CN107904186B - 可用于麻类微生物脱胶的菌株及其麻类脱胶工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可用于麻类微生物脱胶的菌株，该菌株为保藏号CGMCC 14601的植物腐败菌，命名为植物腐败菌PW。并且提供了一种利用植物腐败菌PW进行麻类脱胶的工艺，依次经过菌悬液的制备、麻原料的预处理、循环式浸泡接种、发酵、灭活和洗麻，最终获得纯净的麻纤维。本发明植物腐败菌PW可以产生胞外果胶酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶，其酶活高、培养条件粗犷、生长速度快、脱胶周期短；本发明脱胶流程简单、条件温和，污染物处理负荷比化学脱胶的降低80％，加工成本降低20％左右；采用一种新型循环式麻类生物脱胶工艺，一次培养的菌液多次循环使用，提高菌液浓度和使用效率，缩短工艺流程，降低生产成本，减少菌株变异失活风险。
Description
技术领域
本发明属于麻类脱胶技术领域，具体涉及一种可用于麻类微生物脱胶的菌株及其麻类脱胶工艺。
背景技术
苎麻、红麻、黄麻、大麻等麻类作物韧皮部分，含有20％～40％的非纤维素物质，包括木质素(2％～5％)、果胶(4％～8％)和半纤维素(12％～18％)等物质，这些物质镶嵌于细胞之间及细胞壁中，结构十分复杂。甘露聚糖及木聚糖是纤维素和木质素连接的重要桥梁，它们常以共价键的方式与纤维素连接，以氢键或其它非共价键的方式与木质素连接，木质素由多聚苯丙烷等组成；果胶主要由多聚半乳糖醛酸组成，降解产物为半乳糖醛酸；半纤维素是一类结构和成份十分复杂的物质，主要包括甘露聚糖、木聚糖及多聚半乳糖等。目前，对麻类进行开发利用都需进行纤维提取，纤维的提取过程一般需要除去非纤维物质，而脱胶工艺是其关键步骤。麻类脱胶方法主要包括化学脱胶和生物脱胶两大类。传统的沤麻法存在脱胶周期长、污染严重、工艺条件控制困难、纤维产量与质量不稳定等问题；现有麻类脱胶企业普遍采用化学脱胶法，耗水量大，纤维制成率低、脱胶产生的大量高浓度废水、废渣，严重污染环境，制约着产业的健康发展。
麻类微生物脱胶是以生物催化剂催化非纤维素物质降解为核心而获得满足后续加工要求的纤维的加工过程。虽然微生物脱胶技术在近年来取得了重要突破，但是，长期、稳定和规模化应用的麻类生物脱胶技术尚未见报道，究其原因，一方面是，脱胶菌株功能不强大、不稳定，另一方面是，脱胶工艺不够完善，菌剂制备成本高、技术难度大。目前已经报道的具有麻类生物脱胶功能的菌株有60多种，但普遍分泌的酶系与麻类韧皮胶质成分不能很好的相匹配或酶活不够高，导致脱胶效果不理想。
CN 102965739 A公开了一种苎麻生物脱胶工艺，该工艺是将苎麻剥麻获得的原麻采用青贮的方法进行脱胶，具体包括备料、打捆、青贮、洗麻、晾干、给油等工序。该发明的苎麻生物脱胶工艺利用青贮苎麻上本身附着的微生物将大部分胶质降解，同时青贮密封缺氧的环境，乳酸、乙酸等有机酸逐渐积累，使胶质进一步降解，并抑制了腐败菌的生长，使苎麻不会腐烂，但是该发明青贮时间为15～180天，脱胶周期太长，得到的苎麻纤维产品批次间质量不稳定。CN 101550398 A公开了一株蜡状芽孢杆菌菌株，并且公开了这一菌株的筛选方法，以该蜡状芽孢杆菌为出发菌株，进行种子培养和液体深层发酵，最终制得了高酶活的碱性果胶酶，所述碱性果胶酶活性较高，可用于麻类脱胶和棉织物的精炼工艺品中，可以提高产品品质，降低环境污染，但是其制备工艺复杂，生产成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于麻类微生物脱胶的菌株及其麻类脱胶工艺，以解决现有脱胶工艺中脱胶周期长、工艺复杂、环境污染和成本高的问题。
本发明提供一株可用于麻类微生物脱胶的菌株，该菌株为保藏号CGMCC 14601的植物腐败菌，命名为植物腐败菌PW(Pectobacterium wasabiae IBFC2016)，其于2017年9月08日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。该植物腐败菌PW的生长温度为15～45℃，最适合生长温度约为34℃，生长pH为5.0～8.5，最适pH约为6.8。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种用所述植物腐败菌PW进行麻类脱胶的工艺，包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将植物腐败菌PW菌种进行活化、扩增处理，得到菌悬液；
(2)麻原料的预处理；
(3)循环式浸泡接种：对上述菌悬液进行稀释，然后将不少于2笼麻依次在稀释后的菌悬液中进行浸泡接种，以循环利用菌悬液；
(4)发酵：将接种后的麻类韧皮进行发酵，直至能用水冲洗分散麻类韧皮纤维时停止发酵；
(5)灭活：将发酵后的麻类韧皮进行高温灭活；
(6)洗麻：将灭活后的麻类韧皮进行洗麻处理，洗麻过程中一边碾压一边用高压水冲洗，直至获得纯净的麻纤维。
优选的，所述步骤(1)中菌悬液的制备，通过以下方式实现：
S1.将所述植物腐败菌PW菌种接种到肉汤培养基中进行活化，在34±1℃下震荡或者搅拌培养7～8h，稀释涂布后，在培养平板上生长20～24h，获得典型单菌落；
S2.挑选1个典型单菌落接入装有肉汤培养基的试管中，在34±1℃的温度下静止培养5～8h；
S3.按2％的接种量转接到含无菌肉汤培养基的发酵罐，在34±1℃下以160～180rpm的转速进行搅拌发酵，并向其中通入压缩空气，压缩空气对含无菌肉汤的培养基的流量为0.2～0.3m3/(m3·h)，发酵罐内保持0.3～0.4MPa的压强，培养5～7h，获得菌悬液，根据生产规模，菌悬液可以按该程序和参数进行进一步扩培。
优选的，所述步骤(2)中麻原料的预处理为将麻类韧皮抖松、除杂，按长度将原料扎成0.4kg/把～0.7kg/把的麻把，然后进行悬挂式圆柱形麻笼装笼，装笼密度为400±50kg/笼，麻笼的高径比为1:1，高度不超过2.0m，底座开孔以保证麻笼通气均匀，以麻把基部紧挨着每一层麻的底部为准将麻把弯折后均匀悬挂于麻笼的挂麻钢条上。
优选的，所述步骤(3)中对菌悬液进行稀释，采用35±1℃温水将上述菌悬液进行稀释，菌悬液和温水的比例是1:(40～60)，得到活菌含量在1×107cfu/mL以上的稀菌悬液。
优选的，所述步骤(3)中循环式浸泡接种，通过以下方式实现：准备5笼麻，第1笼麻静止放置于接种锅内，注入稀释后的菌悬液至浸没麻笼，浸泡7～8h，用行车提起沥水3～5min，移入发酵室后；把第2笼麻静止放置于菌悬液中浸泡3～4h，用行车提起沥水3～5min，移入发酵室，随后，依次将装好的第3～5笼麻静止放置于菌悬液中分别浸泡1.5～2h、0.5～1h、20～30min，沥水后移入发酵室，菌悬液不足时，用35℃的温水补充至菌悬液覆盖原料，然后搅拌混匀。
优选的，所述步骤(3)中稀释后的菌悬液中植物腐败菌PW以麻原料为培养基进行进一步繁殖，首次浸泡时，活菌量较低，浸泡7～8h后，活菌量达到5×108cfu/mL以上；接入第2～5笼麻，在麻原料吸附菌液和水分的同时，微生物也同步繁殖，在补充适量温水后，活菌量依然在5×108cfu/mL以上。整个浸泡接种过程时长小于16h，杂菌低于1×106cfu/mL，确保杂菌大量繁殖之前已经完成了整个浸泡过程。
优选的，所述步骤(4)中发酵为湿润发酵，温度为35±1℃，相对湿度85％±5％。
优选的，所述步骤(5)中高温灭活是将麻类韧皮放置于接种锅，加水浸泡，通入蒸汽，温度为90～100℃，保温时间为20～30min。
优选的，所述步骤(6)中洗麻是通过生物脱胶碾压水冲耦合洗麻机组洗涤，获得纯净的麻纤维。
与现有技术相比，本发明方法的优点在于：
(1)本发明植物腐败菌PW可以产生果胶酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶，其酶活高、培养条件粗犷、生长速度快(肉汤培养基，35℃，代时为15min)，本发明脱胶周期短，10h～16h之内能完成苎麻、红麻、黄麻、大麻等麻类作物韧皮生物脱胶。
(2)本发明不需要添加烧碱、浓硫酸，脱胶流程简单、条件温和，污染物处理负荷比化学脱胶降低80％，加工成本降低20％左右。
(3)本发明采用一种新型循环式麻类生物脱胶工艺，一次培养的菌液多次循环使用，提高菌液浓度和使用效率，缩短工艺流程，降低生产成本，减少菌株变异失活风险。
附图说明
图1是本发明的工艺流程。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者通过现有方法制备得到。
实施例1
本发明可用于麻类微生物脱胶的菌株，该菌株为保藏号CGMCC 14601的植物腐败菌，命名为植物腐败菌PW(Pectobacterium wasabiae IBFC2016)，其于2017年9月08日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
植物腐败菌PW的筛选、鉴定方法，包括以下步骤：
(1)采样与处理：取沤麻池污泥样品10g，放置装有适量玻璃珠的锥形瓶中，加入200mL无菌水，180rpm混匀20min，用多层纱布过滤除渣获得悬液；
(2)富集筛选：取10mL悬液、150mL自来水以及15g大麻韧皮混合，置于锥形瓶中，35℃，180rpm震荡发酵至纤维分散；取该发酵液10mL，以及150mL自来水、15g大麻韧皮混合，置于锥形瓶中，35℃，180rpm震荡发酵至纤维分散；取第二次发酵液10mL，以及150mL自来水、15g大麻韧皮混合，置于锥形瓶中，35℃，180rpm震荡发酵至纤维分散；
(3)功能筛查：取第三次发酵液1mL进行稀释涂布，分离获得单菌落。挑选1个单菌落，接入肉汤培养液中培养至浑浊，取3mL菌悬液、150mL自来水以及15g大麻韧皮混合，置于锥形瓶中，35℃，180rpm震荡发酵。筛选出一株发酵10h能完成大麻生物脱胶的菌株，编号PW～IBFC2016；
(4)分类鉴定：提取菌株PW～IBFC2016基因组DNA，通过保守引物27F及1492R扩增16S rDNA序列，经纯化、测序及Blastn比对，结合API试剂盒获取的生理生化特性，鉴定菌株IBFC2016属于Pectobacterium wasabiae。
实施例2
将实施例1得到的植物腐败菌PW进行应用，于2016年12月18～25日，在湖南利尔康生物公司及汉寿紫阳纺织原料有限责任公司分别实施菌悬液制备及苎麻生物脱胶技术，工艺技术路线如图1所示，具体步骤包括：
(1)菌株菌悬液的制备：
将一环斜面保藏植物腐败菌PW接种到肉汤培养基试管中，35℃活化8h，稀释涂布后，在培养平板上生长24h，获得典型单菌落；挑选1个典型单菌落接入装有5mL肉汤培养基的试管中，35℃，静止培养6h；按2％的接种量接种到200mL含无菌肉汤培养基的三角瓶中，35℃，180rpm震荡培养6h；按2％的接种量转接到含无菌肉汤培养基的种子罐，35℃、180rpm，0.4MPa的压缩空气流量0.3m3/m3·h，培养6h，获得10L菌悬液；同等条件下，再通过发酵罐扩培获得120L扩配液备用；
(2)苎麻原料预处理：
将无霉变苎麻韧皮抖松、除杂，按长度将原料扎成0.6kg/把的麻把，然后进行悬挂式圆柱形麻笼装笼(其结构参照专利ZL200810143762.1)。麻笼的高径比为1:1，高度不超过2.0m，额定装料量为450kg/笼，底座开孔以保证麻笼通气均匀，以麻把基部紧挨着每一层麻的底部为准将麻把弯折后均匀悬挂于麻笼的挂麻钢条上；
(3)循环式浸泡接种：
加35℃的温水6000L以及菌悬液120L，混匀制备获得稀菌悬液。准备5笼麻，第一笼麻静止放置于接种锅内，注入稀菌悬液至浸没麻笼，浸泡8h，用行车提起沥水4min，移入发酵室后；把第二笼麻静止放置于稀菌悬液中浸泡4h，用行车提起沥水4min，移入发酵室，随后，依次将装好的第3～5笼麻静止放置于稀菌悬液中分别浸泡2h、1h、20min，沥水后移入发酵室。稀菌悬液不足时，用35℃的温水补充至菌悬液覆盖原料，然后搅拌混匀，循环利用后的稀菌悬液，通入蒸汽，使温度升高至90℃以上，维持30min杀菌，排出废液；
(4)发酵：
将接种后的原料移入温度35℃、相对湿度85％的温室中进行湿润发酵，直至能用水冲洗分散纤维，发酵完成的原料依次运出温室；
(5)灭活：
将发酵后的原料放置于接种锅，加水浸泡，通入蒸汽，90℃维持30min；
(6)洗涤：
用汉寿紫阳纺织原料有限责任公司现有敲麻机敲麻，获得纯净的麻纤维。
实施例3
将实施例1得到的植物腐败菌PW进行应用，于2017年2月16～22日，在中国农业科学院麻类加工酶制剂中试车间实施菌悬液制备及大麻生物脱胶技术，具体步骤包括：
(1)菌株菌悬液的制备：
将一环斜面保藏植物腐败菌PW接种到肉汤培养基试管中，35℃活化8h，稀释涂布后，在培养平板上生长24h，获得典型单菌落；挑选1个典型单菌落接入装有5mL肉汤培养基的试管中，35℃，静止培养6h；按2％的接种量转接到含无菌肉汤培养基的种子罐，35℃、180rpm，0.4MPa的压缩空气流量0.3m3/m3·h，培养6h，获得10L菌悬液；同等条件下，再通过发酵罐扩培获得120L扩配液备用；
(2)大麻原料预处理：
将无霉变大麻韧皮抖松、除杂，按长度将原料扎成0.6kg/把的麻把，然后进行悬挂式圆柱形麻笼装笼(其结构参照专利ZL200810143762.1)。麻笼的高径比为1:1，高度不超过2.0m，额定装料量为400kg/笼，底座开孔以保证麻笼通气均匀，以麻把基部紧挨着每一层麻的底部为准将麻把弯折后均匀悬挂于麻笼的挂麻钢条上；
(3)循环式浸泡接种：
加35℃的温水4800L以及菌悬液120L，混匀制备获得稀菌悬液。准备5笼麻，第一笼麻静止放置于接种锅内，注入稀菌悬液至浸没麻笼，浸泡8h，用行车提起沥水5min，移入发酵室后；把第二笼麻静止放置于稀菌悬液中浸泡4h，用行车提起沥水5min，移入发酵室，随后，依次将装好的第3～5笼麻静止放置于稀菌悬液中分别浸泡2h、1h、20min，沥水后移入发酵室。稀菌悬液不足时，用35℃的温水补充至菌悬液覆盖原料，然后搅拌混匀，循环利用后的稀菌悬液，通入蒸汽，使温度升高至90℃以上，维持30min杀菌，排出废液；
(4)发酵：
将接种后的原料移入温度35℃、相对湿度85％的温室中进行湿润发酵，直至能用水冲洗分散纤维，发酵完成的原料依次运出温室；
(5)灭活：
将发酵后的原料放置于接种锅，加水浸泡，通入蒸汽，95℃维持25min；
(6)洗涤：
通过生物脱胶碾压水冲耦合洗麻机组(参考专利：ZL201220390609.0)洗涤，获得纯净的麻纤维。
实施例4
将实施例1得到的植物腐败菌PW进行应用，于2017年2月22～28日，在中国农业科学院麻类加工酶制剂中试车间实施菌悬液制备及红麻韧皮生物脱胶技术，具体步骤包括：
(1)菌株菌悬液的制备：
将一环斜面保藏植物腐败菌PW接种到肉汤培养基试管中，35℃活化8h，稀释涂布后，在培养平板上生长24h，获得典型单菌落；挑选1个典型单菌落接入装有5mL肉汤培养基的试管中，35℃，静止培养6h；按2％的接种量转接到含200ml无菌肉汤培养基的三角瓶，35℃、180rpm震荡培养6h；同等条件下，再通过发酵罐扩培得到120L菌悬液；
(2)红麻原料预处理：
将无霉变红麻韧皮抖松、除杂，按长度将原料扎成0.5kg/把的麻把，然后进行悬挂式圆柱形麻笼装笼(其结构参照专利ZL200810143762.1)。麻笼的高径比为1:1，高度不超过2.0m，额定装料量为400kg/笼，底座开孔以保证麻笼通气均匀，以麻把基部紧挨着每一层麻的底部为准将麻把弯折后均匀悬挂于麻笼的挂麻钢条上；
(3)循环式浸泡接种：
加35℃的温水7200L以及菌悬液120L，混匀制备获得稀菌悬液。准备5笼麻，第一笼麻静止放置于接种锅内，注入稀菌悬液至浸没麻笼，浸泡8h，用行车提起沥水3min，移入发酵室后；把第二笼麻静止放置于稀菌悬液中浸泡4h，用行车提起沥水3min，移入发酵室，随后，依次将装好的第3～5笼麻静止放置于稀菌悬液中分别浸泡2h、1h、20min，沥水后移入发酵室。稀菌悬液不足时，用35℃的温水补充至菌悬液覆盖原料，然后搅拌混匀，循环利用后的稀菌悬液，通入蒸汽，使温度升高至90℃以上，维持30min杀菌，排出废液；
(4)发酵：
将接种后的原料移入温度35℃、相对湿度85％的温室中进行湿润发酵，直至能用水冲洗分散纤维，发酵完成的原料依次运出温室；
(5)灭活：
将发酵后的原料放置于接种锅，加水浸泡，通入蒸汽，100℃维持20min；
(6)洗涤：
通过适当捶打和高压水洗涤，获得纯净的红麻纤维。
Claims (8)
1.一种用植物腐败菌PW进行麻类脱胶的工艺，包括以下步骤：
(1) 菌悬液的制备：将植物腐败菌（Pectobacterium wasabiae）PW菌种进行活化、扩增处理，得到菌悬液，该植物腐败菌的保藏号为CGMCC No. 14601；
(2) 麻原料的预处理；
(3) 循环式浸泡接种：对上述菌悬液进行稀释，然后将不少于2笼麻依次在稀释后的菌悬液中进行浸泡接种，以循环利用菌悬液；
所述循环式浸泡接种，通过以下方式实现：准备5笼麻，第1笼麻静止放置于接种锅内，注入稀释后的菌悬液至浸没麻笼，浸泡7～8 h，用行车提起沥水3～5min，移入发酵室后；把第2笼麻静止放置于菌悬液中浸泡3～4 h，用行车提起沥水3～5min，移入发酵室，随后，依次将装好的第3～5笼麻静止放置于菌悬液中分别浸泡1.5～2 h、0.5～1 h、20～30 min，沥水后移入发酵室，菌悬液不足时，用35℃的温水补充至菌悬液覆盖原料，然后搅拌混匀；
(4) 发酵：将接种后的麻类韧皮进行发酵，直至能用水冲洗分散麻类韧皮纤维时停止发酵；
(5) 灭活：将发酵后的麻类韧皮进行高温灭活；
(6) 洗麻：将灭活后的麻类韧皮进行洗麻处理，洗麻过程中一边碾压一边用高压水冲洗，直至获得纯净的麻纤维。
2.根据权利要求1所述的用植物腐败菌PW进行麻类脱胶的工艺，所述步骤(1)中菌悬液的制备，通过以下方式实现：
S1. 将所述植物腐败菌PW菌种接种到肉汤培养基中进行活化，在34 ± 1℃下震荡或者搅拌培养7～8 h，稀释涂布后，在培养平板上生长20～24 h，获得典型单菌落；
S2. 挑选1个典型单菌落接入装有肉汤培养基的试管中，在34 ± 1℃的温度下静止培养5～8 h；
S3. 按2%的接种量转接到含无菌肉汤培养基的发酵罐，在34 ± 1℃下以160～180rpm的转速进行搅拌发酵，并向其中通入压缩空气，压缩空气对含无菌肉汤的培养基的流量为0.2～0.3 m3/(m3·h)，发酵罐内保持0.3～0.4 MPa的压强，培养5～7 h，获得菌悬液，根据生产规模，菌悬液可以按该程序和参数进行进一步扩培。
3.根据权利要求1所述的用植物腐败菌PW进行麻类脱胶的工艺，所述步骤(2)中麻原料的预处理为将麻类韧皮抖松、除杂，按长度将原料扎成0.4 kg/把～0.7 kg/把的麻把，然后进行悬挂式圆柱形麻笼装笼，装笼密度为400 ± 50 kg/笼，麻笼的高径比为1:1，高度不超过2.0 m，底座开孔以保证麻笼通气均匀，以麻把基部紧挨着每一层麻的底部为准将麻把弯折后均匀悬挂于麻笼的挂麻钢条上。
4.根据权利要求1所述的用植物腐败菌PW进行麻类脱胶的工艺，所述步骤(3)中对菌悬液进行稀释，采用35 ± 1℃温水将上述菌悬液进行稀释，菌悬液和温水的比例是1:(40～60)，得到活菌含量在1×107 cfu/mL以上的稀菌悬液。
5.根据权利要求1所述的用植物腐败菌PW进行麻类脱胶的工艺，所述步骤(3)中稀释后的菌悬液中植物腐败菌PW以麻原料为培养基进行进一步繁殖，首次浸泡时，活菌量较低，浸泡7～8 h后，活菌量达到5×108 cfu/mL以上；接入第2～5笼麻，在麻原料吸附菌液和水分的同时，微生物也同步繁殖，在补充适量温水后，活菌量依然在5×108 cfu/mL以上。
6.根据权利要求1所述的用植物腐败菌PW进行麻类脱胶的工艺，所述步骤(4)中发酵为湿润发酵，温度为35 ± 1℃，相对湿度85% ± 5%。
7.根据权利要求1所述的用植物腐败菌PW进行麻类脱胶的工艺，所述步骤(5)中灭活是将麻类韧皮放置于接种锅，加水浸泡，通入蒸汽，温度为90～100℃，保温时间为20～30min。
8.根据权利要求1所述的用植物腐败菌PW进行麻类脱胶的工艺，所述步骤(6)中洗麻是通过生物脱胶碾压水冲耦合洗麻机组洗涤，获得纯净的麻纤维。
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