CN107921075A - 用于治疗肿瘤的细小病毒制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种细小病毒制剂，其包括(a)至少1×109pfu/ml的细小病毒H1(H‑1PV)或相关的啮齿动物细小病毒，所述相关的啮齿动物细小病毒选自LuIII、小鼠微小病毒(MMV)、小鼠细小病毒(MPV)、大鼠微小病毒(RMV)、大鼠细小病毒或大鼠病毒(RV)，和(b)药学上可接受的载体，其包含40‑50％碘克沙醇(w/v)、0.7‑0.9mmol CaCl2×2H2O、50‑60mmol NaCl、0.9‑1.2mmol KCl、0.7‑0.95mg/ml氨丁三醇和0.05‑0.15mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠。优选的用途是通过瘤内注射来治疗脑肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及细小病毒制剂，其中细小病毒以至少1×109pfu/ml的浓度存在于药学上可接受的载体，药学上可接受的载体包含40-50％碘克沙醇(w/v)、0.7-0.9mmol CaCl2×2H2O、50-60mmol NaCl、0.9-1.2mmol KCl、0.7-0.95mg/ml氨丁三醇和0.05-0.15mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠。载体在37-40℃下的粘度为3-5mPa.s。
背景技术
癌症是全球第二大死因。据估计，一半的男性和三分之一的女性在其寿命期间会被诊断为患有某种形式的癌症。此外，由于癌症主要是老龄化疾病，并且老年人的人口比例增加，预计从2007年到2030年世界范围内的癌症死亡人数将增加约45％(从790万至1150万死亡数)(世卫组织估计，2008年)。癌症也是最昂贵的疾病。国家癌症研究所的最新估计显示，2007年美国癌症的总体经济成本为2268亿美元，除非更有效的预防性干预措施、早期发现和更有效的治疗得到发展，否则预计这一巨大的经济负担在未来二十年内将进一步增长。尽管过去三十年内美国和欧洲的5年癌症存活率的百分比增长证实在许多形式的癌症的预防、检测、诊断和治疗方面取得了重大进展，但是一些肿瘤类型，如胰腺癌、肝癌、肺癌、脑癌仍然缺乏有效治疗，需要开发新的治疗方案。溶瘤病毒利用癌症特有的弱点杀死癌细胞同时保留正常细胞，其正迅速成为有望对抗癌症的工具。目前，正在用十二种以上不同的溶瘤病毒进行针对各种恶性肿瘤的I-III期临床试验，这些溶瘤病毒可单独使用或与其他抗癌剂组合使用。其中，在对患有复发性多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者进行的I/IIa期临床试验中，溶瘤大鼠细小病毒H-1PV目前被评估为具有安全性和初期体征疗效(GBM)(Geletneky et al,BMC Cancer 2012,pp.99)。
H-1PV是一个小的(直径约25nm)无囊膜的二十面体颗粒，其含有5.1kb长的单链DNA基因组。H-1PV的基因组结构由在两个启动子(P4早期启动子和P38晚期启动子)控制下的两个转录单元组成。P4调节编码非结构(NS)蛋白(NS1和NS2)的基因的表达，P38调节编码衣壳(VP)蛋白(VP1、VP2和VP3)的基因的表达。该病毒优先在快速分裂的癌细胞中繁殖。这种肿瘤选择性不是基于病毒被癌细胞更好地摄取，而是由于癌细胞过度表达病毒DNA复制所需的因子，例如细胞周期蛋白A、E2F或CREB/ATF。最近已经描述了使用细小病毒的癌症疗法及其与化疗或HDAC抑制剂的联合疗法(WO 2009/083232 A1和WO 2011/113600 A1)。
通过注射或输注溶瘤病毒来局部治疗肿瘤的一个常见问题是接种物的靶向分布和活性物质的损失。具体地，由于沿着导管路径穿过组织阻力减小的区域，因此当使用导管时，这种分布沿着导管路径进行。这种现象也被称为回流。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种药物组合物，其在给药后不会经历回流问题，并且在至少12个月的储存期间是稳定的，即使在高温条件下储存数天以及在UV处理下也能保持稳定。
根据本发明，这通过权利要求中限定的主题来实现。
因此，本发明提供了药物组合物，其包括(a)细小病毒H1(H-1PV)或相关的啮齿动物细小病毒，所述相关的啮齿动物细小病毒选自LuIII、小鼠微小病毒(MMV)、小鼠细小病毒(MPV)、大鼠微小病毒(RMV)、大鼠细小病毒或大鼠病毒(RV)，和(b)药学上可接受的载体，其包含40-50％碘克沙醇(w/v)、0.7-0.9mmol CaCl2×2H2O、50-60mmol NaCl、0.9-1.2mmolKCl、0.7-0.95mg/ml氨丁三醇和0.05-0.15mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠。药学上可接受的载体在37-40℃下的粘度为3-5mPa.s。
附图说明
图1：在48％威视派克(Visipaque)/任氏液(Ringer solution)中的H-1PV显示接种物在导管尖端周围靶向分布，没有随机扩散的迹象。
图2：H-1PV在48％威视派克/任氏制剂中稳定超过24个月。
图3：显示在48％威视派克/任氏制剂中的孤立的H-1PV颗粒的电子显微照片；
a)H-1PV装料1，b)H-1PV装料2。
图4：临床试验设计。
图5：碘克沙醇/任氏液[73.62％威视派克TM 320(通用医疗(GE Healthcare)与26.38％任氏液混合]中的病毒浓度。
图6：高温下处理碘克沙醇/任氏液中的H-1PV。
图7：UV-处理两种碘克沙醇/任氏液(A、B)和Tris-EDTA缓冲液(C)中的H-1PV。
具体实施方式
因此，本发明提供了药物组合物，其包括(a)细小病毒H1(H-1PV)或相关的啮齿动物细小病毒，所述相关的啮齿动物细小病毒选自LuIII、小鼠微小病毒(MMV)、小鼠细小病毒(MPV)、大鼠微小病毒(RMV)、大鼠细小病毒或大鼠病毒(RV)，和(b)在37-40℃下具有3-5mPa.s的粘度的药学上可接受的载体，其包含40-50％碘克沙醇(w/v)、0.7-0.9mmol CaCl2×2H2O、50-60mmol NaCl、0.9-1.2mmol KCl、0.7-0.95mg/ml氨丁三醇和0.05-0.15mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠。
如本文所用，术语“细小病毒”包含野生型或其修饰的可复制的衍生物。基于本文的公开内容，在本领域的技术范围内容易确定合适的可用于活跃地产生所述细小病毒并且可用于治疗的修饰的细小病毒，而无需过度的实验工作。
根据本发明，组合物的细小病毒包括细小病毒H1(H1PV)或诸如LuIII、小鼠微小病毒(MMV)、小鼠细小病毒(MPV)、大鼠微小病毒(RMV)、大鼠细小病毒(RPV)或大鼠病毒(RV)的相关的细小病毒。
根据本发明，细小病毒以1×109pfu/ml或更高的浓度以有效剂量存在，并与药学上可接受的载体组合，所述药学上可接受的载体包含40-50％碘克沙醇(w/v)、0.7-0.9mmolCaCl2×2H2O、50-60mmol NaCl、0.9-1.2mmol KCl、0.7-0.95mg/ml氨丁三醇和0.05-0.15mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠。特别地，所述载体包含45-49％碘克沙醇(w/v)、0.75-0.85mmolCaCl2×2H2O、50-55mmol NaCl、0.95-1.1mmol KCl、0.8-0.9mg/ml氨丁三醇和0.05-0.10mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠。在最优选的实施方案中，所述载体含有48％碘克沙醇(w/v)、0.81mmol CaCl2×2H2O、52.80mmol NaCl、1.06mmol KCl、0.88mg/ml氨丁三醇和0.07mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠。
“药学上可接受的”意在包括任何不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对其所施用的患者无毒性的载体。此外，对于以上定义的载体组合，本发明的药物制剂可包含其他药物载体。合适的其他药物载体的实例在本领域中是公知的，包括甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖。这些载体可以通过常规方法配制。
“有效剂量”是指足以影响病程和疾病严重程度从而导致这种病理减轻或缓解的活性成分的量。可以使用本领域技术人员已知的方法来确定可用于治疗和/或预防这些疾病或病症的“有效剂量”。此外，为确保制剂的储存稳定性，活性成分即细小病毒应以至少1×109pfu/ml，特别是至少5×109pfu/ml、1×1010pfu/ml或1×1011pfu/ml的浓度存在。在一个优选的实施方案中，浓度为1×109pfu/ml至1×1010pfu/ml，特别是1×109pfu/ml、2×109pfu/ml、3×109pfu/ml、4×109pfu/ml、5×109pfu/ml、6×109pfu/ml、7×109pfu/ml、8×109pfu/ml或9×109pfu/ml。在另一个优选的实施方案中，浓度为1×1010pfu/ml至1×1011pfu/ml，特别是1×1010pfu/ml、2×1010pfu/ml、3×1010pfu/ml、4×1010pfu/ml、5×1010pfu/ml、6×1010pfu/ml、7×1010pfu/ml、8×1010pfu/ml或9×1010pfu/ml。
根据本发明，载体在37-40℃下的粘度为3.5-4.5mPa.s。更优选为载体粘度为4-5mPa.s的载体。甚至更优选的载体的粘度为约4.5mPa.s。这种粘度类似于血液的粘度(Rosenson et al.,Clinical Chemistry,42:8,pp.1189-1195(1996)；http:www.ucke.de/christian/physik/medprak/Viskositaet.pdf:第84页,表2)。
根据本发明的一个优选实施方案，载体为在任氏液中的碘克沙醇，其通过将73.62％威视派克TM 320(GE Healthcare)与26.38％任氏液混合而制得。威视派克TM 320(通用医疗)含有652mg/ml碘克沙醇(＝65.2％碘克沙醇)，因此与任氏液混合后的碘克沙醇的浓度为48％。“碘克沙醇”是“威视派克”(用于人体注射)或“Iodixanolum”(研究级)的同义词。化学结构为：
其IUPAC名称为5-[乙酰基-[3-[N-乙酰基-3,5-双(2,3-二羟基丙基氨基甲酰基)2,4,6-三碘苯胺基]-2-羟丙基]氨基]-1-N,3,N-双(2,3-二羟丙基)-2,4,6-三碘苯-1,3-二羧酰胺。CAS号码为92339-11-2。它也是一种公知的CT成像造影剂。
可以通过不同的方式进行给药，例如，通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、皮内或瘤内给药。当然，给药途径取决于疗法的种类和药物组合物中所含化合物的种类。优选的给药途径是瘤内给药或静脉内给药。根据患者数据、观察结果和其他临床因素，包括例如患者的体型、体表面积、年龄、性别、将要施用的特定的细小病毒、细胞等、给药时间和途径、肿瘤类型和特征、患者的一般健康状况以及患者正在接受的其它药物治疗，主治医师可以容易地在本领域的技术范围内确定给药方案。
本发明的药物组合物可用于治疗任何肿瘤类型，特别是(非穷举)脑肿瘤(例如神经胶质瘤和成胶质细胞瘤)、胰腺癌、宫颈癌、肺癌、头颈癌、乳腺癌或结肠癌。
本发明的药物组合物可治疗的患者包括人类以及非人类动物。后者的实例包括但不限于诸如牛、绵羊、猪、马、狗和猫等动物。
从实施例1中所示的临床数据可以得出结论，威视派克48％的使用允许(i)通过CT精确地观察接种物，(ii)由于较高的粘度而实现精确的局部递送，和(iii)即使在手动注射以及不使用诸如对流增强递送(CED)的延长自动注射的情况下也不会出现回流。这种有利的分布模式很可能是由于威视派克48％与水溶液相比具有不同的物理性质。折光指数为1.41的任氏液中的威视派克48％在37℃下的粘度为4mPa.s，水在37℃下的粘度为约0.7mPa.s。人体血液在37℃下的粘度为3-5mPa.s。因此，该注射制剂在血液的生理值方面接近血液。
本发明人已经发现病毒浓度对制剂的稳定性有影响(图5)。为确保至少12个月的储存稳定性，通过将73.62％(w/v)威视派克TM 320(通用医疗)与26.30％(w/v)任氏液混合得到的48％碘克沙醇/任氏液中的病毒浓度应为至少1×109pfu/ml。所得溶液含有48％碘克沙醇(w/v)、0.81mmol CaCl2×2H2O、52.80mmol NaCl、1.06mmol KCl、0.88mg/ml氨丁三醇和0.07mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠。
在优选的实施方案中，储存稳定性为至少18个月、至少24个月、至少30个月、至少36个月或甚至长达48个月。
从图6和图7可以得出结论，在48％碘克沙醇/任氏液中的病毒即使在温度升高和UV辐射之后仍然保持活性数天。
以下实施例将更详细地说明本发明。
实施例1 威视派克48％避免回流
开始对18例患有复发性恶性胶质瘤的患者进行I/IIa期临床试验。本试验旨在研究细小病毒H-1的安全性、生物分布、最大耐受剂量和抗肿瘤活性的迹象。根据临床前数据，细小病毒不仅包括瘤内病毒施用，还包括静脉内治疗。
在由12名患者(组I)和6名患者(组II)组成的两个组中进行在48％威视派克中的细小病毒H-1(GMP级制剂)的施用。组1和组2之间的给药途径不同(图4)。
在每组中，施用模式是相同的，但是如果没有观察到剂量限制事件，则将增加剂量。在组I中，细小病毒H-1(也称为“研究性药品”；IMP)以4个剂量水平给药，在组II中以2个剂量水平给药(表1)。
表1两个研究组的给药方案
在组1中，患者在第1天接受通过图像引导注射到肿瘤组织中的IMP。在这一天，向患者注射了预期总剂量的50％。在9天的观察期后，在第10天切除肿瘤。肿瘤去除后，通过直接注射将另一半剂量施用于切除腔的壁上。经过这次在开放性手术期间进行的注射，IMP给药完成，没有进行其他的病毒施用。
在组2中，IMP的初始给药通过静脉途径进行。个体在第1-5天通过5次输注接受预期剂量的50％，每次输注含有总剂量的10％。在第5天最后一次输注后，有一个观察期持续直到第9天，且在第10天，如组1中那样进行肿瘤切除。类似于组1，通过向肿瘤去除后的肿瘤腔周围的组织中进行注射使患者接受另一半剂量，并且在试验过程中对每个个体都不进行其他的病毒注射。
在肿瘤切除之后，在肿瘤腔壁上重新施加病毒。
如图1所示，使用威视派克48％(威视派克TM 320,通用医疗,德国)和任氏液(IDTBiologika GmbH,德国)作为载体溶液在所有12名患者中都没有产生明显的回流。注射完成后30分钟内进行CT。每个插入的导管的注射量为0.5ml-1.2ml(3名患者用2个导管治疗)。对每个导管在30分钟的时间内手动进行注射，并且在所有情况下都使用用于囊肿穿刺的标准导管，其在导管末端具有一个开口。图1还显示了在导管尖端周围接种物靶向分布，没有随机扩散的迹象。
从这个临床数据可以得出结论，威视派克48％的使用允许(i)通过CT精确地观察接种物，(ii)由于较高的粘度而实现精确的局部递送，和(iii)即使在手动注射以及不使用诸如对流增强递送(CED)的延长自动注射的情况下也不会出现回流。这种有利的分布模式很可能是由于威视派克48％与水溶液相比具有不同物理性质。折光指数为1.41的任氏液中的威视派克48％在37℃下的粘度为4mPa.s，水在37℃下的粘度为约0.7mPa.s。人体血液在37℃下的粘度为3-5mPa.s。因此，注射制剂在血液的生理值方面接近血液。
实施例2 稳定性
用蚀斑形成单位(PFU)测得的H-1PV病毒(储存在-20℃或≤-60℃下的48％碘克沙醇/任氏液中，该48％威视派克/任氏液通过将73.62％(w/v)威视派克TM 320(通用医疗)与26.30％(w/v)任氏液(Delta Select GmbH,德赖艾希,德国)混合获得)的活性稳定2年以上。基本上按照Tattersall和Bratton(J.Virol.46(1983),944-55)所述进行蚀斑测定。使NB-324K细胞在包含5％FBS、100μg/ml盘尼西林、100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的MEM培养基中单层培养生长。在60％汇合时用H-1PV的系列稀释液对它们进行感染，并在37℃下孵育1小时。然后用细菌琼脂覆盖物(1.7％，包含5％FBS的MEM)替换培养液。在感染后第4天，通过加入包含细菌琼脂(Becton Dickinson,德国)的0.02％二苯乙烯红染色溶液(Sigma,德国)将活细胞染色18-24小时。将培养皿在37℃下在5％CO2下孵育。感染后5天在灯箱上计数蚀斑形成单位，其浓度以PFU/ml表示。
结果显示在图5中。可以看出，48％碘克沙醇/任氏液中病毒浓度小于1×108pfu/ml时比约1×109或1×1010pfu/ml的更高的病毒浓度时更不稳定。
实施例3 孤立的H-1PV颗粒：电子显微照片显示H-1PV病毒在本发明的制剂中没有聚集
为了定性分析病毒制剂，拍摄电子显微照片。对此，将5μl病毒悬浮液加入到即用型碳包覆的铜网格中并孵育2分钟。然后用5μl重蒸馏水(bidest water)洗涤网格，并用2％醋酸铀酰包覆30s。用Whatman 50滤纸从网格吸收液滴，并将网格干燥约1分钟。用Zeiss透射电子显微镜以20,100×放大率拍摄照片。
实施例4 温度升高对48％威视派克/任氏液中的H-1PV的影响
参数：
体积：100μl
小瓶：500μl螺旋盖
温度：37℃、50℃
孵育时间：1h、4h
进一步储存：4℃
浓度H-1PV：2,3×1010PFU/ml：
结果如图6所示。
图6显示病毒在37℃和50℃处理下的1-4小时后仍然存活。即使在4℃下4周后，H-1PV也是稳定的。
实施例5 UV辐射对48％威视派克/任氏液中的H-1PV的影响
在威视派克(48％碘克沙醇)/任氏液和威视派克(24％碘克沙醇)/任氏液中的H-1PV的UV-去活化
试验#1(UV 254nm,0.35mW/cm2)
试验#2(UV 254nm,0.35mW/cm2)
试验#3(UV 254nm,0.35mW/cm2)
试验#4(UV 254nm,2.4mW/cm2)
结果如图7所示。在威视派克(48％碘克沙醇)/任氏液中的H-1PV病毒通过制剂被保护免受UV处理。在威视派克(24％碘克沙醇)/任氏液中的病毒的稳定性在UV处理后显示出半对数降低。在含水制剂(Tris-EDTA缓冲液＝VTE)中，病毒可以被去活化。
Claims (5)
1.药物组合物，其包括(a)至少1×109pfu/ml的细小病毒H1(H-1PV)或相关的啮齿动物细小病毒，所述相关的啮齿动物细小病毒选自LuIII、小鼠微小病毒(MMV)、小鼠细小病毒(MPV)、大鼠微小病毒(RMV)、大鼠细小病毒或大鼠病毒(RV)；和(b)药学上可接受的载体，其包含40-50％碘克沙醇(w/v)、0.7-0.9mmol CaCl2×2H2O、50-60mmol NaCl、0.9-1.2mmolKCl、0.7-0.95mg/ml氨丁三醇和0.05-0.15mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含48％碘克沙醇(w/v)、0.81mmol CaCl2×2H2O、52.80mmol NaCl、1.06mmol KCl、0.88mg/ml氨丁三醇和0.07mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述细小病毒浓度为1×109pfu/ml至1×1010pfu/ml。
4.权利要求1-3中任一项所述的药物组合物在通过瘤内注射治疗肿瘤中的用途。
5.根据权利要求4所述的权利要求1-3中任一项所述的药物组合物的用途，其中所述肿瘤为脑肿瘤、胰腺癌、宫颈癌、肺癌、头颈癌、乳腺癌或结肠癌。
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