CN107929302A - 京尼平苷酸抗肠炎的医药用途 - Google Patents

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蔡佳仲
刘美静
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Abstract

本发明涉及医药学领域，特别是涉及一种京尼平苷酸抗肠炎的医药用途。本发明的京尼平苷酸具有性抗大肠炎的新功效，该化合物具有疗效显著且毒副作用较低的优点：目前NRF2显示是治疗大肠炎的新靶点，因此，找寻高效、低毒的NRF2的中医药激动剂具有中药意义。本发明提供的京尼平苷酸具有激活NRF2的作用，通过激活肠NRF2，发挥显著的改善大肠炎的作用。本发明治疗大肠炎的京尼平苷酸是中药白花蛇舌草的主要有效成分，该化合物是天然的，具备较高的安全性。

Description

京尼平苷酸抗肠炎的医药用途
技术领域
本发明涉及医药学领域，特别是涉及一种京尼平苷酸的医药用途。本发明的京尼平苷酸是NRF2转录因子激动剂，可用于防治大肠炎。
背景技术
炎性肠病(肠炎)是病因尚不明确的非特异性肠炎，是诱发肠癌的高风险致病因素之一，已逐渐发展为全球5大流行病种之一。据世界卫生组织估计大约15％肠炎患者最终导致癌症发生与转移，严重威胁病人的健康安全。因此，控制肠炎的发生与发展在预防炎症引起的肠癌起着重要的作用。然而，尽管20 多年来在控制肠炎及肠炎引发肠癌的研究已取得许多的进步，但是到现在为止，肠炎的临床治疗效果仍旧不理想。
目前,研究广泛认为NF-kB炎症通路调控炎症在该病的发展起着重要的作用。因此，降低NF-kB调控的炎症通路有助于改善肠炎的发生以及发展。
NRF2为抗氧化转录因子，在氧化应激、感染等条件下起着重要的防护作用。在生理状态下，NRF2与它的抑制剂KEAP1在胞质中形成复合物，当受到外部条件的作用下，如氧化应激等，NRF2与KEAP1解离，NRF2转入核内，招募副激动剂，结合到靶基因的启动子域上，进而调控靶基因的表达。有研究表明，与正常患者比较，在大肠炎患者的结肠组织中NRF2的表达显著降低。类似的， Nrf2-/-小鼠可以自发性形成结肠炎和结肠癌，表明了NFR2在大肠炎症中起着重要的调控作用。反之，给予NRF2激动剂tBHQ可显著抑制NF-kB的活性，进而降低炎症，保护DSS诱导的结肠炎。因此，通过激活NRF2，提高机体抗氧化作用，进而抑制NF-κB炎症信号通路，有助于改善肠炎的发生与发展。
目前，对该病急性期的药物治疗，主要为糖皮质激素、柳氮磺胺吡啶等药物为临床治疗IBD的常用药物，然而，上述药物很难有效抑制肠炎的恶化，同时对肝功能、精神系统等产生严重的副作用，很多患者不能耐受。
中医药治疗肠炎临床疗效好，且副作用较少，易被患者接受。
发明内容
为了解决上述问题，本发明目的旨在提供一种京尼平苷酸的医药用途。
具体地说，本发明提供了一种京尼平苷酸在制备防治肠炎的药物或食品中的应用。
本发明通过细胞水平-体内动物实验两个层次，阐明京尼平苷酸具有抗炎性肠病的医药用途。
(1)以HEK293T和HCT116细胞为研究对象，通过细胞共转染NRF2-ARE- 荧光素酶报告基因系统、NQO1和HO-1(NRF2靶基因)表达水平和活性以及药理抑制和/或基因敲减NRF2后对NQO1和HO-1表达水平和活性的影响等实验，从正反两方面，阐明京尼平苷酸是肠的PXR激动剂。
(2)在DSS诱导的肠炎小鼠模型上，通过给予京尼平苷酸治疗后，观察 DSS肠炎小鼠的血清生化炎症因子的变化、结肠组织病理变化等的表达影响，阐明京尼平苷酸通过激活肠NRF2通路，保护DSS诱导的肠炎。
所述肠炎为溃疡性结肠炎、慢性结肠炎或克隆氏病引起的炎症、腹泻。
本发明的细节将在具体实施方式中得以详尽描述。
京尼平苷酸具有性抗大肠炎的新功效，该化合物具有疗效显著且毒副作用较低的优点：
目前NRF2显示是治疗大肠炎的新靶点，因此，找寻高效、低毒的NRF2的中医药激动剂具有中药意义。
本发明提供的京尼平苷酸具有激活NRF2的作用，通过激活肠NRF2，发挥显著的改善大肠炎的作用。
本发明治疗大肠炎的京尼平苷酸是中药白花蛇舌草的主要有效成分，该化合物是天然的，具备较高的安全性。
下面结合附图与具体实施方式，对本发明进一步说明。
附图说明
图1体现了京尼平苷酸具有增强NRF2活性的功效；
图2为京尼平苷酸诱导NRF2及其调控的靶基因(NQO1和HO-1)的mRNA (A)和蛋白(B)表达；
图3进一步体现了京尼平苷酸具有增强NRF2活性的功效；
图4体现了京尼平苷酸显可具有改善小鼠大肠炎症的的功效。。
具体实施方式
实施例，参见图1至图4，本实施例提供了一种京尼平苷酸抗肠炎的医药用途，
具体地说，本发明提供了一种京尼平苷酸在制备防治肠炎的药物或食品中的应用。
所述肠炎为溃疡性结肠炎、慢性结肠炎或克隆氏病引起的炎症、腹泻。
1.京尼平苷酸提高ARE转录活性研究
将HEK293T细胞按3×106个/ml种于10cm培养皿中，贴壁后，使用 Lipofectamine2000试剂同时共转染mGST-ARE-Luc、Flag-pCDNA3.1-NRF2、 Flag-pCDNA3.1-KEAP1-WT、Flag-pCDNA3.1-KEAP1-C151S、和TK-Renilla-luc 48h后，收割细胞，依次加入50μl细胞液(1×104个细胞)、50μl培养液和 tBHQ(20μM)种于96孔板中，该50μl培养液内含高、中、低浓度的京尼平苷酸(25、50和100μM)，诱导24h后，采用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega公司)，按照说明书操作，测定双荧光素酶的活性，研究京尼平苷酸对ARE转录活性的影响。
实验结果如图1所示，京尼平苷酸提高NRF2调控的mGST-ARE启动子的转录活性。瞬时共转染各种质粒后，高、中、低浓度高、中、低浓度的京尼平苷酸(25、50和100μM)治疗24h后显著诱导mGST-ARE-Luc荧光素酶的活性(图1)。该化合物可显著诱导NRF2-ARE通路，表明京尼平苷酸具有增强NRF2活性的功效。
2.京尼平苷酸通过上调NRF2诱导HCT116细胞NQO1和HO-1的mRNA 及蛋白表达水平。
将HCT116细胞按1×106个/ml种于6孔板中，过夜贴壁后，高、中、低浓度的京尼平苷酸(25、50和100μM)和tBHQ(20μM)治疗24h后，收割细胞，采用Real-time PCR和Westernblotting技术分别测定细胞内NRF2、 NQO1和HO-1的mRNA及蛋白表达水平。
如图2所示，图2为京尼平苷酸诱导NRF2及其调控的靶基因(NQO1和 HO-1)的mRNA(A)和蛋白(B)表达。
实验结果表明，京尼平苷酸诱导HCT116细胞的NRF2及其调控的靶基因 (NQO1和HO-1)的mRNA及蛋白表达水平，表明了京尼平苷酸是NRF2的激动剂，进一步表明了京尼平苷酸具有诱导NRF2活性的作用。
3.敲减NRF2后，京尼平苷酸失去对NQO1和HO-1诱导作用。
将HCT116细胞按1×106个/ml种于6孔板中，贴壁后，使用Lipofectamine 2000试剂同时共转染siNRF2和siControl48h后，更换新鲜的培养基，加入高、中、低浓度京尼平苷酸(100、50和25μM)和tBHQ(20μM)治疗24h后，采用Western blotting技术测定细胞内NQO1和HO-1mRNA和蛋白表达水平，研究敲减NRF2后京尼平苷酸对细胞内NQO1和HO-1蛋白表达的影响。
实验结果表明，敲减NRF2后，高、中、低浓度京尼平苷酸失去对NQO1 和HO-1表达的诱导作用(图3)。该化合物在失去NRF2功能后导致失去诱导 NQO1和HO-1的表达作用，从反面进一步证实了表明京尼平苷酸具有增强 NRF2活性的功效。
4.京尼平苷酸改善DSS诱导的小鼠肠炎
SPF级C57BL小鼠，雄性，随机分为5组：即对照组、京尼平苷酸组、 DSS组、DSS+京尼平苷酸组(100mg/kg)以及DSS+tBHQ(NRF2激动剂) 组(n＝10)。小鼠自由饮用水，预先用tBHQ(100mg/kg)和京尼平苷酸诱导 3天，对照组和DSS组给予0.05％CMC-Na。从第3天开始到第9天，DSS各组小鼠自由饮用4％DSS(W/V)的生理盐水溶液，对照组和木京尼平苷酸组小鼠自由饮用生理盐水。第9天结束实验，水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，并处死小鼠，解剖，取结肠进行各项指标的检测。
(1)症状观察及病理组织切片观察
每天对各组小鼠进行称重并记录,观察小鼠粪便,记录大鼠发生腹泻、血便的例数。
取肛门以上8cm肠段卷起，置10％中性甲醛中固定，常规脱水、透明后，石腊包埋切片，4μm厚连续切片，分别作HE和免疫组化染色。HE染色，于光镜下观察肠细胞变性、坏死，炎症细胞浸润等病理损伤情况。
(2)肠粘膜的炎症因子测定
腹主动脉采血放免法检测TNF-α、IL-6、IL-1β、等。另取新鲜结肠组织，用预冷的生理盐水冲洗除去血液，滤纸吸干称质量，加9倍生理盐水，在低温 (冰水)中用玻璃研磨器研磨制成100ml/L的组织匀浆，高速离心取上清液低温(4℃)保存待测。MPO等按碧云天试剂盒说明书进行测定。
实验结果见图4和表1。图4中，A为小鼠体重变化；B为小鼠便血情况； C为京尼平苷酸抗DSS诱导大肠的代表性病理图片；D为病理级别。京尼平苷酸显著保护DSS-诱导的体重降低(图4A)，减少DSS所致的便血情况(图4B)，并改善小鼠大肠的病理变化(图4C和D)。结果表明京尼平苷酸显可具有改善小鼠大肠炎症的的功效。
表1 GPA对DSS诱导的小鼠肠炎结肠组织的炎症因子的含量的影响(n＝10)
表1所示，京尼平苷酸显著抑制DSS诱导大肠炎症因子的含量(表1)。结果表明京尼平苷酸具有改善大肠炎症的功效。
结论：本发明治疗肠炎的京尼平苷酸药物具有显著改善大肠炎的功效，该化合物为常用中药白花蛇舌草中的一个天然的成分，安全性较高且毒副作用较低。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术手段和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。故凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明之形状、构造及原理所作的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.京尼平苷酸在制备防治肠炎的药物或食品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠炎为溃疡性结肠炎、慢性结肠炎或克隆氏病引起的炎症、腹泻。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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