CN107916308A

CN107916308A - 一种角蛋白酶的复配及在工业生产中的应用

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Publication number: CN107916308A
Application number: CN201711173638.5A
Authority: CN
Inventors: 史劲松; 龚劲松; 张荣先; 许正宏; 李恒; 苏畅
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-11-22
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2037-11-22
Also published as: CN107916308B

Abstract

本发明公开了一种角蛋白酶的复配及在工业生产中的应用，属于工业生物技术领域。本发明提供了一种角蛋白酶单独或者与脂肪酶、淀粉酶进行复配并应用于工业制革脱毛的方法，具有脱毛效率高、作用条件温和、安全性好等优点。采用角蛋白酶可以能够独立完成羊皮脱毛，并对脱毛皮革质量进行表征，脱毛效果与商品酶相同；另外还提供了脂肪酶、淀粉酶与角蛋白酶对羊皮进行复配脱毛，三种酶的结合对羊皮脱毛具有协同作用，可以减少酶的用量，并提高脱毛效率。本发明所获得角蛋白酶及其复配酶制剂在制革领域中具有良好的应用前景。

Description

一种角蛋白酶的复配及在工业生产中的应用

技术领域

本发明涉及一种角蛋白酶的复配及在工业生产中的应用，属于工业生物技术领域。

背景技术

制革生产过程的脱毛工序是必不可少的一步，但传统的化学脱毛采用的脱毛剂是硫化物 (Na₂S)和石灰。但是脱毛废液中含有高浓度的硫化物，这也是制革行业污染环境的主要环节。近年来采用蛋白酶进行脱毛已受到大量关注，但蛋白酶质量不稳定，往往可以降解胶原蛋白，因此专一性差，作用复杂，因此在生产中易出现脱毛不彻底或烂面、松面等问题，操作控制难度大，这也是过去酶法脱毛不能全面代替化学法的主要原因。

在皮革生产过程中，通常要求最大限度地保留皮革的胶原蛋白成分，保护皮革的胶原完整性、使成革具有良好的柔软度和丰满度。因此选择低胶原或者无胶原蛋白活性的角蛋白酶应用于制革脱毛工序具有清洁性、环境友好、脱毛彻底、作用效率高、皮革完整度高、品质好等特征，然而，目前的制格行业中尚不具有可工业化应用的无胶原活性的角蛋白酶，现有的角蛋白酶均会在不同程度上对皮革的胶原蛋白成分或完整性造成破坏。因此，具有无胶原活性特性的角蛋白酶在制革行业中具有广阔的应用前景。

同时生皮中含有大量的蛋白多糖，主要分布于真皮的粒面层、表皮与真皮的区域(基膜)，对皮肤起保护作用，对皮肤的粘性、弹性和物理机械性能有重要影响。蛋白多糖主要包括透明质酸、硫酸皮肤素和硫酸肝素。其中透明质酸是胶体状物质，粘度很大，阻碍外界物质的渗透；硫酸皮肤素由于带有大量负电荷，通过静电引力结合在胶原蛋白表面，对胶原纤维起到保护作用；硫酸肝素主要存在于基膜中，起粘接作用。蛋白多糖的去除在制革脱毛中是关键作用位点(宋健.糖酶、蛋白酶脱毛技术及其机理研究[D]:[博士学位论文].无锡：江南大学生物工程学院,2008.)。另外有研究表明，淀粉酶可以彻底水解真皮组织中提取的黏蛋白，对皮的成革质量有很大影响(Melville W,et al.Leather Chem.Ass.,1977,72:216-229.)。此外皮肤中含有油脂，阻碍了脱毛酶扩散，因此利用脂肪酶可以水解皮肤的油脂等成分，成为脂肪酸和甘油，而达到去除脂肪的效果。因此以角蛋白酶催化剂及其与淀粉酶、脂肪酶等复配的酶制剂脱毛的替代化学法脱毛既可以保证皮革脱毛质量，又可以彻底消除或者降低硫化物对环境的污染。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种利用蛋白酶KERBP对羊皮进行酶法脱毛的方法，所述方法是将角蛋白酶以8000～10000U/kg生羊皮的添加量加入至大小为20～36cm²的生羊皮中，于35～37℃下反应6～8h。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶的添加量为287～500U/cm²

在本发明的一种实施方式中，将10000U所述角蛋白酶与6cm×6cm大小生羊皮混合，在37℃、200rpm条件下振荡反应7～16h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还加入脂肪酶和/或淀粉酶。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶的添加量为19.4-35U/cm²。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉酶的添加量为19.4-35U/cm²。

本发明的第二个目的是提供一种复配酶制剂，含有按酶活单位计287～500:15～35：15～35 U/cm²的角蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶。

本发明还提供所述复配酶制剂在制革领域脱毛方面的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了角蛋白酶，其最适pH为碱性，对表面活性剂有较好的耐受性，且对胶原蛋白无降解活性。相比传统蛋白酶在制革脱毛应用中具有明显优势，不会导致皮革出现松面、烂面等质量问题。

(2)本发明提供了角蛋白酶对羊皮的脱毛效率高，可以9h完成对羊皮的单独脱毛，在 7h内通过与脂肪酶或淀粉酶复配完成脱毛，脱毛效果完全，在制革脱毛中具有较好的应用前景。

(3)本发明提供了角蛋白酶与淀粉酶、脂肪酶对羊皮的复配脱毛方法，可以在7-12h 内完成对羊皮的脱毛，制革脱毛中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为重组角蛋白酶的最适pH和pH稳定性；○，相对酶活；●，残余酶活；

图2为底物特异性；

图3为脱毛的羊皮表面；A，自来水处理；B，化学法处理；C，角蛋白酶KERBP发酵液处理9h；D,商品酶处理7h；

图4为体式显微镜观察脱毛的羊皮表面(×20倍)；A，化学法处理；B，角蛋白酶KERBP 发酵液处理9h；C，商品酶处理7h；

图5为扫描电子显微镜观察脱毛的羊皮表面(×160倍)；A，化学法处理；B，角蛋白酶 KERBP发酵液处理9h；C，商品酶处理7h。

具体实施方式

(1)角蛋白酶活性和胶原蛋白活性测定：分别以1％角蛋白和Ⅰ型胶原蛋白为底物，采用紫外比色法测定酶的活性。取稀释适当倍数的酶液0.5mL，加入1.5mL的底物，在40℃条件下保温15min后，加入2mL的0.4M TCA溶液，静置10min后将样品于12000r·min^-1条件下离心5min，取上清500μL，加入2500μL的0.4M Na₂CO₃和500μL的福林酚试剂，混合均匀后在40℃保温条件下反应20min显色后，检测OD₆₆₀ ^[102]。

酶活定义：在上述反应体系中，波长660nm下的吸光度每增加0.01为1个酶单位(U·mL^-1)。

(2)脂肪酶的活力测定：以对硝基苯酚棕榈酸酯(P-nitrophenyl palmitate,p-NPP)为底物，在40℃、pH 8.0条件下，反应5min。酶活定义为每分钟降解底物生成1μM对硝基苯酚 (P-nitrophenol,p-NP)为一个酶活力单位(U)。

(3)淀粉酶的活力测定：采用DNS方法，可溶性淀粉浓度为1％，Tris-HCl缓冲液，反应温度为40℃，反应时间5min。酶活定义为每分钟降解底物生成1μM还原糖(以葡萄糖计)所用的酶为一个酶活力单位(U)。

实施例1角蛋白酶KERBP的应用特性

(1)最适pH和pH稳定性

KERBP的最适反应pH为8.0，随着pH的不断升高，角蛋白酶的酶活力先升高再降低；重组角蛋白酶的稳定pH范围是7.0-9.0，在该范围内残余酶活>75％，在pH<7.0和>11.0时，残余酶活下降较快。结果显示，在pH 8.0-10.0范围内孵育1h后，仍具有较高酶活，说明重组角蛋白酶在碱性pH范围内较稳定。在制革工艺中，浸水、脱毛和浸灰等多道生产工序的操作条件往往都是偏碱性，而重组角蛋白酶的最适反应pH为碱性，适用于制革工艺。

(2)化学试剂对角蛋白酶活性的影响

在55℃、pH 8.0的反应条件下，分别测定各种化学试剂对酶的活性影响。分别选用化学试剂在25℃条件下，对酶进行处理30min。相对酶活力(100％)定义为不添加任何化学试剂条件下的酶活活力。

Tween 20、Tween 40和Tween 80(5mM)对KERBP的稳定性具有一定的促进作用。阴离子表面活性剂SDS(1％)对重组角蛋白酶处理1h，仍有超过90％的残余酶活；此外5mMTriton X-100对重组角蛋白酶具有明显促进作用。说明，重组碱性角蛋白酶KERBP在工业应用具有良好的应用潜力。

表1化学溶剂对角蛋白酶活性的影响

注：ND代表未检测到活力。

(3)重组角蛋白酶的底物特异性

选择多种蛋白底物，测定该角蛋白酶的降解活性。天然蛋白底物分别有：BSA(牛血清蛋白)、I型胶原蛋白、明胶、酪蛋白、羽毛粉、羊毛粉和人类头发。人工蛋白底物分别有偶氮酪蛋白、天青角蛋白、角蛋白以及人工合成的短肽AAPF。

用pH 8.0的缓冲液配制成1％的底物，考察角蛋白酶的底物特异性。将不溶性的底物(天青角蛋白、人发、羽毛和羊毛)做粉碎处理。反应体系用0.5mL Tris-HCl(pH 8.0,50mM) 缓冲液悬浮0.05g不溶性底物，再与0.05mL的适当稀释的角蛋白酶混匀，在60℃下除天青角蛋白反应0.5h外，其他底物反应1h。之后加入1.0mL的10％的TCA终止反应，然后10000 ×g离心10min。测定角蛋白酶与人法、羽毛和羊毛作为底物的反应体系的上清液在280nm 处的吸光值；以天青角蛋白为底物的反应体系则测定其OD₄₄₀。每种反应先将TCA加入后再加角蛋白酶进入的反应体系，测定其相应波长下的吸光值(OD)作为对照。酶活定义：在上述反应体系中，OD每升高0.01作为一个单位酶活。

选用偶氮酪蛋白为底物，其酶活测定方法见论文(Deng A H,Wu J,Zhang Y,etal. Purification and characterization of a surfactant-stable high-alkalineprotease from Bacillus sp. B001[J].Bioresour.Technol.,2010,101(18):7111-7117.)。酶活定义为实验条件下，每分钟释放的偶氮染料造成OD上升0.01作为1个酶活。

以酪蛋白、BSA、明胶和I型胶原蛋白为底物，酶活测定方法如下：

采用紫外比色法测定酶的活性，取稀释适当倍数的酶液0.5mL，加入1.5mL的1.0％的对应底物，在60℃条件下保温15min后，加入2mL的0.4M TCA溶液，静置10min后将样品于12000r·min^-1条件下离心5min，取上清500μL，加入2500μL的0.4M Na₂CO₃和500 μL的福林酚试剂，混合均匀后在40℃保温条件下反应20min显色后，检测OD₆₆₀。

人工合成底物AAPF的酶活测定：用二甲基亚砜(DMSO)配制10mM的底物储存液。反应缓冲液50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，在60℃，检测405nm波长下反应液吸光度变化曲线。

该酶对不同的蛋白类底物催化效率从高到底的顺序依次是偶氮酪蛋白、羽毛、羊毛角蛋白和酪蛋白；且对I型胶原蛋白和天青角蛋白都没有活性(图2)。由于该酶对胶原蛋白无降解活性，从而保证不破坏皮革胶原蛋白成分，有利于皮革中胶原蛋白成分的保留，获得高品质的皮革产品，因此在皮革生产行业具有较好的应用潜力。

实施例2重组角蛋白酶对羊皮的脱毛应用

角蛋白酶用量为10000U/50mL，与约6cm×6cm大小生羊皮混合(相当于278U/cm2的生羊皮)，在37℃、200rpm条件下振荡反应。选取商业化的来源于芽孢杆菌属的脱毛蛋白酶作为酶法脱毛的阳性对照，其用量与脱毛方法与重组角蛋白酶KERBP同。

以上处理结果显示，无需使用污染严重的硫化物等化学试剂，角蛋白酶与羊皮共同孵育 9h后可以彻底完成脱毛。阴性对照用水与羊皮混合孵育则不能去除羊毛；相对于化学法脱毛的羊皮颜色较重且触感较硬，感官检测显示重组角蛋白酶法脱毛后的羊皮颜色较浅、表面光滑且更加柔软(图3)；显微镜观察到经KERBP酶法脱毛的羊皮粒面清晰，且没有观察到胶原损伤；体式显微镜观察显示酶法脱毛皮色浅且质地软而光滑，粒面更为清晰完整(图4)；扫面电镜结果显示经KERBP重组酶与商品酶脱毛方法，无明显差异(图5)。

综上所述，重组角蛋白酶可以满足条件温和、高效、高品质、低污染的脱毛要求，为绿色制革生产工艺的建立和实施奠定良好基础。

实施例3不同条件下的脱毛效果

毛的去除过程主要是包括降解表皮层、水解真皮毛囊中的细胞间质内黏蛋白，损伤毛根和毛囊之间的链接，造成细胞相互分离，减弱根鞘失去对毛根的包裹作用，继而毛可以从毛囊中脱离。因此，该过程有酶在皮中必须先渗透到表皮连接处，直到真皮达到和毛根鞘、毛乳头及毛球的连接处才能达到脱毛效果。采用表1的添加量进行脱毛。选用脂肪酶、将约6 cm×6cm生羊皮放入复配酶液(50mL)中，在37℃、200rpm条件下振荡反应。

通过对脱毛过程和脱毛效果进行感官评价，结果显示：单独采用脂肪酶或淀粉酶无法实现羊毛脱除，采用脂肪酶或淀粉酶与角蛋白酶复配可以实现大部分羊毛的脱除，但脱毛效果不完全，仍有残留。而三种酶的复配脱毛能够在7h内将羊皮除毛干净(表2)。说明组合脱毛效率更高，更易脱毛。脱毛羊皮色浅、皮面干净，而且脂肪酶和淀粉酶的复合使用可以提高脱毛效率，这些酶对角蛋白酶脱毛具有协同作用，可以节约角蛋白酶的用量。同时，淀粉酶和脂肪酶对胶原蛋白都没有降解活性，因此在制革过程中使用安全性好。

表2脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶的脱毛效果

注：++++代表脱毛彻底；+++代表容易脱毛；++代表部分毛脱落，脱毛效果一般；-代表不能脱毛。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种角蛋白酶的复配及在工业生产中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Cys Val Lys Lys Lys Asn Val Met Thr Ser Val Leu Leu Ala Val

1 5 10 15

Pro Leu Leu Phe Ser Ala Gly Phe Gly Gly Ser Met Ala Asn Ala Glu

20 25 30

Thr Val Ser Lys Thr Asp Ser Glu Lys Ser Tyr Ile Val Gly Phe Lys

35 40 45

Ala Ser Ala Thr Thr Asn Ser Ser Lys Lys Gln Ala Val Ile Gln Asn

50 55 60

Gly Gly Lys Leu Glu Lys Gln Tyr Arg Leu Ile Asn Ala Ala Gln Val

65 70 75 80

Lys Met Ser Glu Gln Ala Ala Lys Lys Leu Glu His Asp Pro Ser Ile

85 90 95

Ala Tyr Val Glu Glu Asp His Lys Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Thr Val

100 105 110

Pro Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val His Ala Gln Gly

115 120 125

Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile His

130 135 140

Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro

145 150 155 160

Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His Gly Thr His Val

165 170 175

Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly Val Leu Gly Val

180 185 190

Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Arg Tyr Gly

195 200 205

Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu Trp Ala Val Ala

210 215 220

Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser

225 230 235 240

Thr Ala Leu Lys Asn Thr Val Asp Thr Ala Asn Asn Arg Gly Val Val

245 250 255

Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ser Thr

260 265 270

Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala Val Ala Asn Val

275 280 285

Asn Ser Asn Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala Gly Pro Glu Leu

290 295 300

Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Val Pro Ser Ser

305 310 315 320

Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala

325 330 335

Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn Leu Thr Asn Ser

340 345 350

Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Cys Glu Thr Cys Ala Cys Trp Ser

355 360 365

Lys Arg Ser Lys Thr Ser Asn Arg Leu Gly Pro Thr Val Leu Tyr

370 375 380

Claims

1.一种利用角蛋白酶对羊皮进行酶法脱毛的方法，其特征在于，所述方法是将角蛋白酶以8000～10000U/kg生羊皮的添加量加入至生羊皮中，于35～37℃下反应6～8h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生羊皮的大小为20～36cm²。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述角蛋白酶的添加量为287～500U/cm²。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还加入脂肪酶和/或淀粉酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶的添加量为19～35U/cm²。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述淀粉酶的添加量为19～35U/cm²。

8.一种复配酶制剂，其特征在于，含有按酶活单位计287～500:15～35：15～35的角蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶。

9.根据权利要求8所述的复配酶制剂，其特征在于，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

10.权利要求8或9所述的复配酶制剂在制革领域脱毛方面的应用。