CN107904281B - 纳豆激酶活力的检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纳豆激酶活力的检测方法，该方法包括以下步骤：制备血栓管、溶解血栓、测定标准溶液的溶栓长度、绘制标准曲线以及测定待测样品的纳豆激酶活力。该方法准确度较高，且数据波动小，稳定性较高。另外，该方法所使用的样品量较少，无需复杂仪器，且能同时测定多组样品，适宜用于的纳豆激酶激活剂或抑制剂的高通量筛选中。

Description

纳豆激酶活力的检测方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及激酶检测技术领域，特别是涉及纳豆激酶活力的检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术

纳豆激酶是一种枯草杆菌蛋白激酶，是一种由纳豆菌或纳豆枯草杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，具有较强的溶栓作用，其在体内溶栓活力为纤溶酶的四倍。

纳豆激酶具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。此外，每百克纳豆的价格与1500美元的尿激酶相当，另外，尿激酶的半衰期为4-20分钟，而纳豆激酶的活力可持续8-12h，且纳豆激酶抑制纤维蛋白的效果较尿激酶和纤维蛋白溶酶更好，且相对耐热。故可知纳豆激酶与其他溶栓药物相比成本低、安全性好、分子量小、口服效果好、溶栓活力高、作用持续时间长等，有望被开发为一种市场竞争能力强的新型溶栓药剂及心脑血管保健品。因此纳豆激酶活力的检测方法显得尤为重要。

传统的纳豆激酶活力检测方法包括：IU纤维蛋白平板法、纤维蛋白快速溶解时间法(CLT法)、四肽底物法、酶联免疫吸附(ELIZA)法。

其中，IU纤维蛋白平板法通过观察激酶在纤维蛋白平板上形成的水解圈，测量水解圈的直径来测定相应纳豆激酶的活力。但因为纤维蛋白凝胶的密度分布非常不均，水解圈的形状往往不规则，以及边缘模糊难辨，而且对水解圈直径的认定存在人员视觉差异，导致数据波动性强，重复性差，操作繁琐，不具权威依据。

另外，CLT法是将纳豆激酶、纤维蛋白原、凝血酶在生理盐水中猛烈搅拌混合后，置于37℃水浴中，形成充满气体的纤维蛋白柱凝胶并开始计时，直至气泡停止生成。通过计算产生气泡的时间来反推酶活。此方法的缺点在于方法迂回间接，精度较差，重复性差，人为误差难以控制，操作繁琐，不具权威依据。

再者，四肽底物法通过利用纳豆激酶与枯草蛋白酶的高同源性，使四肽底物和纳豆激酶反应一段时间后，再用紫外分光光度法测定其小分子产物的浓度来测定纳豆激酶的活力。纳豆激酶在发酵生产的过程中会伴随有大量枯草蛋白酶类的产生，因此对纳豆激酶的活力测定带来干扰。此外，四肽底物较为昂贵，导致此法测定成本过高。

而酶联免疫吸附(ELIZA)法所需的设备及试剂较为苛刻，适用范围受限。

发明内容

基于此，提供一种稳定性较高的纳豆激酶活力检测方法。

一种纳豆激酶活力的检测方法，包括以下步骤：

(1)制备血栓管

取数根毛细管，分别吸取凝血酶液后，再吸取纤维蛋白原溶液，吸取的所述凝血酶液的体积与所述纤维蛋白原溶液的体积比为1:100～1:20，然后密封所述毛细管的非吸取端，静置，待所述毛细管中的溶液凝固后形成血栓，即得所述血栓管，并分别记录所述血栓的长度，作为第一血栓长度；

(2)溶解血栓

配制不同浓度梯度的尿激酶标准溶液，将(1)中制备的所述血栓管分别置于不同浓度的所述尿激酶标准溶液中，再密封所述尿激酶标准溶液，分别在相同温度下，反应相同时间后取出，所述血栓管内有液体状物质生成；

(3)测定所述标准溶液的溶栓长度

使用加热法除去步骤(2)中生成的所述液体状物质，并记录血栓管中剩余的所述血栓的长度，作为第二血栓长度，所述溶栓长度为所述第一血栓长度减去所述第二血栓长度；

(4)绘制标准曲线

绘制所述尿激酶的浓度与所述溶栓长度的标准曲线；

(5)测定待测纳豆激酶样品的酶活力

将待测纳豆激酶样品溶液采用与步骤(2)相同的操作，得到与待测纳豆激酶样品反应后的血栓管；

将与所述待测纳豆激酶样品反应后的所述血栓管，采用与步骤(3)相同的操作，测得待测纳豆激酶样品的溶栓长度；

根据步骤(4)的标准曲线和所述待测纳豆激酶样品的溶栓长度计算所述待测纳豆激酶样品的酶活力。

该方法通过使用毛细管，利用毛细管效应吸取凝血酶液，再吸取纤维蛋白原溶液，在凝血酶的作用下使纤维蛋白原形成纤维蛋白，从而制备血栓管。再将血栓管置于预先配制的不同浓度梯度的尿激酶标准溶液中，由于尿激酶渗透进入血栓管，使血栓溶解，通过判断血栓在规定的时间内的溶解量来判断激酶的活力。并且，该方法通过采用加热法，使血栓管中被激酶溶解的血栓受热沸腾喷出，通过测量前后血栓长度的变化来测得溶栓长度。另外，再通过标准曲线法，根据待测纳豆激酶样品的溶栓长度推测出待测纳豆激酶样品的酶活力。

该方法利用毛细管来制备血栓管，有效地排除了纤维蛋白密度不均所带来的影响，故由该方法测定的待测纳豆激酶样品的酶活力准确度高，数据波动较小，稳定性较高。

在其中一实施例中，所述加热法的具体操作为：取出所述血栓管，将接触样品的一端朝上，在竖直状态下靠近火焰，并来回摆动所述血栓管，使血栓管内所述液体状物质受热沸腾喷出，直至连续加热一段时间后无液体喷出，停止操作。

该方法操作简便，无需复杂仪器即可除去血栓管中的液体部分，进而准确得出溶栓长度。

在其中一实施例中，溶解血栓的反应温度为30℃～40℃，反应时间为24h～72h。

为了保证酶活力，需要控制一定的反应条件，并且，平行试验之间需要固定反应时间和反应温度。在上述反应温度和时间下，可以保证酶的反应活力，同时可以保证一定的溶栓长度，便于测量，减少误差。

在其中一实施例中，在制备所述血栓管时，在所述纤维蛋白原溶液中加入染液。

加入染液可以更方便观察。

在其中一实施例中，在制备所述血栓管时，在所述纤维蛋白原溶液中加入pH为7.5-9的缓冲溶液。

加入pH为7.5-9的缓冲溶液，使纤维蛋白原溶液的pH维持在一定范围内，以保证酶的活力。

在其中一实施例中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液或巴比妥-氯化钠缓冲液。

在其中一实施例中，所述密封为蜡密封。

蜡密封不仅可以防止溶液挥发而使溶液的浓度发生变化，而且可以固定血栓管，防止血栓管运动而带来测量误差。

一种适合使用上述的方法使用的测定纳豆激酶活力的试剂盒，该试剂盒包括：凝血酶、纤维蛋白原、尿激酶以及毛细管。

该试剂盒可以准确、稳定、方便地测定待测纳豆激酶样品的酶活力。

在其中一实施例中，所述试剂盒还包括：染液和缓冲液，所述染液为番红染液，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

上述的纳豆激酶活力的检测方法在大批量待测纳豆激酶样品的高通量筛选中的应用。

上述纳豆激酶活力的检测方法稳定性较高，无需复杂仪器，且可以同时测量大量样品，适宜用于大量待测纳豆激酶样品的高通量筛选中。

附图说明

图1为一实施例的纳豆激酶活力检测方法的流程图；

图2为一实施例的纳豆激酶活力检测方法的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行具体说明。

如图1所示，在一实施例中，一种纳豆激酶活力的检测方法，包括以下步骤：

S100：制备血栓管

取数根毛细管，分别吸取凝血酶液后，再吸取纤维蛋白原溶液，吸取的凝血酶液的体积与纤维蛋白原溶液的体积比为1:100～1:20，然后密封毛细管的非吸取端，静置，待毛细管中的溶液凝固后形成血栓，即得血栓管，并分别记录血栓的长度，作为第一血栓长度。

该步骤通过使用毛细管，利用毛细管效应吸取凝血酶和纤维蛋白原溶液，在凝血酶的作用下使纤维蛋白原形成纤维蛋白，从而制备血栓管。

需要说明的是，由于采用毛细管，所需吸取的纤维蛋白原溶液的体积较少，故所需的凝血酶的体积较少，仅需吸取少量凝血酶液即可使全部纤维蛋白原溶液形成纤维蛋白。形成血栓管后，观察，毛细管内无液体状物质既可。在一实施例中，吸取的凝血酶液的体积与纤维蛋白原溶液的体积比1:60，以便观察。

另外，非吸取端是指毛细管的与吸取凝血酶液和纤维蛋白原溶液的一端相对的另一端。

由于形成的纤维蛋白凝胶是一个不均匀的体系，在IU纤维蛋白平板实验或分光光度实验中，由于纤维蛋白凝胶的密度分布不均，使得实验数据波动较大，重复性较差。

而本发明通过利用毛细管的毛细管效应来吸取液体，即主要是依靠液体与玻璃管的表面张力同液柱重力相平衡来实现，根据毛细现象方程：

经变形

转为微分方程得：

其中，ρ为纤原柱密度，y为表面张力加速度，r为毛细管半径，θ为液面与管壁接触角，h为纤原柱高度。

设定△ρ是一个在有限范围内不定的变量(即密度不均匀)，可以理解为在高度为dh的一小段纤原柱片段的质量Δm，也是和Δρ一样的变量。②式两边同时乘以S d h(S是横截面积)，得：

或

从③可以看出，dθ无限趋于0，即cos dθ无限趋于1，而

是一个恒定值，说明在毛细管法中，Δm倾向自动保持稳定，即纤原柱的密度在制作过程中容易分布均匀。

另外，在毛细管中，所形成的纤维蛋白凝胶柱的长度和半径之比较大，故水平方向的不均匀性被消除，而垂直方向上的密度差异在溶解的过程中可视为相互抵消。该方法有效地排除了反应截面的密度差异所带来的影响，因此该方法的准确性、重复性都较高。

S200：溶解血栓

配制不同浓度梯度的尿激酶标准溶液，将(1)中制备的血栓管分别置于不同浓度的尿激酶标准溶液中，再密封尿激酶标准溶液，分别在相同温度下，反应相同时间后取出，血栓管内有液体状物质生成。

该步骤将血栓管置于尿激酶标准溶液中，尿激酶标准溶液渗透进入毛细管，将血栓溶解形成液体状物质，残留在毛细管中。其中，尿激酶标准溶液的浓度梯度可以根据需要进行调节，且每一个浓度平行测定数组数据，以保证标准曲线的准确性。

另外，对尿激酶标准溶液进行密封是为了防止液体挥发，使溶液的浓度发生变化而带来误差。在一实施例中，使用蜡密封的方法，采用蜡密封的方法不仅可以起到防止液体挥发的作用，还能固定毛细管，使毛细管处于竖直状态，以方便长度测量。还可以采用密封盖等其他方式进行密封。

另外，需要选择合适的反应条件，在一实施例中，反应温度为30℃～40℃，反应时间为24h～72h。需要说明的是，为了防止反应温度和反应时间不同所带来的误差，所有平行实验需要在相同的反应温度和反应时间下进行测定。在一实施例中，反应温度为37℃，反应时间为48h。

S300：测定标准溶液的溶栓长度

使用加热法除去步骤(2)中生成的液体状物质，并记录血栓管中剩余的血栓的长度，作为第二血栓长度，溶栓长度为第一血栓长度减去第二血栓长度。

其中，加热法是指对生成的液体状物质加热，使其沸腾，并从毛细管中喷出。利用该方法来除去生成的液体状物质，从而方便测定反应前后的血栓长度变化(溶栓长度)。

该加热法的具体操作为：取出血栓管，将接触待测样品的一端朝上，在竖直状态下靠近火焰，并来回摆动该血栓管，使血栓管内液体部分受热喷出，直至连续加热一段时间后无液体喷出，停止操作。在操作的过程中，手法需要缓和，且还需要控制每次加热时间以及加热温度，防止加热时间过长或者加热温度过高而使毛细管溶化、断裂。在一实施例中，使用酒精灯进行加热。

S400：绘制标准曲线

绘制尿激酶的浓度与溶栓长度的标准曲线。

根据尿激酶的浓度与溶栓长度绘制标准曲线，建立线性方程。可以以尿激酶的作为横轴、溶栓长度作为纵轴绘制标准曲线。

S500：测定待测纳豆激酶样品的酶活力

将待测纳豆激酶样品溶液采用与步骤(2)相同的操作，得到与待测纳豆激酶样品反应后的血栓管。

将与待测纳豆激酶样品反应后的血栓管采用与步骤(3)相同的操作，测得待测纳豆激酶样品的溶栓长度。

根据步骤(4)的标准曲线和待测纳豆激酶样品的溶栓长度计算待测纳豆激酶样品的酶活力。

需要说明的是，待测纳豆激酶样品是指需要测定纳豆激酶活力的纳豆激酶样品，例如：可以为经纳豆菌种发酵后的发酵原液或者制成的纳豆激酶干粉等，样品经适当预处理后，稀释，然后采用上述方法测定其纳豆激酶活力。另外，待测纳豆激酶样品的浓度不宜过低，防止待测溶液浓度过低而使溶栓长度过小，进而使血栓长度的测量误差增大。

另外，将待测纳豆激酶样品的溶栓长度代入标准曲线中后所得到的值乘以稀释倍数，即可得到待测纳豆激酶样品的酶活。该待测纳豆激酶样品的酶活的单位为尿激酶当量。

以下列举具体实施例对本发明的纳豆激酶活力的检测方法进行说明。

需要说明的是，本发明未注明具体来源的试剂或仪器，为市场购买的常规试剂或仪器。

实施例一

待测纳豆激酶样品1～3的活力值的测量

实施例1

使用本发明的方法测定待测纳豆激酶样品1～3的活力值：

(1)制备血栓管

称取9mg纤维蛋白原，溶于1mL生理盐水中，形成纤维蛋白原溶液，37℃水浴保温5min，加入半滴红墨水，摇匀，用毛细血管沾取凝血酶1mm左右后，立即继续吸取纤原蛋白溶液至6cm左右，然后将毛细管非吸取端沾取一些熔融状态的蜡来进行封闭。静置，待毛细管中的溶液凝固后形成血栓，即得血栓管，在毛细管上标记血栓高度，并记录血栓管中的血栓长度，作为第一血栓长度。

(2)溶解血栓

称量尿激酶标准品溶于生理盐水中，制备成0U/ml，10U/ml，20U/ml，30U/ml，40U/ml，50U/ml，60U/ml，70U/ml，80U/ml，90U/ml，100U/ml的标准溶液。从上述标准溶液中分别取0.8ml的样品液至于11个1ml的离心管中，再将步骤(1)中标记好的血栓管插入离心管液面内，每个离心管插3根血栓管作为平行数据。再在离心管的液面处滴1滴熔融状态的蜡，蜡冷却凝固后形成封闭层。最后将离心管放置到37℃水浴锅中，恒温反应48h后取出。

(3)测定标准溶液的溶栓长度

擦干取出的血栓管表面的样品液，点燃酒精灯，将接触样品液的一端向上，在竖立状态下，靠近距离酒精灯火焰0.5cm至1cm之间来回摆动，使血栓管内已经液化的血栓部分迅速受热、然后沸腾排出。当血栓管液化部分喷发完毕，连续加热5秒至不再产生新的喷发，即可停止该操作。记录剩余的血栓的长度，作为第二血栓长度。

溶栓长度即为第一血栓长度减去第二血栓长度。

(4)绘制标准曲线

以尿激酶的浓度为横轴，溶栓长度为纵轴，绘点，连线即得到标准曲线，如图2所示。

(5)测定待测纳豆激酶样品的酶活

依次称取1g待测纳豆激酶样品1溶于5mL(相当于稀释5倍)、10mL(相当于稀释10倍)、20mL(相当于稀释20倍)、40mL(相当于稀释40倍)生理盐水中，搅拌均匀，分别离心后取上层清液0.8mL溶液于1mL离心管中，再将步骤(1)中标记好的血栓管插入离心管液面内，每个稀释度测3个平行样。再在离心管的液面处滴1滴熔融状态的蜡，蜡冷却凝固后形成封闭层。最后将离心管放置到37℃水浴锅中，恒温反应48h后取出。然后采用与步骤(3)相同的操作，分别测得待测纳豆激酶样品1的溶栓长度。

将待测纳豆激酶样品1的溶栓长度分别代入步骤(4)中绘制的标准曲线中，计算出待测纳豆激酶样品1的酶活。

实施例2

按与实施例1相同的方法测定待测纳豆激酶样品2的活力值。

实施例3

按与实施例1相同的方法测定待测纳豆激酶样品3的活力值。

对比例1

纤维蛋白平板法

(1)铺板,将在50℃水浴中保温的1％琼脂糖液、0.3％纤维蛋白原液,1BP/ml凝血酶液按比例混匀倒板,制成人工血栓平板。

配制尿激酶标准系列溶液，活力单位分别为0U/ml、10U/ml、20U/ml、30U/ml、40U/ml、50U/ml、60U/m l、70U/ml、80U/ml、90U/ml、100U/ml。

然后各取标准系列溶液和待测纳豆激酶样品1溶液0.8ml滴加到纤维蛋白平板上，37℃孵育18h后测量形成透明圈的两条垂直直径,并计算其面积。

以尿激酶标准溶液活力单位为横坐标,透明圈面积对数为纵坐标,绘制标准曲线。根据样品溶液形成透明圈面积,由直线回归方程计算样品溶液活力单位,再根据样品称重量及定容体积,计算待测纳豆激酶样品1中纳豆激酶活力。

(2)将待测纳豆激酶样品1同实施例1分别稀释5倍、10倍、20倍、40倍，每个稀释度测3个平行样，按上述方法测定其纳豆激酶活力。

对比例2

按对比例1相同的方法测定待测纳豆激酶样品2的活力值。

对比例3

按对比例1相同的方法测定待测纳豆激酶样品3的活力值。

对比例4

纤溶活力测定法(2003年由JHFA正式宣布为纳豆激酶官方测量标准)

试管内加入0.05mol/L的硼酸-硼砂缓冲溶液1.4mL，一定量的纤维蛋白原溶液及凝血酶搅拌后，在37摄氏度保温10分钟形成血栓，加入0.1ml尿激酶标准溶液，摇晃5秒，37摄氏度下反应60min，其间每20分钟摇晃5秒，反应完成后加2ml、1mol/L的三氯乙酸，摇晃5秒，在37摄氏度下保温20分钟，再在12000r/min的转速下离心10分钟，收集上清液，测定275nm处吸光度值。

按同样的方法测定相同浓度待测纳豆激酶样品1溶液的吸光度值。

具体结果如表1

表1

表1中“—”表示无法测定。

从表1可以看出，实施例1、实施例2以及实施例3的数据波动均较小，稳定性较高。其中，实施例2为活性较低的样品，实施例3活性较高的样品，可见，无论是低活性待测纳豆激酶样品还是高活性待测纳豆激酶样品，该方法均具有较高的稳定性。另外，样品逐渐稀释后，样品的数据波动仍较小，说明该方法受样品浓度限制较小，在较低浓度下仍具有较高的准确性和稳定性，可见该方法具有较高的灵敏度。

对比例1、对比例2以及对比例3为纤维蛋白平板法测得的活力值，从表1可以看出，该方法数据波动较大，稳定性较低，且待测样品的浓度越低，该方法的稳定性越低，且该方法无法测定浓度较低的样品。另外，从对比例2可以看出，该方法无法准确测定低活性的样品。

对比例4中根据测得待测纳豆激酶样品活力值与尿激酶活力值，将待测纳豆激酶样品活力值换算成尿激酶当量，得到其酶活为87U/ml。可知实施例1的方法准确性较高。

另外，对比例4中的纤溶活力测定法虽然为纳豆激酶活力测定的标准方法，但还存在很多缺陷，例如：在实验的过程中需根据所使用凝血酶的活力及紫外分光光度计的测定范围调整酶的加入量。因为除了纤维蛋白原与凝血酶反应所产生的血纤维蛋白肽的降解产物，在275nm下，多种羰基化合物也会产生吸收，因此该测定结果不能单一表达纳豆激酶活力，且需要使用紫外分光光度计，操作复杂。

实施例二

待测纳豆激酶样品的高通量筛选

取10组不同待测纳豆激酶样品，分别编号1-10，每组测三个平行样，按实施例1的方法同时测定其纳豆激酶活力。具体如表2。

表2

通过上表可知样品4的酶活最高，样品9次之。

可知，本发明的方法可以同时对多组样品进行测定。因此可用于大量待测纳豆激酶样品的高通量筛选中，同时横向对比，得到酶活力最强的样品。

本发明的测定纳豆激酶活力的方法，准确性较高，数据波动小，稳定性较高，且所使用的样品量较少，无需使用复杂仪器，故成本较低。另外，该方法可以同时测定较多样品，可以适用于大量待测纳豆激酶样品的高通量筛选中。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种纳豆激酶活力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备血栓管

取数根毛细管，分别吸取凝血酶液后，再吸取纤维蛋白原溶液，吸取的所述凝血酶液的体积与所述纤维蛋白原溶液的体积比为1:100～1:20，然后密封所述毛细管的非吸取端，静置，待所述毛细管中的溶液凝固后形成血栓，即得所述血栓管，并分别记录所述血栓的长度，作为第一血栓长度；

(2)溶解血栓

配制不同浓度梯度的尿激酶标准溶液，将(1)中制备的所述血栓管分别置于不同浓度的所述尿激酶标准溶液中，再密封所述尿激酶标准溶液，分别在相同温度下，反应相同时间后取出，其中，溶解血栓的反应温度为30℃～40℃，反应时间为24h～72h；所述血栓管内有液体状物质生成；

(3)测定所述标准溶液的溶栓长度

使用加热法除去步骤(2)中生成的所述液体状物质，并记录血栓管中剩余的所述血栓的长度，作为第二血栓长度，所述溶栓长度为所述第一血栓长度减去所述第二血栓长度；

(4)绘制标准曲线

绘制所述尿激酶的浓度与所述溶栓长度的标准曲线；

(5)测定待测纳豆激酶样品的酶活力

将待测纳豆激酶样品溶液采用与步骤(2)相同的操作，得到与待测纳豆激酶样品反应后的血栓管；

将与所述待测纳豆激酶样品反应后的血栓管，采用与步骤(3)相同的操作，测得待测纳豆激酶样品的溶栓长度；

根据步骤(4)的标准曲线和所述待测纳豆激酶样品的溶栓长度计算所述待测纳豆激酶样品的酶活力。

2.根据权利要求1所述的纳豆激酶活力的检测方法，其特征在于，所述加热法的具体操作为：取出所述血栓管，将接触样品的一端朝上，在竖直状态下靠近火焰，并来回摆动所述血栓管，使血栓管内所述液体状物质受热沸腾喷出，直至连续加热一段时间后无液体喷出，停止操作。

3.根据权利要求1所述的纳豆激酶活力的检测方法，其特征在于，在制备所述血栓管时，在所述纤维蛋白原溶液中加入染液。

4.根据权利要求1所述的纳豆激酶活力的检测方法，其特征在于，在制备所述血栓管时，在所述纤维蛋白原溶液中加入pH为7.5-9的缓冲溶液。

5.根据权利要求4所述的纳豆激酶活力的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液或巴比妥-氯化钠缓冲液。

6.根据权利要求1所述的纳豆激酶活力的检测方法，其特征在于，所述密封为蜡密封。

7.权利要求1-6任一权利要求所述的纳豆激酶活力检测方法在大批量待测纳豆激酶样品的高通量筛选中的应用。

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