CN107941769B - 一种甲基对硫磷的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲基对硫磷的检测方法，包括如下步骤：利用水热法制备氮掺杂碳量子点（N‑CDs），甲基对硫磷在碱性条件下分解产生对硝基酚，将制备的N‑CDs与水解产物对硝基酚混合，对硝基酚会吸收N‑CDs的荧光，使N‑CDs的荧光发生猝灭，因此可以通过荧光强度来检测甲基对硫磷的浓度。本发明样品不需要前处理，不需要大型仪器，操作简单，不需要添加酶，大大的降低了成本，检测专一性好，避免其它常见农药干扰，检测灵敏度高，检测限低，稳定性好。用途广泛，可以用于水果、蔬菜、河水样品等中甲基对硫磷的检测。本发明在检测分析领域具有良好的应用前景和潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种甲基对硫磷的检测方法。
背景技术
有机磷类农药具有药效高，用量少，防治对象多，在自然界中易分解等优点，使其在我国农业生产中得到广泛应用。其中，甲基对硫磷(MP)作为一种广谱性高效有机磷类杀虫剂、杀螨剂，曾在世界性范围内大量使用于粮食、棉花等农业作物的害虫防治。但甲基对硫磷对人畜具有剧毒性，可通过食道、呼吸道以及皮肤进入动物体内引起中毒。尽管目前我国已经禁止其生产和使用，可是甲基对硫磷中毒事件的报道时有发生，因此，实现对甲基对硫磷简便、快速、高灵敏度检测具有重要意义。
目前检测甲基对硫磷的方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、质谱分析法、毛细管电泳法、酶活法及电化学检测。这些传统的方法需要大型且昂贵的设备和专业的操作人员，样品前处理时间长，操作复杂，需要专业操作人员，且检测成本高。难以实现实时在线的快速、专一性检测。电化学检测法虽然具有成本低、体积小、操作简便、响应速度快、灵敏度高等特点，但是电化学检测法均是以酶为基底，由于酶易变性，使得酶电化学传感器不稳定且寿命短，因而限制了酶电化学传感器的应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种甲基对硫磷的检测方法，解决现有检测方法样品前处理时间长、操作复杂、稳定性差且检测成本高的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种甲基对硫磷的检测方法，包括如下步骤：
1）利用水热法制备氮掺杂碳量子点：
将邻苯二酚（儿茶酚）溶于超纯水中，然后加入乙二胺，完全溶解后转移至反应釜中，于150~200℃下水热反应20~48h，反应结束后自然冷却至20~25℃，离心得到黄色溶液，并对得到的黄色溶液进行透析，即得到氮掺杂碳量子点，避光保存，待用；
2）标准曲线的建立：
取步骤1）制备的氮掺杂碳量子点溶液平均分成若干份，分别向每份氮掺杂碳量子点溶液中滴加相同体积的PBS缓冲液，混合均匀，使混合溶液呈碱性，再向上述混合溶液中分别加入相同体积但浓度不同的甲基对硫磷标准溶液，于60~90℃下孵育，反应完成后，用荧光分光光度计分别测定加入不同浓度的甲基对硫磷标准液的混合溶液在510nm处的荧光强度，得到的荧光强度与甲基对硫磷浓度为0的混合溶液荧光强度的差值，即为荧光猝灭强度，以荧光猝灭强度为纵坐标，甲基对硫磷的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算得到标准曲线的回归方程，所述的氮掺杂碳量子点的加入量相对于甲基对硫磷的量是过量的；
3）待测物中甲基对硫磷浓度的测定：
取步骤1）制备的氮掺杂碳量子点溶液，然后向氮掺杂碳量子点溶液中滴加PBS缓冲液，混合均匀，使混合溶液呈碱性，再向上述混合溶液中加入待测样品溶液，于60~90℃下孵育，反应完成后，用荧光分光光度计测定上述混合溶液在510nm处的荧光强度，再将得到的荧光猝灭强度带入步骤2）得到的回归方程中，即得到待测物溶液中甲基对硫磷的浓度，所述的PBS缓冲液的滴加量和待测样品溶液的加入体积量分别与步骤2）中PBS缓冲液的滴加量和甲基对硫磷标准液的加入体积量相同，所述的氮掺杂碳量子点的加入量相对于待测液中甲基对硫磷的量是过量的。
优选的，所述邻苯二酚与乙二胺的摩尔比为1:1~5。
优选的，所述水热反应中，反应温度为180℃，反应时间24h。
优选的，所述透析过程中透析袋的截留分子量为500Da，透析时间为24~48h。
优选的，所述孵化温度为70~90℃。
优选的，所述孵化时间为20~35min。
优选的，所述PBS缓冲液的pH值为10~14。
本发明的检测原理是：甲基对硫磷中的基团P-O不稳定，其在碱性条件下容易分解，分解产生的对硝基酚在400nm处有强烈的吸收峰。而本发明合成的N-CDs其激发波长为410nm，发射波长为510nm。因此，N-CDs的激发波长与对硝基酚的吸收峰发生重叠，所以，二者同时存在时会发生内滤效应（图2），即对硝基酚会吸收N-CDs的荧光，使N-CDs荧光发生猝灭（图1），因此，待测样品中甲基对硫磷的浓度不同，N-CDs的荧光也会发生不同程度的猝灭，表现出荧光强度不同。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明通过N-CDs的荧光强度与甲基对硫磷的含量呈线性关系，实现了对甲基对硫磷的快速检测。在检测甲基对硫磷的过程中，样品不需要前处理，不需要大型仪器，操作简单，不需要添加酶，大大的降低了成本，检测专一性好，避免其他常见农药干扰，检测灵敏度高，检测限低，下限为1.31ppb，检测速度快，大大的提高了检测效率，稳定性好。用途广泛，可以用于水果、蔬菜、河水样品等的甲基对硫磷的检测。本发明在检测分析领域具有良好的应用前景和潜在应用价值。
附图说明
图1是甲基对硫磷的检测原理图；
图2是N-CDs与对硝基酚的内滤效果图；
图3是孵化温度对甲基对硫磷检测效果的影响；
图4是孵化时间对甲基对硫磷检测效果的影响；
图5是不同pH值的PBS缓冲溶液对甲基对硫磷检测效果的影响；
图6是N-CDs的光学表征图；
图7是不同浓度的甲基对硫磷对N-CDs的荧光淬灭强度的影响；
内小图是检测甲基对硫磷的标准曲线图；
图8是不同农药对提出的检测甲基对硫磷方法的响应。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
不同pH值的PBS缓冲溶液（0.2M）按照分子克隆试验指南配制。主要成分为NaCl、Na2HPO4•12H2O和NaH2PO4•2H2O。
一、一种甲基对硫磷的检测方法
实施例1
1）称取0.27g儿茶酚溶于25ml超纯水中，然后加入300ul乙二胺，超声5min后转移至50ml的反应釜中，在180℃下水热反应12h后自然冷却至20~25℃，在10000rpm转速下离心10min，得到黄色的N-CDs溶液，并将得到的N-CDs溶液用500Da的透析袋透析48h后，用去离子水稀释10倍后保存在4℃冰箱中待用。
2）取步骤1）制备的N-CDs溶液，平均分成2组，每组8份，每份30uL，向每份N-CDs溶液中加入2.92mLPBS缓冲液（0.2M，pH=12）混合均匀，使混合溶液呈碱性，再向其中一组混合溶液中加入50μl浓度为150ppm的MP溶液，另外一组混合溶液中未加入MP溶液。将上述每组混合溶液分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃孵化30min。反应完成后，用荧光分光光度计测定上述混合溶液在510nm处的荧光强度，得到的荧光强度与同温度下甲基对硫磷浓度为0的混合溶液荧光强度的差值，即为荧光猝灭强度，结果如图3所示。
从图3可以看出，随着温度的提高，相同浓度和相同体积的MP溶液的荧光猝灭强度不断的增强，当孵化温度为70℃，荧光猝灭强度达到最大值，即孵化温度为70℃时，混合溶液中的甲基对硫磷水解成硝基酚的效果最优。
实施例2
试验方法同实施例1，其中孵化温度为70℃，孵化时间设为变量，分别为5min、10min、15min、20min、25min、30min和35min。结果如图4所示。
从图4可以看出，随着孵化时间的增长，相同浓度和相同体积的MP溶液的荧光猝灭强度也在不断的增强，当孵化时间为25min以上，荧光猝灭强度变化不大，即孵化时间为25min时，混合溶液中的甲基对硫磷被彻底水解成硝基酚。
实施例3
试验方法同实施例1，其中孵化温度为70℃，PBS缓冲液的pH值为变量，分别为7、8、9、10、11、12、13和14。结果如图5所示。
从图5可以看出，随着缓冲溶液pH值不断的增大，相同浓度和相同体积的MP溶液的荧光猝灭强度也在不断的增强，当缓冲溶液pH值大于12时，荧光猝灭强度反而在不断的减弱，即缓冲溶液pH值为12时，混合溶液中的甲基对硫磷水解成硝基酚的效果最佳。
实施例4
1）N-CDs的合成：
称取0.27g儿茶酚溶于25ml超纯水中，然后加入300ul乙二胺，超声5min后转移至50ml的反应釜中，在180℃下水热反应12h后自然冷却至室温，在10000rpm转速下离心10min，得到黄色的N-CDs溶液，并将得到的N-CDs溶液用500Da的透析袋透析48h后，用去离子水稀释10倍后保存在4℃冰箱中待用。将合成的N-CDs进行光学表征，如图6所示。
从图6可以看出，合成的N-CDs的激发波长为410nm，发射波长为510nm。
2）标准曲线的建立
取步骤1）制备的N-CDs溶液，平均分成20份，每份30uL，向每份N-CDs溶液中加入2.92mLPBS缓冲液（0.2M，pH=12）混合均匀，使混合溶液呈碱性，再向分别每份混合溶液中加入50μL不同浓度的MP标准溶液，其浓度分别为0ppm、0.075ppm、0.1ppm、0.25ppm、0.5ppm、0.75ppm、1ppm、2ppm、4ppm、6ppm、8ppm、10ppm、12.5ppm、15ppm、17.5ppm、20ppm、25ppm、30ppm、40ppm和50ppm，然后分别在70℃下孵育25min保证其充分反应；然后分别测定加入不同浓度的MP标准液的混合物在510nm处的荧光强度。具体数据如表1所示。从表1和图7可以看出，当MP浓度达到17.5ppm以上时，混合溶液的荧光强度变化不大，说明混合溶液中的N-CDs的量相对于MP的加入量表现不足；当MP浓度达到25ppm以上时，混合溶液的荧光强度基本无变化，即混合溶液中的N-CDs的荧光完全猝灭，即使再增加MP的用量也不会再增加荧光猝灭。
表1
| 试验 | MP浓度（ppm） | 荧光强度（a.u.） | 试验 | MP浓度（ppm） | 荧光强度（a.u.） |
| 1 | 0 | 903.919 | 11 | 8 | 516.6027 |
| 2 | 0.075 | 894.221 | 12 | 10 | 448.235 |
| 3 | 0.1 | 882.0673 | 13 | 12.5 | 320.4311 |
| 4 | 0.25 | 875.7077 | 14 | 15 | 220.3254 |
| 5 | 0.5 | 862.7412 | 15 | 17.5 | 169.3996 |
| 6 | 0.75 | 848.8203 | 16 | 20 | 114.177 |
| 7 | 1 | 839.8864 | 17 | 25 | 69.11957 |
| 8 | 2 | 791.0782 | 18 | 30 | 67.14107 |
| 9 | 4 | 694.8942 | 19 | 40 | 56.321 |
| 10 | 6 | 609.0213 | 20 | 50 | 65.4847 |
得到的荧光强度与甲基对硫磷浓度为0的混合溶液荧光强度的差值，即为荧光猝灭强度。以荧光猝灭强度为纵坐标，甲基对硫磷浓度为横坐标，根据表1中第1-14试验组数据，绘制标准曲线。如图7的内小图所示。
通过图7内小图可以得出，标准曲线的线性范围是0.075-15ppm，线性方程为：Y=45.882X+18.197，R2=0.9934，检测线为1.31ppb，低于国际标准。可见，本发明线性范围宽，检测灵敏度高，能够实现对低浓度甲基对硫磷的检测。
二、甲基对硫磷的检测方法的专一性
1）将0.7g儿茶酚溶于25ml超纯水中，然后加入300ul乙二胺，超声5min后转移至50ml的反应釜中，在180℃下水热反应12h后自然冷却至室温，在10000rpm转速下离心10min，得到黄色的N-CDs溶液，并将得到的N-CDs溶液用500D的透析袋透析48h后，用去离子水稀释10倍后保存在4℃冰箱中待用。
2）取步骤1）制备的N-CDs溶液，平均分成15份，每份30uL，向每份N-CDs溶液中加入2.92mLPBS缓冲液（0.2M，pH=12）混合均匀，使混合溶液呈碱性，再向前体溶液中分别加入50μL浓度为150ppm的其它常见农药：多菌灵(CB)，溴氰菊酯(DT)，三唑酮(TA)，毒死蜱(CR)，异丙威(IP)，西维因(CP)，氧乐果(OM)，马拉硫磷(MT)，甲拌磷(PR)，乙拌磷(PG)，涕灭威(AD)，敌百虫(TC)，甲胺磷(MT)，草甘膦(GP)，和50μL浓度为15ppm甲基对硫磷(MP)，然后将上述混合液均放于70℃下孵育25min保证其充分反应。
用荧光分光光度计分别测定加有不同常见农药的混合液在510nm处的荧光强度，然后计算出不同常见农药的荧光猝灭强度，绘制不同常见农药对N-CDs溶液中荧光的影响。如图8所示。
从图8可以看出，其它常见农药加入后对N-CDs溶液中荧光变化均不大，即其它常见农药对N-CDs发射的荧光影响不大，其影响可忽略，可见，本方法对检测甲基对硫磷具有很好的特异性，对其它常见农药具有很好的抗干扰能力。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种甲基对硫磷的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）利用水热法制备氮掺杂碳量子点：
将邻苯二酚溶于超纯水中，然后加入乙二胺，完全溶解后转移至反应釜中，于150~200℃下水热反应20~48h，反应结束后自然冷却至20~25℃，离心得到黄色溶液，并对得到的黄色溶液进行透析，即得到氮掺杂碳量子点，避光保存，待用；
2）标准曲线的建立：
取步骤1）制备的氮掺杂碳量子点溶液平均分成若干份，分别向每份氮掺杂碳量子点溶液中滴加相同体积的PBS缓冲液，混合均匀，使混合溶液呈碱性，再向上述混合溶液中分别加入相同体积但浓度不同的甲基对硫磷标准溶液，于60~90℃下孵育，反应完成后，用荧光分光光度计分别测定加入不同浓度的甲基对硫磷标准液的混合溶液在510nm处的荧光强度，得到的荧光强度与甲基对硫磷浓度为0的混合溶液荧光强度的差值，即为荧光猝灭强度，以荧光猝灭强度为纵坐标，甲基对硫磷的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算得到标准曲线的回归方程，所述的氮掺杂碳量子点的加入量相对于甲基对硫磷的量是过量的；
3）待测物中甲基对硫磷浓度的测定：
取步骤1）制备的氮掺杂碳量子点溶液，然后向氮掺杂碳量子点溶液中滴加PBS缓冲液，混合均匀，使混合溶液呈碱性，再向上述混合溶液中加入待测样品溶液，于60~90℃下孵育，反应完成后，用荧光分光光度计测定上述混合溶液在510nm处的荧光强度，再将得到的荧光猝灭强度带入步骤2）得到的回归方程中，即得到待测物溶液中甲基对硫磷的浓度，所述的PBS缓冲液的滴加量和待测样品溶液的加入体积量分别与步骤2）中PBS缓冲液的滴加量和甲基对硫磷标准液的加入体积量相同，所述的氮掺杂碳量子点的加入量相对于待测液中甲基对硫磷的量是过量的。
2.根据权利要求1所述甲基对硫磷的检测方法，其特征在于，所述邻苯二酚与乙二胺的摩尔比为1:1~5。
3.根据权利要求1所述甲基对硫磷的检测方法，其特征在于，所述水热反应中，反应温度为180℃，反应时间24h。
4.根据权利要求1所述甲基对硫磷的检测方法，其特征在于，所述透析过程中透析袋的截留分子量为500Da，透析时间为24~48h。
5.根据权利要求1所述甲基对硫磷的检测方法，其特征在于，所述孵育温度为70~90℃。
6.根据权利要求1所述甲基对硫磷的检测方法，其特征在于，所述孵育时间为20~35min。
7.根据权利要求1所述甲基对硫磷的检测方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的pH值为10~14。
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