CN107936272A

CN107936272A - 一种用于放疗防护的3d交联透明质酸盐凝胶的制备方法及其产品

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Publication number: CN107936272A
Application number: CN201711202866.0A
Authority: CN
Inventors: 郭学平; 栾贻宏; 刘建建; 张燕; 杨莹莹; 吴万福; 耿凤
Original assignee: BLOOMAGE FREDA BIOPHARM Co Ltd; Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd
Current assignee: Huaxi Biotechnology Tianjin Co ltd; Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2018-04-20
Anticipated expiration: 2037-11-27
Also published as: CN107936272B

Abstract

本发明提供了一种用于放疗防护的3D交联透明质酸盐凝胶的制备方法：（1）将透明质酸盐与交联剂在碱性溶液中，在0‑10℃下静置反应0.5‑20 h，得到凝胶A；（2）然后将凝胶A在30‑60℃下静置反应0.5‑24 h，得到凝胶B；（3）最后将凝胶B在10‑40℃下静置反应0.5‑20 h，然后经过透析、制粒，得3D交联透明质酸盐凝胶；所得凝胶中交联透明质酸的含量为10 mg/mL‑50 mg/mL。本发明制得的3D交联透明质酸盐凝胶可用于但不限于制备肿瘤放疗隔离防护剂。本发明采用“低温‑高温‑低温”三步交联，每个温度下透明质酸分子间形成一个交联方向，实现多方向多空间交联，交联效率高；制备的交联透明质酸凝胶具有更稳定的3D结构，质地致密，抗酶解能力更好，耐射线辐射，安全性高。

Description

一种用于放疗防护的3D交联透明质酸盐凝胶的制备方法及其产品

技术领域

本发明属于交联透明质酸制备领域，特别涉及一种交联透明质酸盐凝胶的制备方法。

背景技术

透明质酸(HA)，是由(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡糖醛酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖，其广泛存在于皮肤、眼玻璃体、软骨和关节滑液等许多结缔组织中，起到保湿、营养和修复等生理作用。透明质酸具有良好的理化性能和生物相容性，因此广泛应用于美容整形、隔离防护、眼科手术、关节腔注射、手术防护等领域。但是它在体内容易受到透明质酸酶的作用而迅速降解，体内存留时间短。为了延长其体内持续时间，常将透明质酸进行交联，使其对自由基、热和透明质酸酶的降解作用有更强的抵抗力。透明质酸分子上有多个位点可以进行化学修饰，如羧基、5位羟基等。

目前市场上常见的透明质酸凝胶产品多是采用1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）、二乙烯基砜（DVS）等作为交联剂。传统的交联技术为了延长体内降解时间，常加入大量交联剂以提高交联度。但是上述交联剂多具有毒性或致癌性，大量交联剂的加入相应的也会增加产品风险，不利于产品安全。

近年来，也涌现出其它一些改进交联透明质酸降解性质的制备方法。例如公开号为CN 102757572 A的专利、公开号为CN 105713211 A的专利、授权公告号为CN 102321258B的专利等，这些专利或通过使用新的交联剂（如天然氨基酸），或通过降低反应物浓度，或通过引入其它物质（如季铵碱）等方法，来提高交联透明质酸的交联度和安全性。这些方法均为一步交联反应，并且实际操作过程中常需要引入新的化合物或有机溶剂，有一定的安全隐患。

两步交联反应制备交联透明质酸凝胶也是一种有效的改进凝胶性能的方法。

公开号为CN 104761735 A的专利发明了一种具有抑制透明质酸酶活性的交联透明质酸钠凝胶的制备方法。该方法采用两步交联，首先酸性条件下将透明质酸酶抑制剂引入透明质酸钠分子，然后再在碱性条件下将引入透明质酸酶抑制剂的透明质酸钠分子进行交联。本方法所得凝胶虽然自身具备抗酶解分子，但是没有考虑凝胶性质（例如黏弹性）的控制和降低交联剂用量。

公开号为CN 103146003 A的专利中提到一种低温二次交联透明质酸钠凝胶的制备方法，以1,4-丁二醇二缩水甘油醚为交联剂，采用二次交联方法，第一次交联温度2-15℃静止反应24-120 h，第二次交联温度30-50℃反应0.5-3 h。本方法低温交联时间过长。

公开号为CN 104086788 B的专利发明了一种二次交联制备注射用透明质酸钠凝胶的方法：将透明质酸与交联剂在pH＞10的条件下反应得凝胶X；将透明质酸与交联剂在pH＞9的条件下反应得凝胶Y；将凝胶X与凝胶Y混合，再次进行交联，经过调节pH至中性和透析，得注射用修饰透明质酸钠凝胶。

公开号为CN 101107270 A的专利发明了一种用二乙烯基砜交联透明质酸的方法，该方法提到了三种温度的交联。但是该发明水凝胶主要用于药用载体、赋形剂或稀释剂，化妆品用途或美容用途。主要强调制备的凝胶具有更高的均质性、增强的柔软性、和/或更容易的可注射性，并没有涉及凝胶的耐酶性和体内存留时间。

综上所述，为了增加透明质酸凝胶的体内存留时间，提高凝胶理化性能，目前的技术主要通过以下途径实现：一步交联反应主要通过引入新物质实现，但是在此过程中常会引入有机试剂或其它化学物质，不利于产品安全；目前的两步交联反应通常有引入抗降解物质、改变温度、改变反应pH值，在此过程中常存在反应时间过长，操作繁琐等缺点。

放射性粒子（如碘-125，钯-103及铯-137）在恶性肿瘤的治疗中已取得了广泛的应用，其物理学、剂量学特性，治疗的生物学原理已取得了广泛而深入的研究成果，在临床上常被用于各种恶性肿瘤的治疗。当肿瘤与周围器官距离太近时，植入放射粒子后容易对周围器官造成辐射，引发并发症，例如放射性皮肤损伤，放射性急性直肠毒性等。而透明质酸凝胶可以注射至放射性粒子和被保护脏器之间，直接起到隔离防护作用。但是由于体内透明质酸酶作用和放射线对凝胶的影响，透明质酸凝胶容易被降解，体内存留时间不够长（通常放射性粒子96%的能量于6个月释放）。因此，需要耐辐射降解的交联透明质酸，目前尚无相关制备方法报道。

发明内容

针对现有制备交联透明质酸凝胶存在的不能兼具交联剂用量少、方便操作、反应时间适中、不引入除交联剂外的其它有机试剂，耐酶性好等优点的问题，本发明提供一种交联剂用量少，方便操作，反应时间适中的3D交联透明质酸盐凝胶的制备方法。

本发明的另一目的是，提供一种上述制备方法获得的3D交联透明质酸盐凝胶，凝胶致密，具有良好的抗酶解性能。

本发明的再一目的是，提供一种上述3D交联透明质酸盐凝胶在放疗隔离防护剂中的用途。该隔离防护剂抗酶解、抵抗射线降解性能好，不宜发生位移。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种用于放疗防护的3D交联透明质酸盐凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（1）将透明质酸盐与交联剂在碱性溶液中，在0-10℃下静置反应0.5-20 h，得到凝胶A；

（2）然后将凝胶A在30-60℃下静置反应0.5-24 h，得到凝胶B；

（3）最后将凝胶B在10-40℃下静置反应0.5-20 h，然后经过透析、制粒，得3D交联透明质酸盐凝胶。

所述透明质酸盐选自透明质酸或透明质酸的金属盐中的任意一种。

所述透明质酸盐分子量优选为10-350万 Da。

所述交联剂选自环氧化物类或碳二亚胺中的任意一种，优选为环氧化物类，最优选为1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）。

所述交联剂用量为透明质酸质量的0.1-5 %。

所述碱性溶液为碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠溶液中的任意一种。

所述碱性溶液的质量百分浓度为0.1 %-6 %。

所述3D交联透明质酸盐凝胶中交联透明质酸的含量为10 mg/mL-50 mg/mL。

一种上述3D交联透明质酸盐凝胶用于但不限于制备肿瘤放疗隔离防护剂的应用。

本发明具有以下优点：

本发明采用“低温-高温-低温”三步交联，每个温度下透明质酸分子间形成一个交联方向，充分利用极少量的交联剂，实现多方向多空间交联，交联效率高，同时，方便操作，反应时间合理，利于实现工业化大生产。该发明制备的交联透明质酸盐凝胶具有更稳定的3D结构，以及更致密的质地，抗酶解能力更好，因此在放射线的影响下能更稳定的存在，更适用于放疗隔离防护；相同抗酶解能力的情况下，由于所用交联剂更少，本产品更安全。

附图说明

图1为不同交联透明质酸凝胶酶降解率图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 交联透明质酸制备

取BDDE 0.01 g与5 mL 1 wt%氢氧化钠溶液混合均匀，然后加入透明质酸钠（350万Da）1.0 g搅拌使其溶解均匀。将上述反应物密封，静置于3℃下反应15 h，然后静置于50℃反应3 h，最后静置于20℃下反应15 h。将最终反应产物切割成约1cm³的小方块，置于磷酸盐氯化钠缓冲液中透析，所得凝胶块经60目筛网制粒，得含量20 mg/mL的交联透明质酸凝胶。121℃高压蒸汽灭菌8 min。

实施例2 交联透明质酸制备

除交联剂不同外（将BDDE用碳二亚胺代替），其它反应温度和时间均与实施例1相同。最终制备得透明质酸含量20 mg/mL的交联透明质酸凝胶。121℃高压蒸汽灭菌8 min。

对比例不同方法制备交联透明质酸

（1）一步交联法：按照实施例1的投料比例投料，除反应温度和时间不同，其它操作均相同。将上述反应物密封，静置于50℃反应3 h。

（2）“低温-高温”两步交联法：按照实施例1的投料比例投料，除反应温度和时间不同，其它操作均相同。将上述反应物密封，静置于3℃下反应15 h，然后静置于50℃反应3 h。

（3）“高温-低温”两步交联法：按照实施例1的投料比例投料，除反应温度和时间不同，其它操作均相同。将上述反应物密封，静置于50℃反应3 h，然后静置于20℃下反应15h。

将以上方法最终反应产物切割成约1 cm³的小方块，置于磷酸盐氯化钠缓冲液中透析，所得凝胶块经60目筛网制粒，得透明质酸含量20 mg/mL的交联透明质酸凝胶。121℃高压蒸汽灭菌8 min。

（4）DVS“低温-高温-低温”三步交联法：参照公开号为CN 101107270 A的发明专利里最优选交联条件制备DVS交联凝胶。具体方法为：在搅拌条件下将DVS（HA/DVS重量比50:1）加到20 %（w/v）的透明质酸钠溶液中，25℃下搅拌180 min；然后将所得凝胶静置于50℃下反应180 min；最后将凝胶静置于20℃下放置180 min。所得凝胶在中性缓冲液中溶胀、洗涤。最后均化凝胶，得透明质酸含量20 mg/mL的交联透明质酸凝胶。121℃高压蒸汽灭菌8min。

实施例3 交联透明质酸体外耐酶解测定

将对比例中一步交联所得凝胶记为凝胶A，“低温-高温”两步交联所得凝胶记为凝胶B，“高温-低温”两步交联所得凝胶记为凝胶C；实施例1所得透明质酸凝胶记为凝胶D，对比例1中DVS交联凝胶记为凝胶E，实施例2中碳二亚胺交联凝胶记为凝胶F。

分别称取A、B、C、D、E、F六种样品适量（交联透明质酸含量为0.5 g）置于西林瓶中，加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）5 mL和透明质酸酶液（100 U/mL）5 mL，混合均匀，置于37℃水浴中酶解24 h，然后在100℃煮沸10 min灭活。0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液1.0mL，加水定容至10 mL。采用改良咔唑显色法（Bitter. T, Muir H. M. A modified uronicacid carbarbazole reation. Anal. Biochem. 1962 (4): 330-333.）测定糖醛酸含量，乘以2.07后折算为加入酶液的样品中交联透明质酸的含量a；未加酶液样品中交联透明质酸含量为b，计算酶降解率= a/ b× 100 %。酶降解率越低，表明凝胶的耐酶性越好，体内存留时间越长。试验结果如下表1，酶降解率图见图1。

表1 酶降解率数据

结果显示，一步交联所得凝胶A耐酶性最差，体外酶解条件下24 h降解95.31 %。在该设定温度和时间下，“低温-高温”两步交联所得凝胶与DVS交联凝胶的24 h降解率基本相同，分别为70.58 %和72.13%，“高温-低温”交联所得凝胶C降解率为65.73 %，碳二亚胺交联凝胶降解率为61.34%。“低温-高温-低温”三步交联所得凝胶D耐酶性最好，体外酶解条件下24h仅降解50.26 %。综上，在不受射线等影响的条件下，BDDE为交联剂通过三步交联所得透明质酸凝胶具有最好的体外耐酶解性能，明显低于其他方法获得的交联透明质酸。

实施例4 交联透明质酸对粒子植入术后防护测定

小鼠植入放射性¹²⁵I粒子后，考察高温一步交联、低温-高温或高温-低温两步交联和“低温-高温-低温”三步交联所得凝胶，以及不同交联剂交联所得透明质酸凝胶在降低¹²⁵I粒子植入皮肤毒性中的效果。

试验样品：试验样品与样品编号同实施例3。

试验动物：Balb/C小鼠

试验分组：用计算机随机数字法将14只小鼠随机分为7组，每组2只，分别为对照组、A、B、C、D、E、F组。对照组植入空壳粒子1枚（空白对照），其它6组分别植入0.6 mCi活度¹²⁵I粒子1枚。植入放射离子同时分别于皮肤与粒子间注射透明质酸凝胶1.5 ml，组别号与试验样品号相同，空白对照组不注射透明质酸凝胶。

动物喂养：粒子植入术后试验动物标准条件下分笼喂养。

观察及指标：对试验动物进行一般情况观察。

进食量（食物及水）：由每日喂食量减去剩余食物量得出进食总量。由术前开始观察，记录术后第1、4、7、10…180天。

体重：由术前开始观察，记录术后第1、4、7、10…180天。

精神状态：由同一观察者主观评价，记为良好、一般、稍差、萎靡、死亡。由术前开始观察，记录术后第1、4、7、10…180天。

皮肤损伤：同期观察小鼠是否具有皮肤损伤，如色泽变化、毛发脱落、溃疡形成等。以及不同组别之间的皮肤损伤情况。

剩余凝胶观察：分别于术后90天和180天随机处死每组1只动物，观察透明质酸凝胶剩余情况。

试验结果总结：见表2。

表2 一般情况结果汇总

由表2可见，六种样品的隔离防护效果由高到低分别为D＞F＞E＞C＞B＞A，即BDDE三步交联透明质酸凝胶在有放射粒子存在下，对皮肤的保护效果最好；碳二亚胺三步交联透明质酸凝胶效果次之；一步交联透明质酸凝胶效果最差。

对剩余凝胶的观察结果如表3。

表3 剩余交联透明质酸凝胶结果汇总

由表3可见，180天之后体内交联透明质酸凝胶剩余量由高到低分别为D＞F＞E=C＞B=A，这与凝胶的隔离防护效果结果相吻合。

交联透明质酸凝胶用于放疗隔离防护主要是通过物理间隔的形式，在放射离子和被保护器官之间稳定存在一定时间（一般6个月以上），增加放射离子与被保护器官之间距离，从而降低被保护器官接受的放射剂量。当放射粒子能量基本释放完全之后，凝胶可以在体内完全降解。这就要求所选凝胶不仅可以很好的抵抗体内酶降解的作用，还要能牢固的存在于放射粒子与被保护器官之间，同时还要耐受放射线的影响。

以BDDE为交联剂，通过“低温-高温-低温”三步反应交联所得透明质酸凝胶，拥有3D稳定结构，凝胶致密，拥有良好的抗酶解性能，不宜发生位移，具有良好的抵抗射线降解的作用，能够长期稳定存在于放射粒子与被保护器官之间，起到隔离防护的作用。

实施例5 交联透明质酸制备

取碳二亚胺 0.001 g与5 mL 0.1 wt%的氢氧化钠溶液混合均匀，然后加入透明质酸钙（10万Da）1.0 g搅拌使其溶解均匀。将上述反应物密封，静置于1℃下反应20 h，然后静置于60℃反应0.5 h，最后静置于10℃下反应20 h。将最终反应产物切割成约1 cm³的小方块，置于磷酸盐氯化钠缓冲液中透析，所得凝胶块经40目筛网制粒，得含量10 mg/ mL的交联透明质酸凝胶。121℃高压蒸汽灭菌8 min。

实施例6 交联透明质酸制备

取BDDE 0.05 g与5 mL 6 wt%的碳酸钠溶液混合均匀，然后加入透明质酸钾（100万Da）1.0 g搅拌使其溶解均匀。将上述反应物密封，静置于10℃下反应0.5 h，然后静置于30℃反应24 h，最后静置于40℃下反应0.5 h。将最终反应产物切割成约1 cm³的小方块，置于磷酸盐氯化钠缓冲液中透析，所得凝胶块经60目筛网制粒，得含量50 mg/mL的交联透明质酸凝胶。121℃高压蒸汽灭菌8 min。

实施例7 交联透明质酸制备

取BDDE 0.02 g与3 mL 0.4 wt%的氢氧化钠溶液混合均匀，然后加入透明质酸锌（250万Da）1.0 g搅拌使其溶解均匀。将上述反应物密封，静置于7℃下反应5 h，然后静置于40℃反应18 h，最后静置于30℃下反应5 h。将最终反应产物切割成约1 cm³的小方块，置于磷酸盐氯化钠缓冲液中透析，所得凝胶块经80目筛网制粒，得含量30 mg/mL的交联透明质酸凝胶。121℃高压蒸汽灭菌8 min。

实施例8 交联透明质酸制备

取四臂-聚乙二醇-环氧化物0.015 g与5 mL 5 wt%的碳酸氢钠溶液混合均匀，然后加入透明质酸铋（150万Da）1.0 g搅拌使其溶解均匀。将上述反应物密封，静置于4℃下反应10h，然后静置于45℃反应12 h，最后静置于25℃下反应10 h。将最终反应产物切割成约1 cm³的小方块，置于磷酸盐氯化钠缓冲液中透析，所得凝胶块经60目筛网制粒，得透明质酸量为25 mg/mL的交联透明质酸凝胶。121℃高压蒸汽灭菌8 min。

Claims

1.一种用于放疗防护的3D交联透明质酸盐凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）然后将凝胶A在30-60℃下静置反应0.5-24 h，得到凝胶B；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，透明质酸盐选自透明质酸或透明质酸的金属盐中的任意一种。

3. 根据权利要求1或2任一所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸盐分子量为10-350万 Da。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂用量为透明质酸盐质量的0.1%-5%。

5.根据权利要求1或4任一所述的制备方法，其特征在于，交联剂选自环氧化物类或碳二亚胺中的任意一种。

6.根据权利要求1或4任一所述的制备方法，其特征在于，交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液为碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠溶液中的任意一种。

8. 根据权利要求1或7任一所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液的质量百分浓度为0.1 %-6 %。

9. 一种根据权利要求1所述的制备方法获得的3D交联透明质酸盐凝胶，其特征在于，交联透明质酸的含量为10 mg/mL-50 mg/mL。

10.一种根据权利要求9所述的3D交联透明质酸盐凝胶用于但不限于制备肿瘤放疗隔离防护剂的应用。