CN107942522A - 用于对物体进行照明和成像的设备、系统与方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种照明系统，所述照明系统包括配置为将成像目标置于其上的表面、光源、分束器，至少还包括第一反射镜。所述分束器配置为将来自所述光源的光束分开，并且所述第一反射镜配置为将来自所述分束器的第一束反射到具有所述成像目标的所述表面上。成像系统包括配置为具有布置于其上的成像目标的成像表面、反射镜和捕获设备。所述捕获设备配置为通过从所述成像目标延伸、反射出所述反射镜并且到达所述捕获设备的发射光的路径捕获所述成像目标的图像。所述反射镜、所述捕获设备或两者均配置为相对于所述成像表面在对角线方向上移动以缩短所述发射光的路径的长度。还公开了用于校准成像系统以消除或减小样本图像内由于成像系统特性引起的非均匀性。

Description

用于对物体进行照明和成像的设备、系统与方法

技术领域

本公开涉及用于对物体进行照明并且获得物体的高分辨率图像的设备、系统与方法。本公开还涉及图像非均匀性校正的方法。

背景技术

需要不依赖于诸如数字放大或使用变焦透镜的方法提供物体的高分辨率图像的成像设备、系统与方法。随着图像被放大，数字放大通常导致图像像素化。在许多情况下难以使用变焦透镜，因为通常难以以稳定的方式满足诸如大孔径、焦距、工作距离、变形、场曲率和信号衰减等各种要求。

还需要能够在不同时使用两个或更多个光源的情况下提供两束或更多束光以对成像目标进行照明的照明设备、系统和方法，特别是在均匀的照明方法中。使用多个光源通常导致不同光功率的光束被施加于成像目标，因为使用两个光源时必须单独进行维护，并且可能在制造或配置在设备或系统内之后具有不同的光学特性。此外，使用多个光源通常导致成像目标的总体照度具有较高的非均匀性，并且照明系统还具有较高的机械复杂性，其继而提高了维护要求并且增加了不均匀照明的可能性。成像期间的另一个常见问题(与成像模式无关)是图像非均匀性。例如，当相同样品置于成像表面或视野的不同位置，即使相同样品发射相同信号，相应图像也会基于位置看起来不均匀。本领域需要解决图像非均匀性。

发明内容

本发明公开了一种照明系统。该照明系统包括表面、光源、分束器、第一反射镜和第二反射镜。表面配置为具有布置于其上的成像目标。光源配置为射出一束光。分束器配置为将来自光源的光束分离为第一光束和第二光束。第一反射镜配置为反射第一光束以提供对表面进行照明的反射的第一光束。第二反射镜配置为反射第二光束以提供对表面进行照明的反射的第二光束。

在另一个实施例中，照明系统包括表面、光源、分束器和第一反射镜。表面配置为具有布置于其上的成像目标。光源配置为射出一束光。分束器配置为将来自光源 的光束分离为第一光束和第二光束。第二光束对表面进行照明。第一反射镜配置为反射来自分束器的第一光束以提供对表面进行照明的反射的第一光束。

还公开了一种照明方法。该方法包括提供具有布置于其上的成像目标的表面。该方法还包括通过光源提供一束光。该方法还包括将该束光分离为第一光束和第二光束。该方法还包括对表面进行照明。照明包括：(i)使用第一反射镜反射第一光束以产生对表面进行照明的反射的第一光束，以及(ii)使用第二反射镜反射第二光束以产生对表面进行照明的反射的第二光束。

在另一个实施例中，照明方法包括通过光源提供一束光。该方法还包括将该束光分离为第一光束和第二光束。该方法还包括对置于其上的成像目标的表面进行照明。照明包括使用第一反射镜反射第一光束以产生对表面进行照明的反射的第一光束。从该束光中分出第二光束，使得该第二光束对表面进行照明。

还公开了一种成像系统。该成像系统包括成像表面、反射镜和捕获设备。成像表面配置为置于其上的成像目标。捕获设备配置为通过从成像目标延伸、反射出反射镜并且到达捕获设备的发射光的路径捕获成像目标的图像。反射镜、捕获设备或两者配置为相对于成像表面在对角线方向上移动以缩短发射光的路径的长度。

在另一个实施例中，成像系统包括成像表面、反射镜、反射镜轴、捕获设备、捕获设备轴和传动块。成像表面配置为置于其上的成像目标。反射镜配置为沿反射镜轴在第一对角线方向上移动。捕获设备配置为通过从成像目标延伸、反射出反射镜并且到达捕获设备的发射光的路径捕获成像目标的图像。捕获设备配置为沿捕获设备轴在第二对角线方向上移动。传动块传递反射镜和捕获设备之间的运动，从而使反射镜和捕获设备同时移动。

还公开了一种成像方法。该方法包括将成像目标置于成像表面上。该方法还包括使捕获设备、反射镜或两者均相对于成像表面在对角线方向上移动。该方法还包括使用捕获设备通过从成像目标延伸、反射出反射镜并且到达捕获设备的发射光的路径捕获成像目标的图像。

还公开了一种照明与成像系统。该系统包括配置为具有布置于其上的成像目标的表面。光源配置为射出一束光。分束器配置为将来自光源的光束分离为第一光束和第二光束。第一照明镜配置为反射第一光束以提供对表面进行照明的反射的第一光束。 第二照明镜配置为反射第二光束以提供对表面进行照明的反射的第二光束。捕获设备配置为通过从成像目标延伸、反射出发射镜并且到达捕获设备的路径捕获成像目标的图像。发射镜、捕获设备或两者配置为相对于表面在对角线方向上移动以缩短路径的长度。

还公开了一种照明与成像方法。该方法包括将成像目标置于表面上。该方法还包括从光源射出一束光。该方法还包括将该束光分离为第一光束和第二光束。该方法还包括对成像目标进行照明。照明包括：(i)使用第一照明镜反射第一光束以产生对表面进行照明的反射的第一光束，以及(ii)使用第二照明镜反射第二光束以产生对表面进行照明的反射的第二光束。该方法还包括使用捕获设备通过从成像目标延伸、反射出发射镜并且到达捕获设备的路径捕获成像目标的图像。

本公开在一些实施例中描述了用于生成经过非均匀性校正的图像的方法。在一些实施例中，非均匀性被显示为对于在视场上的不同位置处测得的相同信号，具有变化的强度信号的图像。

本公开的非均匀性校正方法可应用于从各种样本获得的图像，所述样本包括生物样本，该生物样本包含生物分子诸如蛋白质、多肽、糖蛋白、改性蛋白、核酸、DNA、RNA、碳水化合物、脂质、脂多糖、生物聚合物、由细胞和组织产生的其它代谢物以及它们的组合。生物分子或具有生物分子的生物样本可单独成像，或者可分散、定位或嵌入膜、凝胶、滤纸、载玻片、微板或基质诸如聚丙烯酰胺凝胶或硝酸纤维素或PDVF膜印迹、琼脂糖凝胶、琼脂平板、细胞培养板或组织切片中进行成像。本公开的非均匀性校正方法可应用于从上述样本中的任一种获得的图像。

本公开的非均匀性校正方法可应用于通过生物样本的化学发光变化生成的图像或通过样本的荧光变化生成的图像。本公开的非均匀性校正方法可应用于通过生物发光成像、透照或反射光成像生成的图像。

在一个实施例中，生成经过非均匀性校正的图像的方法包括：计算成像传感器上多个像素的成像透镜的相对照度；基于该相对照度生成平场校正矩阵；捕获或采集一个或多个生物样本的图像，其中图像具有非均匀性；以及使用平场校正矩阵调整所捕获的图像以生成经过非均匀性校正的图像。

在一个实施例中，生成平场校正矩阵包括对相对照度取倒数以生成平场校正矩阵。在一些实施例中，使用通过线性或非线性曲线拟合回归获得的公式计算相对照度。该曲线可为一次多项式、二次多项式、三次多项式等。计算平场校正矩阵生成平场校正矩阵值。

利用平场校正矩阵调整所捕获的图像包括将捕获或采集的一个或多个生物样本的图像乘以平场校正矩阵的值。在一些实施例中，利用平场校正矩阵调整所捕获或采集的图像还包括基于像素到像素将捕获或采集的一个或多个生物样本的图像乘以平场校正矩阵的值以生成经平场校正的图像。在一些实施例中，经平场校正的图像显示捕获或采集的一个或多个生物样本的各个图像的信号电平的正确率，而与其在视场上的位置无关。

在一个实施例中，本公开提供了一种生成经过非均匀性校正的图像的方法，该方法包括：计算成像传感器上多个像素的成像透镜的相对照度；对相对照度取倒数以生成平场校正矩阵；捕获或采集生物样本的图像；以及基于像素到像素将捕获或采集的生物样本的图像乘以平场校正矩阵的值以生成经平场校正的图像。

在一个实施例中，本公开描述了生成经过非均匀性校正的图像的方法，该方法包括：捕获或采集一个或多个生物样本的图像，其中图像具有非均匀性；以及利用平场校正矩阵调整所捕获或采集的图像以生成经过非均匀性校正的图像。调整所捕获或采集的图像可包括基于像素到像素将捕获的一个或多个生物样本的图像乘以平场校正矩阵的值以生成经平场校正的图像。

在一些实施例中，平场校正矩阵在成像器件或成像系统中。平场校正矩阵对于使用成像器件的用户可用。平场校正矩阵值可存储于成像设备中。在一些实施例中，平场校正矩阵值可存储于成像设备的软件部件或计算机部件中。平场校正矩阵值对于使用成像系统进行非均匀性校正的用户可用。在一些实施例中，平场校正矩阵为平场校正主矩阵。

在一个实施例中，生成用于校正图像的非均匀性的平场校正矩阵的方法包括：计算成像传感器上多个像素的成像透镜的相对照度；基于相对照度生成平场校正矩阵，并且基于矩阵中的最大像素强度值对平场校正矩阵进行归一化。在一个实施例中，生 成平场校正矩阵包括对相对照度取倒数并且对矩阵中的值进行归一化。例如，制造商或用户可生成平场校正矩阵以备将来使用。

以下描述中将部分阐述本发明另外的目的和优点，并且所述目的和优点将部分从描述中显而易见，或者可通过对本发明的实践习得。本发明的目的和优点将借助于所附权利要求书中特别指出的元件和组合来实现和获得。

应理解，前文大体描述以及以下详细描述仅是示例性以及解释性的且并不限制所主张的发明。

附图简略说明

附图并入并构成本说明书的一部分，用以说明本发明并与本说明一起用于解释本发明的原理。

图1和图2示出根据一个实施例的成像系统的透视图(从不同角度透视)。

图3和图4示出根据一个实施例的成像系统的透视图，其中图1和图2中的一些部件被省略以更好地示出耦接部件的轴。

图5、图6、图7和图8示出根据一个实施例不断提高缩放比例的成像系统的横截面侧视图。

图9示出根据一个实施例从成像系统的照明模块射出的一束光。

图10示出根据一个实施例当发射光的路径的中心随发射镜在缩放过程中的移动居中保持在反射镜上时，至少部分地被反射镜阻挡的落射照明束。

图11示出根据一个实施例从图9所示的成像系统的照明模块射出的光束的简化的示意性侧视图。

图12示出根据一个实施例从具有附加反射镜的照明模块射出的光束的简化的示意性顶视图。

图13示出根据一个实施例从具有两个分束器的照明模块射出的光束的简化的示意性顶视图。

图14示出根据一个实施例的光束在穿过孔到达分束器之前的横截面侧视图。

图15示出光度计参考板的透视图。

图16A示出在视场的不同位置处的光度计参考板的一个光点的堆叠图像，并且图16B示出表示不同位置处相同光斑的信号的图。

图17示出根据一个实施例表示成像系统内的成像透镜的相对照度以及由非线性回归得到的最佳拟合结果。

图18A示出根据一个实施例通过应用平场校正主矩阵得到的图16A的修改后的图像，并且图18B示出表示斑点的强度与斑点的最高强度的比率的图。

图19A示出在1倍缩放比例下处于视场中间的化学发光样本的图像，图19B示出在1倍缩放比例下介于视场的中间位置和右上对角位置之间的位置处的化学发光样本的图像，并且19C示出在1倍缩放比例下处于视场的右上对角位置处的化学发光样本的图像。

图20A示出根据一个实施例对两行条带进行定量分析的图像，图20B示出图20A的第一行条带在平场校正之前的强度的图，图20C示出图20A的第一行条带在平场校正之后的强度的图，图20D示出图20A的第二行条带在平场校正之前的强度的图，并且图20E示出图20A的第二行条带在平场校正之后的强度的图。

图21A示出根据一个实施例在放大1倍时成像透镜的相对照度对传感器图像高度的表格，并且图21B示出在放大2倍时成像透镜的相对照度对传感器图像高度的表格。

图22示出根据一个实施例相对于CCD中心对称的相对照度的曲线图。

图23A示出根据一个实施例在放大1倍时最佳拟合非线性回归曲线的图，并且图23B示出在放大2倍时最佳拟合非线性回归曲线的图。

图24示出根据一个实施例在放大1倍时的模拟图像。

图25示出示出根据一个实施例的平场校正主图象。

图26A、图26B和图26C为应用平场校正后的图像。图26A示出根据一个实施例在放大1倍时处于视场的中间位置的图像，图26B示出在放大2倍时介于视场的中间位置和右上对角位置之间的位置处的图像，并且图26C示出在放大1倍时处于视场的右上对角位置处的图像。

图27示出根据一个实施例的两行各八个条带的图像。

图28A示出根据一个实施例在放大1倍时图27的第一行在平场校正之前的图，图28B示出在放大1倍时图27的第一行在平场校正之后的图，并且图28C示出在放大1倍时图27的第二行在平场校正之前的图，并且图28D示出在放大1倍时图27的第二行在平场校正之后的图。

图29A示出根据一个实施例在放大2倍时图27的第一行在平场校正之前的图，图29B示出在放大2倍时图27的第一行在平场校正之后的图，并且图29C示出在放大2倍时图27的第二行在平场校正之前的图，并且图29D示出在放大2倍时图27的第二行在平场校正之后的图。

图30示出根据一个实施例在平场校正之前和之后的膜位置(例如，中间、右上角)的图表。

具体实施方式

现将详细参考本发明的示范性实施方案，在附图中说明所述示范性实施方案的实例。在可能的情况下，将贯穿图式使用相同的参考标号来指代相同或类似的部件。在以下描述中，参考形成其一部分的附图，并且其中借助于说明其中可实践本发明的具体示范性实施例示出。充分详细地描述这些实施方案，以使得所属领域的技术人员能够实践本发明，并且应理解，可利用其它实施方案且可在不背离本发明的范围的情况下作出改变。因此，以下描述仅为示例性的。

图1和图2示出根据一个实施例从不同角度获得的成像系统100的部分的透视图。成像系统100可包括成像表面110。在一个实例中，成像表面110可以为或包括托盘或屏幕。成像表面110可为平面的并且基本上为水平的(即，平行于地面)。成像目标112可被置于成像表面110上。成像目标112可以为或包括与聚丙 烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、硝酸纤维素膜和PVDF膜相关的生物材料诸如核酸和/或蛋白质。成像目标112还可以为或包括非生物材料诸如制造的制品和文档。

成像系统100还可包括反射镜120。反射镜120可被定位在(例如，直接)成像表面110和成像目标112上方。反射镜120可包括反射表面。如图所示，反射表面可以为平面的；然而，在其它实施例中，反射表面可以为弯曲的。当反射镜120的反射表面为平面的，反射镜120的反射表面可相对于成像表面110(即，相对于水平方向)取向成一定角度。该角度可以为约10°至约80°、约20°至约70°、或约30°至约60°。例如，该角度可以为约45°。

成像系统100还可包括捕获设备130。捕获设备130可包括检测器外壳140、一个或多个滤光器(其中一个如150所示)和相机160。检测器外壳140可被定位在成像表面110上方并且横向(例如，水平)偏移反射镜120。检测器外壳140可包括透镜142。检测器外壳140还可包括滤光轮、电机和/或控制透镜142的焦点和孔的传感器。透镜142可为平面的，并且通过透镜142的中心纵向轴线可以与中反射镜120的反射表面相交。照此，发射光的路径可以在成像目标112和反射镜120之间在竖直方向延伸，并且在检测器外壳140的反射镜120和透镜142之间横向地延伸。如本文所用，“发射光的路径”是指视场中从成像目标112通过透镜142到相机160的路径。

滤光器150可以耦接到并且定位于检测器外壳140的后面，并且发射光的路径可延伸穿过检测器外壳140并且进入滤光器150中。滤光器150可为仅将选定波长的光传输至相机160的电磁(“EM”)滤光器。将滤光器150置于透镜142后面可允许滤光器150小于滤光器150被置于透镜142前方的情况。激发光和发射光均可进入透镜142。由滤光器150阻挡的激发光可击中透镜142及周围表面，并且一定量的激发光可再次返回滤光器150并且可在此时穿过滤光器150。在另一个实施例中，滤光器可以被置于透镜142的前方。由于激发被透镜142前方的滤光器阻挡，因此在滤光器之后可能会有非常少的激发光，例如，几乎没有激发光传播到透镜142内并且到达相机160，这使得易于控制杂散光并且降低背景信号。透镜142前方的滤光器可大于透镜后面的滤光器150。因此，滤光轮的尺寸可能更大并且占据更大的空间。在某些实施例中，第二滤光器也可置于透镜142前方。在此类实施例中，某些实施例中可以是陷波滤波器的第二滤光器置于透镜142前方，而滤光器150置于透镜142后方。这些实施例可以提供两个滤波器同时工作的优点，以便最大程度弱化包括杂散激发光在内的杂散光对由相机160捕获的发射的影响。

相机160可耦接到并且定位在滤光器150后面，并且发射光的路径可延伸穿过滤光器150并且进入相机160中，其中相机160可捕获成像目标112的一个或多个(例如，经滤光的)图像。

成像系统100还可包括位于第一位置处的第一传感器190以及位于第二位置处的第二传感器192(在图1中示出)。第一传感器190可为限制传感器，该限制传感器配置为限制检测器外壳140、滤光器150和相机160的行进距离。第二传感器192可为寻的传感器，该寻的传感器配置为将检测器外壳140、滤光器150和相机160设置为初始的默认位置。

成像系统100还可包括照明模块200(如图1所示)。照明模块200可以为或包括落射照明模块和/或透射照明模块。照明模块200可包括光源210。光源210可以为或包括一个或多个发光二极管(“LED”)。照明模块200还可包括激发滤光器220，该激发滤光器220耦接到并且定位于光源210的前方。激发滤光器220可配置为限制来自光源210的光的波长范围。照明模块200还可包括透镜230，该透镜230耦接到并且定位于激发滤光器220的前方。在至少一个实施例中，透镜230可以为或包括环形透镜。照明模块200还可包括分束器240，该分束器240耦接到并且定位于透镜230的前方。分束器240可配置为将来自光源210的光束分开或划分为两个或更多个光束部分。照明模块200还可包括近红外(“NIR”)照明模块以及可被定位为靠近光源210(例如，处于下方)的反射镜250、激发滤光器220、透镜230、分束器240或它们的组合。NIR照明模块和反射镜250可包括提供NIR范围内的光的LED。NIR照明模块和反射镜250还可以与可见光基本上相同的角度将NIR光反射到分束器240中。照明模块200还可包括被定位在捕获设备130下方和/或光源210上方的后反射镜260、激发滤光器220、透镜230、分束器240或它们的组合。照明模块200还可包括前反射镜262。成像表面110可横向地(例如，水平地)定位于光源210、激发滤光器220、透镜230、分束器240的一侧和前反射镜262的另一侧之间。前反射镜262还可被定位在成像表面110上方。尽管未示出，但是照明模块200还可包括透射照明模块和光源(例如，LED)。用于透射照明的一个光源或多个光源可被定位在成像表面110下方以通过成像表面110和成像目标112提供照明。

图3和图4示出根据一个实施例的成像系统100的透视图，其中一些部件(例如，反射镜120和捕获设备130)被省略以更好地示出耦接部件的轴124、134。

反射镜120(在图3和图4中未示出)可耦接到反射镜支撑结构122，并且捕获设备130(在图3和图4中也未示出)可耦接到捕获设备支撑结构132。反射镜支撑结构122可耦接到并且配置为沿反射镜轴124在与反射镜轴124对准(例如，平行)的轴向上前后滑动。捕获设备支撑结构132可耦接到并且配置为沿捕获设备轴134在与捕获设备轴134对准(例如，平行)的轴向上前后滑动。传动块180可耦接到并且配置为沿传动块轴184在与传动块轴184对准(例如，平行)的轴向上前后滑动。在至少一个实施例中，反射镜轴124、捕获设备轴134、传动块轴184或它们的组合可处于单个平面中。

反射镜轴124可相对于成像表面110的上表面呈对角取向。如本文所用，“对角”是指既不平行也不垂直于成像表面110的方向。更具体地，反射镜轴124可相对于成像表面110取向成一定角度，该角度为约10°至约170°、约40°至约140°、或约70°至约110°(当从图3和图4所示的方向进行观察时)。例如，角度126可以为约91°(当从图3和图4所示的角度进行观察时)。

捕获设备轴134也可相对于成像表面110(即，相对于水平方向)呈对角取向。更具体地，捕获设备轴134可相对于成像表面110取向成一定角度，该角度为约10°至约80°、约20°至约70°、或约30°至约60°(当从图3和图4所示的方向进行观察时)。例如，角度136可以为约35°(当从图3和图4所示的角度进行观察时)。反射镜轴124和捕获设备轴134之间的角度127可以为约80°至约140°、约90°至约130°、或约100°至约120°。例如，角度127可以为约123°。

传动块轴184可被定位在反射镜轴124和捕获设备轴134之间(即，处于角度127内)。传动块轴184还可相对于成像表面110的上表面呈对角取向或垂直(即，竖直)取向。

参见图4，第一传动轴138可耦接到并且在捕获设备支撑结构132和传动块180之间延伸。捕获设备支撑结构132(和捕获设备130)、传动块180或它们的组合可配置为沿第一传动轴138轴向滑动。第二传动轴128可耦接到并且在反射镜支 撑结构122和传动块180之间延伸。反射镜支撑结构122(和反射镜120)、传动块180或它们的组合可配置为沿第一传动轴128轴向滑动。

成像系统100可包括一个或多个电机(其中一个如图3中的170所示)。电机170可使得反射镜120和/或捕获设备130(例如，检测器外壳140、滤光器150和相机160)相对于成像表面110和成像目标112运动。在示出的实施例中，单个电机170可使得反射镜120和捕获设备130同时移动。这种同时移动可通过使用动力传动轴和传动块而实现，所述动力传动轴和传动块联接反射镜120和捕获设备130，诸如上文结合图4所述的第一传动轴138、第二传动轴128和传动块180。此类方法提供了利用单个电机控制反射镜120和捕获设备130的运动的优点，并且以不依赖于诸如控制软件等单独控制机构的同步方式来控制运动，从而提供降低复杂性和成本、减少维护需求的优点，并且改善了在不同缩放程度下保持一致的图像中心的能力。在另一个实施例中，第一电机可使得反射镜120运动，并且第二电机可使得捕获设备130运动，并且反射镜120相对于捕获设备130的运动的比率可以是固定的。可通过软件控制第一电机和第二电机来实现这种固定的运动比例，并且能够实现同步运动，同时在缩放期间保持图像的中心一致。传动块180可耦接到反射镜120和捕获设备130。当使用单个电机170时，传动块180可联接反射镜120和捕获设备130的运动，如图3和图4所详述。在其它实施例中，一个或多个皮带传动器或其它设备可用于移动反射镜120和捕获设备130。

再次参见图3和图4，电机170可通过耦合器174耦接到丝杆172。耦合器174可以将电机170的旋转运动传递至丝杆172，从而使丝杆172旋转。丝杆172可以与捕获设备轴134平行。当丝杆172沿第一方向旋转时，丝杆172可以沿捕获设备轴134在第一轴向上推动捕获设备支撑结构132(和捕获设备130)。相反地，当丝杆172沿第二(即，相反的)方向旋转时，丝杆172可以沿捕获设备轴134在第二(即，相反的)方向上牵拉捕获设备支撑结构132(和捕获设备130)。

当捕获设备支撑结构132(和捕获设备130)沿捕获设备轴134在第一轴向上移动时，第一传动轴138可以使传动块180沿传动块轴184在第一轴向上移动。相反地，当捕获设备支撑结构132(和捕获设备130)沿捕获设备轴134在第二轴向上移动时，第一传动轴184可以使传动块180沿传动块轴184在第二(即，相反的)轴向上移动。

当传动块180沿传动块轴184在第一轴向上移动时，第二传动轴128可以使反射镜支撑结构122(和反射镜120)沿反射镜轴124在第一轴向上移动。相反地，当传动块180沿传动块轴184在第二轴向上移动时，第二传动轴128可以使反射镜支撑结构122(和反射镜120)沿反射镜轴124在第二(即，相反的)轴向上移动。

因此，应当理解，反射镜120和捕获设备130可以同时一起运动。当反射镜120和捕获设备130沿其相应的第一轴向运动时，从成像目标112(反射出反射镜120)到检测器外壳140的透镜142的发射光的路径的总长度可以减小，并且当反射镜120和捕获设备130沿其相应的第二轴向运动时，从成像目标112(反射出反射镜120)到检测器外壳140的透镜142的发射光的路径的总长度可以增加。

图5、图6、图7和图8示出根据一个实施例不断提高缩放比例的成像系统100的横截面侧视图。更具体地，图5示出未缩放的成像系统100。在一个实施例中，当未缩放时，从成像目标112(反射出反射镜120)到检测器外壳140的透镜142的发射光的路径115中心的总长度可以为例如约455mm，但是发射光的路径115中心的总长度将取决于系统及其部件的总体配置，包括捕获设备130的特性。当未缩放时，发射光的路径114可与反射镜120的第一部分(例如，表面区域)接触。第一部分(例如，表面区域)可以为反射镜120的总表面区域的约50％至约100％、约75％至约99％、或约85％至约95％。

现在参见图6，捕获设备130和反射镜120可以沿其相应的第一轴向运动以减小发射光的路径115中心的总长度(即，放大成像表面110上的成像目标112)。介于成像目标112和反射镜120之间的发射光的路径115的中心可以在反射镜120对角运动时保持固定(即，垂直箭头与图5和图6中相同)。因此，发射光的路径115的中心接触的反射镜的点可以随反射镜120和捕获设备130沿其相应的第一轴向运动而变化/移动。例如，发射光的路径115的中心可以在图5中的点116A处并且在图6中的点116B处与反射镜120接触。另外，发射光的路径114接触的反射镜120的部分(例如，表面区域)可以随反射镜120和捕获设备130沿其第一轴向运动而减小。

现在参见图7，反射镜120和捕获设备130还可以沿其相应的第一轴向运动以进一步减小发射光的路径115中心的总长度(即，放大成像表面110上的成像目标112)。介于成像目标112和反射镜120之间的发射光的路径115的中心可以在 反射镜120对角运动时保持固定(即，垂直箭头与图5-7中相同)。因此，发射光的路径114的中心接触的反射镜的点可以随反射镜120和捕获设备130沿其相应的第一轴向运动而变化/移动。例如，发射光的路径114的中心可以在图7中的点116C处与反射镜120接触。另外，发射光的路径114接触的反射镜120的部分(例如，表面区域)可以随反射镜120和捕获设备130沿其第一轴向进一步运动而继续减小。

现在参见图8，反射镜120和捕获设备130可最大程度减小发射光的路径115中心的总长度(即，最大程度放大成像表面110上的成像目标112)。介于成像目标112和反射镜120之间的发射光的路径115的中心可以在反射镜120对角运动时保持固定(即，垂直箭头与图5-8中相同)。因此，发射光的路径115的中心接触的反射镜的点可以随反射镜120和捕获设备130沿其相应的第一轴向运动而变化/移动。例如，发射光的路径115的中心可以在图8中的点116D处与反射镜120接触。在一个实例中，当放大倍数最大时，从从成像目标112(反射出反射镜120)到检测器外壳140的透镜142的发射光的路径115的中心的总长度可以为例如约215mm。因此，成像系统100可配置为从约1倍放大至约2倍；然而，在其它实施例中，成像系统100可被置为进一步放大(即，大于2倍)。另外，发射光的路径114接触的反射镜120的部分(例如，表面区域)可以随放大倍数增加而减小。例如，当放大倍数最大时，该部分(例如，表面区域)可以为反射镜120的总表面区域的约5％至约80％、约10％至约70％、或约20％至约60％。

图9示出根据一个实施例从照明模块200射出的一束光(例如，落射照明束)212。光束212可从照明模块200的光源210(见图1)射出。光束212可由分束器240分离为第一光束213和第二光束214。第一光束213可反射出后反射镜260并且对成像目标112进行照明，并且第二光束214可反射出前反射镜262并且对成像目标112进行照明。这在下文结合图11予以更详细的描述。在另一个实施例中，光束212可从NIR照明模块250射出并且反射出的NIR照明模块250中的反射镜而到达成像目标112。在至少一个实施例中，光束212可延伸穿过发射光的路径114以对成像目标112进行照明，其可以反射照明光或可以包含由落射照明激发后发出光的荧光部件。

当反射镜120和捕获设备130处于其最大放大倍数的位置时，如图9所示，捕获设备130的下端139可定位在反射镜120下端129的下方。因此，反射镜120在沿反射镜轴124的任意点处可不阻挡光束214。

图10示出根据一个实施例至少部分地被反射镜120阻挡的落射照明束212。如果发射光的路径114的中心在反射镜移动时保持固定在反射镜120上的同一点(例如，图5中的点116A)，则当捕获设备130和反射镜120处于其最大放大倍数的位置时，反射镜120的下端129可被定位在捕获设备130下端139的下方。因此，反射镜120可至少部分地阻挡光束212。因而，如图5-9所示，发射光的路径114的中心可以随反射镜120运动而在反射镜120上移动/变化以免阻挡光束212。

落射照明和/或激发可用于蛋白质分析的荧光模式。许多荧光染料可用于蛋白质染色和/或蛋白质印迹，并且不同染料具有不同的激发光谱分布，因此需要不同颜色的激发光。某些激发功率可在可接受的成像曝光时间内提供荧光成像信号。如果照明和/或激发功率在视场中变化太大，则可能存在一个或多个暗区，其中难以看到样本的纹带/条带，或可以在暗区中看到纹带/条带，但是较亮区域的信号变得饱和。因此，基本上均匀的照明可改善成像质量。

存在两类落射照明：轴向和偏轴(即，倾斜)。轴向照明可在图像上生成亮斑，因为某些光反射自样本。偏轴照明是应对这种问题的一种方法。在一些实施例中，偏轴角度可大于或等于预先确定的量以免生成亮斑。

图11示出根据一个实施例从图9所示的照明模块200射出的光束212的简化的示意性侧视图。光束212可从照明模块200的光源210(见图1)射出。光源210可包括用于荧光激发的第一LED和用于近红外的第二LED。在另一个实施例中，可使用卤钨灯涵盖两种光谱。对于任何特定的通道，可以仅存在一束光。光源210可具有单一颜色。在至少一个实施例中，光源210可为白光源，并且滤光器可用于生成不同的颜色。

光束212可以由分束器240分离为第一光束213和第二光束214。尽管未示出，但是在其它实施例中，分束器240可配置为将光束212分离为三束或更多束。如本文所用，术语“分束器”包括能够分开或其它方式分离光束的一种或多种光学部 件，并且包括但不限于棱镜、板、介质反射镜、金属涂覆反射镜、分束器立方体、光纤分束器以及配置为在产生两个或更多个输出光束之前使光准直成束的光纤。

分束器240可在所得的光束之间平均分开或分离强度，或者可将它们分离为不同比例的强度。在示出的实施例中，分束器240为板，并且第一光束213反射出分束器240，而第二光束214穿过分束器240。分束器240可包括涂层和/或滤光器(例如，线性可变滤光器)，使得分束器240的一端部/侧可具有与相对端部/侧不同的特性。第一光束213可包括束212的光功率的约40％至约60％(例如，40％、45％、50％、55％或60％)，并且第二光束214可包括束212的光功率的约40％至约60％(例如，40％、45％、50％、55％或60％)。因此，在某些实施例中，第一光束213和第二光束214可均匀地分开束212的光功率(第一光束213占50％并且第二光束214占50％)。在其它实施例中，第一光束213相比于第二光束214可具有束212的光功率的更大或更小的百分比。第一光束213的中心和第二光束214的中心之间的角度可为约62°至约68°、约70°至约90°、或约90°至约110°。第一光束213可反射出后反射镜260，产生对成像表面110上的成像目标112进行照明的反射的第一光束215。第二光束214可反射出前反射镜262，产生对成像表面110上的成像目标112进行照明的反射的第二光束216。反射的第一光束215的中心和反射的第二光束216的中心之间的角度可为约80°至约100°、约106°至约114°、或约120°至约140°。尽管未示出，但是在至少一个实施例中，第二光束214可直接照亮成像表面110上的成像目标112，而无需反射出前反射镜262并且产生反射的第二光束216。

反射的第一光束215和反射的第二光束216可提供对成像表面110上的成像目标112的偏轴照明。更具体地，反射的第一光束215和反射的第二光束216可提供对成像表面110上的成像目标112的基本上对称的照明。例如，反射的第一光束215和成像表面110之间的角度可处于反射的第二光束216和成像表面110之间的角度+/-10°以内。从分束器240到后反射镜260到成像表面110的距离可基本上等于(例如，相差10％以内)从分束器240到前反射镜262到成像表面110的距离。在至少一个实施例中，后反射镜260和/或前反射镜262可与分束器240的旋转结合移动，以便改变对成像表面110上成像目标112的照明。

图12示出根据一个实施例从具有附加反射镜1261-1265的照明模块1200射出的光束1212的简化的示意性顶视图。在示出的实施例中，光束1212可从照明模块1200的光源射出，并且可由分束器1240分离为第一光束1213和第二光束1214。第一光束1213可反射出分束器1240，并且第二光束1214可穿过分束器1240。第一光束1213在可对成像表面110上的成像目标112进行照明前反射出第一反射镜1261和第二反射镜1262。第二光束1214在可对成像表面110上的成像目标112进行照明前反射出第三反射镜1263、第四反射镜1264和第五反射镜1265。与图11中的实施例相同，束1213、1214可提供对成像表面110上的成像目标112的偏轴照明。另外，束1213、1214可提供对成像表面110上的成像目标112的基本上对称的照明。

图13示出根据一个实施例从具有两个分束器1340、1342的照明模块1300射出的光束1312的简化的示意性顶视图。在示出的实施例中，光束1312可从照明模块1300的光源射出，并且可由第一分束器1340分离为第一光束1313和第二光束1314。第一光束1313可反射出第一分束器1340，而第二光束1314可穿过第一分束器1340。在至少一个实施例中，第一光束1313可包括束1312的光功率的约15％至约35％(例如，15％、20％、25％、30％、或35％)，并且第二光束1314可包括束1312的光功率的约65％至约85％(例如，65％、70％、75％、80％、或85％)。

然后，第一光束1313可反射出第一反射镜1360，产生对成像表面110上的成像目标112进行照明的反射的第一光束1315。第二光束1314可由第二分束器1342分离为第三束1316和第四束1317。第三束1316可反射出第二分束器1342，而第四束1317可穿过第二分束器1342。在至少一个实施例中，第三束1316可包括束1314的光功率的约20％至约40％(例如，33％)，并且第四束1317可包括束1314的光功率的约60％至约80％(例如，66％)。然后，第三束1316可反射出第二反射镜1362，产生对成像表面110上的成像目标112进行照明的反射的第三束1318。与图11中的实施例相同，束1315、1318可提供对成像表面110上的成像目标112的偏轴照明。另外，束1315、1318可提供对成像表面110上的成像目标112的基本上对称的照明。

第四束1317也可对成像表面110上的成像目标112进行照明。如图所示，第四束1317在对成像表面110上的成像目标112进行照之前可以不反射出反射镜。 在一个实施例中，第一光束1313和第四束1317之间的角度可处于第三束1316和第四束1317之间的角度的约10°至约40°以内。相似地，在一个实施例中，反射的第一光束1315和第四束1317之间的角度可处于反射的第三束1318和第四束1317之间的角度的约10°至约40°以内。

尽管图13示出对对成像表面110上的成像目标112进行照明的束1315、1317、1318，但是在另一个实施例中，四个或更多个束可对成像表面110上的成像目标112进行照明。例如，四个束可从前部、后部、左侧和右侧对成像表面110上的成像目标112进行照明。

图14示出根据一个实施例图9中的光束212在穿过光束整形器1410的孔1418到达分束器240之前的横截面侧视图。光束整形器1410可包括一个或多个透镜(三个透镜如1412、1414、1416所示)。如图所示，孔1418可被定位在第二透镜1414和第三透镜1416之间；然而，在其它实施例中，孔1418可被定位在光束整形器1410内的任意位置或者在光到达分束器之前被定位在光束整形器1410的外部。孔1418的尺寸(例如，横截面积或直径)可以是固定的。在另一个实施例中，可改变孔1418的尺寸以改变成像表面110上成像目标112的照明尺寸(例如，横截面积或直径)。还可改变来自光源的光束212的强度以改变成像表面110上成像目标112的照明强度。

平场校正校准

本公开的成像器件或成像系统可用于对各种生物分子和生物样本进行成像，所述生物分子和生物样本诸如蛋白质、多肽、糖蛋白、改性蛋白、核酸、DNA、RNA、碳水化合物、脂质、脂多糖、生物聚合物以及由细胞和组织产生的其它代谢物。生物样本可单独成像，或者可处于膜、凝胶、滤纸、载玻片、微板或基质诸如聚丙烯酰胺凝胶或硝酸纤维素或PDVF膜印迹、琼脂糖凝胶、琼脂平板、细胞培养板或组织切片中进行成像。

本公开的成像系统可在若干成像模式下对生物分子和生物样本进行成像，包括荧光成像、化学发光成像、生物发光成像、透照或反射光成像。在一些成像模式中，样品发光或显示发射的光的变化(波长、频率或强度变化)，无需外部照明或激发即可成像。在一些成像模式中，样品发光或改变发射的光(波长、频率或强度变化)， 然后暴露于外部照明或激发源进行成像。在一些成像模式中，样品反射光或改变反射的光(波长、频率或强度变化)，然后暴露于外部照明进行成像。

成像过程中面临的一个常见问题是(与成像模式无关)，当样本被置于成像表面或视场的不同位置时，图像的不同位置看起来不均匀。成像表面在一个实施例中由图1中的部件110举例示出，并且在本文中也称为成像区域、视场、样本屏幕或样本托盘。在一些实施例中，图像非均匀性被显示为对于在成像表面或视场上的不同位置处测得的相同信号，具有变化的强度信号的图像。在一些实施例中，图像非均匀性被显示为对于在成像表面或视场上的不同位置处测得的相同信号，具有不同信号电平的图像。与位置有关的图像非均匀性部分地是由于成像透镜的一种特性即相对照度引起。

基于样本在成像表面上的位置的图像的非均匀性妨碍对生物分子进行准确定量测量。本公开描述了用于校准成像系统的透镜组件的系统、算法和方法，该系统、算法和方法可消除透镜表现出的非均匀性以从生物分子的样本图像获得准确的数据。利用本公开的方法和系统校准透镜组件消除了透镜表现出的非均匀性以从样本图像获得准确的数据。

如上文实施例所述，本公开的成像和照明设备与系统提供了成像校正功能以通过图像分析提高数据准确度。这些功能单独或与方法和系统进一步结合以校准图像非均匀性，以在在电泳凝胶或膜中提供对生物样本的优异且准确的定量测量，并且随后提供可靠的数据分析和得自样本的图像信息。

在一个实施例中，生成经过非均匀性校正的图像的方法包括：计算成像传感器上多个像素的成像透镜的相对照度；基于该相对照度生成平场校正矩阵；捕获一个或多个生物样本的图像，其中图像具有非均匀性；以及使用平场校正矩阵调整所捕获的图像以生成经过非均匀性校正的图像。

在一个实施例中，利用平场校正矩阵调整所捕获的图像包括基于像素到像素将捕获的生物样本的图像乘以平场校正矩阵的值以生成经平场校正的图像。

在一些实施例中，一种生成经过非均匀性校正的图像的方法可包括：计算成像传感器上多个像素的成像透镜的相对照度；对相对照度取倒数以生成平场校正矩阵；将平场校正矩阵提供给用户；其中用户可基于像素到像素将捕获的生物样本的图像乘 以平场校正矩阵的值以生成经平场校正的图像。用户在使用平场校正矩阵对图像进行平场校正处理之前可使用成像器件获得捕获的图像。在一些实施例中，用户可选择生成经过非均匀性校正的图像。在一些实施例中，可通过向用户提供预先计算的平场校正矩阵的值并且指示用户基于像素到像素将捕获的生物样本的图像乘以平场校正矩阵的值以生成经平场校正的图像，指示用户生成经过非均匀性校正的图像。在一些实施例中，成像设备或成像软件制造商可向用户提供平场校正矩阵。在一些实施例中，用户可使用本文所述的方法和算法计算平场校正矩阵的值。

在一个实施例中，一种用于生成经过非均匀性校正的图像的方法包括：计算成像传感器上多个像素的成像透镜的相对照度；对相对照度取倒数以生成平场校正矩阵。例如，成像设备制造商或用户可生成平场校正矩阵以备将来使用。

通过本公开的方法获得的经平场校正的图像显示了捕获的生物样本的每个图像的信号电平的正确率，而与其在成像表面、成像区域或视场上的位置无关。经平场校正的图像为经过非均匀性校正的图像。

平场校正校准的实例

本公开的成像器件或成像系统的一种示例性应用模式是用作在化学发光模式下对生物分子(例如但不限于凝胶或印迹中的蛋白质和核酸)进行成像的成像器件，在化学发光模式下，化学发光样本在无需外部照明和激发的情况下发光。如上文所述，进行化学发光成像时面临的一个问题是图像的非均匀性，其中当化学发光样本被置于成像表面(诸如，图1中部件110、成像区域、视场、样本屏幕或样本托盘)的不同位置时，即使对于相同的样本(诸如凝胶或印迹中的相同蛋白质或核酸条带)，图像信号也不同。

该问题通过使用光度计参考微板示出。在一个实例中，图15示出光度计参考板1500的透视图。然而，本领域中已知的任何光度计参考板均可用于示出该问题。光度计参考板1500具有一个或多个辐射光斑。光度计1500上所示的八个辐射光斑被编号为1501-1508。辐射被辐射光斑中的七个所阻挡(例如，1501-1507)。仅一个(例如，最明亮的)光斑1508成像于成像表面的不同位置处(在成像屏幕的对角线上)。光度计参考板1500的光斑1508被置于视场(或样本屏幕)中的不同位置处。 在成像表面的各个部分采用恒定的曝光时间采集对光度计1500的光斑1508的图像，并且将图像堆叠。

图16A示出光度计1500的光斑1508的图像1600。图16B示出根据一个实施例从本公开的成像器件的成像表面上的各个位置处采集的光斑1508的信号的图1610。图16B的图1610显示，来自相同光斑1508的信号看起来在成像屏幕的不同位置处具有不同的强度，即使所有信号均相同，因为这些信号由光度计1500上相同的发射光斑1508发出。如图16A和图16B所示，由于在成像屏幕/样本屏幕的不同位置处成像，因此来自化学发光样本的相同信号看起来不同。由位置引起的这种信号差异是由于成像透镜的一种特性即相对照度引起。鉴于图像的非均匀性，用户无法确定成像差异是否由各种发光样本中生物分子(蛋白质、核酸、DNA等)的浓度差异引起，或者信号差异是否由样本条带在样本屏幕的不同位置处成像引起。因此，利用当前的成像方法无法获得可靠而准确的定量信息。

上述信号差异可能是由本公开的成像系统中成像透镜的相对照度引起的。相对照度是表示成像透镜中的晕影和滚降的综合效应的一种方式，并且通常用传感器上任一点处的照度百分比来表示，将其归一化为具有最大照度的视场中的位置。晕影和滚降是相对照度的两种单独的成份。由于上述信号差异是由相对照度(即，成像透镜的特性之一)引起，因此如果已知相对照度，则可以校正这种差异。校正过程包括基于成像透镜的相对照度数据创建平场校正主矩阵文件，基于矩阵中的最大值对平场校正主矩阵进行归一化，并且将该平场校正(FF)主矩阵应用于从系统中捕捉的图像。

图17示出根据一个实施例的本公开的成像透镜的相对照度的图1700。通过线性或非线性曲线拟合回归可获得图1700中的曲线的公式。对于离散的数据点，可应用回归方法针对一系列点拟合曲线以便找出最佳拟合公式。然后，可使用所识别的公式计算成像传感器上任意位置处的相对照度数。在本公开的一个实施例中，平场校正的算法包括以下步骤：

·步骤1-基于从曲线拟合回归所识别的公式计算成像传感器上所有像素的相对照度数；

·步骤2-对步骤1中的数字取倒数，并且基于倒数中的最大值对倒数进行归一化以生成平场校正主矩阵；和

·步骤3-在图像采集时，基于像素到像素将所捕获的生物样本的图像乘以步骤2中所创建的矩阵以生成应用平场校正处理的最终图像。

经平场校正处理后的图像显示样本中所有条带的信号电平的正确率。

图18A示出根据一个实施例经过平场校正处理的图16A的图像1800，并且图18B示出图18A中的光斑强度与中心光斑的比率。换句话讲，图18B示出那些光斑在平场校正处理前后的相对百分比。如图所示，在应用平场校正之前，各个光斑强度与具有最大强度值的光斑的比率(图18A)可为约0.7，而经过平场校正处理后，该比率增加至大于0.95。照此，在应用平场校正后，获得了显著的照度补偿。

图19A示出根据一个实施例在1倍缩放比例下化学发光样本在视场中间位置处的图像1900，图19C示出在1倍缩放比例下化学发光样本在视场右上角位置处的图像1910，并且图19B示出在1倍缩放比例下化学发光样本在视场中间位置和右上角位置处的图像1920。

图20A示出根据一个实施例对两行条带进行定量分析的图像2000，图20B示出第一行条带在平场校正之前的强度的图2010，图20C示出第一行条带在平场校正之后的强度的图2020，图20D示出第二行条带在平场校正之前的强度的图2030，并且图20E示出第二行条带在平场校正之后的强度的图2040。如图所示，单个条带的强度随成像表面(具有相同样本)上样本的位置而变化，而在平场校正之后，强度不随成像表面上的位置而变化。

生成平场校正(FF)主矩阵

图21A示出根据一个实施例在放大1倍时成像透镜的相对照度与传感器图像高度的表格2100，并且图21B示出在放大2倍时CCD传感器成像透镜的相对照度与图像高度的表格2110。

图22示出根据一个实施例相对于图像传感器中心对称的相对照度的曲线图2200。最大图像高度为约8mm。从0mm至8mm进行模拟。

图23A示出根据一个实施例在放大1倍时最佳拟合曲线的图2300，并且图23B示出在放大2倍时最佳拟合曲线的图2310。曲线可以为一次多项式、二次多项式、三次多项式等。利用该公式计算图像高度：

其中h表示距离检测传感器的中心像素的高度(用mm表示)，x_c表示中心像素的x坐标，并且y_c表示中心像素的y坐标。该示例中的像素高度为3.69μm/像素。考虑到这点，在放大1倍时，可利用最佳拟合曲线的公式计算相对照度：

RI＝-0.3654h²-3.1275h+100.15

其中RI表示相对照度(％)，0≤RI≤100。

对于Bin 1x1图像：

宽度＝3360像素→x_c＝1690

高度＝2704像素→y_c＝1352

对于像素(1，1)

RI＝-0.3654×7.98092²-3.1275×7.98092+100.15＝51.9％

图24示出根据一个实施例在放大1倍时的模拟图像2400。

图25示出示出根据一个实施例的平场校正主图象2500。主图像中每个像素的值可以等于RI^-1。

平场校正主图像的应用

图26A示出根据一个实施例在放大1倍时具有处于视场中间位置的样本的图像2600，图26C示出在放大1倍时具有处于视场右上角位置的样本的图像2610，并且图26B示出具有处于视场中间位置及右上角位置的样本的图像2620。在该实例 中，样本为蛋白印迹膜，其具有与化学发光底物可视化的等量的蛋白质，仓位数为5，缩放比例可为1倍或2倍，增益为高(例如，55)，并且有效期为60秒。

将平场主矩阵应用于图26A-26C中的图像。可在所选择的条带上绘制矩形掩模，并且对平均像素强度进行测量。利用宏确保所测量的每个条带的测定区域对于应用平场校正主矩阵之前和应用平场校正主矩阵之后的图像处于相同的位置。尽管蛋白印迹膜被制备为具有相等的蛋白质量，但是不同条带之间的信号值仍然存在变化。对于每个单独条带，同一行中的信号强度应当相似，而与膜位置无关。

图27示出根据一个实施例的两行各八个样本条带的图像2700。

图28A示出根据一个实施例在平场校正之前第一行的图2800，图28B示出在应用平场校正主矩阵之后第一行的图2810，图28C示出在应用平场校正主矩阵之前第二行的图2820，并且图28D示出在应用平场校正主矩阵之后第二行的图2830。图28A-28D中的放大倍数为1倍。在应用平场校正主矩阵之前，ADU(模数转换单元)值的差异是由成像器件表面/成像器件屏幕上膜的位置引起。在应用平场校正主矩阵之后，ADU值相似，与膜的位置无关。

图29A示出根据一个实施例在应用平场校正主矩阵之前第一行的图2900，图29B示出在应用平场校正主矩阵之后第一行的图2910，图29C示出在应用平场校正主矩阵之前第二行的图2920，并且图29D示出在应用平场校正主矩阵之后第二行的图2930。图29A-29D中的放大倍数为2倍。

图30示出根据一个实施例在应用平场校正主矩阵之前和之后的膜位置(例如，成像器件表面/成像器件屏幕上的膜及其样本条带的中间位置、右上角位置)。如图所示，在应用平场校正主矩阵之前，右上角的位置较模糊，并且在施加平场校正主矩阵之后，条带具有相似的亮度。

尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但特定实例中所阐述的数值是尽可能精确报告的。然而，任何数值都固有地包含一定的误差，在它们各自的试验测定中存在的标准偏差必然会引起这种误差。此外，本文中所公开的所有范围应理解为涵盖其中所包含的任何和所有子范围。例如，“小于10”的范围可包含介于最小值零与最大值10之间的任何及所有子范围，也就是说，具有等于或大于零的最小值及等于或小于10的最大值(例如1到5)的任何和所有子范围。在某些情况 下，如针对参数陈述的数值可呈现负值。在这种情况下，陈述为“小于10”的范围的实例值可采用负值，例如-1、-2、-3、-10、-20、-30等。

虽然已参考其示范性实施例的教义，但所属领域的技术人员将能够对所描述实施例进行各种修改而不背离真实精神及范围。本文所使用的术语及描述仅借助于说明阐述并且不意味着限制。确切地说，虽然已通过实例描述方法，可以不同于所说明的次序或同时执行方法步骤。此外，就实施方式和权利要求书中使用术语“包含(including，includes)”、“具有(having，has，with)”或其变化形式的程度而言，此类术语旨在以类似于术语“包含”的方式是包含的。如本文所使用，关于所有物品的列举(A及B)的术语“中的一或多个”意味着单独的A、单独的B或A和B。所属领域的技术人员将认识到，这些及其它变化可能在如在以下权利要求书及其等效物中所定义的精神及范围内。

从本文中揭示的本发明的说明书和实践的考虑，本发明的其它实施例将对所属领域的技术人员显而易见。希望仅将说明书以及实例视为示例性的，其中本发明的真实范围和精神由以下权利要求书来指示。

如本文所用，术语“内部”和“外部”、“上”和“下”、“朝上”和“朝下”、“之上”和“之下”、“向内”和“向外”及本文所用的其它类似术语是指彼此的相对位置，并非旨在表示特定的方向或空间取向。术语“耦接”、“耦接的”、“连接(connect和connection)”、“连接的”、“与……连接”和“使连接”是指“与……直接连接”或“通过一个或多个中间元件或构件连接”。

Claims (103)

1.一种照明系统，包括：

表面，配置将成像目标置于其上；

光源，配置为射出一束光；

分束器，配置为将来自所述光源的所述光束分离为第一光束和第二光束；

第一反射镜，配置为反射所述第一光束以提供对所述表面进行照明的反射的第一光束；

第二反射镜，配置为反射所述第二光束以提供对所述表面进行照明的反射的第二光束。

2.根据权利要求1所述的照明系统，其中所述反射的第一光束和所述反射的第二光束提供对所述表面的偏轴照明。

3.根据权利要求1所述的照明系统，其中所述反射的第一光束和所述反射的第二光束提供对所述表面的基本上对称的照明。

4.根据权利要求1所述的照明系统，其中所述光束具有光束光功率，所述第一光束具有第一光束光功率并且第二光束具有第二光束光功率，并且其中所述第一光束光功率和第二光束光功率各自为所述光束光功率的至少40％。

5.根据权利要求4所述的照明系统，其中所述第一光束光功率和第二光束光功率各自为所述光束光功率的至少45％。

6.根据权利要求5所述的照明系统，其中所述第一光束光功率和第二光束光功率基本上相等。

7.根据权利要求1所述的照明系统，还包括第三反射镜，其中所述反射的第一光束或所述反射的第二光束配置为在对所述表面进行照明之前反射出所述第三反射镜。

8.根据权利要求1所述的照明系统，其中所述分束器配置为将来自所述光源的所述光束分离为所述第一光束、所述第二光束和第三束。

9.根据权利要求1所述的照明系统，其中所述分束器包括棱镜、板、介质反射镜、金属涂覆反射镜、分束器立方体、光纤分束器或光纤，所述光纤配置为在产生两个或更多个输出光束之前使光准直成束。

10.根据权利要求1所述的照明系统，其中所述第一光束反射出所述分束器，并且所述第二光束穿过所述分束器。

11.根据权利要求1所述的照明系统，还包括第二分束器，所述第二分束器配置为将所述反射的第一光束分离为两个反射束，所述两个反射束对所述表面提供不同角度的偏轴照明。

12.根据权利要求11所述的照明系统，还包括第三分束器，所述第三分束器配置为将所述反射的第二光束分离为两个反射束，所述两个反射束对所述表面提供不同角度的偏轴照明。

13.根据权利要求1所述的照明系统，其中所述第一光束的中心和所述第二光束的中心之间的角度为约62°至约68°。

14.根据权利要求1所述的照明系统，其中所述反射的第一光束的中心和所述反射的第二光束的中心之间的角度为约106°至约114°。

15.根据权利要求1所述的照明系统，其中从所述分束器到所述第一反射镜到所述表面的第一距离基本上等于从所述分束器到所述第二反射镜到所述表面的第二距离。

16.一种照明系统，包括：

表面，配置为将成像目标置于其上；

光源，配置为射出一束光；

分束器，所述分束器配置为将来自所述光源的光束分离为第一光束和第二光束，其中所述第二光束对所述表面进行照明；

第一反射镜，所述第一反射镜配置为反射来自所述分束器的所述第一光束以提供对所述表面进行照明的反射的第一光束。

17.根据权利要求16所述的照明系统，其中反射的第一光束和所述第二光束提供对所述表面的基本上对称的照明。

18.根据权利要求16所述的照明系统，其中所述分束器具有第一端部和第二端部，并且其中所述分束器为可变分束器，所述可变分束器在所述第一端部和所述第二端部分得的所述光束的光功率不同。

19.根据权利要求18所述的照明系统，其中所述光束具有光束光功率，所述第一光束具有第一光束光功率，并且第二光束具有第二光束光功率，并且其中所述第一光束光功率和第二光束光功率各自为所述光束光功率的至少40％。

20.根据权利要求19所述的照明系统，其中所述第一光束光功率和第二光束光功率各自为所述光束光功率的至少45％。

21.根据权利要求20所述的照明系统，其中所述第一光束光功率和第二光束光功率基本上相等。

22.一种照明方法，包括：

提供可将成像目标置于其上的表面；

通过光源提供一束光；

将所述光束分离为第一光束和第二光束；以及

对所述表面进行照明，其中所述照明包括：(i)使用第一反射镜反射所述第一光束以产生对所述表面进行照明的反射的第一光束，以及(ii)使用第二反射镜反射所述第二光束以产生对所述表面进行照明的反射的第二光束。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述反射的第一光束和所述反射的第二光束提供对所述表面的偏轴照明。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述反射的第一光束和所述反射的第二光束提供对所述表面的基本上对称的照明。

25.根据权利要求22所述的方法，其中所述光束具有光束光功率，所述第一光束具有第一光束光功率并且第二光束具有第二光束光功率，并且其中所述第一光束光功率和第二光束光功率各自为所述光束光功率的至少40％。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一光束光功率和第二光束光功率各自为所述光束光功率的至少45％。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第一光束光功率和第二光束光功率基本上相等。

28.根据权利要求22所述的方法，其中在对所述表面进行照明之前，利用第三反射镜反射所述反射的第一光束或所述反射的第二光束。

29.根据权利要求22所述的方法，其中所述光束被分离为所述第一光束、所述第二光束和第三束。

30.根据权利要求22所述的方法，其中所述光束由分束器进行拆分。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述分束器包括棱镜、板、介质反射镜、金属涂覆反射镜、分束器立方体、光纤分束器或光纤，所述光纤配置为在产生两个或更多个输出光束之前使光准直成束。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一光束反射出所述分束器，并且所述第二光束穿过所述分束器。

33.根据权利要求22所述的方法，其中所述反射的第一光束被分离为两个反射束，所述两个反射束对所述表面提供不同角度的偏轴照明。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述反射的第二光束被分离为两个反射束，所述两个反射束对所述表面提供不同角度的偏轴照明。

35.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一光束的中心和所述第二光束的中心之间的角度为约62°至约68°。

36.根据权利要求22所述的方法，其中所述反射的第一光束的中心和所述反射的第二光束的中心之间的角度为约106°至约114°。

37.根据权利要求30所述的方法，其中从所述分束器到所述第一反射镜到所述表面的第一距离基本上等于从所述分束器到所述第二反射镜到所述表面的第二距离。

38.一种照明方法，包括：

通过光源提供一束光；

将所述光束分离为第一光束和第二光束；以及

对置有成像目标的表面进行照明，其中照明包括使用第一反射镜反射所述第一光束以产生对所述表面进行照明的反射的第一光束，并且其中所述第二光束从所述光束中分出，使得所述第二光束对所述表面进行照明。

39.一种照明与成像系统，包括：

表面，配置为将成像目标置于其上；

光源，配置为射出一束光；

分束器，配置为将来自所述光源的所述光束分离为第一光束和第二光束；

第一照明镜，所述第一照明镜配置为反射所述第一光束以提供对所述表面进行照明的反射的第一光束；

第二照明镜，所述第二照明镜配置为反射所述第二光束以提供对所述表面进行照明的反射的第二光束；

发射镜；和

捕获设备，所述捕获设备配置为通过从所述成像目标延伸、反射出所述发射镜并且到达所述捕获设备的路径捕获所述成像目标的图像，其中所述发射镜、所述捕获设备或两者均配置为相对于所述表面在对角线方向上移动以缩短所述路径的长度。

40.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述反射的第一光束和所述反射的第二光束提供对所述表面的偏轴照明。

41.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述反射的第一光束和所述反射的第二光束提供对所述表面的基本上对称的照明。

42.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述光束具有光束光功率，所述第一光束具有第一光束光功率并且第二光束具有第二光束光功率，并且其中所述第一光束光功率和第二光束光功率各自为所述光束光功率的至少40％。

43.根据权利要求42所述的照明与成像系统，其中所述第一光束光功率和第二光束光功率各自为所述光束光功率的至少45％。

44.根据权利要求43所述的照明与成像系统，其中所述第一光束光功率和第二光束光功率基本上相等。

45.根据权利要求39所述的照明与成像系统，还包括第三照明镜，其中所述反射的第一光束或所述反射的第二光束配置为在对所述表面进行照明之前反射出所述第三照明镜。

46.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述分束器配置为将来自所述光源的所述光束分离为所述第一光束、所述第二光束和第三束。

47.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述分束器包括棱镜、板、介质反射镜、金属涂覆反射镜、分束器立方体、光纤分束器或光纤，所述光纤配置为在产生两个或更多个输出光束之前使光准直成束。

48.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述第一光束反射出所述分束器，并且所述第二光束穿过所述分束器。

49.根据权利要求39所述的照明与成像系统，还包括第二分束器，所述第二分束器配置为将所述反射的第一光束分离为两个反射束，所述两个反射束对所述表面提供不同角度的偏轴照明。

50.根据权利要求39所述的照明与成像系统，还包括第三分束器，所述第三分束器配置为将所述反射的第二光束分离为两个反射束，所述两个反射束对所述表面提供不同角度的偏轴照明。

51.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述第一光束的中心和所述第二光束的中心之间的角度为约62°至约68°。

52.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述反射的第一光束的中心和所述反射的第二光束的中心之间的角度为约106°至约114°。

53.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中从所述分束器到所述第一反射镜到所述表面的第一距离基本上等于从所述分束器到所述第二反射镜到所述表面的第二距离。

54.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述捕获设备和所述发射镜两者均在不同的对角线方向上同时移动。

55.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述捕获设备包括透镜、滤光器和相机，并且其中所述滤光器被定位在所述透镜和所述相机之间。

56.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述发射光的路径从所述发射镜的区域中反射出，并且其中所述区域在所述捕获设备、所述发射镜或两者均相对于所述表面在对角线方向上移动时缩小以缩短所述发射光的路径的长度。

57.根据权利要求39所述的照明与成像系统，其中所述发射光的路径的中心从所述发射镜的点处反射出，并且其中所述点在所述捕获设备、所述发射镜或两者均相对于所述表面在对角线方向上移动时移动以缩短所述发射光的路径的长度。

58.根据权利要求39所述的照明与成像系统，还包括：

反射镜轴，其中所述发射镜配置为沿所述反射镜轴在第一对角线方向上移动；和

捕获设备轴，其中所述捕获设备配置为沿所述捕获设备轴在第二对角线方向上移动。

59.根据权利要求39所述的照明与成像系统，还包括传动块，所述传动块传递所述发射镜和所述捕获设备之间的移动，从而使所述发射镜和所述捕获设备同时移动。

60.根据权利要求59所述的照明与成像系统，还包括：

第一传动轴，所述第一传动轴在所述捕获设备和所述传动块之间延伸，其中所述捕获设备、所述传动块或两者均配置为沿所述第一传动轴移动；和

第二传动轴，所述第二传动轴在所述发射镜和所述传动块之间延伸，其中所述发射镜、所述传动块或两者均配置为沿所述第二传动轴移动。

61.根据权利要求60所述的照明与成像系统，还包括：

电机；和

传动螺杆，所述传动螺杆耦接到所述电机，其中所述电机配置为旋转所述传动螺杆，并且其中所述捕获设备、所述反射镜或两者均在所述对角线方向上移动以响应于所述传动螺杆的旋转。

62.根据权利要求39所述的照明与成像系统，还包括：

第一电机，所述第一电机配置为使所述发射镜在第一对角线方向上移动；和

第二电机，所述第二电机配置为使所述捕获设备在第二对角线方向上移动，其中所述反射镜和所述捕获设备同时移动，并且其中所述反射镜和所述捕获设备相对于彼此以固定的速率移动。

63.根据权利要求39所述的照明与成像系统，还包括第二光源，所述第二光源配置为从所述捕获设备下方射出光束，其中所述发射镜的下端被定位在所述捕获设的下端，甚至当所述发射光的路径的所述长度最小化时也是如此，使得所述反射镜的所述下端不阻挡所述光束。

64.一种照明与成像方法，包括：

将成像目标布置在表面上；

从光源射出一束光；

将所述光束分离为第一光束和第二光束；

对所述成像目标进行照明，其中所述照明包括：(i)使用第一照明镜反射第一光束以产生对表面进行照明的反射的第一光束，以及(ii)使用第二照明镜反射第二光束以产生对表面进行照明的反射的第二光束；并且

使用捕获设备通过从所述成像目标延伸、反射出发射镜并且到达所述捕获设备的路径捕获所述成像目标的图像。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述反射的第一光束和所述反射的第二光束提供对所述表面的偏轴照明。

66.根据权利要求64所述的方法，其中所述反射的第一光束和所述反射的第二光束提供对所述表面的基本上对称的照明。

67.根据权利要求64所述的方法，其中所述光束具有光束光功率，所述第一光束具有第一光束光功率并且第二光束具有第二光束光功率，并且其中所述第一光束光功率和第二光束光功率各自为所述光束光功率的至少40％。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述第一光束光功率和第二光束光功率各自为所述光束光功率的至少45％。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述第一光束光功率和第二光束光功率基本上相等。

70.根据权利要求64所述的方法，其中在对所述表面进行照明之前，利用第三照明镜反射所述反射的第一光束或所述反射的第二光束。

71.根据权利要求64所述的方法，其中所述光束被分离为所述第一光束、所述第二光束和第三束。

72.根据权利要求64所述的方法，其中所述光束由分束器进行拆分。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述分束器包括棱镜、板、介质反射镜、金属涂覆反射镜、分束器立方体、光纤分束器或光纤，所述光纤配置为在产生两个或更多个输出光束之前使光准直成束。

74.根据权利要求72所述的方法，其中所述第一光束反射出所述分束器，并且所述第二光束穿过所述分束器。

75.根据权利要求64所述的方法，其中所述反射的第一光束被分离为两个反射束，所述两个反射束对所述表面提供不同角度的偏轴照明。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述反射的第二光束被分离为两个反射束，所述两个反射束对所述表面提供不同角度的偏轴照明。

77.根据权利要求64所述的方法，其中所述第一光束的中心和所述第二光束的中心之间的角度为约62°至约68°。

78.根据权利要求65所述的方法，其中所述反射的第一光束的中心和所述反射的第二光束的中心之间的角度为约106°至约114°。

79.根据权利要求64所述的方法，其中从所述分束器到所述第一照明镜到所述表面的第一距离基本上等于从所述分束器到所述第二照明镜到所述表面的第二距离。

80.根据权利要求64所述的方法，其中电机使所述捕获设备、所述发射镜或两者均移动以缩短所述发射光的路径的长度。

81.根据权利要求80所述的方法，还包括通过传动块传递所述捕获设备和所述反射镜之间的移动，从而使所述捕获设备和所述反射镜在两个不同的对角线方向上同时移动。

82.根据权利要求81所述的方法，其中在所述反射镜移动时，所述反射镜的反射表面相对于所述成像表面保持对角取向。

83.根据权利要求82所述的方法，其中所述发射光的路径的中心从所述反射镜的点处反射出，并且其中所述点在所述捕获设备和所述反射镜相对于所述成像表面移动时移动以缩短所述发射光的路径的长度。

84.一种用于生成经过非均匀性校正的图像的方法，包括：

计算成像传感器上多个像素的成像透镜的相对照度；

基于所述相对照度生成平场校正矩阵；

捕获一个或多个生物样本的图像，其中所述图像具有非均匀性；以及

使用所述平场校正矩阵调整所捕获的图像以生成经过非均匀性校正的图像。

85.根据权利要求84所述的方法，其中生成平场校正矩阵包括对所述相对照度取倒数以生成平场校正矩阵。

86.根据权利要求84所述的方法，其中利用所述平场校正矩阵调整所捕获的图像包括将所捕获的所述一个或多个生物样本的图像乘以所述平场校正矩阵的所述值。

87.根据权利要求86所述的方法，其中调整还包括基于像素到像素将所捕获的所述一个或多个生物样本的图像乘以所述平场校正矩阵的所述值以生成经平场校正的图像。

88.根据权利要求84所述的方法，其中使用通过线性或非线性曲线拟合回归获得的公式计算所述相对照度。

89.根据权利要求88所述的方法，其中所述曲线可为一次多项式、二次多项式或三次多项式。

90.根据权利要求84所述的方法，其中所述平场校正矩阵为平场校正主矩阵。

91.根据权利要求84所述的方法，其中所述经平场校正的图像显示所捕获的所述一个或多个生物样本的各个图像的信号电平的正确率，而与其在视场上的位置无关。

92.根据权利要求84所述的方法，其中所述一个或多个生物样本包含生物分子，所述生物分子包括蛋白质、多肽、糖蛋白、改性蛋白、核酸、DNA、RNA、碳水化合物、脂质、脂多糖、生物聚合物或由细胞和组织产生的代谢物。

93.根据权利要求92所述的方法，其中所述生物分子分散、定位或嵌入膜、凝胶、滤纸、载玻片、微板或基质诸如聚丙烯酰胺凝胶或硝酸纤维素或PDVF膜印迹、琼脂糖凝胶、琼脂平板、细胞培养板或组织切片中。

94.根据权利要求84所述的方法，其中所述图像通过所述样本的化学发光变化生成。

95.根据权利要求84所述的方法，其中所述图像通过所述样本的荧光变化生成。

96.根据权利要求84所述的方法，其中，对于在所述视场上的不同位置处测得的相同信号，所述非均匀性显示为具有变化强度的信号的图像。

97.一种用于生成经过非均匀性校正的图像的方法，包括：

捕获一个或多个生物样本的图像，其中所述图像具有非均匀性；以及

利用平场校正矩阵调整所捕获的图像以生成经过非均匀性校正的图像。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述平场校正矩阵处于所述成像系统中。

99.根据权利要求97所述的方法，其中调整所捕获的图像包括基于像素到像素将所捕获的所述一个或多个生物样本的图像乘以所述平场校正矩阵的所述值以生成经平场校正的图像。

100.一种生成用于校正图像的非均匀性的平场校正矩阵的方法，包括：

计算成像传感器上多个像素的成像透镜的相对照度；以及

基于所述相对照度生成平场校正矩阵并进行归一化。

101.根据权利要求100所述的方法，其中所述平场校正矩阵处于成像器件中。

102.根据权利要求101所述的方法，其中所述平场校正矩阵对于使用所述成像器件的用户可用。

103.根据权利要求100所述的方法，其中生成平场校正矩阵包括对所述相对照度取倒数并且进行归一化。