CN107904316A

CN107904316A - 一种鉴定人体液的组织来源的方法及其专用miRNA组合

Info

Publication number: CN107904316A
Application number: CN201711205433.0A
Authority: CN
Inventors: 孙启凡; 季安全; 胡胜; 李冉冉; 江丽; 李彩霞; 王乐
Original assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Current assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2037-11-27
Also published as: CN107904316B

Abstract

本发明公开了一种鉴定人体液的组织来源的方法。该方法包括检测体液中miRNA205、miRNA451、miRNA144、miRNA214、miRNA888和miRNA891六个miRNA的表达量，然后采用softmax回归模型和分类的one‑hot形式计算待测体液来自组织来源的概率值，概率值最大的即为该人体液的组织来源。采用本发明提供的方法可以有效的鉴定人体液的组织来源，大大简化了鉴定刑侦现场体液或其斑迹的组织来源的步骤，能为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人以及定罪量刑等提供准确的科学依据。

Description

一种鉴定人体液的组织来源的方法及其专用miRNA组合

技术领域

本发明涉及法医技术学领域，具体涉及一种鉴定人体液的组织来源的方法及其专用miRNA组合。

背景技术

鉴定犯罪现场遗留的人体液(如血液、精斑、唾液)的组织来源对于案件定性或重现案发现场意义重大，因此鉴定体液的组织来源一直是法医物证学重要的研究内容。传统体液的组织来源的鉴定方法主要基于酶促反应或免疫学的应用，但鉴定过程繁琐，并且对于刑事案件现场通常会出现的微量体液检材往往不能获得良好的鉴定结果。目前体液的组织来源的鉴定方法主要依赖分子生物学的手段，如mRNA(messengerRNA)、DNA甲基化和miRNA(MicroRNA)等等。

miRNA是一类广泛存在于真核细胞中约由18-25个核酸组成的内源性非编码小分子RNA，具有组织特异性、分子小、拷贝数高且不易降解的特点，即使在极端温度、强酸、强碱条件下其含量和分子结构均无明显变化，满足检测降解检材的需求，成为继mRNA之后的用于解决法医学关注的热点；但其拷贝数高、分子量小的特点，使得其检测难度较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定人体液的组织来源。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种鉴定人体液的组织来源的系统，其可包括检测待测体液的miRNA组合中各个miRNA的表达量的试剂；

所述miRNA组合可为a1)或a2)：

a1)包括miR451、miR144、miR214、miR888、miR891和miR205；

a2)由所述miR451、所述miR144、所述miR214、所述miR888、所述miR891和所述miR205组成；

所述miR451的核苷酸序列可如序列表中序列1所示；

所述miR144的核苷酸序列可如序列表中序列2所示；

所述miR214的核苷酸序列可如序列表中序列3所示；

所述miR888的核苷酸序列可如序列表中序列4所示；

所述miR891的核苷酸序列可如序列表中序列5所示；

所述miR205的核苷酸序列可如序列表中序列6所示。

所述系统还可包括将“待测体液的所述miRNA组合中各个miRNA的表达量”转换为待测体液来自组织来源的概率值的系统。

所述将“待测体液的所述miRNA组合中各个miRNA的表达量”转换为“待测体液来自组织来源的概率值”的系统具体可通过采用softmax回归模型和分类的one-hot形式实现。

上述任一所述的系统中，所述组织来源可为外周血、唾液、月经血或精液。

本发明还保护一种鉴定待测体液的组织来源的方法，依次可包括如下步骤：

(1)检测待测体液的所述miRNA组合中各个miRNA的表达量；

(2)采用softmax回归模型和分类的one-hot形式计算待测体液来自组织来源的概率值，概率值最大的即为该人体液的组织来源。

上述方法中，所述组织来源可为外周血、唾液、月经血或精液。

本发明还保护一种鉴定待测体液属于哪一种组织来源的方法，依次可包括如下步骤：

(1)检测待测体液的所述miRNA组合中各个miRNA的表达量；检测标准体液群中的各个标准体液的所述miRNA组合中各个miRNA的表达量；

所述标准体液群由外周血、唾液、月经血和精液组成；

(2)将待测体液中各个miRNA的表达量与每个标准体液中各个miRNA的表达量进行主成分分析，主成分分析中待测体液与哪个标准体液为同一类，该待测体液与该标准体液即属于同一种组织来源。

上述任一所述miRNA组合也属于本发明的保护范围。

上述任一所述miRNA组合在鉴定人体液的组织来源中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述系统在鉴定人体液的组织来源中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述组织来源可为外周血、唾液、月经血或精液。

上文中，检测所述miRNA组合中各个miRNA的表达量具体可为检测所述miRNA组合中各个miRNA的相对表达量。所述检测miRNA组合中各个miRNA的相对表达量具体可以RNU6b为内参。

以所述miR451为例，检测miR451的相对表达量步骤如下：

1)以待测体液的Total RNA为模板，以miR451的RT引物：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA-3’进行逆转录，得到的cDNA；

2)以步骤1)得到cDNA为模板，采用miR451的上游引物(F)：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’和下游引物(R)：5’-CGGAAACCGTTACCATTACTGAG-3’组成的引物对进行实时荧光定量PCR，然后输出待测体液的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)，即为Ct_miR451；

3)以待测体液的Total RNA为模板，以RNU6b的RT引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’进行逆转录，得到的cDNA；

4)以步骤3)得到cDNA为模板，采用5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’组成的引物对进行实时荧光定量PCR，然后输出待测体液的Ct值(C：Cycle，t：threshold，即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)，即为Ct_RNU6b；

5)计算miR451的ΔCt，ΔCt＝Ct_miR451-Ct_RNU6b，ΔCt即为miR451的相对表达量(以RNU6b为内参)。

各个miRNA的RT引物的核苷酸序列具体见表2。

各个miRNA的上游引物(F)和下游引物(R)的核苷酸序列具体见表4。

实验证明，采用本发明提供的方法可以有效的鉴定人体液的组织来源，大大提高了鉴定刑侦现场体液或其斑迹的组织来源的科学性和准确性，能为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人以及定罪量刑等提供准确的科学依据。

附图说明

图1为miRNA451的标准曲线。

图2为miRNA451的扩增曲线和熔解曲线。

图3为实施例1步骤四中2的实验结果。

图4为实施例1步骤四中4的实验结果。

图5为实施例1步骤四中5的实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，所有引物均有sangon公司合成。miRNeasy Mini Kit为德国Qiagen公司的产品。Turbo DNA-free^TM kit为美国Ambion的产品。Nanodrop2000c为美国ThermoScientific公司的产品。QuantStudio ^TM7为美国Thermo Fisher公司的产品。Power SYBRGreenPCR Master Mix(2×)为Applied Biosystems公司的产品。Nuclease-Free Water为TaKaRa公司的产品。5×First-Strand Buffer、DTT(0.1M)和M-MLV ReverseTranscriptase(200U/μL)均为invitrogen公司的产品。dNTP Mixture(10mM)和Nuclease-Free Water为TaKaRa公司的产品。Recombinant RNase Inhibitor(40U/μL)为Promega公司的产品。

下述实施例中，6种miRNA的名称和核苷酸序列如表1中第2行至第7行所示，RNU6b的核苷酸序列如表1中第8行所示。

表1

目的miRNA	核苷酸序列(5’-3’)	在序列表中的位置
			miR451	AAACCGUUACCAUUACUGAGUU	序列1
miR144	UACAGUAUAGAUGAUGUACU	序列2
			miR214	ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU	序列3
miR888	UACUCAAAAAGCUGUCAGUCA	序列4
			miR891	UGCAACGAACCUGAGCCACUGA	序列5
miR205	UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG	序列6
			RNU6b	CTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTT	无

实施例1、基于6种miRNA的相对表达量鉴定人体液的组织来源的方法

一、样本采集

105个样本来自北京地区的50个志愿者(年龄在23-35周岁)。50个志愿者为无关汉族个体，且均知情同意。40个外周血样本为抽取部分志愿者手臂处静脉血获得，31个唾液样本为将志愿者唾液收集在离心管中获得，18个月经血样本为志愿者用无菌棉签在月经第2d或第3d时采集，16个精液为将志愿者将新鲜精液收集在取精杯中获得。

105个样本均保存于-80℃。

二、cDNA的获得

1、采用miRNeasy Mini Kit分别提取105个样本的Total RNA，然后采用TurboDNA-free^TM kit进行纯化(目的为去除基因组DNA)，得到105个样本的Total RNA。

2、完成步骤1后，分别取(少量)105个样本的Total RNA进行琼脂糖凝胶电泳(目的为检测105个样本的Total RNA的完整性)。

3、完成步骤2后，取105个样本的Total RNA，使用Nanodrop2000c进行定量。

4、完成步骤3后，分别以105个样本的Total RNA为模板(含100ng RNA)，分别以表2中RT引物进行逆转录，得到相应的cDNA。

逆转录的反应体系见表3。

逆转录的反应条件：16℃30min，37℃30min，65℃5min，4℃保存。

表2

表3

三、目的miRNA的标准曲线的制备

1、取步骤二得到的cDNA(浓度为400ng/μL)，按照10倍连续梯度稀释方法用去核酸酶水进行稀释，依次得到cDNA1(浓度为0.4ng/μL)、cDNA2(浓度为0.04ng/μL)、cDNA3(浓度为0.004ng/μL)、cDNA4(浓度为0.0004ng/μL)和cDNA5(浓度为0.00004ng/μL)。

2、分别以去核酸酶水、cDNA1、cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5为模板，采用相应的目的miRNA的上游引物(F)和下游引物(R)组成的引物对进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR在QuantStudio ^TM7上进行。上游引物(F)和下游引物(R)的核苷酸序列见表4。检测RNU6b的引物为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

表4

miRNA	上游引物(F)的核苷酸序列(5’-3’)	下游引物(R)的核苷酸序列(5’-3’)
			miR451	GTGCAGGGTCCGAGGT	CGGAAACCGTTACCATTACTGAG
miR144	GTGCAGGGTCCGAGGT	CGCGCCTTACAGTATAGATGATG
			miR214	GTGCAGGGTCCGAGGT	TGATGACAGCAGGCACAGACA
miR888	GTGCAGGGTCCGAGGT	CGTCTCATACTCAAAAAGCTGTCAG
			miR891	GTGCAGGGTCCGAGGT	ACAACTGCAACGAACCTGAGC
miR205	GTGCAGGGTCCGAGGT	AGATCTCCTTCATTCCACCGG

实时荧光定量PCR的反应体系见表5。

表5

组分	体积
		Power SYBR GreenPCR Master Mix(2×)	5μL
上游引物(浓度为10μM)	0.25μL
		下游引物(浓度为10μM)	0.25μL
Nuclease-free water	4μL
		模板	0.5μL

实时荧光定量PCR的反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。

以cDNA的浓度为横坐标，相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。Ct值在进行实时荧光定量PCR后，由仪器自动生成。

miRNA451的标准曲线见图1。标准曲线的方程为：y＝-3.281x+16.6563。

结果表明，目的miRNA(miRNA451、miRNA144、miRNA214、miRNA888、miRNA891或miRNA205)的标准曲线指标R²＞0.99，Eff％(Efficiency)＞0.9。可见，各个引物的特异性良好。

四、基于6种miRNA的相对表达量鉴定人体液的组织来源的方法

1、实时荧光定量PCR检测

分别以步骤二中1得到的cDNA为模板，采用相应的目的miRNA的上游引物(F)和下游引物(R)组成的引物对进行实时荧光定量PCR(每个模板做三个平行样)。通过实时荧光定量PCR检测目的miRNA(miRNA451、miRNA144、miRNA214、miRNA888、miRNA891和miRNA205)的相对表达量(以RNU6b为内参)。实时荧光定量PCR在QuantStudio ^TM7上进行。上游引物(F)和下游引物(R)的核苷酸序列见表4。检测RNU6b的引物为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。实时荧光定量PCR的反应体系见表5。

实时荧光定量PCR的反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环；95℃15s，60℃1min条件下分析熔解曲线。

miRNA451的扩增曲线的见图2中A(纵坐标为PCR产物量(对数值)，扩增曲线的模板从左至右依次为cDNA1、cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5)。miRNA451的熔解曲线见图2中B。

结果表明，目的miRNA(miRNA451、miRNA144、miRNA214、miRNA888、miRNA891或miRNA205)的扩增曲线梯度重复性好，熔解曲线呈现单一峰。因此，目的miRNA的表达效率高，重复性好。

2、完成步骤1后，取实时荧光定量PCR的反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳。

部分实验结果见图3。结果表明，实时荧光定量PCR的反应产物条带单一，纯度良好。

3、完成步骤2后，将步骤1得到的实时荧光定量PCR的结果通过QuantStudio^TMReal-Time PCR Software V1.3(美国Thermo Fisher Scientific公司的产品)输出，即每个样本的Ct值。Ct值越小，目的miRNA的表达量越高(经统计分析有学者将Ct值大于35视作不表达)。同时计算目的miRNA的ΔCt，ΔCt＝Ct_目的miRNA-Ct_RNU6b。

ΔCt即为目的miRNA(miRNA451、miRNA144、miRNA214、miRNA888、miRNA891或miRNA205)的相对表达量(以RNU6b为内参)。

4、完成步骤3后，使用Rv3.2.3(Ross Ihaka，Robert Gentleman)中的程序包ggplot2(Hadley Wickham，2005)，根据ΔCt制作集合热图，分析目的miRNA相对表达量的高低。ΔCt值越小，则miRNA的相对表达量越高。实验结果见图4(颜色越深，相对表达量越高)。

5、完成步骤3后，以6条不同miRNA的相对表达量作为变量，对不同体液来源样本进行主成分分析。

实验结果见图5(B为外周血，位于图5左部；M为月经血，位于图5中下部；SA为唾液，位于图5中上部；SE为精液，位于图5右部)。结果表明，四种组织来源的样本有明显的聚类趋势，外周血、唾液、月经血、精液各自聚为一类。

6、完成步骤3后，将每个样本的ΔCt输入softmax回归模型(Yoshua Bengio，Rejean Ducharme，Pascal Vincent，and Christian Jauvin.A neural probabilisticlanguage model.Journal of Machine Learning Research(JMLR)，3:1137–1155，2003.Andrew Ng et al.UFLDL tutorial.Stanford.Ian Goodfellow，Yoshua Bengio，andAaron Courville.Deep learning.Book in preparation for MIT Press，2016.YannLeCun，Yoshua Bengio，and Geoffrey Hinton.Deep learning.Nature，521(7553)：436–444，2015.)及分类的one-hot形式(Turian Joseph，Lev Ratinov，and YoshuaBengio.Word representations：a simple and general method for semi-supervisedlearning.Proceedings of the 48th Annual Meeting of the Association forComputational Linguistics(ACL).2010.和Yao K，Zweig G，Hwang M Y，et al.Recurrentneural networks for language understanding[C]//Interspeech.2013:2524-2528.)，计算每个样本来自每种组织的概率值，概率值最高的组织即为样本的组织来源。

部分鉴定结果见表6。结果表明，基于6种miRNA的相对表达量鉴定人体液的组织来源的方法准确率高，准确率达到100％。

表6

<110> 公安部物证鉴定中心

<120> 一种鉴定人体液的组织来源的方法及其专用miRNA组合

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

aaaccguuac cauuacugag uu 22

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

uacaguauag augauguacu 20

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

acagcaggca cagacaggca gu 22

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

uacucaaaaa gcugucaguc a 21

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

ugcaacgaac cugagccacu ga 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

uccuucauuc caccggaguc ug 22

Claims

1.鉴定人体液的组织来源的系统，包括检测待测体液的miRNA组合中各个miRNA的表达量的试剂；

所述miRNA组合为a1)或a2)：

a1)包括miR451、miR144、miR214、miR888、miR891和miR205；

所述miR451的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述miR144的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

所述miR214的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

所述miR888的核苷酸序列如序列表中序列4所示；

所述miR891的核苷酸序列如序列表中序列5所示；

所述miR205的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于：所述系统还包括将“待测体液的所述miRNA组合中各个miRNA的表达量”转换为待测体液来自组织来源的概率值的系统。

3.如权利要求1或2所述的系统，其特征在于：所述组织来源为外周血、唾液、月经血或精液。

4.一种鉴定待测体液的组织来源的方法，依次包括如下步骤：

(1)检测待测体液的权利要求1所述miRNA组合中各个miRNA的表达量；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述组织来源为外周血、唾液、月经血或精液。

6.一种鉴定待测体液属于哪一种组织来源的方法，依次包括如下步骤：

(1)检测待测体液的权利要求1所述miRNA组合中各个miRNA的表达量；检测标准体液群中的各个标准体液的权利要求1所述miRNA组合中各个miRNA的表达量；

所述标准体液群由外周血、唾液、月经血和精液组成；

7.权利要求1所述miRNA组合。

8.权利要求1所述miRNA组合在鉴定人体液的组织来源中的应用。

9.权利要求1至3任一所述系统在鉴定人体液的组织来源中的应用。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述组织来源为外周血、唾液、月经血或精液。