明还提供了所述合成多肽的合成方法，按照所述合成多肽C端到N端的氨基酸顺序进行逐一的固相合成。

在本发明具体实施方式中，按照SEQ ID NO：1所示序列C端到N端的氨基酸顺序，将保护氨基酸原料和树脂进行逐一偶联，然后裂解液脱除树脂和保护氨基酸侧链保护基，获得粗品，粗品纯化后获得所述合成多肽。

作为优选，所述保护氨基酸N端采用Fmoc保护；更为具体地，各保护氨基酸为Fmoc-Thr (tbu) -OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr (tbu) -OH、Fmoc-Met-OH。

作为优选，所述树脂为2-氯三苯基氯树脂。

保护氨基酸和树脂进行逐一偶联可采用固相合成领域常规的偶联试剂和活化试剂，在本发明具体实施方式中，采用DIEA完成第一个保护氨基酸和树脂的偶联，采用HBTU及DIEA进行余下保护氨基酸之间的偶联。

在本发明具体实施方式中，通过体积百分比95%TFA，2%乙二硫醇，2%三异丙基硅烷，1%水组成的裂解液，将肽链从树脂上切割下来以及脱去保护氨基酸侧链保护基。在以Fmoc为N端保护基合成过程中，每步缩合需采用20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，处理20min，去除Fmoc保护基，然后进行氨基酸之间的偶联。

由以上技术方案可知，本发明提供了一种新型的活性七肽Thr-Gly-Val-Leu-Thr-Val-Met，其孵育后的皮肤细胞在高剂量紫外UVA照射损伤下的存活率提高了20%，细胞周期G2期升高，呈现出旺盛的生长、增值状态。本发明的合成多肽可用于各种美容护肤产品及医用产品，减少紫外线对人体组织的危害，起到保护皮肤、延缓衰老的作用。

附图说明

图1所示为MTT法评估所述合成多肽对UV造模细胞的存活率影响柱形图；*表示0.05mM和0.5mM的合成多肽组（即给药组，含TGVLTVM肽）相对于模型组能够显著提高造模细胞存活率（p<0.05）；

图2所示为流式细胞仪检测门细胞百分数以及细胞内活性氧含量（%）；*表示合成多肽组（即给药组，含TGVLTVM肽）相对于造模组能够显著提高细胞内活性氧含量（p<0.05）；***表示合成多肽组（即给药组，含TGVLTVM肽）相对于造模组能够显著降低门细胞百分数（p<0.001）。

具体实施方式

本发明公开了一种合成多肽及其合成方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述合成多肽及其合成方法和应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的合成多肽及其合成方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种合成多肽及其合成方法和应用做进一步说明。

实施例1：固相合成所述合成多肽

称取n当量2-氯三苯基氯树脂加入反应器，加入DCM（二氯甲烷）溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入合成多肽序列C端到N端中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的DIEA，适量的DMF、DCM溶剂，氮气鼓泡反应60min。然后加入5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、MEOH洗净。往反应器中加入序列C端到N端中余下氨基酸，按氨基酸序列Thr-Gly-Val-Leu-Thr-Val-Met的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，2n当量HBTU及DIEA，N₂鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除Fmoc（9-芴甲氧羰基）保护基，洗净，茚三酮检测。将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量的切割液（95%TFA，2%乙二硫醇，2%三异丙基硅烷，1%水），震荡，滤掉树脂。往滤液中加入大量乙醚。析出粗产物，离心，清洗得序列粗产物。用高效液相色谱提纯粗产物，冻干为白色粉末。纯品经HPLC鉴定浓度为98.66%。（上海强耀生物科技有限公司）

实施例2：对UV造模细胞存活率的MTT试验

1、构造皮肤光老化模型

用含10%胎牛血清, 100 U/mL 青霉素、链霉素的MEM培养基对HaCaT细胞进行传代培养。取对数生长期的HaCaT细胞, 细胞密度为3×10⁴个/mL 接种到96 孔培养板，每孔100μL。待贴壁完全后，设置假照组、模型组（不含肽，UV照射）和给药组（含TGVLTVM肽、UV照射）。其中给药组多肽浓度为0.5mM 和0.05 mM。培养24 h后，吸出含血清的培养液，用D- Hanks液漂洗1 次，每孔加入100 μL 的PBS 接受UVA 照射。UVA 辐射仪光源离培养板的高度为20cm，垂直照射，经辐照度监测仪测UVA 照射剂量为3J/cm²。为避免照射过程中培养基温度升高对细胞可能造成的伤害, 将培养板底部置垫冰袋。照射后立即换新鲜培养基，置培养箱继续孵育16 h 后进行MTT 比色法测定细胞存活率。假照射组用铝箔纸完全遮盖避光。每处理组设5个复孔。

2、MTT法检测

MTT 法检测上述步骤处理后细胞存活率。将96 孔板中接受UVA 照射后的Hacat细胞置于37℃、5%CO₂培养箱中继续培养12 h, 然后向每100μL 培养基中加入5 g/L MTT 10μL，继续孵育4 h后，弃去上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μL，室温下振荡15 min，酶标仪于492 nm 波长处测定各孔吸光度(A)值，按照以下公式计算细胞存活率: 细胞存活率=样品组OD490nm/对照组OD490nm×100%。

3、结果

如图1所示，3J/cm²UV剂量辐照Hacat细胞造模，模型组和给药组（孵育0.5mM、0.05mM TGVLTVM肽）细胞的存活率，MTT检测OD490nm发现，0.5mM肽孵育细胞存活率为125.6%，对比造模细胞存活率提高25.6%。0.05mM肽孵育细胞存活率为124.6%，对比造模细胞存活率提高24.6%。孵育合成多肽的细胞UV辐照后存活率显著性提高。

实施例3：对UV造模细胞的流式细胞试验

用含10%胎牛血清, 100 U/mL 青霉素、链霉素的MEM培养基对HaCaT细胞进行传代培养。取对数生长期的HaCaT细胞, 细胞密度为2.5×10⁵个/mL 接种到6 孔培养板，每孔1mL。待贴壁完全后，设置假照组、造模组（不含肽，UV照射）和给药组（含TGVLTVM肽、UV照射）。选择MTT实验中细胞存活率更高的药物剂量0.5mM 的TGVLTVM肽进行给药。按照实例1中UV造模方法进行实验。立即检测细胞内活性氧（ROS）含量变化。

细胞内ROS含量检测方法：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集细胞后用流式细胞仪488nm激发波长，525nm发射波长检测。

流式细胞仪检测细胞内活性氧含量，结果如图2，3J/cm²UV剂量辐照Hacat细胞造模，试剂盒ROS染色后，流式细胞仪检测假照组细胞、造模组细胞和0.5mM肽孵育后造模细胞的胞内活性氧ROS含量变化。从流式细胞仪检测结果发现：对比空白对照和造模组，造模后细胞内活性氧显著性提高，造成细胞的氧化应激损伤，造模成功。对比造模组（不含肽）和给药组（含TGVLTVM肽）细胞内ROS，发现给药组细胞内活性氧荧光强度X-mean显著性降低，门细胞百分数显著性下降，两方面数据表明给药组hacat细胞内的活性氧含量显著性降低，UV造模造成的氧化应激损伤减弱，UV对细胞的损伤降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 无限极（中国）有限公司

<120> 一种合成多肽及其合成方法和应用

<130> MP1719398

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Gly Val Leu Thr Val Met

1 5

Claims

1.一种合成多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述合成多肽的基因。

3.权利要求1所述合成多肽在制备抗UV损伤的医用产品和/或预防皮肤老化的美容护肤品中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述预防皮肤老化的美容护肤品为乳剂、霜剂、精华液或面膜。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述抗UV损伤的医用产品为凝胶、敷料、冻干粉、膏剂、颗粒剂、丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液或糖浆剂。

6.一种抗UV损伤的医用产品，其特征在于，包括权利要求1所述合成多肽和医药上可接受的辅料。

7.一种预防皮肤老化的美容护肤品，其特征在于，包括权利要求1所述合成多肽和美容产品可接受的辅料。

8.权利要求1所述合成多肽的合成方法，其特征在于，按照所述合成多肽C端到N端的氨基酸顺序进行逐一的固相合成。

9.根据权利要求8所述合成方法，其特征在于，按照SEQ ID NO：1所示序列C端到N端的氨基酸顺序，将保护氨基酸原料和树脂进行逐一偶联，然后裂解液脱除树脂和保护氨基酸侧链保护基，获得粗品，粗品纯化后获得所述合成多肽。

10.根据权利要求9所述合成方法，其特征在于，所述保护氨基酸N端采用Fmoc保护。

11.根据权利要求9所述合成方法，其特征在于，所述树脂为2-氯三苯基氯树脂。