CN107941588B - 基于纳米压痕和纳米划痕的钙化骨力学性能实验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于纳米压痕和纳米划痕的钙化骨力学性能实验方法，属于生物材料微纳米力学测试方法。将关节软骨置于金属试样杯中，通过接触力学判断准则，获得每条划痕过渡区的起始点和结束点位置。以矩形区域左下角顶点为零点，建立包括全部划痕路径的直角坐标系，并将过渡区的起始点和结束点依次连接成线。将计算得到的结构柔度与仪器框架的结构柔度相加得到修正后的框架柔度，重新计算骨与钙化骨弹性模量，获得修正后的骨与钙化骨弹性模量。通过本发明可以有效的判断一定深度下的骨‑钙化骨界面影响区，当压入深度小于划痕深度时，可以有效避免压痕压入在骨‑钙化骨复合相，获得钙化骨的纳米压痕力学性能。

Description

基于纳米压痕和纳米划痕的钙化骨力学性能实验方法

技术领域

本发明属于生物材料微纳米力学测试方法，特别是通过纳米压痕和纳米划痕进行实验的方法。

背景技术

成熟的关节软骨自关节面向深部可分为浅表层、过渡层、辐射层和钙化骨4层结构。未成熟的关节软骨仅具软骨细胞增殖区，以满足生长。其中，关节面的浅表层增殖区扩大了关节软骨的范围，而深层增殖区则以成骨方式形成软骨下骨，此时软骨钙盐沉积与吸收处于平衡，使骨骼继续长粗、长长。骨骼发育成熟后，即17岁以后，软骨内骨化生长随之停止，此时基质沉积的钙盐不再被吸收，形成钙化骨结构。

钙化骨位于潮线与黏合线之间，结构致密，内有少量软骨细胞。潮线结构是关节软骨成熟的标志，是钙化骨与未钙化软骨之间分界线，利用特异性染色方法可以清晰显示潮线结构。关节软骨的非钙化骨与钙化骨之间存在间隙，骨刀垂直关节表面，通过骨锤敲击后，可使软骨的非钙化骨从潮线处与钙化骨分开。扫描电镜观察界面结果显示，非钙化骨呈现沟壑状结构，沟面为分布均匀的絮状突起；钙化骨表面为分布均匀的沙硕状突起。将界面相互铆合的沟壑状结构为一种界面之间的连接方式――“沟壑铆合”，非钙化骨的细小絮状突起与钙化骨的沙硕状突起之间形成另外一种连接方式――“沙硕镶嵌”。虽然两种连接方式均以突起与凹陷铆合，但两者存在明显不同。“沟壑铆合”连接方式中，非钙化骨主要呈现壑状凸起，钙化骨主要呈现沟状凹陷；在“沙硕镶嵌”连接方式中，钙化骨表面的沙硕状突起被镶嵌在非钙化骨表面的絮状突起之间。这不但增加了界面之间的连接面积，也增加了连接强度。尽管如此，潮线结构依然是关节最脆弱的地方，在外伤或病变导致软骨分离时，剥离的位置往往在潮线结构。由于骨-钙化骨之间是交错铆合的，所报道文献在钙化骨上的测试点均是随机选择，使得在钙化骨上的测试结果常常受到基底效应和周边效应的影响，需要设计一种方法来避免这些影响。通常采用组织形态学相关技术与方法，可以对骨组织的形态结构进行有效的研究。可以取骨包埋块连续切片，染色后在显微镜下获得组织的染色图像，通过图像处理软件采集界面轮廓，再通过建模软件进行三维重建。也可以将组织固定后选用CT、micro-CT、X-ray等对骨组织进行逐层扫描，将扫描得到的图片拼接重建。前一种方法分辨力高，理论上可以将通过纳米压痕法测试完的试样通过此方法筛选不受基底效应和周边效应的影响的点，然而由于生物材料性能分散度高，常常需要大量实验，此方法显然不适于批量实验研究。后一种方法较易完成，依然需要后期建模研究，而且十微米左右的精度也难于满足选择的要求。纳米压痕仪和原子力显微镜的原位扫描模式提供了一种接触扫描的方法，施加微小的力使得压头与试样表面接触，通过往复的接触扫描使得压头以一定的力同试样保持接触，进而输出试样的形貌、接触刚度、相位角和简谐位移等一系列材料性能，可以用来描述材料表面形貌、表面刚度的变化，然而这些都是材料表面性能，依然难于描述当压头压入一定深度后基底效应和周边效应的影响。

纳米划痕法作为复杂磨损的简化，可以评估薄膜与基材的结合能力，测试界面结合强度和摩擦系数。可以用于测定粘弹性材料在各种温度条件下的力学性能和划入特性之间的关系，分析粘弹性对划入阻力的影响。随着生物科学和仿生科学的迅速发展，尤其是在生物材料及其仿生领域所取得的成果，人们越来越关心生物材料表面及内部的微观乃至纳观力学性能，因此，纳米划痕测试在生物材料领域也得到了广泛应用。本发明将纳米划痕测试做为一种原位的实验方法用于判断骨-钙化骨界面影响区，然而由于使用载荷线性增加加载方式和载荷恒定加载方式时，压头划入被测试样深度非恒定值，划过不同相的载荷不能定量比较，所以本章提出了通过反馈划入深度不变的方法来定量研究载荷变化，通过其判断界面影响区形貌，在界面影响区外的划痕间设置压痕，得到骨区和钙化骨区进行压痕测试的结果，并引入边界接触理论中的经典修正公式，考虑了结构柔度引起的纳米压痕仪框架柔度的变化，重新计算后得到骨与钙化骨的弹性模量，避免了压痕实验的盲目性，提高了实验结果的可信度。

现将常规划痕方法和钙化骨测量中的问题概述如下：

第一，常规接触扫描的方法(原子力显微镜或者纳米压痕仪)可以根据扫描得到接触刚度或者接触力，进而计算出骨-钙化骨区域的弹性模量，但是测得结果会受到表面特性影响，而且无法准确区分一定区域的骨和钙化骨测试结果。

第二，常规获得钙化骨力学性能的方法通过光学显微镜观察骨-钙化骨界面，进而在钙化骨区进行定位压痕，这种方法无法确定一定深度下是钙化骨还是骨，测得结果受不确定的基底效应影响。

第三，常规获得钙化骨力学性能的方法先在骨-钙化骨混合区设置大量的压痕点，压痕实验完成后，对试样脱水、切片、染色和观察，判断压头位置受到基底相的影响。观察时，压痕常常不准，而且对一次压痕需要反复对比多张染色后图像，分析困难，测试效率很低。

第四，常规通过纳米压痕仪进行的划痕方法通过法相力变化控制划痕过程，这使得在不同材料上划痕深度不同，即在不同相上进行划痕时压头与试样相对位置是不同的，这使得无法通过接触力学判断准则获得界面影响区的宽度。

第五，常规通过纳米压痕仪进行的划痕方法基底效应和周边效应、试样粗糙度、磨抛引起的亚表面损伤、表面粘性、凸起或者凹陷等影响不是恒定的，通过非恒深度划痕测得的影响区难于分析，无法得到定量的结论。

第六，引入边界接触理论中的经典修正公式，考虑了结构柔度引起的纳米压痕仪框架柔度的变化，重新计算后得到骨与钙化骨的弹性模量，避免了压痕实验的盲目性，提高了实验结果的可信度。

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发明内容

通过本发明可以有效的判断一定深度下的骨-钙化骨界面影响区，当压入深度小于划痕深度时，可以有效避免压痕压入在骨-钙化骨复合相，获得钙化骨的纳米压痕力学性能。

本发明采用的技术方案为基于纳米压痕和纳米划痕的钙化骨力学性能实验方法，该方法的具体步骤如下：首先，将关节软骨置于金属试样杯中，提动关节韧带，保证被测关节软骨表面高于试样杯口0.5毫米-1毫米。对高于试样杯口的关节表面通过生物材料研磨、抛光方法，制成用于纳米压痕实验的试样。通过纳米压痕仪自带光学显微镜定位一定范围骨-钙化骨的矩形区域。划痕起始位置为矩形区域的左边界，划痕开始之前在起始点进行预压入五次。通过反馈调节方法，使得压头保持恒定划入深度，慢速划过骨、界面和钙化骨，接下来按照平行、等间距、等深度进行划痕操作。通过接触力学判断准则，获得每条划痕过渡区的起始点和结束点位置。以矩形区域左下角顶点为零点，建立包括全部划痕路径的直角坐标系，将划痕路径上采集点的坐标导入origin，并将过渡区的起始点和结束点依次连接成线。在起始点连线左侧相邻划痕间中心位置进行压入深度小于划痕深度的压痕实验，即测得未修正的骨弹性模量；在结束点连线右侧相邻划痕间中心位置进行压入深度小于划痕深度的压痕实验，即测得未修正的钙化骨弹性模量。将测得弹性模量带入修正公式，计算获得划痕引起的结构柔度。将计算得到的结构柔度与仪器框架的结构柔度相加得到修正后的框架柔度，重新计算骨与钙化骨弹性模量，获得修正后的骨与钙化骨弹性模量。

矩形区域延划痕方向的长度为100微米-200微米。

反馈调节方法，对PID(比例(proportion)、积分(integral)、导数(derivative))控制器进行调解时，P值为10000至1000000，I值为100至500，D值为1000至10000，调节时力的变化速度是±0.1毫牛/秒至±1毫牛/秒。

接触力学判断准则，实验用Berkovich压头是三棱锥压头，在划痕过程中通过棱划开试样，为分析方便简化为二维模型的一个边，叫做前边。由于划痕过程中后侧面不与被测材料接触，将后侧面简化为二维模型的一个边，叫做后边。由于当划入深度为数微米时，压头在划痕过程中不会划到骨与钙化骨多相交叉在一起的情况，因此将划入过程中骨与钙化骨间的边界简化成一条直线。

前边与划痕方向的夹角α₁同边界与划痕方向的夹角α₂会有三种关系，即：(1).α₁＞α₂；(2).α₁＜α₂；(3).α₁＝α₂。

如图1所示，当α₁＞α₂时，前边先在骨中进行划痕，载荷为恒定，体现在力与划痕距离的关系为一条近似平行于x轴的直线，即骨性能平台。随着划痕的进行，前边的底部在划痕过程中将最先接触边界，此时为压头位置1。随着划痕的进行，前边将逐渐划入骨-钙化骨的混合区，此时体现在力与划痕距离的关系为一个过渡区，由于钙化骨力学性能差，载荷会逐渐降低直到前边完全进入钙化骨一侧，此时为压头位置2，从压头位置1至压头位置2的过渡区宽为L₁。从第二个压头的位置开始前边将全部进入钙化骨内，所以随着划痕的继续进行，体现在力与划痕距离的关系为一条近似平行于x轴的直线，即钙化骨性能平台。若沿着划痕方向设置的一系列压痕得到纯相性能，必须保证整个压头，即前边和后边，同时在一种相内，在压头位置1之前的压痕完全落入骨区域，则此时界面影响区起始点即压头位置3与过渡区的起始点即压头位置1重合，而在压头位置2时后边仍然部分落入骨相中，压头位置2延划痕方向向右平移一个接触直径的宽度即得到界面影响区的结束点即压头位置4，只有在压头位置4之后的位置进行压痕才能保证整个压头完全位于钙化骨相上。

当α₁＜α₂时，获得骨性能平台后，随着划痕的进行，前边的顶部在划痕过程中将最先接触边界，此时为压头位置1。随着划痕的进行，前边将逐渐划入骨-钙化骨的混合区，此时体现在力与划痕距离的关系为一个过渡区，由于钙化骨力学性能较差，载荷会逐渐降低直到前边完全进入钙化骨一侧，此时为压头位置2。从第二个压头的位置开始前边将全部进入钙化骨内，所以随着划痕的继续进行，体现在力与划痕距离的关系为一条平行于x轴的直线，即钙化骨性能平台。在压头位置1的之前进行压入的压痕将全部落入骨相，而在压头位置2之后进行的压痕将全部落入钙化骨相。此时，过渡区的起始点压头位置1与界面影响区的起始点压头位置3重合，过渡区的结束点即压头位置2与界面影响区的结束点即压头位置4重合，即L₁＝L₂。

当α₁＝α₂时，棱边同骨-钙化骨边界平行，随着划痕的进行，全部棱边在划痕过程中接触边界，载荷随划痕距离会有一个跳跃，由骨性能平台直接跳入钙化骨性能平台，所以此时的压头位置1与压头位置2是重合的，即L₁＝0。在压头位置3之前进行压入的压入将全部落入骨相，而在距离压头位置3一个接触直径宽度的压头位置4之后进行的压入将全部落入钙化骨相，即此时的L₂宽度等于接触直径。

修正公式为

式中C_s为划痕引起的结构柔度，ν为泊松比，E为未修正的弹性模量，当压痕位置位于两条划痕之间时d为压痕中心点距离划痕中心点之间的距离。

本发明可以解决常规方法测试钙化骨力学性能时带来的问题，如下：常规接触扫描的方法(原子力显微镜或者纳米压痕仪)可以根据扫描得到接触刚度或者接触力，进而计算出骨-钙化骨区域的弹性模量，但是测得结果会受到表面特性影响，而且无法准确区分一定区域的骨和钙化骨测试结果；常规获得钙化骨力学性能的方法通过光学显微镜观察骨-钙化骨界面，进而在钙化骨区进行定位压痕，这种方法无法确定一定深度下是钙化骨还是骨，测得结果受不确定的基底效应影响；常规获得钙化骨力学性能的方法先在骨-钙化骨混合区设置大量的压痕点，压痕实验完成后，对试样脱水、切片、染色和观察，判断压头位置受到基底相的影响。观察时，压痕常常不准，而且对一次压痕需要反复对比多章染色后图像，分析困难，测试效率很低；常规通过纳米压痕仪进行的划痕方法通过法相力变化控制划痕过程，这使得在不同材料上划痕深度不同，即在不同相上进行划痕时压头与试样相对位置是不同的，这使得无法通过接触力学判断准则获得界面影响区的宽度；常规通过纳米压痕仪进行的划痕方法基底效应和周边效应、试样粗糙度、磨抛引起的亚表面损伤、表面粘性、凸起或者凹陷等影响不是恒定的，通过非恒深度划痕测得的影响区难于分析，无法得到定量的结论。

附图说明

图1接触力学判断准则示意图，(a).α₁＞α₂；(b).α₁＜α₂；(c).α₁＝α₂。

具体实施方式

本发明基于纳米压痕技术和纳米划痕技术的钙化骨力学性能实验方法其特征在于：首先，将关节软骨镶嵌、研磨、抛光，制成用于纳米压痕实验的试样。通过纳米压痕仪自带光学显微镜定位一定范围的骨-钙化骨矩形区域。划痕起始位置为矩形区域的左边界，划痕开始之前在起始点进行预压入。通过反馈调节方法，使得压头保持恒定的划入深度，依次划过骨、界面和钙化骨，完成一系列平行、等间距、等深度的划痕。以矩形区域左下角顶点为零点，建立包括全部划痕路径的直角坐标系，将划痕路径上采集点的坐标导入origin。通过接触力学判断准则，获得每条划痕过渡区的起始点和结束点位置，并将过渡区的起始点和结束点依次连接成线。在起始点连线左侧相邻划痕间中心位置进行压入深度小于划痕深度的压痕实验，即可测得骨微尺度力学性能；在结束点连线右侧相邻划痕间中心位置进行压入深度小于划痕深度的压痕实验，即可测得钙化骨微尺度力学性能。实例1测量钙化骨弹性性能

应用基于纳米压痕技术和纳米划痕技术的钙化骨力学性能实验方法检测骨和钙化骨力学性能，首先，通过纳米压痕仪自带光学显微镜定位典型骨-钙化骨的矩形混合区域200微米×200微米。反馈调节P值为200000，I值为200，D值为5000，调节时力的变化速度是±0.1毫牛/秒。设置划痕数量11条，间隔20微米。预压入深度2微米，压入速度0.2微米/秒，划痕速度5微米/秒。以矩形区域左下角顶点为零点，建立直角坐标系，将测得结果导入origin。通过接触力学判断准则，获得每条划痕过渡区的起始点和结束点位置，并将过渡区的起始点和结束点依次连接成线。在结束点连线右侧相邻划痕中心位置选点进行压痕实验，点左右间隔10微米，压入深度500纳米，加载速度50纳米/秒，保载时间200秒，通过Oliver-Pharr模型获得未修正的弹性模量。将未修正的弹性模量带入修正公式，计算获得划痕引起的结构柔度。将计算得到的结构柔度与仪器框架的结构柔度相加得到修正后的框架柔度，重新计算骨与钙化骨弹性模量，获得修正后钙化骨的弹性模量。

实例2测量钙化骨粘弹性性能

应用基于纳米压痕技术和纳米划痕技术的钙化骨力学性能实验方法检测骨和钙化骨力学性能，首先，通过纳米压痕仪自带光学显微镜定位典型骨-钙化骨的矩形混合区域200微米×200微米。反馈调节P值为200000，I值为200，D值为5000，调节时力的变化速度是±0.1毫牛/秒。设置划痕数量11条，间隔20微米。预压入深度2微米，压入速度0.2微米/秒，划痕速度5微米/秒。以矩形区域左下角顶点为零点，建立直角坐标系，将测得结果导入origin。通过接触力学判断准则，获得每条划痕过渡区的起始点和结束点位置，并将过渡区的起始点和结束点依次连接成线。在起始点连线左侧相邻划痕中心位置选点进行压痕实验，点左右间隔10微米，压入深度500纳米，加载速度50纳米/秒，保载时间200秒，通过Oliver-Pharr模型获得未修正的弹性模量。将未修正的弹性模量带入修正公式，计算获得划痕引起的结构柔度。将计算得到的结构柔度与仪器框架的结构柔度相加得到修正后的框架柔度，重新计算骨与钙化骨弹性模量，获得修正后钙化骨的弹性模量并得到修正后的压痕深度-时间曲线。最后通过考察保载段变形量与保持时间的关系获得钙化骨粘弹性性能。

Claims (3)

1.基于纳米压痕和纳米划痕的钙化骨力学性能实验方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：首先，将关节软骨置于金属试样杯中，提动关节韧带，保证被测关节软骨表面高于试样杯口0.5毫米-1毫米；对高于试样杯口的关节表面通过生物材料研磨、抛光方法，制成用于纳米压痕实验的试样；通过纳米压痕仪自带光学显微镜定位一定范围骨-钙化骨的矩形区域；划痕起始位置为矩形区域的左边界，划痕开始之前在起始点进行预压入五次；通过反馈调节方法，使得压头保持恒定划入深度，慢速划过骨、界面和钙化骨，接下来按照平行、等间距、等深度进行划痕操作；通过接触力学判断准则，获得每条划痕过渡区的起始点和结束点位置；以矩形区域左下角顶点为零点，建立包括全部划痕路径的直角坐标系，将划痕路径上采集点的坐标导入origin，并将过渡区的起始点和结束点依次连接成线；在起始点连线左侧相邻划痕间中心位置进行压入深度小于划痕深度的压痕实验，即测得未修正的骨弹性模量；在结束点连线右侧相邻划痕间中心位置进行压入深度小于划痕深度的压痕实验，即测得未修正的钙化骨弹性模量；将测得弹性模量带入修正公式，计算获得划痕引起的结构柔度；将计算得到的结构柔度与仪器框架的结构柔度相加得到修正后的框架柔度，重新计算骨与钙化骨弹性模量，获得修正后的骨与钙化骨弹性模量；

接触力学判断准则，实验用Berkovich压头是三棱锥压头，在划痕过程中通过棱划开试样，为分析方便简化为二维模型的一个边，叫做前边；由于划痕过程中后侧面不与被测材料接触，将后侧面简化为二维模型的一个边，叫做后边；由于当划入深度为数微米时，压头在划痕过程中不会划到骨与钙化骨多相交叉在一起的情况，因此将划入过程中骨与钙化骨间的边界简化成一条直线；

前边与划痕方向的夹角α₁同边界与划痕方向的夹角α₂会有三种关系，即：(1).α₁＞α₂；(2).α₁＜α₂；(3).α₁＝α₂；

当α₁＞α₂时，前边先在骨中进行划痕，载荷为恒定，体现在力与划痕距离的关系为一条近似平行于x轴的直线，即骨性能平台；随着划痕的进行，前边的底部在划痕过程中将最先接触边界，此时为压头位置1；随着划痕的进行，前边将逐渐划入骨-钙化骨的混合区，此时体现在力与划痕距离的关系为一个过渡区，由于钙化骨力学性能差，载荷会逐渐降低直到前边完全进入钙化骨一侧，此时为压头位置2，从压头位置1至压头位置2的过渡区宽为L₁；从压头位置2开始前边将全部进入钙化骨内，所以随着划痕的继续进行，体现在力与划痕距离的关系为一条近似平行于x轴的直线，即钙化骨性能平台；若沿着划痕方向设置的一系列压痕得到纯相性能，必须保证整个压头，即前边和后边，同时在一种相内，在压头位置1之前的压痕完全落入骨区域，则此时界面影响区起始点即压头位置3与过渡区的起始点即压头位置1重合，而在压头位置2时后边仍然部分落入骨相中，压头位置2延划痕方向向右平移一个接触直径的宽度即得到界面影响区的结束点即压头位置4，只有在压头位置4之后的位置进行压痕才能保证整个压头完全位于钙化骨相上；

当α₁＜α₂时，获得骨性能平台后，随着划痕的进行，前边的顶部在划痕过程中将最先接触边界，此时为压头位置1；随着划痕的进行，前边将逐渐划入骨-钙化骨的混合区，此时体现在力与划痕距离的关系为一个过渡区，由于钙化骨力学性能较差，载荷会逐渐降低直到前边完全进入钙化骨一侧，此时为压头位置2；从压头位置2开始前边将全部进入钙化骨内，所以随着划痕的继续进行，体现在力与划痕距离的关系为一条平行于x轴的直线，即钙化骨性能平台；在压头位置1的之前进行压入的压痕将全部落入骨相，而在压头位置2之后进行的压痕将全部落入钙化骨相；此时，过渡区的起始点压头位置1与界面影响区的起始点压头位置3重合，过渡区的结束点即压头位置2与界面影响区的结束点即压头位置4重合，即L₁＝L₂；

当α₁＝α₂时，棱边同骨-钙化骨边界平行，随着划痕的进行，全部棱边在划痕过程中接触边界，载荷随划痕距离会有一个跳跃，由骨性能平台直接跳入钙化骨性能平台，所以此时的压头位置1与压头位置2是重合的，即L₁＝0；在压头位置3之前进行压入的压入将全部落入骨相，而在距离压头位置3一个接触直径宽度的压头位置4之后进行的压入将全部落入钙化骨相，即此时的L₂宽度等于接触直径；

修正公式为

式中C_s为划痕引起的结构柔度，ν为泊松比，E为未修正的弹性模量，当压痕位置位于两条划痕之间时d为压痕中心点距离划痕中心点之间的距离。

2.根据权利要求1所述基于纳米压痕和纳米划痕的钙化骨力学性能实验方法，其特征在于：矩形区域沿划痕方向的长度为100微米-200微米。

3.根据权利要求1所述基于纳米压痕和纳米划痕的钙化骨力学性能实验方法，其特征在于：反馈调节方法，对PID控制器进行调解时，P值为10000至1000000，I值为100至500，D值为1000至10000，调节时力的变化速度是±0.1毫牛/秒至±1毫牛/秒。

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