CN107921188A - 用于治疗衰老相关的损伤的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了治疗成年哺乳动物中衰老相关的损伤的方法。该方法的多个方面包括以足以治疗哺乳动物中衰老相关的损伤的方式降低哺乳动物中的2‑微球蛋白(B2M)水平。可以通过实施所述方法来治疗各种衰老相关的损伤，所述损伤包括认知损伤。

Description

用于治疗衰老相关的损伤的方法和组合物

政府权益

本发明在政府的支持下按照由国家卫生研究院授予的AG027505、OD012178和TR000004合同进行。政府拥有本发明的某些权益。

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.第119(e)条，本申请要求享有于2015年5月18日提交的第62/163,222号美国临时专利申请的申请日的优先权，该申请的公开内容通过引用并入本文。

本申请也是2014年5月19日提交的第14/280,939号美国专利申请的继续申请；第14/280,939号美国专利申请是2012年10月9日提交的第13/575,437号美国专利申请的继续申请，现已被放弃；第13/575,437号美国专利申请是2011年1月28日提交的PCT申请PCT/US2011/022916的美国国家阶段申请；根据35U.S.C.第119(e)条，PCT申请PCT/US2011/022916要求享有2010年1月28日提交的第61/298,998号美国临时专利申请的申请日的优先权；这些申请的公开内容通过引用并入本文。

背景技术

机体的衰老伴随着随着时间推移的积累。在神经系统中，衰老伴随着在健康个体中导致认知衰退和易感退行性疾病的结构和神经生理学变化。(Heeden&Gabrieli,"Insights into the ageing mind:a view from cognitive neuroscience,"Nat.Rev.Neurosci.(2004)5:87-96；Razet al.,"Neuroanatomical correlates ofcognitive aging:evidence from structural magnetic resonance imaging,"Neuropsychology(1998)12:95-114；Mattson&Magnus,"Ageing and neuronalvulnerability,"Nat.Rev.Neurosci.(2006)7:278-294；和Rapp&Heindel,"Memorysystems in normal and pathological aging,"Curr.Opin.Neurol.(1994)7:294-298)。包括在这些变化中的是突触损失和其导致的神经元功能丧失。因此，虽然在自然衰老过程中通常不会观察到明显的神经元死亡，但是衰老的脑中的神经元容易受到结构、突触完整性以及突触处分子加工的亚致死-年龄相关改变的影响，所有这些都损害认知功能。

除了在自然衰老期间的正常突触损失之外，突触损失是许多神经退行性疾病中常见的早期病理学事件，并且与与这些疾病相关的神经元和认知损伤的相关性最好。事实上，衰老仍然是与诸如阿尔茨海默氏病(AD)的痴呆相关的神经退行性疾病的最主要的风险因素(Bishop et al.,"Neural mechanisms of ageing and cognitive decline,"Nature(2010)464:529-535(2010)；Heeden&Gabrieli,"Insights into the ageing mind:a viewfrom cognitive neuroscience,"Nat.Rev.Neurosci.(2004)5:87-96；Mattson&Magnus,"Ageing and neuronal vulnerability,"Nat.Rev.Neurosci.(2006)7:278-294)。

随着人类寿命的增加，更多的人类患有衰老相关的认知损伤，这使得通过拮抗或甚至消除衰老的影响来阐明维持认知完整性的手段是至关重要的(Hebert et al.,"Alzheimer disease in the US population:prevalence estimates using the2000census,"Arch.Neurol.(2003)60:1119-1122；Bishop et al.,"Neural mechanismsof ageing and cognitive decline,"Nature(2010)464:529-535)。

β-2微球蛋白(B2M)是I类主要组织相容性复合物(MHC)的组成部分，MHC是几乎存在于所有有真核哺乳动物细胞表面的多蛋白复合物。这些复合物通过在细胞表面上呈递外源性抗原或肽片段而发挥作用，使得免疫系统可以识别并破坏被感染的细胞。I类MHC的蛋白质组分由若干个基因编码，每个基因具有多个等位基因，并且表达的I类MHC的类型在个体之间有差异。由于MHC是多态性的，因此宿主免疫系统可能会排斥带有外源性MHC的器官，从而MHC是器官移植期间考虑的重要因素。在癌细胞中，MHC表达可能是有缺陷的，这使得这类细胞可以逃避免疫检测和破坏。

诸如血清、尿液和脑脊髓液等的人生理体液中也发现了游离的细胞外B2M。由于体积小，该蛋白通常从血液中滤出，然后以一定量被肾脏重吸收。高血清浓度的B2M通常伴随着几种疾病的存在，例如非何杰金淋巴瘤和脑膜炎( et al.,“Lactoferrin,lysozyme,and beta 2-microglobulin levels in cerebrospinal fluid:differentialindices of CNS inflammation,”Inflammation(1982)6:291-304；et al.,“Prognosticsignificance of serum beta-2microglobulin in patients with non-Hodgkinlymphoma,”Oncology(2014)87:40-7)。当以高浓度存在于机体血清中时，该蛋白可以形成淀粉样纤维(Corland&Heegaard,“B(2)-microglobulin amyloidosis,”Sub-cellularBiochemistry(2012)65:517-40)。已经对作为进行透析的个体中慢性肾脏疾病的并发症的机体组织和体液中B2M的累积进行了广泛研究。在肾功能下降的患者中，累积与关节和骨骼无力以及疼痛有关。测量尿B2M水平以指示肾损伤和过滤障碍(Acchiardo et al.,“Beta2-microglobulin levels in patients with renal insufficiency,”American Journalof Kidney Diseases(1989)13:70-4；Astor et al.,“Serum Beta-2-microglobulin atdischarge predicts mortality and graft loss following kidneytransplantation,”Kidney International(2013)84:810-817)。

因为B2M的蛋白质聚集体在引发骨关节炎中发挥作用，所以担心该蛋白可能对对异常蛋白质沉积物敏感的神经细胞是有毒性的(Giorgetti et al.,“beta2-Microglobulin is potentially neurotoxic,but the blood brain barrier is likelyto protect the brain from its toxicity,”Nephrology Dialysis Transplantation(2009)24:1176-81)。该蛋白涉及神经元发育、正常海马依赖性记忆以及突触形成和可塑性(Bilousova et al.,“Major histocompatibility complex class I moleculesmodulate embryonic neuritogenesis and neuronal polarization,”Journal ofNeuroimmunology(2012)247:1-8；Harrison et al.,“Human brain weight iscorrelated with expression of the‘housekeeping genes’beta-2-microglobulin andTATA-binding protein,”Neuropathology and Applied Neurobiology(2010)36:498-504)。I类MHC蛋白如β2微球蛋白的变化可破坏突触可塑性并导致老化的、受损的或患病的脑中的认知缺陷(Nelson et al.,“MHC class I immune proteins are critical forhippocampus-dependent memory and gate NMDAR-dependent hippocampal long-termdepression,”Learning&Memory(2013)20:505-17)。B2M的不足也可能导致脑中海马区左-右不对称性的丧失(Kawahara et al.,“Neuronal major histocompatibility complexclass I molecules are implicated in the generation of asymmetries inhippocampal circuitry,”The Journal of Physiology(2013)591:4777-91)。

此外，B2M用作可用于确定免疫妥协或中枢神经系统免疫激活的分子标志物(Svatoňováet al.,“Beta2-microglobulin as a diagnostic marker in cerebrospinalfluid:a follow-up study,”Disease Markers(2014)2014)。该蛋白的水平可以表示中枢神经系统炎症反应的程度。一篇对于B2M及其用作疾病标志物的综述指出，脑脊髓液中的B2M水平升高反映了多发性硬化、神经-白塞氏病、结节病、获得性免疫缺陷综合征-痴呆综合征以及恶性肿瘤的脑膜转移(Adachi,“Beta-2-microglobulin levels in thecerebrospinal fluid:their value as a disease marker.A review of the recentliterature,”European Neurology(1991)31:181-5)。其他研究表明，B2M有潜力用作认知损伤风险的临床标志物，或者是用作正在经受一系列疾病(包括肾衰竭、HIV感染和阿尔茨海默氏病)的个体的疾病预后工具(Almeida,“Cognitive impairment and majordepressive disorder in HIV infection and cerebrospinal fluid biomarkers,”Arquivos de Neuro-Psiquiatria(2013)71:689-92；Annunziata et al.,“Serum beta-2-microglobulin levels and cognitive function in chronic dialysis patients,”Clinica Chimica Acta(1991)201:139-41；Doecke et al.,“Blood-based proteinbiomarkers for diagnosis of Alzheimer disease,”Archives of Neurology(2012)69:1318-25；Isshiki et al.,“Cerebral blood flow in patients with peritonealdialysis by an easy Z-score imaging system for brain perfusion single photonemission tomography,”Therapeutic Apheresis and Dialysis(2014)18:291-6)。升高的血清水平对于成年多发性骨髓瘤、淋巴细胞性白血病和淋巴瘤有特别的预后意义(Kantarjian et al.,“Prognostic significance of elevated serum beta 2-microglobulin levels in adult acute lymphocytic leukemia,”The AmericanJournal of Medicine(1992)93:599-604；Wu et al.,“Prognostic significance ofserum beta-2microglobulin in patients with non-Hodgkin lymphoma,”Oncology(2014)87:40-7)。更多的研究继续探讨异常血清和组织B2M水平对癌症、心血管疾病、精神分裂症和全身性疾病活动的意义(Chittiprol et al.,“Longitudinal study of beta2-microglobulin abnormalities in schizophrenia,”InternationalImmunopharmacology(2009)9:1215-7)。在一些情况下，B2M一直是疾病治疗的靶标(Morabito et al.,“Analysis and clinical relevance of human leukocyte antigenclass I,heavy chain,and beta2-microglobulin down regulation in breastcancer,”Human Immunology(2009)70:492-5；Yang et al.,“Identification of beta2-microglobulin as a potential target for ovarian cancer,”Cancer Biology&Therapy(2009)8:232-8)。

发明内容

本发明提供用于治疗成年哺乳动物中衰老相关的损伤的方法。本发明的各个方面包括以足以治疗哺乳动物中衰老相关的损伤的方式降低哺乳动物中的β2-微球蛋白(B2M)水平。可以通过实施所述方法来治疗各种衰老相关的损伤，所述损伤包括认知损伤。

附图说明

图1a-1k。B2M是损害海马依赖性认知功能和成年神经发生的衰老全身环境的组成部分。图1a和图1c，未配对的年轻小鼠和老年小鼠的示意图(图1a)，以及年轻的等时联体生物和异时联体生物的示意图(图1c)。图1b和图1c，3、6、12、18和24个月大时B2M血浆浓度的变化(图1b)，在联体共生后五周年轻等时联体生物与年轻异时联体生物之间的B2M血浆浓度变化(图1d)。数据获自每组5只小鼠。图1e和1f，在健康的人受试者中血浆B2M浓度(图1e；r＝0.51；p<0.0001；95％置信区间＝0.19-0.028)和CSF B2M浓度(图1f)随着年龄增长的变化。图1g和图1k，在12天内，向年轻成年(3个月大)小鼠眼眶内注射B2M或PBS(载体)对照，注射5次。图1g，示出B2M治疗和认知测试所使用的时间顺序的示意图。图1h和图1i，通过RAWM(图1h)和场景性恐惧条件化(contextual fear conditioning)(图1i)评估海马学习和记忆。图1h，在找到平台前的进入臂错误(entry arm error)的数量。图1i，训练后24小时的僵直时间(freezing time)百分比。数据获自每组9-10只小鼠。图1j，每个治疗组的Dcx阳性细胞的代表性领域(比例尺：100μm)。图1k，治疗后齿状回(DG)中神经发生的定量。数据获自每组7-8只小鼠。所有数据表示为平均值的点图或平均值±SEM的条形图；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001t检验(图1d、图1f、图1i和图1k)，ANOVA，Tukey事后检验(图1b)，Mann-Whitney U检验(图1e)和重复测量ANOVA，Bonferroni事后检验(图1k)。

图2a-2e。海马依赖性学习和记忆。图2a-2e，在年轻(3个月大)动物与老年(18个月大)动物的正常衰老的过程中，使用RAWM(图2a和图2b)和场景性恐惧条件化(图2c和图2e)模式检测学习和记忆。每组n＝10。图2a，在RAWM任务的测试阶段，老年小鼠展现出了对平台位置的学习和记忆受损。认知缺陷被定量为在找到目标平台之前出现的进入臂错误的数量。图2b，在年轻动物和老年动物之间没有检测到游泳速度的差异。图2c，年轻动物和老年动物在恐惧条件化训练期间表现出类似的基线僵直时间。图2d，在场景性恐惧条件化期间，老鼠表现出在场景性记忆测试期间减少的僵直时间。图2e，在训练后24小时没有检测到线索性记忆(cued memory)方面的差异。数据表示为平均值±s.e.m。*P<0.05；**P<0.01；n.s.，不显著；t检验(图2a-2c和图2e)，重复测量ANOVA，Bonferroni事后检验(图2d)。

图3a-3d。全身性B2M施用不改变体重、游泳速度和线索性记忆。图3a-3d，在行为测试前，在10天内，给年轻成年(3个月大)小鼠眼眶内注射B2M或PBS(载体)对照，注射5次。图3a，B2M组和载体处理组的平均小鼠体重。图3b，在RAWM的测试阶段，用B2M或载体注射的小鼠的游泳速度。图3c和图3d，条件性恐惧显示为僵直行为。图3c，来自所有治疗组的动物在训练期间表现出类似的基线僵直时间。图3d，在训练后24小时，当再次暴露于新环境中的条件性刺激(音调和光线)时，在两组之间未检测到线索性记忆方面的差异。数据获自每组9只小鼠。所有数据表示为平均值+SEM；n.s.，不显著；t检验。

图4a和图4b。B2M的全身性施用减少了年轻动物DG中的神经发生。图4a和图4b，在12天内通过眼眶内注射将B2M或PBS(载体)对照注射至年轻成年小鼠(3-4个月大)，注射5次。在安乐死之前，通过腹膜内注射施用溴脱氧尿苷(BrdU)，持续三天。治疗后齿状回(DG)中的MCM2阳性和BrdU阳性的定量。数据获自每组5只小鼠。所有数据表示为平均值+SEM；*P<0.05；**P<0.01；t检验。

图5a-5h。在衰老期间局部B2M表达在海马中增加，并损害海马依赖性认知功能和成年神经发生。图5a和图5b，来自年轻(3个月大)和老年(18个月大)未配对动物的海马裂解物的代表性蛋白质印迹和定量(图5a)，或来自联体共生后5周的年轻等时联体生物和年轻异时联体生物的海马裂解物的代表性蛋白质印迹和定量(图5b)，所述海马裂解物使用抗B2M抗体和抗肌动蛋白抗体探测。图5c-5e，对年轻成年(3个月大)野生型(WT)小鼠以及敲除了与抗原加工相关的转运蛋白1(Tap1-/-)的小鼠单侧立体定向注射B2M或载体对照。图5c，示出了WT和Tap1-/-治疗组在同一部分内的DG相邻侧面中Dcx阳性细胞的代表性领域。图5d和图5e，立体定向B2M施用后WT小鼠(图5d)和Tap1-/-(图5e)小鼠DG中神经发生的定量。数据获自每组5只小鼠。图5f-5h，在行为测试前6天，给年轻成年小鼠双侧立体定向注射B2M或载体。图5f，示出局部B2M施用和认知测试所使用的时间顺序的示意图。图5g和图5h，立体定向注射后，通过RAWM(图5h)和场景性恐惧条件化(图5g)评估学习和记忆。数据获自每组10只动物。所有数据均以平均值±SEM表示；*P<0.05；**P<0.01；n.s.，不显著；ANOVA，t检验(图5a、图5b、图5d、图5e和图5h)；重复测量ANOVA，Bonferroni事后检验(图5g)。

图6a-6c。局部B2M施用不改变游泳速度和线索性记忆。图6a-6c，在行为测试前6天，给年轻成年小鼠双侧立体定向注射B2M或PBS(载体)对照。图6a，在RAWM的测试阶段，用B2M或载体注射的小鼠的游泳速度。图6b，来自所有治疗组的动物在恐惧条件化训练期间表现出类似的基线僵直时间。图6c，在训练后24小时，当再次暴露于新环境中的条件性刺激(音调和光线)时，在两组之间未检测到线索性记忆方面的差异。数据获自每组10只小鼠。所有数据表示为平均值+SEM；n.s.，不显著；t检验。

图7a-7e。在年轻的未配对WT和Tap1-/-动物或年轻的等时WT和Tap1-/-动物的DG中没有观察到神经发生方面的差异。图7a，在年轻成年(3个月大)野生型(WT)和Tap1-/-未配对小鼠的DG中的双皮质素(Dcx)-阳性细胞的定量。数据获自每组5只小鼠。图7b，年轻WT和Tap1-/-等时联体生物的示意图。图7c-7e，联体共生后五周，年轻WT和Tap1-/-等时联体生物的Dcx、T-box转录因子Tbr2和BrdU免疫染色的定量。数据获自每组6-8只小鼠。所有数据均表示为平均值+SEM；n.s.，不显著；t检验(图7a)；ANOVA，Tukey事后检验(图7c-7e)。

图8a-8d。减少内源性MHC I表面表达部分减轻了异时性联体共生对年轻动物中成年神经发生的负面影响。图8a，年轻野生型(WT)和TAP1敲除(TAP1-/-)等时联体生物以及年轻WT和TAP1-/-异时联体生物的示意图。图8b和图8c，联体共生后5周，年轻等时联体生物和年轻异时联体生物的双皮质素免疫染色的代表性领域(图8b)和定量(图8c)(箭头指向单个细胞，比例尺：100μm)。图8d，在安乐死之前，向动物注射溴代脱氧尿苷(BrdU)三天，并且在联体共生后定量DG中具有纳入的BrdU的增殖细胞。数据获自8个年轻等时WT联合生物、6个年轻等时Tap1-/-联体生物、8个年轻异时WT联体生物和8个年轻异时Tap1-/-联体生物。所有数据均表示为平均值±SEM；*P<0.05；ANOVA，Tukey事后检验。

图9a和图9b。减少内源性MHC I表面表达部分地减轻了异时性联体共生后年轻小鼠中神经元祖细胞数的减少。图9a，年轻野生型(WT)和TAP1敲除(TAP1-/-)等时联体生物以及年轻WT和TAP1-/-异时联体生物的示意图。图9b，联体共生后5周，年轻等时联体生物和年轻异时联体生物的T-box转录因子Tbr2免疫染色的定量。数据获自8个年轻等时WT联合生物、6个年轻等时Tap1-/-联体生物、8个年轻异时WT联体生物和8个年轻异时Tap1-/-联体生物。所有数据均表示为平均值±SEM；*P<0.05；ANOVA，Tukey事后检验。

图10a-10j。内源性B2M的缺乏增强老年动物中的海马依赖性认知功能和成年神经发生。图10a-10d，在年轻(3个月大)和老年(15-16个月大)野生型(WT)小鼠和B2M敲除(B2M-/-)小鼠中通过RAWM(图10a、图10c)和场景性恐惧条件化(图10b和图10d)评估学习和记忆。数据获自每种基因型的10只年轻小鼠和8-12只老年小鼠。图10e-10j，通过对年轻和老年WT小鼠和B2M-/-小鼠的DG中Dcx阳性细胞的免疫染色来分析神经发生。示出了年轻(图10e和图10f)和老年(图10e和图10g)WT动物和B2M-/-动物的Dcx阳性细胞的代表性领域和定量(箭头指向单个未成熟神经元，比例尺：100μm)。数据来自每种基因型的8只年轻小鼠和10只老年小鼠。图10h和图10j，通过腹腔内注射向WT小鼠和B2M-/-小鼠施用BrdU，持续6天，并在28天后执行安乐死。图10h，对BrdU(红色)与NeuN(绿色)组合免疫染色的脑切片中DG的代表性共聚焦显微镜检查。图10i和图10j，对年轻(图10i)和老年(图10j)WT动物和B2M-/-动物DG中的总BrdU阳性细胞中BrdU和NeuN双阳性细胞的相对数量的定量。数据获自每组8只小鼠(每只小鼠3张切片)。所有数据均表示为平均值±SEM；*P<0.05；**P<0.01；n.s.，不显著；t检验(图10b、图10d、图10f、图10i、图10j)；重复测量ANOVA，Bonferroni事后检验(图10a、图10c)

图11a-11f。在老年B2M-/-动物中，游泳速度和线索性记忆没有改变。图11a-11f，在RAWM的测试阶段评估了老年成年(17个月大)WT的海马学习和记忆。在恐惧条件化训练期间，不管基因型如何，动物均表现出类似的基线僵直时间。在训练后24小时，小鼠再次暴露于新环境中的条件性刺激(色调和光线)时，在两个基因型之间没有检测到线索性记忆方面的差异。数据获自12只WT小鼠和8只B2M-/-小鼠。所有数据均表示为平均值+SEM；n.s.，不显著；t检验。

图12a-12e。内源性B2M的缺乏在体内以年龄依赖的方式增加增殖但不增加星形胶质细胞分化。图12a-12c，为了评估增殖，在安乐死之前通过腹膜内注射向年轻(3个月大)和老年(15-16个月大)野生型(WT)小鼠和B2M敲除(B2M-/-)小鼠施用BrdU，持续3天。图12b和图12c，对年轻(图12b)和老年(图12c)动物的DG中的BrdU阳性细胞的免疫染色进行量化。数据获自每种基因型的8只年轻小鼠和10只老年小鼠。图12c-12e，为了检测星形胶质细胞分化，通过腹膜内注射向WT小鼠和B2M-/-小鼠施用BrdU，持续六天，并在28天后执行安乐死。图12c，对BrdU(红色)与GFAP(绿色)组合免疫染色的脑切片中DG的代表性共聚焦显微镜检查。图12d和图12e，对年轻(图12d)和老年(图12e)WT动物和B2M-/-动物的DG中的总BrdU阳性细胞中BrdU和GFAP双阳性细胞的相对数量的定量。数据获自每组8只小鼠(每只小鼠3张切片)。所有数据均表示为平均值±SEM；**P<0.01；n.s.，不显著；t检验。

图13。通过SomaScan蛋白质组学测定(Somalogic,Inc,Boulder,CO)检测18岁、30岁、45岁、55岁和66岁健康男性人类供体血浆样品中β2-微球蛋白的相对水平。对于每个年龄组，将来自40个个体的血浆作为8个组(pools)(每组5个人)进行分析。通过对数转换值的双向Student t检验进行统计学分析，还通过使用Jonckheere-Terpstra检验进行的未转化数据的趋势分析进行统计学分析。发现观察到的变化是非常显著的，t检验的p值为1.1×10^-4(66岁与18岁)，JT检验的p值为1.3×10^-7(所有年龄组)。(RFU是指SomaScan蛋白质组学测定中的相对荧光单位)。

具体实施方式

本发明提供了用于治疗成年哺乳动物的衰老相关的损伤的方法。所述方法的多个方面包括以足以治疗哺乳动物的衰老相关的损伤的方式降低哺乳动物中的β2-微球蛋白(B2M)水平。可以通过实施所述方法来治疗各种衰老相关的损伤，这些损伤包括认知损伤。

在描述本发明的方法和组合物之前，应当理解，本发明不限于所描述的具体方法或组合物，因为所述方法和组合物无疑是可以变化的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求限定。

在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一也被具体公开。在所描述的范围内的任何描述的值或中间值与该范围内的任何其他描述的值或中间值之间的每个较小范围都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围外，并且其中两个限值中的一个、零个或两个包括在较小范围内的每个范围也包括在本发明中，受制于所描述的范围中任何特别排除的限值。在所描述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除这些所包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。

除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试中，但是本发明描述了一些潜在的和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。应当理解，如果存在矛盾之处，本发明将取代所引用的出版物的任何公开内容。

在阅读本发明后，对于本领域技术人员而言将显而易见的是，本文描述和示出的各个实施方案中的每一个都具有分立的部件和特征，其可以容易地与其他几个实施方案中任何一个的特征分离或与其他几个实施方案的特征组合，而不背离本发明的范围或精神。可以按照所描述的事件的顺序或以逻辑上可行的任何其他顺序来实施任何所描述的方法。

应注意，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数个提及物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，提及“肽”包括提及一种或更多种肽及其等价物，例如本领域技术人员已知的多肽等。

提供本文所讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于先前发明而无权早于这类公开。此外，提供的公开日期可能不同于实际公开日期，可能需要独立确认实际公开日期。

方法

如上所述，本发明的多个方面包括治疗成年哺乳动物中衰老相关的损伤的方法。衰老相关的损伤可以以许多不同的方式呈现，例如，作为衰老相关的认知损伤和/或生理损伤，例如形式为对身体的中枢器官或外周器官的损伤(damage)，例如但不限于：细胞损伤、组织损伤、器官功能障碍、衰老相关的寿命缩短和癌变，其中感兴趣的特定器官和组织包括但不限于：皮肤、神经元、肌肉、胰腺、脑，肾、肺、胃、肠、脾、心脏、脂肪组织、睾丸、卵巢、子宫、肝和骨；形式为神经发生减少等。

在一些实施方案中，衰老相关的损伤是在个体认知能力方面的衰老相关的损伤，即衰老相关的认知损伤。认知能力或“认知”是指心理过程，其包括注意力和集中力、学习复杂任务和概念、记忆(短期和/或长期获取、保留和找回新信息)、信息处理(处理由五官感觉收集的信息)、视觉空间功能(视觉感知、深度感知、使用心理意象、复制图像、构建对象或形状)、产生和理解语言、言语流畅(词汇找取)、解决问题、作出决定和执行职能(规划和优先排序)。“认知衰退”是指这些能力中的一种或更多种进行性衰退，例如记忆、语言、思维、判断力等方面的衰退。“认知能力受损”和“认知损伤”是指相对于健康个体(例如，年龄匹配的健康个体)或相对于较早时间时个体的认知能力(例如，2周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、5年，或10年或更早之前)，认知能力的降低。衰老相关的认知损伤包括通常与衰老相关的认知能力的损伤，包括例如与自然衰老过程相关的认知损伤如轻度认知损伤(M.C.I.)；以及与衰老相关疾病相关的认知损伤，衰老相关的疾病即是随着衰老的进行而频率增加的疾病，例如神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病、帕金森病、额颞痴呆、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、强直性肌营养不良、血管性痴呆等。

“治疗”是指实现至少改善与成年哺乳动物患有的衰老相关损伤相关的一种或更多种症状，其中使用改善在广义上是指至少减轻参数的大小，所述症状例如与正在治疗的损伤相关的症状。因此，治疗还包括其中病理状况或至少与其相关的症状被完全抑制(例如，阻止其发生)或停止(例如终止)使得成年哺乳动物不再遭受该损伤或至少表征该损伤的症状的折磨的情况。在一些情况下，“治疗”以及类似的词是指获得期望的药理学和/或生理学效果。在完全或部分预防疾病或其症状方面，该效果可以是预防性的，并且/或者，在部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利影响方面，该效果可以是治疗性的。“治疗”可以是对哺乳动物疾病的任何治疗，包括：(a)防止疾病发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的个体中；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)减轻疾病，即导致疾病消退。治疗可导致各种不同的物理表现，例如基因表达的调节、增加的神经发生、组织或器官的恢复等。在一些实施方案中出现了对正在进行的疾病的治疗，其中所述治疗稳定或减轻患者的不期望的临床症状。可以在受影响的组织功能完全丧失之前实施这种治疗。可以在疾病的症状阶段期间施用该治疗，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用该治疗。

在其中衰老相关的损伤是与衰老相关的认知衰退的某些情况下，通过本发明的方法进行的治疗会减慢或减少衰老相关的认知衰退的进展。换句话说，与用所公开的方法进行治疗之前或没有用所公开的方法进行治疗相比，在用所公开的方法进行治疗之后(如果有的话)，个体的认知能力衰退更缓慢。在一些情况下，通过本发明的方法进行的治疗稳定个体的认知能力。例如，在通过所公开的方法进行治疗之后，在遭受衰老相关的认知衰退的折磨的个体中，认知衰退进展停止。另一个实例是，在通过所公开的方法进行治疗后，预防了预计会患有衰老相关的认知衰退的个体(例如40岁或更老的个体)中的认知衰退。换句话说，没有观察到(进一步的)认知损伤。在一些情况下，通过本公开的方法进行的治疗减轻或逆转认知损伤，例如通过改善患有衰老相关的认知衰退的个体的认知能力所观察到的。换句话说，在通过所公开的方法进行治疗后，患有衰老相关的认知衰退的个体的认知能力比通过所公开的方法进行治疗之前要好，即认知能力在治疗后得到了改善。在一些情况下，通过本公开的方法进行的治疗消除了认知损伤。换句话说，例如，如通过改善患有衰老相关的认知衰退的个体的认识能力而证实的，通过所公开的方法进行治疗之后，患有衰老相关的认知衰退的个体的认知能力得到恢复，例如，恢复至当个体年龄在约40岁或小于40岁时的认知能力水平。

在一些情况下，根据该方法治疗成年哺乳动物导致中枢器官(例如中枢神经系统器官，如脑、脊髓等)发生变化，其中所述变化可以以多种不同的方式呈现，例如，如下文所更详细地描述的，变化包括但不限于分子、结构和/或功能变化，例如形式为增强的神经发生。

如上所述，本文描述的方法是治疗成年哺乳动物中衰老相关的损伤(例如，如上所述的损伤)的方法。成年哺乳动物是指已经达到成熟的哺乳动物，即完全发育的哺乳动物。因此，成年哺乳动物不是幼年动物。可以用本发明的方法治疗的哺乳动物物种包括犬科动物和猫科动物、马类、牛科动物、绵羊类等以及灵长类动物，包括人类。本发明的方法、组合物和试剂(reagent)也可以应用于动物模型，包括例如在实验研究中的小哺乳动物，例如鼠科动物、兔类等。下面的讨论将重点关注将本发明的方法、组合物、试剂、装置和试剂盒应用于人类，但是本领域技术人员将会理解，可以基于现有技术将这样的描述容易地修改为其他感兴趣的哺乳动物。

成年哺乳动物的年龄可能会有所不同，具体取决于正在治疗的哺乳动物的类型。如果成年哺乳动物是人类，则人类的年龄通常为18岁或更老。在一些情况下，成年哺乳动物是患有或有风险患上衰老相关的损伤的个体，例如衰老相关的认知损伤，其中成年哺乳动物可以是已经被确定(例如以接受诊断的形式)为患有或有风险患上衰老相关的损伤(如衰老相关的认知损伤)的哺乳动物。短语“患有或有风险患上衰老相关的认知损伤的个体”是指约50岁或更老的个体，例如60岁或更老、70岁或更老、80岁或更老、有时候不超过100岁，如90岁，即年龄在50岁至100岁之间，例如50、55、60、65、70、75、80、85或约90岁。个体可以患有与自然衰老过程(例如M.C.I)相关的衰老相关病症，例如认知损伤。可选择地，个体可以是50岁或更老、例如60岁或更老、70岁或更老、80岁或更老、90岁或更老，有时不超过100岁，即年龄在约50岁和100岁之间，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100岁，并且个体尚未开始表现出衰老相关的病症的症状，例如，认知损伤。在其他实施方案中，个体可以是任何年龄的，其中个体因为衰老相关的疾病(例如阿尔茨海默氏病、帕金森病、额颞痴呆、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、强直性肌营养不良、痴呆等)而遭受认知损伤的折磨。在某些情况下，个体是被诊断患有衰老相关的疾病(该疾病通常伴有认知损伤)的任何年龄的个体，所述疾病例如阿尔茨海默氏病、帕金森病、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩、多发性硬化症、多系统萎缩、青光眼、共济失调、强直性肌营养不良、痴呆等，其中个体尚未开始表现出认知损伤的症状。

如上所述，该方法的多个方面包括以足以治疗哺乳动物中的衰老损伤的方式降低哺乳动物中的β2-微球蛋白(B2M)水平，例如如上所述。降低B2M水平是指降低哺乳动物中B2M的量，例如哺乳动物中细胞外B2M的量。虽然降低的幅度可以变化，但在某些情况下，幅度是2倍或更大，例如5倍或更大，包括10倍或更大，例如15倍或更大、20倍或更大、25倍或更大(与合适的对照相比)，其中在某些情况下，该幅度使得个体循环系统中可检测的游离B2M的量为在根据本发明的干预之前可检测的量的50％或更少，例如25％或更少，包括10％或更少，例如1％或更少，并且在一些情况下，在干预后游离B2M的量是不可检测的。

可以使用任何方便的方案来降低B2M水平。在一些情况下，通过从成年哺乳动物中去除全身性B2M(例如，通过从成年哺乳动物的循环系统中去除B2M)来降低B2M水平。在这种情况下，可以采用用于去除循环B2M的任何方便的方案。例如，可以从成年哺乳动物获得血液，并进行体外加工以从血液中去除B2M，从而产生B2M耗尽的血液，然后所得到的B2M耗尽的血液可以被返回给成年哺乳动物。这样的方案可以采用各种不同的技术以便从所获得的血液中去除B2M。例如，所获得的血液可以与允许B2M通过但禁止其他血液成分(例如细胞等)通过的过滤部件(例如膜等)接触。在一些情况下，所获得的血液可以与从血液中吸收B2M的B2M吸收性部件接触，例如多孔珠粒或颗粒组合物。在其他情况下，所获得的血液可以与稳定地与固体支持物结合的B2M结合元件接触，使得B2M与结合元件结合并由此固定在固体支持物上，从而使B2M与其他血液成分分离。根据需要，所采用的方案可以或可以不被配置为从所获得的血液中选择性地去除B2M。已知多种不同的技术用于从血液中去除B2M，并且可以在本发明的实施方案中采用这些技术，其中这样的技术包括以下中描述的技术：第4,872,983、5,240,614、6,416,487、6,419,830、6,423,024、6,855,121、7,066,900、8,211,310、8,349,550号美国专利，以及已公开的第20020143283号美国专利申请和已公开的第WO/1999/006098和WO/2003/020403号PCT申请公开文本，这些申请的公开内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，通过向哺乳动物施用有效量的B2M水平降低剂来降低B2M水平。因此，在实施根据本发明的这些实施方案的方法的过程中，向成年哺乳动物提供有效量的活性剂，例如B2M调节剂。

根据在实施的具体实施方案，可以使用各种不同类型的活性剂。在一些情况下，该活性剂调节基因的RNA和/或蛋白表达，使得其以某种方式改变靶基因的RNA或蛋白表达。在这些情况下，活性剂可以以多种不同的方式改变RNA或蛋白的表达。在某些实施方案中，活性剂是降低(包括抑制)B2M蛋白的表达的活性剂。可以使用任何方便的方法来实现B2M蛋白表达的抑制，包括使用抑制B2M蛋白表达的活性剂，例如但不限于：RNAi活性剂、反义活性剂、干扰转录因子与B2M基因的启动子序列结合的活性剂，或者使B2M基因失活(例如通过重组技术等)。

例如，B2M蛋白的转录水平可以通过使用RNAi物质(例如双链RNA)的基因沉默进行调节(参见例如，Sharp,Genes and Development(1999)13:139-141)。诸如双链RNA干扰(dsRNAi)或小干扰RNA(siRNA)的RNAi已在秀丽隐杆线虫(nematode C.elegans)中被广泛记载(Fire,et al,Nature(1998)391:806-811)，并且它们常规地用于在各种系统中“敲减(knock down)”基因。RNAi活性剂可以是dsRNA或干扰核糖核酸的转录模板(其可用于在细胞中产生dsRNA)。在这些实施方案中，转录模板可以是编码干扰核糖核酸的DNA。与RNAi相关的方法和步骤还在已公开的第WO 03/010180和WO 01/68836号PCT申请公开本文中记载，该申请的公开内容通过引用并入本文。可以根据本领域中已知的多种方法中的任意一种来制备dsRNA，包括体外和体内方法，以及合成化学方法。这些方法的实例包括但不限于以下中描述的方法：Sadher et al.,Biochem.Int.(1987)14:1015；Bhattacharyya,Nature(1990)343:484；和第5,795,715号美国专利，它们的公开内容通过引用并入本文。还可以使用酶法合成与有机合成的组合或通过全有机合成来生产单链RNA。合成化学方法的使用使得人们将所期望的修饰核苷酸或核苷酸类似物引入至dsRNA中。还可以根据多种已确立的方法来体内制备dsRNA(参见，例如Sambrook,et al.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd ed.；Transcription and Translation(B.D.Hames,andS.J.Higgins,Eds.,1984)；DNA克隆，卷I和卷II(D.N.Glover,Ed.,1985)；和寡核苷酸合成(M.J.Gait,Ed.,1984,每篇文献都通过引用并入本文)。可以利用多种方案将dsRNA递送至例如在细胞培养物、组织、器官或胚胎中的细胞或细胞群。例如，可以直接在细胞内引入RNA。在这种情况下，通常使用各种物理方法，例如通过显微注射施用(参见，例如Zernicka-Goetz,et al.Development(1997)124:1133-1137；和Wianny,et al.,Chromosoma(1998)107:430-439))。用于细胞递送的其他方法包括在dsRNA的存在下使细胞膜透化和电穿孔、脂质体介导的转染或使用诸如磷酸钙的化学物质的转染。还可以利用多种已确立的基因治疗技术来将dsRNA引入至细胞中。例如，通过引入病毒颗粒内的病毒构建体，人们可以实现将表达构建体有效引入至细胞并实现由该构建体编码的RNA的转录。可用于减少B2M表达的RNAi活性剂的具体实例包括但不限于：对应于B2M的dsRNA和短干扰RNA(siRNA)，其具有以下正义序列和反义序列：(正义)5'-GAUUCAGGUUUACUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO:01)和(反义)5'-ACGUGAGUAAACCUGAAUCdTdT-3’(SEQ ID NO:02)(如Matin,et al.,“Specificknockdown of Oct4and beta2-microglobulin expression by RNA interference inhuman embryonic stem cells and embryonic carcinoma cells,”Stem Cells(2004)22:659-68)和WO/2004/085654中所述)；shRNA(GCCACTCCCACCCTTTCTCAT)(SEQ ID NO:03)(如Goyos,et al.,“Involvement of nonclassical MHC class Ib molecules in heatshock protein-mediated anti-tumor responses,”(2007)37:1494-501中所公开的)；以及在以下中公开的RNAi活性剂：Figueiredo,et al.,“Generation of HLA-deficientplatelets from hematopoietic progenitor cells,”Transfusion(2010)50:1690-701；Bhatt,et al.,“Knockdown of beta2-microglobulin perturbs the subcellulardistribution of HFE and hepcidin,”Biochemical and Biophysical ResearchCommunications(2009)378:727-31；Elders,et al.,“Targeted knockdown of canineKIT(stem cell factor receptor)using RNA interference,”Veterinary Immunologyand Immunopathology(2011)141:151-6；Heikkila,et al.,“Internalization ofcoxsackievirus A9is mediated by beta 2-microglobulin,dynamin,and Arf6but notby caveolin-1or clathrin,”(2010)84:3666-81；Figueiredo,et al.,“Class-,gene-,and group-specific HLA silencing by lentiviral shRNA delivery(2006)84:425-37；WO/2004/020586；US20040127445和US20130096370。

在某些情况下，反义分子可用于下调细胞中B2M基因的表达。反义活性剂可以是反义寡脱氧核苷酸(ODN)，特别是来自天然核酸的具有化学修饰的合成ODN，或者是表达这类反义分子为RNA的核酸构建体。反义序列与靶蛋白的mRNA互补，并抑制靶蛋白的表达。反义分子通过各种机制抑制基因表达，例如通过减少可用于翻译的mRNA的量，通过激活核糖核酸酶H或空间位阻来抑制基因表达。可以施用一种反义分子或反义分子的组合，其中组合可以包括多种不同的序列。

可以通过在合适载体中表达全部或部分靶基因序列来产生反义分子，其中转录起始被定向为使得反义链作为RNA分子产生。可选择地，反义分子是合成的寡核苷酸。反义寡核苷酸的长度通常为至少约7个核苷酸，通常至少约12个核苷酸，更通常至少约20个核苷酸，并且不超过约500个核苷酸，通常不超过约50个核苷酸，更通常长度不超过约35个核苷酸，其中长度由抑制效率、特异性(包括没有交叉反应性)等决定。长度为7至8个碱基的短寡核苷酸可以是基因表达的强的选择性抑制剂(参见Wagner et al.,Nature Biotechnol.(1996)14:840-844)。

内源正义链mRNA序列的一个或多个特定区域被选择为与反义序列互补。可以使用实证方法选择寡核苷酸的具体序列，其中在体外或动物模型中测定若干候选序列对靶基因表达的抑制。还可以使用序列的组合，其中选择mRNA序列的若干区域用于与反义序列互补。

可以通过本领域已知的方法化学合成反义寡核苷酸(参见Wagner et al.(1993)，同上)。可以从其本身的磷酸二酯结构来化学修饰寡核苷酸，以便增加其细胞内稳定性和结合亲和力。在文献中已经记载了许多这样的修饰，其改变主链、糖或杂环碱基的化学性质。其中骨架化学性质的有益改变是硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯，其中两个非桥氧都被硫取代；亚磷酰胺；烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。非手性磷酸酯衍生物包括3'-O-5'-S-硫代磷酸酯、3'-S-5'-O-硫代磷酸酯、3'-CH₂-5'-O-膦酸酯和3'-NH-5'-O-氨基磷酸酯。肽核酸用肽键代替整个核糖磷酸二酯骨架。糖修饰也用于增强稳定性和亲和力。可以使用脱氧核糖的α-端基异构体，其中碱基相对于天然β-端基异构体反转。可以改变核糖的2'-OH以形成2'-O-甲基糖或2'-O-烯丙基糖，其在不损害(comprising)亲和力的情况下提供耐降解性。杂环碱基的修饰必须维持适当的碱基配对。一些有用的取代包括用于脱氧胸苷的脱氧尿苷；用于脱氧胞苷的5-甲基-2'-脱氧胞苷和5-溴-2'-脱氧胞苷。已经证明5-丙炔基-2'-脱氧尿苷和5-丙炔基-2'-脱氧胞苷在分别取代脱氧胸苷和脱氧胞苷时可增加亲和力和生物活性。可以用于降低B2M表达的反义活性剂的具体实例包括但不限于：WO/2004/004575中描述的

代码	寡核苷酸
		MB-00027	βA*βG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*βZ*βZ
MB-00540	Eru*SS*βA*βG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*βZ*βZ
		MB-00541	Myr*SS*βA*βG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*βZ*βZ
MB-00542	Dier*SS*βA*βG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*βZ*βZ
		MB-00543	Ermy*SS*βA*βG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*βZ*βZ

(SEQ ID NO：04-SEQ ID NO：08)；以及在以下中描述的那些反义活性剂：Lichtenstein，et al.，“Effects of beta-2 microglobulin anti-senseoligonucleotides on sensitivity of HER2/neu oncogene-expressing andnonexpressing target cells to lymphocyte-mediated lysis,”Cell Immunology(1992)141：219-32；Ogretmen，et al.，“Molecular mechanisms of loss of beta 2-microglobulin expression in drug-resistant breast cancer sublines and itsinvolvement in drug resistance，”Biochemistry(1998)37∶11679-91；WO/2004/020586；WO/2006/130949；7,553,484；和8,715,654。

作为反义抑制剂的替代物，例如核酸酶、反义缀合物等的催化性核酸化合物可用于抑制基因表达。核酸酶可以在体外合成并施用给患者，或者可以在表达载体上被编码，在靶细胞中，核酸酶由表达载体合成(例如，参见国际专利申请号WO 9523225和Beigelman etal.Nucl.Acids Res.(1995)23：4434-42)。具有催化活性的寡核苷酸的实例描述于WO9506764中。反义ODN与金属复合物如三联吡啶Cu(II)的缀合物能够调节mRNA水解，该缀合物描述于Bashkin et al.Appl.Biochem.Biotechnol.(1995)54：43-56中。

在另一个实施方案中，B2M基因被失活，使得其不再表达功能性蛋白。失活是指基因(例如编码序列和/或其调节元件)被基因修饰，使得其不再表达功能性B2M蛋白，例如至少在B2M衰老损伤活性方面。改变或突变可以采取多种不同的形式，例如通过缺失一个或更多个核苷酸残基，通过交换一个或更多个核苷酸残基等。在编码序列中进行这种改变的一种方式是通过同源重组。通过同源重组产生靶基因修饰的方法在本领域是已知的，包括在以下专利中描述的那些：美国专利第6,074,853号、第5,998,209号、第5,998,144号、第5,948,653号、第5,925,544号、第5,830,698号、第5,780,296、第5,776,744号、第5,721,367号、第5,614,396号、第5,612,205号，它们的公开内容通过引用并入本文。

在某些实施方案中感兴趣还有B2M蛋白的显性负性突变体，其中这种突变体在细胞中的表达导致对B2M介导的衰老损伤的调节，例如降低。B2M的显性负性突变体是显示出显性负性B2M活性的突变蛋白。如本文所用的，术语“显性负性B2M活性”或“显性负性活性”是指抑制、打消或降低B2M的某些特定活性，特别是B2M介导的衰老损伤。可以容易地产生相应蛋白的显性负性突变。这些可通过几种不同的机制起作用，包括：底物结合结构域中的突变；催化结构域中的突变；蛋白结合结构域(例如，多聚体形成、效应子或活化蛋白结合结构域)中的突变；细胞定位结构域中的突变等。突变多肽可以与野生型多肽(由其他等位基因制得)相互作用并形成非功能性多聚体。在某些实施方案中，突变多肽将被过量产生。可以进行具有这样效果的点突变。另外，将各种长度的不同多肽融合至蛋白的末端或缺失特定结构域可以得到显性负性突变体。可使用一般策略制备显性负性突变体(参见例如Herskowitz,Nature(1987)329:219以及上文引用的参考文献)。这种技术被用于产生功能丧失突变，这对于确定蛋白质功能是有用的。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有编码序列以及用于增加引入至细胞的外源基因的表达的合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。可选择地，可以使用例如合成仪来化学合成能够编码基因产物序列的RNA。参见例如在"Oligonucleotide Synthesis",1984,Gait,M.J.ed.,IRL Press,Oxford中描述的技术。

在其他实施方案中，活性剂是通过结合B2M和/或抑制B2M与第二蛋白(例如MHC1的蛋白成员)的结合来调节(例如抑制)B2M活性的活性剂。例如，与B2M结合并抑制其活性的小分子是感兴趣的。感兴趣的天然存在的或合成的小分子化合物包括许多化学类别，例如有机分子如分子量大于50且小于约2,500道尔顿的小的有机化合物。候选活性剂包含用于与蛋白质进行结构相互作用(特别是氢键合)的官能团，并且通常包含至少一个胺基、羰基、羟基或羧基，优选这些化学官能团中的至少两个。候选活性剂可以包含被一个或更多个上述官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳族或聚芳族结构。在包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合的生物分子中也发现了候选活性剂。在其他方式中，可以通过采用下面描述的筛选方案来鉴定这样的分子。可以用于降低B2M表达的小分子试剂的具体实例包括但不限于：Riamycin SV：(7S,9E,11S,12R,13S,14R,15R,16R,17S,18S,19E,21Z)-2,15,17,27,29-五羟基-11-甲氧基-3,7,12,14,16,18,22-七甲基-26-{(E)-[(4-甲基哌嗪-1-基)亚氨基]甲基}-6,23-二氧代-8,30-二氧杂-24-氮杂四环[23.3.1.14,7.05,28]三十烷-1(28),2,4,9,19,21,25(29),26-辛烯-13-基乙酸酯(如Woods,et al.,“Ligand binding to distinct states diverts aggregation of anamyloid-forming protein”Nature Chemical Biology(2011)7:730-9中所公开的)；甲氯环素、多西环素、4-表-氧四环素、罗利四环素(rolitetracycline)、脱水四环霉素(anhydrochlortetracycline)、美他环素(methacycline)和氧四环素(如Giorgetti,etal.,“Effect of tetracyclines on the dynamics of formation and destructurationof beta2-microglobulin amyloid fibrils,”The Journal of Biological Chemistry(2011)286:2121-31中所描述的)；肽D-TLKIVW、D-TWKLVL、D-YVIIER和D-DYYFEF(如8,754,034中所描述的)；以及以下中所描绘的活性剂：Morozov,et al.,“Survey of smallmolecule and ion binding to beta 2-microglobulin—possible relation to BEN,”(1991)34:S85-8；Regazzoni,et al.,“Screening of fibrillogenesis inhibitors ofB2-microglobulin:integrated strategies by mass spectrometry capillaryelectrophoresis and in silico simulations,”Analytica Chimica Acta(2011)685:153-61；Quaglia,et al.,“Search of ligands for the amyloidogenic protein beta2-microglobulin by capillary electrophoresis and other techniques,”Electrophoresis(2005)26:4055-63；Ozawa,et al.,“Inhibition of beta2-microglobulin amyloid fibril formation by alpha2-macroglobulin,”The Journalof Biological Chemistry(2011)286:9668-9676；Pullara和Emanuele,“Early stages ofbeta2-microglobulin aggregation and the inhibiting action of alphaB-crystallin,”(2008)73:1037-46；Wanchu,et al.,“Suppression of beta2microglobulin by pentoxiphylline therapy in asymptomatic HIV infectedindividuals,”(2001)113:75-7；Brancolini,et al.,“Can small hydrophobic goldnanoparticles inhibit B2-microglobulin fibrillation？,”Nanoscale(2014)6:7903-11；US20040127445和US20130331327。

在某些实施方案中，所施用的活性剂是B2M特异性结合分子(member)。一般而言，可用的B2M特异性结合分子对于靶标B2M(例如人B2M)表现出亲和力(Kd)，所述亲和力足以提供所期望的衰老相关损伤B2M活性降低。如本文所用，术语“亲和力”是指两种活性剂的可逆结合的平衡常数；“亲和力”可以表示为解离常数(Kd)。亲和力可以比抗体对无关氨基酸序列的亲和力的至少高1倍，至少高2倍，至少高3倍，至少高4倍，至少高5倍，至少高6倍，至少高7倍，至少高8倍，至少高9倍，至少高10倍，至少高20倍，至少高30倍，至少高40倍，至少高50倍，至少高60倍，至少高70倍，至少高80倍，至少高90倍，至少高100倍或至少高1000倍或更多。特异性结合分子对靶蛋白的亲和力可以为例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM，约100nM至约1皮摩尔(pM)或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更高。术语“结合”是指由例如共价、静电、疏水和离子键和/或氢键相互作用(包括诸如盐桥和水桥的相互作用)导致的两个分子之间的直接结合。在一些实施方案中，抗体以纳摩尔级或皮摩尔级亲和力结合人B2M。在一些实施方案中，抗体以小于约100nM、50nM、20nM、20nM或1nM的Kd结合人B2M。

B2M特异性结合分子的实例包括B2M抗体及其结合片段。此类抗体的非限制性实例包括针对B2M的任何表位的抗体。还包括双特异性抗体，即其中两个结合结构域中的每一个结合结构域识别不同结合表位的抗体。Cunningham,et al.,"The complete amino acidsequence of beta-2-microglobulin,"Biochemistry(1973)12:4811-4821中公开了人B2M的氨基酸序列。

可以使用的抗体特异性结合分子包括任何同种型的完整抗体或免疫球蛋白，以及保持与抗原特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。抗体可以被可检测地标记，例如用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等标记。抗体可以进一步缀合至其他部分，例如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员)等。该术语还包括保持与抗原特异性结合的Fab'、Fv、F(ab')2和/或其他抗体片段，以及单克隆抗体。抗体可以是单价的或二价的。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；线性抗体(Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个抗原结合片段具有单个抗原结合位点和剩余的“Fc”片段，该名称反应了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。

“Fv”是含有完整抗原识别位点和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密非共价结合的一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种结构中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上界定抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整的结合位点的亲和力。

“Fab”片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或更多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文对其恒定结构域的半胱氨酸残基携带有游离巯基的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以归类为两种明显不同的类型中的一种，两种类型称为κ和λ。根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的类别。有五种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中这些中的若干可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域以单条多肽链存在。在一些实施方案中，Fv多肽还包含VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，这使得sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。

因此，可以结合本发明使用的抗体可以包括单克隆抗体，多克隆抗体，双特异性抗体，Fab抗体片段，F(ab)2抗体片段，Fv抗体片段(例如VH或VL)，单链Fv抗体片段和dsFv抗体片段。此外，抗体分子可以是全人抗体，人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体分子是单克隆全人抗体。

可以结合本发明使用的抗体可以包括与任何免疫球蛋白恒定区连接的成熟或未加工的任何抗体可变区。如果轻链可变区与恒定区连接，则其可以是κ链恒定区。如果重链可变区与恒定区连接，则其可以是人γ1、γ2、γ3或γ4恒定区，更优选γ1、γ2或γ4，甚至更优选γ1或γ4。

在一些实施方案中，使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠产生针对B2M的全人单克隆抗体。

如果氨基酸序列的变化维持该序列的至少75％，例如至少80％、90％、95％或99％，则本发明涵盖抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化。具体而言，涵盖了保守氨基酸取代。保守取代是那些在侧链相关的氨基酸的家族内发生的取代。通过测定多肽衍生物的比活性可以容易地确定氨基酸变化是否产生功能性肽。本领域普通技术人员可以容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段(或类似物)。片段或类似物的优选的氨基末端和羧基末端在功能结构域的边界附近存在。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴定结构结构域和功能结构域。优选地，使用计算机化的比较方法来鉴定存在于具有已知结构和/或功能的其他蛋白中的序列基序或预测的蛋白构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。根据本发明，序列基序和结构构象可以用来定义结构和功能结构域。

可以用于降低B2M表达的抗体剂的具体实例包括但不限于：来自Immunotech S.A.(Marseille,France)的Anti-B2m B1-1G6(免疫球蛋白G2a[IgG2])、B2-62-2(IgG2a)和C21-48A(IgG2b)；Anti-B2m MAb HC11-151-1(IgG1)(如Corbeau,et al.,“An earlypostinfection signal mediated by monoclonal anti-beta 2microglobulin antibodyis responsible for delayed production of human immunodeficiency virus type1in peripheral blood mononuclear cells,”Journal of Virology(1990)64:1459-64中所公开的)；克隆B2、小鼠IgG1(Sero-tec Ltd.,Oxford,UK)；如Yang,et al.,“Targetingbeta(2)-microglobulin for induction of tumor apoptosis in human hematologicalmalignancies,”(2006)10:295-307中所公开的抗人B2M的小鼠单克隆抗体；1B749(IgG2a)和HB28(IgG2b)(如Pokrass,et al.,“Activation of complement by monoclonalantibodies that target cell-associated B2-microglobulin:implications forcancer immunotherapy,”(2013)56:549-60中所公开的)；anti-B2-微球蛋白(BBM.1抗体)(如Brodsky,et al.,“Characterization of a monoclonal anti-beta 2-microglobulinantibody and its use in the genetic and biochemical analysis of majorhistocompatibility antigens,”European Journal of Immunology(1979)9:536-45中所公开的)；BBM-1(如Korkolopoulou,“Loss of antigen-presenting molecules(MHC classI and TAP-1)in lung cancer,”British Journal of Cancer(1996)73:148-53中所公开的)；B1.1G6，C23.24.2，B2.62.2和C21.48A1抗体(如Liabeuf,et al.,“An antigenicdeterminant of human beta 2-microglobulin masked by the association with HLAheavy chains at the cell surface:analysis using monoclonal antibodies,”Journal of Immunology(1981)127:1542-8中所公开的)；以及在以下中描述的那些抗体：Zhang,et al.,“Anti-B2M monoclonal antibodies kill myeloma cells via cell-andcomplement-mediated cytotoxicity,”International Journal of Cancer(2014)135:1132-41；Yang,et al.,“Anti beta2-microglobulin monoclonal antibodies induceapoptosis in myeloma cells by recruiting MHC class I to and excluding growthand survival cytokine receptors from lipid rafts,”Blood(2007)110:3028-35；Josson,et al.,“Inhibition of B2-microglobulin/hemochromatosis enhancesradiation sensitivity by induction of iron overload in prostate cancercells,”(2013)8:e68366；Par和Falus,“Serum beta 2-microglobulin(beta 2m)andanti-beta 2m antibody in chronic hepatitis,”Acta Medica Hungarica(1986)43:343-9；Huang,et al.,“Androgen receptor survival signaling is blocked by anti-beta2-microglobulin monoclonal antibody via a MAPK/lipogenic pathway in humanprostate cancer cells,”The Journal of Biological Chemistry(2010)285:7947-56；Tam和Messner,“Differential inhibition of mitogenic responsiveness bymonoclonal antibodies to beta 2-microglobulin,”(1991)133:219-33；Domanska,etal.,“Atomic structure of a nanobody-trapped domain-swapped dimer of anamyloidogenic beta2-microglobulin variant,”ProcNatlAcadSci U S A.(2011)108(4):1314-9；Falus,et al.,“Prevalence of anti-beta-2microglobulinautoantibodies in sera of rheumatoid arthritis patients with extra-articularmanifestations,”Annals of the Rheumatic Diseases,(1981)40:409-413；Shabunina,et al.,“Immunosorbent for Removal of B2-microglobulin from Human BloodPlasma,”Bulletin of Experimental Biology and Medicine(2001)132:984-986)；WO/2010/017443；7,341,721；WO/1996/002278；WO/2003/079023；和WO/1990/013657。

在将活性剂施用给成年哺乳动物的那些实施方案中，可以使用能够产生所需活性的任何方便的施用方案将一种或多种活性剂施用给成年哺乳动物。因此，可以将活性剂纳入各种制剂中，例如药学上可接受的载体，以用于治疗性施用。更具体地说，本发明的活性剂可以通过与合适的药学上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏(例如护肤霜)、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。因此，可以以各种方式施用活性剂，包括口服施用、颊施用、直肠施用、肠胃外施用、腹膜内施用、皮内施用、透皮施用、气管内施用等。

在药物剂型中，所述活性剂可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者它们也可以单独使用或以适当的结合形式使用，以及与其他药学活性化合物组合使用。以下方法和辅料仅仅是示例性的，绝不是限制性的。

对于口服制剂，活性剂可以单独使用或与合适的添加剂组合使用以制成片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如用常规添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶组合；与崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁组合；如果需要的话，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合。

通过将活性剂溶解、混悬或乳化在水性或非水性溶剂如植物油或其他类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂族酸或丙二醇的酯中，活性剂可以被配制成注射用制剂；如果需要的话，用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、混悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂配制。

这些活性剂可以用于气溶胶制剂中以通过吸入施用。本发明的化合物可以配制至加压的、可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。

此外，可以通过与各种基质如乳化基质或水溶性基质混合而将活性剂制成栓剂。本发明的化合物可以通过栓剂经直肠施用。栓剂可以包括在体温下熔化但在室温下固化的载体，例如可可脂、碳蜡和聚乙二醇。

可以提供用于口服或直肠施用的单位剂型，例如糖浆剂、酏剂和混悬剂，其中每个剂量单位(例如茶匙、大汤匙、片或栓剂)含有预定量的含有一种或多种抑制剂的组合物。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可以包含组合物中的抑制剂，所述组合物为无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载体的溶液的形式。

如本文所用，术语“单位剂型”是指适合作为用于人和动物个体的单位剂量的、物理上分立的单位，每个单位含有预定量的本发明化合物，本发明化合物的量被计算为与药学上可接受的稀释剂、载体(carrier)或赋形剂(vehicle)联合足以产生所需的效果。本发明的新单位剂型的规格取决于所使用的具体化合物、要实现的效果以及在宿主中与每种化合物相关的药效动力学。

药学上可接受的辅料如赋形剂、佐剂、载体或稀释剂是公众容易获得的。而且，药学上可接受的辅助性物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂(tonicity adjustingagent)、稳定剂、润湿剂等也是公众容易获得的。

当活性剂为多肽、多核苷酸、其类似物或模拟物时，可以通过多种途径将其引入至组织或宿主细胞中，所述途径包括病毒感染、显微注射或囊泡融合。喷射注射也可以用于肌内施用，如Furth et al.,Anal Biochem.(1992)205:365-368所述。可以将DNA涂覆到金微粒上，并通过如文献(参见例如Tang et al.,Nature(1992)356:152-154)中所述的粒子轰击装置或“基因枪”进行皮内递送，其中金微粒用DNA涂覆，然后将其轰击至皮肤细胞中。对于核酸治疗剂，可使用多种不同的运输载体，包括本领域已知的病毒和非病毒载体系统。

本领域技术人员将容易地理解，剂量水平可以根据具体化合物的作用、运输载体的性质等变化。给定化合物的优选剂量可由本领域技术人员通过多种方式容易地确定。

在将有效量的活性剂施用给成年哺乳动物的那些实施方案中，当施用合适的时间段(例如1周或更长，包括2周或更长，如3周或更长、4周或更长、8周或更长等)时，所述量或剂量是有效的，以证明成年哺乳动物中诸如认知衰退的损伤减轻和/或认知改善。例如，有效剂量是这样的剂量，即当施用合适的时间段(例如至少约1周，可能约2周以上，长达约3周、4周、8周或更长时间)时，所述剂量将减慢(例如，停止)例如约20％或更多，例如减慢30％或更多，减慢40％或更多，或减慢50％或更多，在一些情况下，减慢60％或更多，减慢70％或更多，减慢80％或更多，或减慢90％或更多，经历自然衰老或患有衰老相关病症的患者中的认知衰退。在一些情况下，活性剂的有效量或有效剂量将不仅减慢或停止病情的进展，而且还会引发疾病的逆转，即引起认知能力的提高。例如，在一些情况下，有效量是这样的量，即当施用合适的时间段(通常至少约1周，可能约两2周或更多，长达约3周、4周、8周或更长的时间)时，所述量将提高患有衰老相关的认知损伤的个体的认知能力，例如相对于施用血液制品前的认识能力提高1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍，在一些情况下，提高6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多。

在需要时，可以使用任何方便的方案评估治疗的有效性。用于测量认知能力(例如，注意力和集中力、学习复杂任务和概念的能力、记忆、信息处理、视觉空间功能、产生和理解语言的能力、解决问题和做出决定的能力以及履行执行功能的能力)的认知测试和智商测试在本领域中是众所周知的，其中的任何一种都可以用于测量在用本申请的血液制品治疗前和/或治疗期间以及治疗后的个体的认知能力，例如以确认已经施用了有效的量。这些测试包括例如全科医师认知评估(GPCOG)测试、记忆损伤筛选、简易精神状态检查(MMSE)、加州语言学习测验(第二版，简表，测试记忆)、Delis-Kaplan执行功能系统测试、阿尔茨海默氏病评估量表(ADAS-Cog)、精神病评估量表(PAS)等。功能性脑改善的进展可以通过脑成像技术如磁共振成像(MRI)或正电子发射断层扫描(PET)等来检测。可以应用各种各样的其他功能评估来监测日常生活活动、执行功能、可动性等。在一些实施方案中，所述方法包括测量认知能力和检测降低的认知衰退速率、认知能力的稳定化和/或与施用血液制品前个体的认知能力相比施用血液制品后认知能力的增强的步骤。这样的测量可以在施用血制品后的一周或更久来进行，例如1周、2周、3周，或更久，例如4周、6周或8周或更久，例如3个月、4个月、5个月或6个月或更久。

在生物化学上，活性剂的“有效量”或“有效剂量”是指这样的活性剂的量，即将抑制、拮抗、降低、减轻或压制(suppress)约20％或更多，例如30％或更多，40％或更多，或50％或更多，在一些情况下，抑制，拮抗，降低，减轻或压制60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多，在一些情况下，抑制、拮抗、降低、减轻或压制100％(即抑制、拮抗、降低、减轻或压制至可忽略的量)，并在一些情况下，是指逆转在自然衰老过程期间或衰老相关疾病的发展期间发生的突触可塑性的降低和突触丧失的活性剂的量。换言之，根据本发明的方法治疗的成年哺乳动物中存在的细胞将更积极地响应线索，例如促进突触的形成和维持的活性线索。

例如如上所述，本发明的方法的实施可以表现为所观察到的突触可塑性的改善，在体外和体内都作为对长时程增强作用的诱导。例如，在清醒的个体中可以观察到神经回路中LTP的诱导，例如通过对清醒个体实施非侵入性刺激技术以诱导局部化神经活性中的LTP样长期变化(Cooke SF,Bliss TV(2006)Plasticity in the human central nervoussystem.Brain.129(Pt 7):1659-73)；例如通过使用正电子发射断层摄影术、功能性磁共振成像和/或经颅磁刺激来成像个体中的可塑性和增加的中枢回路活动(Cramer和Bastings,"Mapping clinically relevant plasticity after stroke,"Neuropharmacology(2000)39:842-51)；以及例如通过测定再现相关的脑活动来检测学习之后的神经可塑性，即，记忆的改善(Buchmann et al.,"Prion protein M129Vpolymorphism affects retrieval-related brain activity,"Neuropsychologia.(2008)46:2389-402)；或者例如通过在用熟悉以及不熟悉的对象进行重复启动之后通过功能磁共振成像(fMRI)来对脑组织进行成像(Soldan et al.,"Global familiarity ofvisual stimuli affects repetition-related neural plasticity but notrepetition priming,"Neuroimage.(2008)39:515-26；Soldan et al.,"Aging does notaffect brain patterns of repetition effects associated with perceptualpriming of novel objects,"J.Cogn.Neurosci.(2008)20:1762-76)。在一些实施方案中，所述方法包括测量突触可塑性以及检测降低的突触可塑性丧失速率、突触可塑性的稳定化和/或与施用血液制品前个体的突触可塑性相比施用血液制品后突触可塑性的增强的步骤。这样的测量可以在施用血制品后的一周或更久来进行，例如1周、2周、3周或更久，例如4周、6周或8周或更久，例如3个月、4个月、5个月或6个月或更久。

在一些情况下，所述方法导致宿主一种或多种组织中一种或多种基因的表达水平的变化，例如与合适的对照(例如下面的实验部分中所描述的)相比。给定基因的表达水平的变化可以是0.5倍或更多，例如1.0倍或更多，包括1.5倍或更多。组织可以变化，在一些情况下，组织是神经系统组织，例如中枢神经系统组织，包括脑组织，例如海马组织。在一些情况下，海马基因表达的调节表现为增强的海马可塑性，例如与合适的对照相比。

在一些情况下，治疗导致宿主一种或多种组织中一种或多种蛋白的水平的提高，例如与合适的对照(例如下文实验部分中所描述的)相比。给定蛋白的蛋白水平的变化可以是0.5倍或更多，例如1.0倍或更多，包括1.5倍或更多，其中在一些情况下，该水平可以接近健康野生型水平的水平，例如是健康野生型水平的50％或更少，例如25％或更少，包括10％或更少，例如5％或更少。组织可以变化，在一些情况下，组织是神经系统组织，例如中枢神经系统组织，包括脑组织，例如海马组织。

在一些情况下，这些方法导致一个或多个组织中的一个或多个结构变化。组织可以变化，在一些情况下，组织是神经系统组织，例如中枢神经系统组织，包括脑组织，例如海马组织。感兴趣的结构变化包括海马齿状回(DG)中成熟神经元的树突棘密度的增加，例如与合适的对照相比。在一些情况下，海马结构的调节表现为增强的突触形成，例如与合适的对照相比。在一些情况下，所述方法可以导致长时程增强作用的增强，例如与合适的对照相比。

在一些情况下，方法的实施(例如如上所述的)导致成年哺乳动物中神经发生的增加。该增加可以以多种不同的方式来鉴定，例如，如下面的实验部分中所描述的。在一些情况下，神经发生的增加表现为Dcx-阳性未成熟神经元的量的增加，例如该增加可以是2倍或更多。在一些情况下，神经发生的增加表现为BrdU/NeuN阳性细胞数量的增加，其中该增加可以是2倍或更多。

在一些情况下，所述方法导致学习和记忆的增强，例如与合适的对照相比。学习和记忆的增强可以以多种不同的方法进行评估，例如在下面的实验部分中描述的场景性恐惧条件化和/或径向臂水迷宫(RAWM)范例。当通过场景性恐惧条件化进行测量时，在一些情况下，治疗会导致场景性(contextual)记忆测试而非线索性记忆测试中的僵直增加。当通过RAWM进行测量时，在一些情况下，治疗会导致在任务的测试阶段期间对平台定位的学习和记忆增强。在一些情况下，治疗表现为海马依赖性学习和记忆的认知改善的增强，例如与合适的对照相比。

在一些实施方案中，降低B2M水平(例如如上所述的)可以与具有适于治疗衰老相关的认知损伤的活性的活性剂联合使用。例如，许多活性剂已经被证明在治疗阿尔茨海默氏病的认知症状(例如，记忆丧失、混淆以及思考和推理方面的问题)方面具有一定功效，例如，胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐(Donepezil)、利凡斯的明(Rivastigmine)、加兰他敏(Galantamine)、他克林(Tacrine))，美金刚(Memantine)和维生素E。作为另一个实例，许多活性剂已经被证明在治疗阿尔茨海默氏病的行为或精神病症状方面具有一定功效，例如，西酞普兰(citalopram)(Celexa)、氟西汀(fluoxetine)(Prozac)、帕罗西汀(paroxeine)(Paxil)、舍曲林(sertraline)(Zoloft)、曲唑酮(trazodone)(Desyrel)、劳拉西泮(lorazepam)(Ativan)、奥沙西泮(oxazepam)(Serax)、阿立哌唑(aripiprazole)(Abilify)、氯氮平(clozapine)(Clozaril)、氟哌啶醇(haloperidol)(Haldol)、奥氮平(olanzapine)(Zyprexa)、喹硫平(quetiapine)(Seroquel)，利培酮(risperidone)(Risperdal)和齐拉西酮(ziprasidone)(Geodon)。

在本发明方法的一些方面，该方法还包括测量治疗后的认知能力和/或突触可塑性(例如使用本文所述的或本领域已知的方法)以及确定认知衰退或突触可塑性丧失的速率已经降低和/或确定个体的认知能力或突触可塑性已经得到提高的步骤。在一些这样的情况下，通过将认知或突触可塑性测试的结果与在较早时间(例如，2周前、1个月前、2个月前、3个月前、6个月前、1年前、2年前、5年前或10年前或更早以前)对同一个体实施的测试的结果进行比较来进行确定。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括在施用本发明的包含血浆的血液制品之前，将个体诊断为具有认知损伤(例如使用本文所述的或本领域已知的用于测量认知和突触可塑性的方法)。在一些情况下，诊断将包括测量认知和/或突触可塑性并将认知或突触可塑性测试的结果与一个或更多个参照(例如，阳性对照和/或阴性对照)进行比较。例如，参照可以是由经受衰老相关的认知损伤(即，阳性对照)或不经受衰老相关的认知损伤(即，阴性对照)的一个或更多个年龄匹配的个体进行的测试的结果。作为另一个实例，参照可以是由同一个体在较早的时间进行的测试的结果，例如2周前、1个月前、2个月前、3个月前、6个月前、1年前、2年前、5年前或10年前或更早之前。

在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括将个体诊断为患有衰老相关的病症，例如阿尔茨海默氏病、帕金森病、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、多发性硬化症、多系统萎缩症、青光眼、共济失调、强直性肌营养不良、痴呆等。用于诊断这种衰老相关的病症的方法是本领域众所周知的，普通技术人员可以使用它们中的任何一种来诊断个体。在一些实施方案中，本发明的方法还包括将个体诊断为患有衰老相关的病症并且患有认知损伤。

实用性

本发明的方法用于治疗(包括预防)衰老相关的损伤和与之相关的病症，如个体认知能力方面的损伤。患有衰老相关的认知损伤或有风险患上衰老相关的认知损伤的个体包括年龄为约50岁或更老，例如60岁或更老、70岁或更老、80岁或更老、90岁或更老并且通常不超过100岁，即在约50和100岁之间，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100岁的个体，以及患有与自然衰老过程相关的认知损伤，例如轻度认知损伤(MCI)的个体；以及尚未开始表现出认知损伤的症状的年龄为50岁或更老，例如60岁或更老、70岁或更老、80岁或更老、90岁或更老并且通常不超过100岁，即在约50和90岁之间，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100岁，并且的个体。由自然衰老导致的认知损伤的实例包括以下：

轻度认知损伤(M.C.I.)是一种轻度的认知破坏，表现为随着时间的推移记忆或其他精神功能(如计划、遵从指示或做出决定)恶化方面的问题，而整体精神功能和日常活动则不受影响。因此，虽然明显的神经元死亡通常不会发生，但是衰老的大脑中的神经元容易受到结构、突触完整性和突触处分子加工方面的亚致死性的年龄相关的改变的伤害，所有这些改变都损害认知功能。

例如通过本文所公开的方法，将从使用本发明的包含血浆的血液制品的治疗中受益的、患有或有风险患上衰老相关的认知损伤的个体，还包括患有由衰老相关疾病导致的认识损伤的任何年龄的个体；以及被已经被诊断为患有通常伴有认知损伤的衰老相关疾病的任何年龄的个体，其中个体尚未开始表现出认知损伤的症状。这种衰老相关的疾病的实例包括以下：

阿尔茨海默氏病(AD)。阿尔茨海默氏病是与大脑皮质和皮质下灰质中过多数量的老年斑相关的进行性的、无法改变的认知功能丧失，老年斑还包含β-淀粉样蛋白和由tau蛋白组成的神经原纤维缠结。常见形式影响>60岁的人，其发病率随年龄增长而增加。它占老年人中痴呆症的65％以上。

阿尔茨海默氏病的病因尚不清楚。约有15％至20％的病例发生在家族中。其余的所谓散发病例有一些遗传决定因素。该病在大多数早发性病例和一些迟发性病例中具有常染色体显性遗传模式，但具有可变的晚期外显率。环境因素是积极调查的重点。

在该疾病的过程中，大脑皮层、海马体和皮质下结构(包括Meynert基底核的选择性细胞丧失)、蓝斑以及中缝背核(Nucleus raphae dorsalis)内的突触以及最终的神经元丧失。在脑的一些区域(早期疾病的顶叶和颞皮质，晚期疾病的前额叶皮质)中脑葡萄糖的使用和灌注减少。神经斑或老年斑(由神经突、星形胶质细胞和淀粉样蛋白核周围的神经胶质细胞组成)和神经原纤维缠结(由成对的螺旋形细丝组成)在阿尔茨海默氏病的发病机理中起作用。老年斑和神经原纤维缠结伴随正常衰老而发生，但是它们在阿尔茨海默氏病患者中更普遍。

帕金森病。帕金森病(PD)是一种特发性、缓慢发展的退行性中枢神经系统疾病，其特征在于运动缓慢和减少、肌肉强直、静止性震颤和姿势不稳。原本认为PD主要为运动疾病，现在认为PD也影响认知、行为、睡眠、植物神经功能和感觉功能。最常见的认知损伤包括注意力和集中力、工作记忆、执行功能、产生语言和视觉空间功能方面的损伤。

在原发性帕金森病中，黑质、蓝斑和其他脑干多巴胺能细胞的色素神经元丧失。原因尚不清楚。投射到尾状核和尾壳核的黑质神经元的丧失导致这些区域中神经递质多巴胺的耗尽。发病一般在40岁以后，老年人群发病率增加。

继发性帕金森病是由基底节中多巴胺作用的丧失或被干扰所致，所述丧失或干扰是由其他特发性退行性疾病、药物或外源毒素导致的。继发性帕金森病最常见的原因是摄入抗精神病药物或利血平(reserpine)，它们通过阻断多巴胺受体而导致帕金森病。不那么常见的原因包括一氧化碳或锰中毒、脑积水、结构性病变(肿瘤、影响中脑或基底节的梗塞)、硬膜下血肿和包括纹状体黑质变性在内的退行性疾病。

额颞痴呆。额颞痴呆(FTD)是大脑额叶逐渐恶化所导致的一种疾病。随着时间的推移，退化可以进展到颞叶。患病率仅次于阿尔茨海默氏病(AD)，FTD占早老性痴呆病例的20％。根据受影响的额叶和颞叶的功能，症状分为三类：行为变异型FTD(bvFTD)，症状一方面包括嗜睡和体重下降，另一方面是解除抑制；进行性非流行性失语症(PNFA)，其中观察到由发音困难、语音和/或语法错误而导致的对言语流畅性的破坏，但保留词语理解；和语义性痴呆(SD)，其中患者保持正常语音和语法的流利性，但在命名和词语理解方面的难度增加。所有FTD患者常见的其他认知症状包括执行功能和注意力受损。其他认知能力(包括知觉、空间技能、记忆和实践能力)通常保持不变。通过观察结构MRI扫描中显露出的额叶和/或前颞叶萎缩可以诊断FTD。

存在许多形式的FTD，其中任何一种均可以使用本发明的方法和组合物进行治疗或预防。例如，额颞痴呆的一种形式是语义性痴呆(SD)。SD的特征在于是在口头和非口头领域中都丧失语义记忆。SD患者经常表现出找词困难的问题。临床症状包括流畅性失语、忘名、对词义的理解能力受损，以及联想性视觉失认(无法匹配与语义相关的图片或物体)。随着疾病的发展，尽管病例因几乎没有后期行为症状而被描述为“纯粹的”语义性痴呆，但行为和性格改变常常与额颞痴呆观察到的相似。结构MRI成像显示颞叶萎缩(主要在左侧)的特征性模式，下方受累高于上方受累(superior involvement)，前方颞叶萎缩高于后方。

作为另一个实例，额颞痴呆的另一种形式是皮克病(PiD，也是PcD)。这种疾病的一个明确特征是神经元中tau蛋白的累积，积聚成称为“皮克体(Pick bodies)”的银染色的球形聚集体。症状包括失语(失语症)和痴呆。具有眶额叶功能损伤的患者可变得具有攻击性且不适于社交。他们可能会偷窃或表现出迷恋或重复的刻板行为。具有背内侧或背外侧额叶功能损伤的患者可表现为漠不关心、冷漠或自发性下降。患者可表现出没有自我监控、自我意识异常和无法体会含义。在双侧后外侧眶额叶皮质和右前脑岛中的灰质丧失的患者可表现出进食行为的变化，例如病态性喜食甜食等。在前外侧眶额叶皮质中具有更多病灶性灰质丧失的患者可患上食欲过盛。虽然一些症状最初可以得到缓解，但是该疾病继续发展并且患者经常在两到十年内死亡。

亨廷顿病。亨廷顿病(HD)是一种遗传性、进行性、神经退行性疾病，其特征在于情绪、行为和精神异常的发生；智力或认知功能丧失；和运动异常(运动障碍)。HD的典型症状包括舞蹈症-可影响面部、手臂、腿部或躯干的不自主的、快速的、不规则的、生涩的运动-的发展以及认知衰退(包括逐渐丧失思维加工和获得智力的能力)。可能有记忆、抽象思维和判断的损害；对时间、地点或身份的认识不正确(迷向)；增强躁动；和性格变化(人格分裂)。虽然症状通常在生命的四五十岁期间变得明显，但是发病年龄是可变的，范围从幼儿期到晚年(例如70或70多岁或者80或80多岁)。

HD在家族内作为常染色体显性特征传播。该疾病发生是由染色体4上的基因内异常的长序列或编码指令“重复”(4p16.3)所致。与HD有关的神经系统功能的进行性丧失是由大脑某些区域(包括基底神经节和大脑皮层)中的神经元丢失造成的。

肌萎缩性侧索硬化症。肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种快速进展的且总是致命的神经系统疾病，其攻击运动神经元。最初最常在手中注意到、其次在脚中注意到肌无力和萎缩以及前角细胞功能损伤的体征。发病部位是随机的，而且进展是不对称的。抽筋是常见的，并且可先于无力。很少有病人能存活30年，50％死于发病3年内，20％存活5年，10％存活10年。诊断特征包括在成年中期或晚期发病，以及进行性的、广泛的运动受累(motorinvolvement)而没有感觉异常。神经传导速度正常，直到疾病晚期。最近的研究也记录了认知损伤的出现，尤其是即时言语记忆、视觉记忆、语言和执行功能的减弱。

甚至在ALS患者的表现正常的神经元中已经报道了细胞体面积、突触数量和总突触长度的减小。有人提出，当活动区的可塑性达到极限时，突触的持续损失可导致功能损伤。促进形成新突触或预防突触丧失可以维持这些患者的神经元功能。

多发性硬化症。多发性硬化症(MS)的特征在于中枢神经系统功能障碍的各种症状和体征，伴有缓解及复发加重。最常见的主要症状是一个或多个肢体，躯干，或在面部一侧的感觉异常；腿或手无力或笨拙；或视觉障碍，例如，一只眼睛部分失明和疼痛(眼球后视神经炎)，视力模糊或暗点。常见的认知损伤包括在记忆(获得、保留和再找回新信息)、注意力和集中力(特别是注意力分散)、信息处理、执行功能、视觉空间功能和言语流畅性方面的损伤。常见的早期症状是导致双重视野(复视)的眼部麻痹，一肢或多肢的短暂性无力，肢体轻微僵硬或异常易疲劳，轻微步态功能障碍，膀胱控制困难，眩晕和轻度情绪障碍；它们均表明分散的中枢神经系统受累，并且经常在疾病被确认之前数月或数年发生。过热会加重症状和体征。

这个过程是高度可变的，不可预测的，并且在大多数患者中是间歇性的。起初，数月或数年的缓解可将发作隔开，尤其是当疾病从后眼球视神经炎开始时。然而，一些患者经常发作，并且迅速丧失活力；对为数不多的患者，该过程可以是快速发展的。

青光眼。青光眼是影响视网膜神经节细胞(RGC)的常见神经退行性疾病。证据支持在突触和树突中(包括在RGC中)存在分隔的退化程序。最近的证据还表明老年人认知损伤与青光眼之间存在相关性(Yochim BP,et al.Prevalence of cognitive impairment,depression,and anxiety symptoms among older adults with glaucoma.JGlaucoma.2012；21(4):250-254)。

强直性肌营养不良。强直性肌营养不良(DM)是一种常染色体显性多系统疾病，其特征在于营养不良性肌无力和肌强直。分子缺陷是染色体19q上肌动蛋白-蛋白激酶基因3'非翻译区中扩增的三核苷酸(CTG)重复。症状可发生在任何年龄段，临床严重程度的范围是广泛的。肌强直在手部肌肉中是突出的，甚至即使在轻度病例中，上睑下垂也是常见的。在重度病例中，会出现明显的外周肌无力，通常伴有白内障、过早脱发、脸部消瘦、心律失常、睾丸萎缩和内分泌异常(例如糖尿病)。智力迟钝在严重的先天性形式中是常见的，而衰老相关的额叶和颞叶认知功能(特别是语言和执行功能)衰退在该疾病的较轻度的成年形式中被观察到。被严重影响的人在五十出头死亡。

痴呆。痴呆描述了具有严重影响思维和社交能力、足以干扰日常功能的症状的一类疾病。除了上述讨论的衰老相关的疾病的晚期阶段中观察到的痴呆以外，痴呆的其他例子还包括下文所述的血管性痴呆和路易体痴呆。

在血管性痴呆或“多发梗塞性痴呆”中，认知损伤是由向大脑供应血液的问题引起的，通常通过一系列的轻度中风，或者有时通过在其他较小中风之前或之后的一次大中风引起。血管病变可以是弥漫性脑血管疾病的结果，如小血管疾病或局灶性病变，或两者兼而有之。患有血管性痴呆的患者在急性脑血管事件后表现出急性或亚急性认知损伤，其后观察到进行性认知衰退。认知损伤与阿尔茨海默氏病中观察到的类似，包括语言、记忆、复杂的视觉加工或执行功能方面的损伤，但是大脑中的相关变化不是由AD病理学所致，而是由脑部血流长期减少所致，并最终导致痴呆。单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)神经成像可以与包括精神状态检查的评估结合用来确认多发梗塞性痴呆的诊断。

路易体痴呆(DLB，也有多个其他名称，包括路易体痴呆、弥漫性路易体病、皮层路易体病，以及老年性路易体型痴呆)是一种痴呆，其解剖学上的特征在于神经元中路易体(α-突触核蛋白和泛素蛋白的团块)的存在，在死后脑组织学分析中可检测到。其主要特征是认知衰退，特别是执行功能衰退。警觉性和短期记忆将提高和减弱。伴有生动且详细的图案的持续的或反复发生的幻视往往是早期的诊断症状。DLB在其早期阶段通常与阿尔茨海默氏病和/或血管性痴呆混淆，但是，阿尔茨海默氏病通常相当缓慢地开始，而DLB通常具有快速或急性的发作。DLB症状还包括类似于帕金森病的运动症状。DLB的痴呆与帕金森病中有时出现的痴呆的区别在于，痴呆症状相对于帕金森病症状出现的期限。当痴呆发作在帕金森病发作后的一年以上时：诊断结果为伴有痴呆的帕金森病(PDD)。当认知症状与帕金森病症状同时开始或者在帕金森症状一年内开始时，诊断为DLB。

进行性核上性麻痹。进行性核上性麻痹(PSP)是一种脑部疾病，其导致步态和平衡控制方面的严重的进行性问题，以及复杂的眼球运动和思维问题。这种疾病的典型症状之一是无法正确瞄准眼睛，这是由大脑中协调眼球运动的区域中的损伤所致。有些人把这种影响描述为模糊不清。受影响的个体经常表现出情绪和行为的改变，包括抑郁和冷漠以及进行性轻度痴呆。这个疾病的长的名称表明疾病缓慢开始并持续恶化(进行性)，并且通过损害称为核的、豌豆大小的结构上方(核上)控制眼睛运动的某些大脑部分而引起无力(麻痹)。PSP在1964年首次被描述为一种独特的疾病，当时有三位科学家发表了一篇论文，该论文将该疾病与帕金森病区分开。它有时被称为Steele-Richardson-Olszewski综合征，反映了定义该疾病的科学家的组合名称。虽然PSP进行性地恶化，但没有人死于PSP本身。

共济失调。患有共济失调的人有协调问题，因为控制运动和平衡的神经系统部分受到影响。共济失调可影响手指，手，手臂，腿，身体，言语和眼球运动。“共济失调”这个词经常被用来描述与感染、损伤、其他疾病或中枢神经系统的退行性改变有关的不协调症状。共济失调也被用来表示一组称为遗传性和散发性共济失调的特定的神经系统退化性疾病，该疾病是国家共济失调基金会的主要重点。

多系统萎缩。多系统萎缩(MSA)是一种退行性神经障碍。MSA与大脑特定区域中神经细胞的退化有关。这种细胞退化会引起身体的运动、平衡和其他自主功能方面的问题，如膀胱控制或血压调节。MSA的原因是未知的，尚未确定具体的危险因素。约有55％的病例发生在男性中，典型的发病年龄在50多岁的后几年至60出头。MSA经常表现出与帕金森病相同的一些症状。然而，MSA患者一般对用于帕金森病的多巴胺药物仅有最低限度的反应(如果有的话)。

在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于减缓衰老相关的认知损伤的进展。换句话说，在用所公开的方法治疗之后，与在用所公开的方法治疗之前或没有用所公开的方法进行治疗相比，个体的认知能力将更缓慢地衰退。在一些这样的情况下，本发明的治疗方法包括测量治疗后认知衰退的进展，并确定减缓了认知衰退的进展。在一些这样的情况下，通过与参考进行比较来进行确定，所述参考例如治疗前个体的认知衰退速率，例如通过在施用本发明的血液制品前的两个或更多个时间点提前测量认知。

本发明的方法和组合物还可用于稳定个体(例如，患有衰老相关的认知衰退的个体或有风险患上衰老相关的认知衰退的个体)的认知能力。例如，个体可以表现出一些衰老相关的认知损伤，并且在用所公开的方法进行治疗之前观察到的认知损伤的进展将会在用所公开的方法进行治疗之后停止。作为另一个实例，个体可以处于患上衰老相关的认知衰退的风险中(例如，个体的年龄可以是50岁更大，或者可以已经被诊断为患有衰老相关的疾病)，并且个体的认知能力基本上没有变化，即，与在用所公开的方法进行治疗之前相比，在用所公开的方法进行治疗之后，没有检测到认知衰退。

本发明的方法和组合物还可用于减轻患有衰老相关的认知损伤的个体的认知损伤。换言之，用本发明的方法进行治疗后，个体的认知能力提高。例如，相对于用本发明的方法进行治疗之前在个体中观察到的认知能力相比，在用本发明的方法进行治疗之后，个体的认知能力提高了例如2倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、15倍或更多、20倍或更多、30倍或更多或者40倍或更多，包括50倍或更多、60倍或更多、70倍或更多、80倍或更多、90倍或更多、或100倍或更多。在一些情况下，用本发明的方法和组合物进行的治疗恢复了患有衰老相关的认知衰退的个体的认知能力，例如恢复至个体大约40岁或更小时的认知能力水平。换句话说，认知损伤消除。

试剂、设备和试剂盒

还提供了用于实施上述一种或多种方法的试剂、设备和其试剂盒。本发明的试剂、设备和试剂盒可以多种多样。感兴趣的试剂和设备包括上文关于降低成年哺乳动物体中B2M水平的方法中所提及的那些。

除了上述组件外，本发明的试剂盒还包括实施本发明方法的说明书。这些说明书可以以各种形式存在于本发明的试剂盒中，其中的一种或更多种可以存在于试剂盒中。这些说明书可以存在的一种形式是作为在合适的介质或基底上印刷的信息，例如在试剂盒的包装中，在包装插页中等其上印刷有信息的一张或多张纸。另一种方式是计算机可读介质，例如其上记录了信息的软盘、CD、便携式闪存驱动器等。另一个可以存在的方式是网站地址，可以通过互联网使用该网站地址来访问在远程位点上的信息。任何方便的方式均可出现在工具包中。

提供以下实施例是为了说明而不是进行限制。

实验

提出以下实施例是为了向本领域的普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整公开内容和描述，而不旨在限制发明人所认为的发明的范围，并且它们也不旨在表示下文的实验是所进行的所有实验或唯一的实验。已经努力确保所使用的数字(例如数量、温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是在大气压或接近大气压。

I.方法

A.动物模型。

使用以下小鼠系：C57BL/6(Jackson实验室)，C57BL/6老年小鼠(美国国家老龄研究所，National Institutes of Ageing)，β2-微球蛋白(B2M-/-)突变小鼠和与抗原加工相关的转运蛋白1(Tap1-/-)突变小鼠(Jackson实验室)。所有的研究都在雄性小鼠中进行。使用α＝0.05和校验效能(power)＝0.8的标准检验效能计算来计算用于得到统计学显著性差异的小鼠的数量。发明人根据对各测试、测试的可变性以及组内的个体间差异的经验，使用在线工具(http://www.stat.uiowa.edu/～rlenth/Power/index.html)来计算检验效能和样本量。在12小时光照-黑暗周期下在无特定病原体的条件下饲养小鼠，并且所有动物处理和使用均符合由加利福尼亚大学旧金山分校IACUC(University of California SanFrancisco IACUC)和VA Palo Alto Committee on Animal Research批准的机构指导。

B.联体共生。

按照先前描述的方法进行联体共生手术(Villeda,S.A.,et al.,“The ageingsystemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function.,”Nature(2011)477:90-94)，(Villeda,S.A.et al.,“Young blood reverses age-relatedimpairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.,”Naturemedicine(2014)20:659-663)。制作左右两侧穿过皮肤的镜像切口，并制作穿过腹壁的较短的切口。将相邻的联体生物的腹膜开口缝合在一起。将每只联体生物的肘关节和膝关节缝合在一起，并将每只小鼠的皮肤钉至(9mm Autoclip，Clay Adams)相邻联体生物的皮肤上。给每只小鼠皮下注射Baytril抗生素和用于对抗疼痛的Buprenex并在恢复过程中进行监测。对于整体健康和维持行为，在手术后的不同时间分析几种恢复特征，包括配对体重和理毛(grooming)行为。

C.立体定向注射。

将动物置于立体定向框架中并用通过麻醉鼻锥体递送的2％异氟烷(2L/min氧气流量)麻醉。将眼药膏(Puralube Vet Ointment，Dechra)施用于角膜以防止手术期间的干燥。切口周围的区域被修剪。使用以下坐标将溶液双侧注射至背侧海马的DG中：(距前囱)前部＝-2mm，侧部＝1.5mm，(距颅骨表面)高度＝-2.1mm。使用5μl 26s规格的Hamilton注射器在10分钟内立体定向注射2μl体积(注射速度：0.20μl/min)。为了限制沿着注射道的回流，将针维持在原位8分钟，缓慢拉出一半，并另外再在该处保持2分钟。使用丝线缝合皮肤。每只小鼠皮下注射止痛剂Buprenex。在恢复过程中，单独饲养并监测小鼠。

D.B2M施用。

将无载体的纯化的人β2-微球蛋白(Lee Biosolutions)溶解于PBS中，并在年轻(3个月大)野生型动物中经由眼眶内全身施用(100μg/kg)，或立体定向(0.50μl；0.1μg/μl)施用至年轻(3个月大)野生型和Tap1-/-突变体的海马的DG中。为了组织学分析，将B2M和载体(vehicle)施用至同一动物的对侧DG中。为了行为分析，将B2M和载体双侧施用至DG，并使小鼠在认知测试之前恢复6或30天。

E.BrdU施用和定量。

对于短期Brdu标记，在处死之前3天或6天，将50mg/kg BrdU每天一次腹膜内注射到小鼠中。对于长期BrdU标记，将50mg/kg BrdU每天一次注射到小鼠中，持续6天，并且在首次施用后28天将动物处死。为了估计脑中BrdU阳性细胞的总数，发明人对总共6个切片中的每第六个半脑切片进行BrdU的DAB染色。对DG颗粒细胞和颗粒细胞下层中的BrdU阳性细胞数量进行计数并将该数量乘以12以估算整个DG中的BrdU阳性细胞的总数。为了确定分裂细胞的命运，通过共聚焦显微镜分析每个小鼠4-6个切片中总共200个BrdU阳性细胞中NeuN和GFAP的共表达。双阳性细胞的数量表示为BrdU阳性细胞的百分比。

F.免疫组织化学法。

按照标准公开的技术(Villeda,S.A.,et al.,“The ageing systemic milieunegatively regulates neurogenesis and cognitive function.,”Nature(2011)477:90-94)对自由浮动的切片进行组织处理和免疫组织化学法。简言之，小鼠用400mg/kg水合氯醛(Sigma-Aldrich)麻醉，并用0.9％盐水经心脏灌注。取出大脑并在磷酸盐缓冲的4％多聚甲醛(pH 7.4)中于4℃下固定48小时，然后沉入30％蔗糖中用于冷冻保护。然后，大脑用冷冻切片机(Leica Camera，Inc.)以40μm进行冠状切片并储存在低温保护培养基中。一抗为：山羊抗Dcx(1:500；Santa Cruz Biotechnology；sc-8066，克隆：C-18)，大鼠抗BrdU(1:5000，Accurate Chemical and Scientific Corp.；ab6326，克隆：BU1/75)，小鼠抗Nestin(1:500；Millipore；MAB353；克隆：大鼠-401)，MCM2(1:500；BD Biosciences；610700；克隆：46/BM28)，鸡抗Tbr2(1:500；Millipore；AB15894)，小鼠抗NeuN(1:1000；Millipore；MAB377；克隆：A60)，兔抗GFAP(1:500；DAKO；Z0334)。在孵育过夜后，使用生物素化的二抗(Vector)和带有二氨基联苯胺(DAB，Sigma-Aldrich)的ABC试剂盒(Vector)或荧光缀合的二抗(Life Technologies)使一抗染色显现。对于BrdU标记，将大脑切片用2N HCl在37℃下预处理30分钟，用含有Tween的Tris-缓冲盐水(TBST)洗涤三次，然后用一抗孵育。对于Nestin和Tbr2标记，将大脑切片用0.1M柠檬酸盐在95℃下预处理5分钟三次，并用含有Tween的Tris-缓冲盐水(TBST)洗涤三次，然后用一抗孵育。为了估算每个DG的Dcx阳性细胞的总数，计数总共六个切片中每第六个通过海马的冠状半脑切片中DG颗粒细胞和颗粒细胞下层中的免疫阳性细胞，并乘以12。

G.蛋白质印迹分析。

在灌注动物后解剖小鼠海马，将小鼠海马快速冷冻并在RIPA裂解缓冲液(500mMTris，pH7.4，150mM NaCl，0.5％脱氧胆酸钠，1％NP40，0.1％SDS和完全蛋白酶抑制剂；Roche)中裂解。将组织裂解物与4×NuPage LDS上样缓冲液(Invitrogen)混合并加载到4-12％SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶(Invitrogen)上，随后转移到硝酸纤维素膜上。将印迹封闭在含有Tween的Tris-缓冲盐水(TBST)中的5％牛奶中，并与兔抗肌动蛋白(1:5000，Sigma；A5060)和兔抗B2M(1:2500，Abcam；ab75853；克隆：EP2978Y)孵育。使用辣根过氧化物酶缀合的二抗(1:5000，GE Healthcare；NA934)和ECL试剂盒(GE Healthcare/AmershamPharmacia Biotech)检测蛋白信号。在胶片的动态范围内进行多次曝光以选择图像(GEHealthcare Amersham HeperfilmTM ECL)。使用ImageJ软件(版本1.46k)扫描所选的胶片(300dpi)并定量。肌动蛋白条带用于进行归一化。

H.细胞培养分析。

如先前所述，从C57BL/6小鼠或Dcx报告小鼠(Couillard-Despres S,et al.“Invivo optical imaging of neurogenesis:watching new neurons in the intactbrain.”Molecular imaging.2008；7:28-34.)分离小鼠神经祖细胞(Villeda,S.A.,etal.,“The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis andcognitive function.,”Nature(2011)477:90-94)，(Mosher KI,et al.“Neuralprogenitor cells regulate microglia functions and activity.”Natureneuroscience.2012；15:1485-1487)。将来自出生后动物(1日龄)的大脑解剖以去除嗅球、皮质、小脑和脑干。在去除浅表血管后，最后用解剖刀切碎海马，并在含有2.5U/ml木瓜蛋白酶(Worthington Biochemicals)、1U/ml分散酶II(Boeringher Mannheim)和250U/ml DNA酶I(Worthington Biochemicals)的DMEMB培养基中于37℃下消化30分钟(沃辛顿生物化学)并机械解离。NSC/祖细胞使用65％Percoll梯度纯化，并以10⁵个细胞/cm²的密度铺在未涂布的组织培养皿上。将NPC在标准条件下在补充有青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)、2mM L-谷氨酰胺、不含维生素A的无血清B27补充物(Sigma-Aldrich)、bFGF(20ng/ml)和EGF(20ng/ml)的NeuroBasal A培养基中培养48小时。将无载体形式的人重组B2M(Vendor)溶解在PBS中，并在细胞铺板后每隔一天在自我更新条件下加入到细胞培养物中。对于增殖，使用细胞增殖测定系统测量BrdU纳入，所述细胞增殖测定系统使用过氧化物酶偶联的抗BrdU抗体和用于进行检测的彩色底物(Fisher)。对于生物发光测定，使用萤光素酶测定系统(Promega)测量Dcx-萤光素酶活性。使用小鼠抗MAP2(1：1000，Sigma；M9942；克隆：HM-2)和兔抗GFAP(1：500，DAKO；Z0334)抗体，通过免疫细胞化学方法评估分化。通过使用PierceLDH细胞毒性测定系统(Life Technologies)的乳酸脱氢酶(LDH)检测来测量细胞毒性。

I.场景性恐惧条件化。

在这项任务中，小鼠学习将环境背景(恐惧条件化室)与厌恶刺激(轻度足部电击；非条件性刺激，美国)联系起来，从而能够测试海马依赖的场景性恐惧条件化。由于场景性恐惧条件化是海马和杏仁核依赖性的，所以轻度足部电击与光和音调线索(条件性刺激，CS)配对，以评估杏仁核依赖的线索性恐惧条件化。条件性恐惧表现为僵直行为。具体的训练参数如下：音长30秒；电平为70dB，2kHz；电击持续时间是2秒；强度是0.6毫安。这种强度是不痛苦的，是可以容易忍受的，但会产生不愉快的感觉。更具体地说，在第1天，将每只小鼠置于恐惧条件化室中，并允许小鼠探查2分钟，然后提供30秒钟的音调(70dB)，以2秒钟的电击(0.6mA)结束。两分钟后，提供第二CS-US对。在第2天，将每只小鼠首先置于含有相同精确背景的恐惧条件化室中，但没有CS或足部电击。分析1-3分钟的僵直。一小时后，将小鼠置于具有不同气味、清洁溶液、地板纹理、室壁和形状的新环境中。允许动物探查2分钟，然后重新暴露于CS。分析1-3分钟的僵直。使用FreezeScan视频追踪系统和软件(Cleversys，Inc)来测量僵直。

J.径向臂水迷宫。

按照Alamed et al.Nat.Protocols(2006)1:1671-1679中所描述的方案，使用径向臂水迷宫(RAWM)模式评估空间学习和记忆。在该任务中，在整个训练和测试阶段，包含平台的目标臂位置保持不变，而在每次试验期间改变起始臂。在训练阶段的第一天，用15次试验训练小鼠，试验在可见平台和隐藏平台之间交替。在测试阶段的第二天，在隐藏平台的情况下用15次试验测试小鼠。进入不正确的臂被记为错误，错误是训练块的平均值(连续三次试验)。研究者在评分时不知道基因型和治疗。

K.血浆收集和蛋白质组学分析。

在处死时通过尾静脉放血、下颌静脉放血或心内出血将小鼠血液收集到EDTA包被的管中。通过以1000g离心新鲜收集的血液来产生EDTA血浆，并将等分试样储存在-80℃直至使用。人血浆和CSF样品获自华盛顿大学医学院、退伍军人事务部西北网络精神病研究所、教育和临床中心(Veterans Affairs Northwest Network Mental Illness Research,Education,and Clinical Center)、俄勒冈健康科学大学和加州大学圣地亚哥分校。如先前所述(Villeda,S.A.,et al.,“The ageing systemic milieu negatively regulatesneurogenesis and cognitive function.,”Nature(2011)477:90-94)(Zhang,J.et al.,“CSF multianalyte profile distinguishes Alzheimer and Parkinson diseases.,”American journal of clinical pathology(2008)129:526-529)(Li,G.et al,.“Cerebrospinal fluid concentration of brain-derived neurotrophic factor andcognitive function in non-demented subjects.,”PloS one(2009)4:e5424)以及辅表1中所概述的，基于标准化的纳入和排除标准选择受试者。根据各中心的机构审查委员会指南，从人类受试者获得知情同意书。

表1

由收费服务提供商，Rules Based Medicine Inc.，使用标准的基于抗体的多重免疫测定法(Luminex)测量人和小鼠血浆样品中细胞因子和信号分子的血浆浓度。所有的Luminex测量结果都以不知情的方式获得。根据制造商描述的免疫测定原理，所有的测定都按照临床实验室标准协会(之前的NCCLS)指南开发和验证。

L.数据和统计学分析。

在进行药物治疗或评估基因小鼠模型之前，所有实验均由独立研究人员随机化和盲化。在整个组织学、生物化学和行为评估中，研究人员仍然不知情。每个实验结束在统计分析时，各组是非盲的。数据表示为平均值±SEM。使用D'Agostino-Pearson综合检验或Shapiro-Wilk检验来检验每组实验中数据分布的正态性。使用F检验未检测到组间变化的显著差异。用Prism5.0软件(GraphPad Software)进行统计学分析。将两组之间的平均值与双尾未配对Student t检验进行比较。使用单因素ANOVA，然后进行适当的事后检验(如图例所示)来分析多个组的平均值互相之间的比较结果或与一个对照组的比较结果。

II.结果和讨论

衰老仍然是诸如阿尔茨海默氏病的痴呆相关的神经退行性疾病的最主要的危险因素(Hedden&Gabrieli,“Insights into the ageing mind:a view from cognitiveneuroscience.,”Nature reviews.Neuroscience(2004)5:87-96；Mattson&Magnus,“Ageing and neuronal vulnerability.,”Nature reviews.Neuroscience(2006)7:278-294；Small et al.,“A pathophysiological framework of hippocampal dysfunctionin ageing and disease.,”Nature reviews.Neuroscience(2011)12:585-601)。因此，为了维持老年人的认知完整性，并因此抵抗对神经退行性疾病的易损性，必须对什么驱动大脑中衰老表型的机制有深刻了解。最近，发明人和其他人已经表明，全身性的操作，如异时性联体共生(其中年轻动物和老年动物的循环系统连接在一起)或年轻血浆施用可以部分地逆转老年大脑中年龄相关的认知和再生能力的丧失(Katsimpardiet al.,“Vascularand neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemicfactors.,”Science(2014)344:630-634；Villedaet al.,“The ageing systemic milieunegatively regulates neurogenesis and cognitive function.,”Nature(2011)477:90-94；Villedaet al.,“Young blood reverses age-related impairments incognitive function and synaptic plasticity in mice.,”Nature medicine(2014)20:659-663)。有趣的是，异时性联体共生研究已经揭示了在全身环境的影响下依赖于年龄的双向性，这表明了年轻血液中的促年轻因子(pro-youth factor)引起年轻化，而老年血液中的促衰老因子(pro-aging factor)驱动衰老(Katsimpardiet al.,“Vascular andneurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors.,”Science(2014)344:630-634；Villedaet al.,“The ageing systemic milieu negativelyregulates neurogenesis and cognitive function.,”Nature(2011)477:90-94；Ruckhetal.,“Rejuvenation of regeneration in the aging central nervous system.,”Cellstem cell(2012)10:96-103；Conboy et al.,“Rejuvenation of aged progenitor cellsby exposure to a young systemic environment.,”Nature(2005)433:760-764；Bracket al.,“Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate andincreases fibrosis.,”Science(2007)317:807-810)。已经有人提出，减轻促衰老因子的作用也可以提供使衰老表型恢复年轻的有效方法(Villedaet al.,“Young bloodreverses age-related impairments in cognitive function and synapticplasticity in mice.,”Nature medicine(2014)20:659-663；Laviano,“Young blood.,”The New England journal of medicine(2014)371:573-575；Bouchard&Villeda,“Agingand brain rejuvenation as systemic events.,”Journal of neurochemistry(2014))。

在B2M的传统作用中，B2M代表形成适应性免疫系统的活性部分的MHC I分子的轻链(Zijlstraet al.,“Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+cytolytic Tcells.,”Nature(1990)344:742-746)。在中枢神经系统(CNS)中，B2M和MHC I可以独立于其公认的免疫功能起作用以调节正常的大脑发育，突触可塑性，甚至是行为(Lee etal.Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db.Nature(2014)509:195-200；Loconto et al.,“Functional expression of murineV2R pheromone receptors involves selective association with the M10andM1families of MHC class Ib molecules.,”Cell(2003)112:607-618；Boulanger&Shatz,“Immune signalling in neural development,synaptic plasticity and disease.,”Nature reviews.Neuroscience(2004)5:521-531；Shatz,“MHC class I:an unexpectedrole in neuronal plasticity.,”Neuron(2009)64:40-45；Huh et al.,“Functionalrequirement for class I MHC in CNS development and plasticity.,”Science(2000)290:2155-2159；Goddard et al.,“Regulation of CNS synapses by neuronal MHCclass I.,”Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America(2007)104:6828-6833；Glynnet al.,“MHCI negatively regulatessynapse density during the establishment of cortical connections.,”Natureneuroscience(2011)14:442-451)。此外，当B2M为可溶形式时，由于细胞表面脱落，B2M在全身血液循环中积聚。有趣的是，B2M的全身水平增加已经涉及到与慢性血液透析有关的认知损伤(Murray,“Cognitive impairment in the aging dialysis and chronic kidneydisease populations:an occult burden.,”Advances in chronic kidney disease(2008)15:123-132；Corlin et al.,“Quantification of cleaved beta2-microglobulinin serum from patients undergoing chronic hemodialysis.,”Clinical chemistry(2005)51:1177-1184)。此外，在HIV-痴呆(McArthuret al.,“The diagnostic utility ofelevation in cerebrospinal fluid beta 2-microglobulin in HIV-1dementia.Multicenter AIDS Cohort Study.,”Neurology(1992)42:1707-1712；Brew etal.,“Predictive markers of AIDS dementia complex:CD4cell count andcerebrospinal fluid concentrations of beta 2-microglobulin and neopterin.,”The Journal of infectious diseases(1996)174:294-298)患者和阿尔茨海默氏病患者(Carrette et al.,“A panel of cerebrospinal fluid potential biomarkers for thediagnosis of Alzheimer's disease.,”Proteomics(2003)3:1486-1494)的脑脊液(CSF)中也观察到了可溶性B2M的增加，这进一步表明B2M涉及认知功能障碍。

发明人首先表征了在正常衰老期间(图1A，图1B)以及在异时性联体共生实验衰老模型(图1C，图1D)中小鼠血浆中B2M全身水平的变化。发明人观察到，与年轻动物相比，来自老年动物的血浆中的B2M水平增加了三倍(图1B)，并且检测到：与年轻的等时联体生物相比，源自暴露于老年动物血液后的年轻异时联体生物的血浆中的B2M水平有相应的增加(图1D)。为了用人类中发生的全身性变化来证实衰老小鼠中所观察到的B2M全身性变化，发明人测量了来自20至90岁健康个体的存档血浆和CSF样品中的B2M(上文表1)。发明人检测到在血浆和脑脊液中测量到的B2M存在与年龄相关的增加，这与在衰老小鼠中所观察到的变化一致(图1E，图1F)。

在已经确定了B2M是潜在的促衰老全身性因子后，发明人接下来想知晓全身性增加B2M是否会引起暗示年龄相关的功能障碍的认知损伤。作为对照，发明人首先使用径向臂水迷宫(RAWM)和场景性恐惧条件化模式在年轻和老年的未治疗动物组中测试海马依赖性学习和记忆，并且在两种行为模式下均观察到了年龄相关的认知损伤(图2A-图2E)。随后，发明人认知地测试了通过眼眶内注射全身性施用可溶性B2M蛋白或载体的年轻成年小鼠(图1G)。无论何种处理，动物都没有表现出疾病或体重减轻的迹象(图3A)。在RAWM任务的训练阶段期间，所有小鼠均表现出相似的游泳速度(图3B)和对任务的学习能力(图1H)。然而，在测试阶段，接受B2M的动物表现出受损的学习和记忆缺陷，在定位目标平台方面与接受载体对照的动物相比明显犯了更多的错误(图1H)。在恐惧条件化训练过程中，所有小鼠，无论接收何种处理，在基线僵直时间方面均没有显示出差异(图3C)。然而，与载体处理的对照动物相比，接受B2M的小鼠在场景性记忆测试中表现出了减少的僵直时间(图1I)，但是在线索性记忆测试中没有表现出减少的僵直时间(图3D)。总之，这些行为数据表明，外源性B2M的全身施用会损害学习和记忆。

先前已经将海马依赖性学习和记忆的损伤与成年神经发生减少联系在一起(Clellandet al.,“A functional role for adult hippocampal neurogenesis inspatial pattern separation.,”Science(2009)325:210-213；Kitamuraet al.,“Adultneurogenesis modulates the hippocampus-dependent period of associative fearmemory.,”Cell(2009)139:814-827；Zhang et al.,“A role for adult TLX-positiveneural stem cells in learning and behaviour.,”Nature(2008)451:1004-1007)。虽然年龄相关的认知衰退与成年神经发生减少之间的因果关系仍然不清楚(Drapeauet al.,“Spatial memory performances of aged rats in the water maze predict levels ofhippocampal neurogenesis.,”Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America(2003)100:14385-14390；Merrill et al.,“Hippocampalcell genesis does not correlate with spatial learning ability in aged rats.,”The Journal of comparative neurology(2003)459:201-207；Bizon&Gallagher,“Production of new cells in the rat dentate gyrus over the lifespan:relationto cognitive decline.,”The European journal of neuroscience(2003)18:215-219；Seib et al."Loss of Dickkopf-1restores neurogenesis in old age andcounteracts cognitive decline,"Cell stem cell(2013)12:204-214)，但是最近使用异时性联体共生的研究表明，由血液引发的认知改变与成年神经发生的相应改变相关(Katsimpardi et al.,"Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mousebrain by young systemic factors,"Science(2014)344:630-634；Villedaet al.,“Theageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitivefunction.,”Nature(2011)477:90-94)。因此，发明人研究了降低水平的成年海马神经发生是否还伴随由对B2M的全身性暴露增加所引起的认知损伤。使用免疫组织化学分析法，发明人检测到，与注射载体对照的小鼠相比，在全身性施用外源性B2M的小鼠的DG中双皮质素(Dcx)阳性新生神经元(图1J，图1K)和Mcm2阳性祖细胞(图4A)的数量显著降低。与神经发生的变化一致，发明人检测到，与注射载体的动物相比，注射有B2M的动物中具有纳入的溴脱氧尿嘧啶(BrdU)的增殖细胞的数量减少(图4B)。这些数据表明对外源性B2M的全身性暴露足以减少成年神经发生。

为了确定B2M水平的全身性的、年龄相关的变化是否也伴随着大脑内的局部变化，发明人通过蛋白质印迹分析测量年轻和老年动物的海马内的B2M水平，并检测到年龄相关的B2M蛋白增加(图5A)。随后，发明人想知晓由异时性联体共生引起的B2M水平的全身性变化是否还与暴露于老年全身环境后年轻海马内的相应局部变化有关。发明人检测到，与年轻的等时性对照相比，在年轻的异时联体生物的海马裂解物中B2M蛋白表达增加(图5B)。总之，这些数据表明在全身性环境中观察到的年龄有关的B2M变化伴随着大脑内的相应变化。

为了测试局部暴露于外源性B2M对学习和记忆的影响，发明人通过双侧立体定向注射施用B2M或载体对照，然后使用RAWM和场景性恐惧条件化进行认知测试(图5C)。在RAWM的训练阶段期间，所有小鼠均显示出相似的游泳速度(图6A)和学习能力(图5D)。在测试阶段期间，与接受载体对照的动物相比，接受B2M的动物在定位目标平台方面犯了明显更多的错误(图5D)。在恐惧条件化训练期间，没有小鼠表现出基线僵直时间方面的差异(图6B)。然而，接受B2M的小鼠在场景性记忆测试期间表现出减少的僵直时间(图5E)，但是在线索性记忆测试中没有表出现减少的僵直时间(图6C)。这些功能性数据表明，在DG中局部暴露于B2M损害学习和记忆。

为了检测在大脑中局部暴露于外源性B2M的影响，发明人将B2M立体定向注射到年轻成年小鼠的右侧DG，而将载体对照立体定向注射至年轻成年小鼠的左对侧DG。与用载体对照处理的对侧DG相比，DG局部暴露于B2M导致Dcx阳性细胞的数量减少(图5F，图5G)。鉴于B2M是通过细胞表面的非共价相互作用而作为MHC I复合物的活性成分，发明人接下来研究了外源性B2M对成年神经发生的抑制作用是否是由MHC I细胞表面表达所介导的。与抗原加工相关的转运体1(Tap1)蛋白是将MHC I分子转运到细胞表面所需的，而Tap1的缺乏导致非常少的典型MHC I分子到达细胞表面(Boulanger&Shatz,"Immune signalling in neuraldevelopment,synaptic plasticity and disease,"Nature reviews.Neuroscience(2004)5:521-531；Shatz,“MHC class I:an unexpected role in neuronalplasticity.,”Neuron(2009)64:40-45；Van Kaer et al.,“TAP1mutant mice aredeficient in antigen presentation,surface class I molecules,and CD4-8+Tcells.,”Cell(1992)71:1205-1214)。因此，为了测试表面MHC I表达降低是否可以减轻外源性B2M的抑制作用，发明人将B2M立体定向注射至年轻成年Tap1敲除小鼠(Tap1-/-)的右侧DG，将载体对照注射至左对侧DG。与载体处理的TAP1-/-小鼠的DG相比，在B2M处理的DG之间没有检测到Dcx阳性细胞数量的差异(图5F，图5H)。与先前的报道一致(Laguna Goya etal.,"Adult neurogenesis is unaffected by a functional knock-out of MHC classI in mice,"Neuroreport(2010)21:349-353)，发明人没有观察到年轻成年Tap1-/-和野生型(WT)同窝动物之间神经发生基线水平的差异(图7A)。总之，这些数据表明外源性B2M的局部水平增加足以以典型MHC I依赖的方式减少成年神经发生。

接下来，发明人试图研究降低表面MHC I表达是否也能部分地减轻由异时性联体共生所引起的老年血液对成年神经发生的不利影响(图8A)。与先前的报道一致(Katsimpardi et al.,“Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mousebrain by young systemic factors.,”Science(2014)344:630-634；Villedaet al.,“Theageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitivefunction.,”Nature(2011)477:90-94)，发明人观察到，与年轻的野生型等时联体生物相比，在年轻的野生型异时联体生物中，Dcx阳性未成熟神经元(图8B，图8C)、Tbr2阳性祖细胞(图9A，图9B)和BrdU阳性增殖细胞(图8D)的数量减少。相反，在年轻的Tap1-/-异时联体生物中，发明人没有检测到神经发生水平的剧烈变化(图8B-图8D)。作为对照，在年轻的野生型等时联体生物和年轻的Tap1-/-等时联体生物之间没有检测到神经发生的变化(图7B-图7D)。总之，发明人的数据进一步证实了促衰老因子作为再生损伤的驱动者在成年大脑中的作用，并且进一步表明MHC I分子参与这个过程。

最后，发明人研究了消除内源性B2M表达对衰老期间所观察到的年龄相关的认知衰退的潜在益处。发明人使用了B2M基因敲除小鼠(B2M-/-)，这些小鼠在全身性环境和大脑局部中缺乏蛋白表达。发明人使用RAWM和场景性恐惧条件化评估了在年轻的和老年的B2M-/-和WT对照中的海马依赖性学习和记忆。在年轻动物中，在RAWM训练或测试期间，在B2M-/-和WT对照之间未观察到空间学习和记忆方面的差异(图10A)。有趣的是，与WT对照相比，老年B2M-/-小鼠在RAWM模式的训练阶段期间表现出了增强的空间学习能力，以及在任务的测试阶段期间表现出增强的对平台位置的学习和记忆(图10C)。不管基因型如何，每个年龄组的动物均没有显示出游泳速度方面的差异(图11A，图11D)。在恐惧条件化训练期间，不管基因型如何，所有小鼠均表现出类似的基线僵直(图11B，图11E)。另外，在场景性恐惧条件化(图10B)或是线索性恐惧条件化(图11C)模式期间，在年轻的B2M-/-和WT小鼠中都没有观察到僵直方面的差异。然而，与WT对照相比，老年的B2M-/-小鼠在场景性记忆测试中表现出显著增加的僵直(图10D)，而在线索性记忆测试中没有表现出显著增加的僵直(图11F)。发明人的数据表明内源性B2M的缺乏改善了老年动物中在海马依赖性学习和记忆方面的年龄相关的损伤，这进一步暗示了B2M是衰老期间调节认知衰退的促衰老因子。

随后，发明人研究了缺乏内源性B2M是否也可以消减成年神经发生的年龄相关的衰退。发明人通过免疫组织化学分析检测了年轻和老年成年B2M-/-和WT同窝动物中神经发生的变化。发明人观察到，在年轻成年动物中，内源性B2M表达的缺乏对Dcx阳性细胞的数量没有影响(图10E，图10F)。重要的是，发明人在老年动物中观察到，与野生型同窝动物相比，B2M-/-小鼠中Dcx阳性新生神经元的数量增加了近2倍(图10E，图10G)。与发明人的Dcx数据一致，不管B2M表达如何，发明人没有通过BrdU标记在年轻动物中检测到增殖变化(图12A)。然而，与WT对照相比，老年的B2M-/-动物表现出BrdU阳性细胞的数量的显著增加(图12B)。随后，发明人使用长期BrdU纳入模式评估了B2M-/-小鼠中的神经元分化和存活，其中成熟分化的神经元表达BrdU和神经元标志物NeuN(图10H)。与WT对应物相比，年轻的成年B2M-/-小鼠没有显示出表达BrdU和NeuN两者的细胞的百分比方面的差异(图10I)；而与年龄匹配的WT同窝动物相比，老的成年B2M-/-小鼠表现出表达BrdU和NeuN两者的细胞的百分比的显著增加(图10J)。发明人没有检测到任何年龄的星形胶质细胞分化的差异，所述星形胶质细胞分化被量化为表达BrdU和GFAP标志物两者的细胞的百分比(图12C-图12E)。总之，这些数据表明，内源性B2M的丢失增加了老年大脑而不是年轻大脑中的神经发生水平，这表明在衰老过程中B2M对再生能力衰退起积极作用。

与MHC I分子合作的B2M继续被证明在CNS中有独一无二的参与(Lee et al.,“Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db.,”Nature(2014)509:195-200；Boulanger&Shatz,“Immune signalling in neuraldevelopment,synaptic plasticity and disease.,”Nature reviews.Neuroscience(2004)5:521-531；Shatz,“MHC class I:an unexpected role in neuronalplasticity.,”Neuron(2009)64:40-45；Huh et al.,“Functional requirement forclass I MHC in CNS development and plasticity.,”Science(2000)290:2155-2159；Goddard et al.,“Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I.,”Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica(2007)104:6828-6833；Glynnet al.,“MHCI negatively regulates synapsedensity during the establishment of cortical connections.,”Natureneuroscience(2011)14:442-451)，最近的研究开始探究消除MHC I表达在大脑损伤模型如中风中的治疗性作用(Adelson et al.,“Neuroprotection from stroke in the absenceof MHCI or PirB.,”Neuron(2012)73:1100-1107)。然而，在衰老过程中这些分子在中枢神经系统或外周组织中的功能参与尚未被研究。因此，发明人的研究阐明了先前并未认识到的B2M在认知和再生过程中年龄相关的损伤的发展中的作用。此外，发明人的研究还涉及在部分地介导B2M和异时性联体共生对再生功能的不利影响方面的MHC I表面表达。值得注意的是，人类全基因组关联研究(GWAS)已将染色体6p21上的MHC基因座与衰老的退行性疾病联系在一起，这表明这些分子在年龄依赖性损伤中起到积极的作用(Jeck et al.,“Review:a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases.,”Aging cell(2012)11:727-731)。现在发明人的数据为衰老表型中的这种参与提供了功能性证据。发明人的数据使人们洞察了在全身环境中衰老相关的变化如何驱动老年大脑中的局部损伤的机制，并强调了B2M和MHC I分子参与该过程。从翻译的角度来看，发明人的数据表明在衰老期间所观察到的年龄相关的认知和再生功能障碍可以通过在老年阶段靶向B2M来改善。

III.确定B2M的相对水平

通过SomaScan蛋白质组学测定(Somalogic，Inc，Boulder，CO)测定18、30、45、55和66岁健康男性人供体血浆样品中的β2-微球蛋白的相对水平。对于每个年龄组，将来自40个个体的血浆以8个组(pools)(每组5个人)进行分析。通过对数转换值的双向Student t检验进行统计学分析，还通过使用Jonckheere-Terpstra检验进行未转化数据的趋势分析进行统计学分析。发现观察到的变化是非常显著的，t检验的p值为1.1×10^-4(66岁与18岁)，JT检验的p值为1.3×10^-7(所有年龄组)。(RFU是指SomaScan蛋白质组学测定中的相对荧光单位)。所述结果的图示于图13中。

尽管附有条款(clauses)，本发明还由以下条款定义：

1.一种治疗成年哺乳动物中衰老相关的损伤的方法，所述方法包括：

以足以治疗成年哺乳动物中衰老相关的损伤的方式降低哺乳动物中的β2-微球蛋白(B2M)水平。

2.根据条款1所述的方法，其中所述方法包括减少哺乳动物的全身B2M。

3.根据条款2所述的方法，其中通过从哺乳动物的血液中去除B2M来减少哺乳动物的全身B2M。

4.根据条款3所述的方法，其中所述方法包括在体外从哺乳动物的血液中除去B2M。

5.根据条款1所述的方法，其中通过向哺乳动物施用有效量的B2M水平降低剂来降低B2M水平。

6.根据条款5所述的方法，其中所述B2M水平降低剂是B2M结合剂。

7.根据条款6所述的方法，其中所述B2M结合剂包括抗体或其结合片段。

8.根据条款6所述的方法，其中所述B2M结合剂包括小分子。

9.根据条款5所述的方法，其中所述B2M水平降低剂包括B2M表达抑制剂。

10.根据条款9所述的方法，其中所述B2M表达抑制剂包括核酸。

11.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是灵长类动物。

12.根据条款11所述的方法，其中所述灵长类动物是人。

13.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述成年哺乳动物是老年哺乳动物。

14.根据条款13所述的方法，其中所述老年哺乳动物是60岁或更老的人。

15.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述衰老相关的损伤包括认知损伤。

16.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述成年哺乳动物患有衰老相关的病症。

17.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述衰老相关的病症是认知衰退病症。

前面仅仅说明了本发明的原理。应该理解的是，本领域的技术人员将能够设计各种布置，所述各种布置尽管在本文中并没有明确地描述或示出，但它们体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文所述的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理以及发明人为推进本领域所贡献的概念，并且应被解释为不限于这些具体描述的实例和条件。此外，本文中记载本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实例的所有描述均旨在涵盖其结构和功能等同物。此外，这样的等同物旨在包括当前已知的等同物和未来将开发的等同物，即，执行相同功能而开发的任何元件，而不管其结构如何。因此，本发明的范围不旨在限于本文所示出和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附的权利要求来体现。

Claims (15)

1.一种治疗成年哺乳动物中衰老相关的损伤的方法，所述方法包括：

以足以治疗成年哺乳动物中衰老相关的损伤的方式降低哺乳动物中的β2-微球蛋白(B2M)水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括减少哺乳动物全身的B2M。

3.根据权利要求2所述的方法，其中通过从哺乳动物的血液中去除B2M来减少哺乳动物全身的B2M。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括在体外从哺乳动物的血液中去除B2M。

5.根据权利要求1所述的方法，其中通过向哺乳动物施用有效量的B2M水平降低剂来降低B2M水平。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述B2M水平降低剂是B2M结合剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述B2M结合剂包括抗体或其结合片段。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述B2M结合剂包括小分子。

9.根据权利要求5所述的方法，其中所述B2M水平降低剂包括B2M表达抑制剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述B2M表达抑制剂包括核酸。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是灵长类动物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述灵长类动物是人。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成年哺乳动物是老年哺乳动物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述老年哺乳动物是60岁或更老的人。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述衰老相关的损伤包括认知损伤。