CN107937325A - 一种柠檬酸杆菌菌株及其应用 - Google Patents

一种柠檬酸杆菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于环境微生物领域，涉及一种柠檬酸杆菌菌株及其应用。该柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)名称为除臭菌ZT‑S5，于2017年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.15120。本发明提供的柠檬酸杆菌菌种活力高，适应性强，可广泛用于水体和气体中硫化氢和氨的生物处理过程中。以该菌株吸附后制成的生物除臭装置，能很好地抵御废气的冲击，实现生物除臭的应用。

Description

一种柠檬酸杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，涉及一种柠檬酸杆菌菌株及其应用。
背景技术
随着经济的不断发展，城市化进程的不断推进，人们生活水平不断提高，污水处理厂、污水提升站、垃圾中转站、垃圾填埋场等市政处理设施距离人们的生活区越来越近，这些设施在运行过程中产生的恶臭废气已成为影响人们正常生活的一个重要因素。恶臭废气主要包括含硫化合物、含氮化合物、卤素及其衍生物、烃类、含氧的有机、有机酸等。
恶臭气体以空气为传播介质，通过呼吸系统对人体健康产生危害。而硫化氢和氨气由于其自身的特殊性，即臭阈值低，处理后的空气中的臭气浓度要求低，这有别于一般的臭气处理，要求更加高效和彻底的对臭气进行去除。
除臭方法一般可以分为两类：一类是从源头上对恶臭气体进行去除，主要通过改良生产工艺。另一类是对尾气的处理和净化，使排出的气体洁净无污染。尾气净化常采用物理法、化学法、生物法以及等离子法进行对臭气的去除处理。
生物除臭法一般经过三个步骤：
(1)废气中的臭气分子由气相进入液相，溶解入生物膜表面的液膜中。
(2)溶解到水中的臭气分子进一步扩散到生物膜表面，接着被微生物代谢分解。
(3)进入微生物细胞的臭气分子被代谢分解，排除无机小分子物质和离子等，从而净化空气。
微生物除臭则是利用微生物的方法进行除臭。去除臭气中硫化氢的微生物有排硫硫杆菌(ThiobacillusThioparu)、氧化硫硫杆菌(ThiobacillusThiooxidans)和脱氮硫杆菌 (Thiobacillusdenitrificans)等，去除氨气的菌株主要有假单胞菌属等。而关于柠檬酸杆菌去除硫化氢和氨气目前还未发现相关的报道。
发明内容
针对现有技术存在的空白，本发明提供柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)菌株及其应用，柠檬酸杆菌属肠细菌科，目的是决现在环境中废气废水中硫化氢，氨气所产生的臭气气体，给人们生活带来困扰的问题。
本发明的柠檬酸杆菌菌株，名称为除臭菌ZT-S5，于2017年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.15120，分类命名为：檬酸杆菌Citrobacter sp.；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
所述的柠檬酸杆菌菌株呈现典型的柠檬酸杆菌菌落形态，菌落为湿润、隆起、乳白色、边缘整齐。
本发明还提供所述的柠檬酸杆菌菌株在废水除臭方面的应用。
本发明还提供一种生物除臭装置，生物除臭装置包括所述的柠檬酸杆菌菌株。
所述的生物除臭装置中中活菌总浓度为1×108CFU/mL。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
(1)本发明从不同样本中分离、筛选到高效去除硫化氢和氨气的优势柠檬酸杆菌菌种ZT-S5，经过驯化成高效稳定的菌株，经过试验，该菌株经过18h后就能在LB培养基上生长到最大浓度，能在30-40℃，pH5-9，次氯酸钠5mg/L的条件下正常生长，接种到废水中在8小时对水中的硫化氢去除率达到60％以上，对废水中氨的去除率接近60％，在火山石等固体载体上吸附后通气30小时后对废气中的氨和硫化氢的去除率达到100％，说明该菌种活力高，适应性强，可广泛用于水体和气体中硫化氢和氨的生物处理过程中。以该菌株吸附后制成的生物除臭装置，经过实际运行，30天后去除率达到100％，连续运行4 个月，去除效果稳定，说明制成的生物除臭装置能很好地抵御废气的冲击，实现生物除臭的应用。
(2)本发明提供的柠檬酸杆菌菌活力高，适应性强，能够广泛用于废水中硫化氢和氨气的去除。
附图说明
图1是除臭菌株ZT-S5在LB中12小时生长曲线图；
图2是菌株ZT-S5的最适培养温度；
图3是菌株ZT-S5的最适培养pH；
图4是本发明的除臭菌株ZT-S5的菌落形态图；
图5是5mg/L的浓度范围内的次氯酸钠对菌株ZT-S5生长无明显影响图；
图6是实施例2中菌株ZT-S5在污水中的CFU计数；
图7是实施例2中菌株ZT-S5对硫化氢的去除率；
图8是实施例2中菌株ZT-S5对氨气的去除率；
图9是实施例2中全过程中菌株ZT-S5对硫化氢的去除效果；
图10是实施例2中全过程中菌株ZT-5对氨气的去除效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。
本研究采用菌株对废水中硫化氢和氨气的去除率作为评价标准。
实施例1
本实施例是对除臭菌株ZT-S5的筛选与鉴定：
1.培养
以下试验用培养基在制备过程中均在121℃灭菌20min。
Luria-Bertani培养基(LB)：胰蛋白胨10.0g，氯化钠(NaCl)10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000mL，pH＝7.4，121℃下灭菌20min。其在LB中12小时生长曲线如图1所示，该菌株经过18h后就能在LB培养基上生长到最大浓度。
牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：牛肉膏3.0g，氯化钠(NaCl)5.0g，蛋白胨10.0g，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000mL，pH＝7.5±0.1，121℃下灭菌20min。
含氨富集培养基：蔗糖5.0g，蛋白胨2.0g，磷酸二氢钾(KH2PO4)2.0g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钠(NaCl)2.0g，硫酸锌(ZnSO4)0.05g，硫酸亚铁(FeSO4) 0.04g，氨水5.0mL(过滤除菌，灭菌后加入)，涂布、纯化时加入琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000mL，pH＝7.0，121℃下灭菌20min。
异养硝化培养基:柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)5.0g，硫酸铵((NH4)2SO4)0.45g，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.25g，硫酸铁(FeSO4·7H2O)0.0025g，氯化钠(NaCl)0.125g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.06g，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.001g，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000mL，pH＝7.0，121℃下灭菌20min。
含硫富集培养基：氯化铵(NH4Cl)2.0g，氯化镁(MgCl2)0.5g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)3.0g，硫化钠(Na2S·9H2O)10.0g(过滤除菌，灭菌后加入)，氯化钙 (CaCl2·6H2O)0.2g，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000mL，pH＝6.1±0.1，121℃下灭菌20min。
含硫纯化培养基：氯化铵(NH4Cl)2.0g，氯化镁(MgCl2)0.5g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)3.0g，硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)10.0g，氯化钙(CaCl2·6H2O)0.2g，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000mL，pH＝6.1±0.1，121℃下灭菌20min。
降解硫化物培养基：硫化钠(Na2S·9H2O)0.1g，氯化铵(NH4Cl)0.4g，氯化镁(MgCl2) 0.2g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g，碳酸钠(Na2CO3)0.4g，加蒸馏水至1000mL，pH＝6.1±0.1，121℃下灭菌20min。
柠檬酸盐培养基：磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)1.0g，氯化钠(NaCl)5.0g，磷酸二氢铵((NH4)H2PO4)1.0g，柠檬酸钠2.0g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g，加蒸馏水至1000mL，加热搅拌溶解上述各溶质，pH＝7.0。
本实施例实施之前对菌株最适合培养温度、pH做了研究，结果如图2和图3所示。
2.脱氨功能菌的初筛：
量取25mL蒸馏水于250mL三角瓶中，加入10颗玻璃珠，121℃高压灭菌20min，冷却至室温后，加入10g污水处理厂污泥样品，将三角瓶置于28℃、180r/min的恒温摇床震荡培养，打碎混匀1-2h，使污泥中的细菌游离出来，再用移液枪取5mL震荡后的培养液转移至100mL含氨富集培养基中，并在培养基中加入1％的氨水(由于氨水易挥发，需过滤除菌)，再次将三角瓶置于28℃、180r/min的恒温振摇床中震荡培养，培养基出现混浊时，再用移液枪在超净工作台中取5mL，转接到相同的含氨富集培养基中，转接三次后通过稀释涂板法在琼脂平板上分离功能菌，取100μL培养液加入到900μL的无菌水中，相当于稀释10倍，以此类推，分别稀释到10-4、10-5、10-6，取这三个梯度浓度的稀释液 100μL均匀涂布于含氨纯化培养基的琼脂平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中培养。待菌落长出，挑取形态大小外观不同的单个菌落，再次于含氨纯化培养基的琼脂平板上三区划线，待菌落长出后再将三区划线的单菌落再次在含氨纯化培养基的琼脂平板上三区划线，如此反复三次，得到的则为纯化的菌株。
3.脱硫功能菌的分离与初筛：
与脱氨功能菌的初筛相似，采用富集法。量取25mL蒸馏水于250mL三角瓶中，加入10颗玻璃珠，121℃高压灭菌20min，冷却至室温后，加入10g污水处理厂污泥样品，将三角瓶置于28℃、180r/min的恒温摇床震荡培养，打碎混匀1-2h，使污泥中的细菌游离出来，再用移液枪取5mL震荡后的培养液转移至100mL含硫富集培养基中，并在培养基中加入1％的硫化钠(由于硫化钠易分解，也需过滤除菌)，再次将三角瓶置于28℃、180 r/min的恒温振摇床中震荡培养，培养基出现混浊时，再用移液枪在超净工作台中取5mL，转接到相同的含氨富集培养基中，转接三次后通过稀释涂板法在琼脂平板上分离功能菌，取100μL培养液加入到900μL的无菌水中，相当于稀释10倍，以此类推，分别稀释到 10-4、10-5、10-6，取这三个梯度浓度的稀释液100μL均匀涂布于含硫纯化培养基的琼脂平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中培养。待菌落长出，挑取形态大小外观不同的单个菌落，再次于含硫纯化培养基的琼脂平板上三区划线，待菌落长出后再将三区划线的单菌落再次在含硫纯化培养基的琼脂平板上三区划线，如此反复三次，得到的则为纯化的菌株。
4.脱氨菌株的复筛：
脱氨菌株的复筛是用纳氏试剂比色法来筛选脱氨能力强的菌株。
待测菌株为含氨富集培养基富集分离出的纯化菌株，从固体琼脂平板上挑各菌株的单菌落转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于恒温摇床中过夜培养，培养条件为28℃、180 r/min，以获得到新鲜种子液，再用移液枪取种子液按5％的接种量转接于异养硝化培养基中，置于恒温摇床中180r/min、28℃培养24h，间隔一定时间取菌液，于离心机12000r/min 离心2min，取上清液用纳氏试剂比色法显色后，在波长420nm下使用分光光度计测定溶液中氨氮的含量，同时以不加菌的培养基(CK)作为对照至于同样条件下，测定CK中氨氮含量，将样品与CK对比计算即可得到培养基中氨氮的脱除率。
测定样品时，分别取适量菌液离心后的上清液于比色管中，加无氨水补足至标线，先加入0.2mL酒石酸钾纳溶液，并在振荡器上混匀。再加入0.3mL纳氏试剂溶液，再次在震荡器上充分混匀。静置10min后，在波长420nm处，用光程10mm比色皿测定吸光度，并以无氨水为参比。由测得的吸光度，减去零浓度空白管的吸光度后，得到校准吸光值，绘制以氨氮含量(mg)对校正吸光度的标准曲线。同时以无氨水代替水样，做空白测定，校准样品的吸光值。由测得的样品的吸光度减去空白对照的吸光度后，从标准曲线上查得氨氮量(mg)后，按取样体积计算出培养基中的氨氮量，对比各菌液和对照CK中的氨氮量，计算出培养基中氨的脱除率，从而比较各菌株的脱氨能力，从中选出脱氨效果好的菌株进行下一步实验。
5.脱硫菌株的复筛：
脱硫菌株的复筛是用亚甲基蓝比色法来筛选脱硫能力强的菌株。
与测定脱氨功能相似，待测菌株为含氨富集培养基富集分离出的纯化菌株，从固体琼脂平板上挑各菌株的单菌落转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于恒温摇床中过夜培养，培养条件为28℃、180r/min，以获得到新鲜种子液，再用移液枪取种子液按5％的接种量转接于硫化钠降解培养基中，置于恒温摇床中180r/min、28℃培养24h，间隔一定时间取菌液，于离心机12000r/min离心2min，取上清液用亚甲基蓝比色法显色后，在波长 665nm下测定溶液中硫化物的含量，每个处理设置3个重复。测定培养液上清中硫化物含量，置于10mL比色管中，加无二氧化碳水至8mL，加1mL对氨基二甲基苯胺溶液，盖紧后上下颠倒一次，轻微混匀。不可以剧烈震荡，然后加入200μL硫酸铁铵溶液，立即在振荡器上震荡混匀，静置10min后，以水为参比，在665nm处测量吸光值，并以无二氧化碳水的空白管为对比进行校正。
取适量上清液于比色管中，加水稀释至8mL，按标准曲线显色方法进行显色，加1mL对氨基二甲基苯胺溶液，盖紧后上下颠倒一次，轻微混匀。不可以剧烈震荡，然后加入200 μL硫酸铁铵溶液，立即在振荡器上震荡混匀，静置10min后，以水为参比，在665nm 处测量吸光值，并以无二氧化碳水的空白管为对比进行校正。以标准曲线为依据，从中计算出硫化物的含量，并将实验样本和空白对照样本进行比较，去除空白对照样本的硫化物值所得的即为脱硫菌株分解代谢硫化物的量。根据去除能力的大小进行菌株的筛选比较，以获得较强脱硫率的菌株。最终得到一株脱硫脱氮能力强的菌株ZT-S5。
6.菌株鉴定
采用伯杰氏细菌手册上的方法，测定分离菌株的生化特性，结果如表1。
该表显示菌株ZT-S5生理生化结果与柠檬酸杆菌属相符，属柠檬酸杆菌，其菌落形态图如图4所示。
7.稳定性测试
菌株ZT-S5能在30-40℃，pH5-9，次氯酸钠5mg/L的条件下正常生长，如图5所示。
实施例2
本实施例应用菌株ZT-S5进行全过程除臭。
除臭废水样品为南京市城北污水处理厂未被处理的污水，由于氨和硫化氢主要由微生物在厌氧条件下将有机质分解代谢而来，故实验条件是在静置的污水中投加接种除臭菌株的活性污泥，并在不同的时间测定污水中的氨和硫化氢的含量，计算去除率。
具体过程为：
(1)将培养12h的ZT-S5菌液加入污泥当中，搅拌均匀，对照组为不加菌的培养基按同样的接种量加入到污泥当中。
(2)将搅拌均匀的污泥分装到大试管中，填装到试管的1/5处，并用污水装满试管，菌株ZT-S5在污水中的CFU计数如图6所示。
(3)分别在0h、4h、8h和24h取污水测定其中氨和硫化氢的含量，并计算去除率，结果如图7和图8所示，结果表明菌株ZT-S5接种到废水中在8小时对水中的硫化氢去除率达到60％以上，对废水中氨的去除率接近60％。
(4)在火山石等固体载体上吸附后通气30小时后对废气中的氨和硫化氢的去除率达到100％，说明该菌种活力高，适应性强，可广泛用于水体和气体中硫化氢和氨的生物处理过程中，连续运行4个月，去除效果稳定，其全过程除臭效果如图9和图10所示，说明制成的生物除臭装置能很好地抵御废气的冲击，实现生物除臭的应用。

Claims (4)

1.一种柠檬酸杆菌菌株，其特征在于：所述柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)名称为除臭菌ZT-S5，于2017年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.15120。
2.权利要求1所述的柠檬酸菌株在废水除臭方面的应用。
3.一种生物除臭装置，其特征在于：该生物除臭装置包括权利要求1所述的柠檬酸杆菌菌株。
4.权利要求3所述的生物除臭装置，其特征在于：生物除臭装置中活菌总浓度为1×108CFU/mL。
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