CN107889507A - 改进的人视网膜色素（rpe）细胞和感光祖细胞的效能测定 - Google Patents

改进的人视网膜色素（rpe）细胞和感光祖细胞的效能测定 Download PDF

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Abstract

本公开提供新的吞噬测定来测试RPE细胞和感光祖细胞的功能，该测定使用对pH敏感的荧光标记。

Description

改进的人视网膜色素(RPE)细胞和感光祖细胞的效能测定
相关申请
本申请要求按照35U.S.C.§119(e)于2015年3月23日递交的题为“改进的人视网膜色素细胞和感光祖细胞的效能测定”的美国临时申请系列号62/136,660的权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及基于细胞的体外方法用于测量感光视杆细胞外节的吞噬的用途。
背景
视网膜色素上皮细胞(RPE)是下面的脉络膜(视网膜后面的血管层)和上面的视网膜视觉细胞(例如感光细胞——视杆细胞和视锥细胞)之间的感觉神经视网膜外的色素化细胞层。RPE对于感光细胞和视网膜的功能和健康至关重要。RPE通过回收感光色素，传递、代谢和储存维生素A，吞噬感光视杆细胞外节，在视网膜和脉络膜之间运输铁和小分子，维持布鲁赫膜和吸收杂散光以允许更好的图像分辨率来保持感光细胞功能。参见例如WO2009/051671；Engelmann and Valtink(2004)“RPE Cell Cultivation.”Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 242(1):65–67；IrinaKlimanskaya,Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells,于Stem Cell Anthology 335–346(Bruce Carlson ed.,2009)。
RPE变性能够导致视网膜脱离，视网膜不典型增生或视网膜萎缩，这与导致感光细胞损伤和失明的许多改变视力的疾病有关，如脉络膜血症，糖尿病性视网膜病，黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性，AMD)和眼底黄斑营养不良(Stargardt’s macular dystrophy，SMD)，后两者分别是世界上成人和青少年失明的两个主要原因。虽然两者目前无法治疗，但在黄斑变性的临床前模型中有证据表明移植hESC衍生的RPE可挽救感光细胞并阻止视力丧失(Lund RD,Wang S,Klimanskaya I,et al.Human embryonic stem cell-derived cellsrescue visual function in dystrophic rats.Cloning and Stem Cells 2006；8,189-199；Lu B,Malcuit C,Wang S,et al.Long-term safety and function of RPE fromhuman embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration.StemCells 2009；21,2125-2135)。
还促进上述一些疾病是有丝分裂后神经元细胞的额外损失。这些视网膜疾病包括视杆细胞或视锥细胞营养不良，视网膜变性，视网膜色素变性(RP)，糖尿病性视网膜病变，黄斑变性，莱伯先天性黑内障和眼底黄斑症(Stargardt disease)。在大多数视网膜变性的病例中，细胞丢失主要在包括视杆细胞和视锥细胞感光细胞的外核层(ONL)中。
感光细胞的潜在替代来源包括干细胞。早期研究评估了小鼠细胞，小鼠干细胞或异质视网膜祖细胞群作为失去感光细胞的替代细胞的可能来源。这些早期研究描述了从出生后第1天的小鼠视网膜移植感光祖细胞(Maclaren et al.Nature 444(9):203-207,2006)，从小鼠胚胎干细胞体外产生视网膜祖细胞(Ikeda et al.Proc.Natl.Acad.Sci.102(32):11331-11336,2005)，从出生后第1天的小鼠视网膜产生视网膜祖细胞(Klassen etal.Invest.Ophthal.Vis.Sci.45(11):4167-4175,2004)，将骨髓间充质干细胞植入视网膜变性的RCS大鼠模型(Inoue et al.Exp.Eye Res.8(2):234-241,2007)，从H1人胚胎干细胞系产生视网膜祖细胞，包括神经节细胞，无长突细胞，其中总细胞的0.01％表达S-视蛋白或视紫红质的感光细胞，双极细胞和水平细胞(Lamba et al.Proc.Natl.Acad.Sci.10(34):12769-12774,2006)，并且从人成纤维细胞诱导诱导性多能干细胞(iPS)以产生视网膜祖细胞(Lamba et al.PLoS ONE 5(1):e8763.doi:10.1371/journal.pone.0008763)。这些方法都没有产生用于植入的均质感光祖细胞或感光细胞群。这些方法都没有产生显示出体内视杆细胞或视锥细胞功能(例如，通过赋予视敏度改善能够检测)的均质感光祖细胞或感光细胞群。感光细胞和感光祖细胞可能从其中分离的供体衍生组织(例如尸体、胎儿组织和活体动物)的供应受到限制。干细胞可以体外无限增殖和扩增，为人治疗提供了非供体来源细胞的潜在来源。将干细胞分化成均质感光祖细胞或感光细胞群可以提供用于植入和治疗视网膜疾病的非供体衍生细胞的大量供应。感光祖细胞可具有吞噬活性。
在共同拥有的2010年11月17日提交的美国专利申请序列号13/510,426和PCTUS2012/65091中公开了某些主题，包括制备RPE细胞的方法，RPE细胞的组合物，以及针对RPE细胞的释放测定(包括吞噬测定)，这样的教导通过引用结合于此。共同拥有的PCTUS2014/029790中公开了某些主题，包括制造感光祖细胞的方法，以及感光祖细胞的组合物和测试功能的方法(包括吞噬测定)，这样的教导通过引用结合于此。
概述
已经使用FITC标记的感光细胞外节(OS)(通常是牛或猪)来研究视网膜色素上皮(RPE)在体外的吞噬。然而，用于吞噬评估的大多数定量方法(FACS，荧光酶标仪)不区分表面结合的和内化的颗粒，因此不能专门解释涉及表面受体结合和内化吞噬阶段的机制。此外，FITC荧光对pH敏感，并且FITC荧光在pH低于6时显著降低，而溶酶体和与溶酶体融合的吞噬体的pH低于5。因此，FITC标记的OS的荧光可能不能真正代表内化OS的量。
本文提供了用于检测感光细胞外节的内化吞噬的更灵敏和准确的测定，这是RPE细胞和感光祖细胞功能的重要量度，因此是用于治疗视网膜疾病的RPE细胞和感光祖细胞的重要发布标准，视网膜疾病如视锥细胞或视杆细胞营养不良，视网膜变性，视网膜色素变性，脉络膜血症，糖尿病性视网膜病，黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性和近视性黄斑变性)，莱伯先天性黑内障和眼底黄斑症(fundus flavimaculatus)。参见例如WO 2009/051671。
本文所述的RPE细胞在移植后起作用。为此，RPE细胞在接受移植细胞的受试者(或患者)中的感觉神经视网膜和脉络膜之间形成单层。RPE细胞还可以向邻近的感光细胞提供营养，并通过吞噬处理脱落的感光细胞外节。
可以基于许多功能和/或表型特征(包括但不限于吞噬活性)来选择适于移植的RPE细胞。例如，可根据其吞噬活性以及其增殖效能评估适于移植的RPE细胞。例如，RPE细胞可具有比来自眼供体的细胞更大的增殖效能(例如，RPE细胞比眼供体的“年轻”)。这使得本文描述的RPE细胞比来自眼供体的细胞具有更长的有用寿命。
RPE细胞效能在临床背景中的一个关键参数是RPE细胞药物制剂的外节吞噬活性的定量测量。外节的吞噬导致被吞噬的细胞片段积累在RPE细胞的低pH隔室中。本发明提供了已经与能够以分光光度法检测的可检测标志物结合(即共价或非共价结合)以提供分光光度信号的感光细胞外节，所述可检测标志物选择性地在存在于中性pH或生理pH，即7-7.5的pH时具有第一分光光度信号，并且当存在于细胞内隔室的低pH环境例如溶酶体、吞噬体、内吞体等中时具有第二分光光度信号。第一分光光度信号和第二分光光度信号之间的差异可以是荧光发射的程度(相对于中性pH在低pH下增加的强度)，中性与低pH之间的荧光发射波长的改变，中性和低pH值之间的荧光激发波长的改变等等中的一种或多种。
在某些实施方案中，可检测标志物可以是荧光pH传感器，例如荧光染料。可用于本发明的示例性荧光染料可以是具有作为对pH敏感的指示剂部分的氨基(脂肪族或芳香族)的荧光染料部分，所述氨基即在培养基的pH下未质子化的胺，其中将RPE细胞和外节一起孵育(即中性pH或生理pH)，并在细胞内隔室的pH下质子化，外节通过吞噬被细胞如RPE细胞吸收进入细胞内隔室中。当这样的染料吸附光子，产生激发的电子状态时，氨基的非共享电子对的电子转移到被激发所空出的轨道上。称为光致电子转移(PET)的这种电子转移阻止激发的分子免于发射转变，因此染料的荧光被淬灭。氨基的质子化改变了电子对的轨道的性质和能量，并终止了PET。结果，荧光报道分子部分响应于pH的改变。因为氨基的质子化消除了淬灭，所以基于PET的传感器变成随着pH降低而发出更强的荧光。
在某些实施方案中，荧光染料是基于罗丹明的对pH敏感的染料，如WO 2005/098437中所述。这些染料具有通过-OH或-SH(或其去质子化形式)而被邻位取代成呫吨部分的苯环。这些染料表现出类似于胺PET指示剂的pH-依赖性，但基于对pH传感器的感知需要，其被设计为具有小于6的pKa值，所述pH传感器将靶向pH小于6的细胞隔室。
在另一个示例性实施方案中，荧光标志物是对pH敏感的荧光纳米颗粒。对pH敏感的荧光纳米颗粒主要使用与小分子对pH敏感的染料缀合的聚合物(Srikun,D.,J.Chem.Sci.2011,2,1156；Benjaminsen,R.V.,ACS Nano 2011,5,5864；Albertazzi,L.,J.Am.Chem.Soc.2010,132,18158；Urano,Y.,Nat.Med.2009,15,104)或使用对pH敏感的接头来缀合对pH不敏感的染料(Li,C,Adv.Fund.Mater.2010,20,2222；Almutairi,J.Am.Chem.Soc.2007,130,444)。为了进一步说明，WO 2013152059描述了可调节成适用于本测定中的pH可调、可高度活化的多色荧光纳米平台。
因此，本文在一个方面中提供了用于评估吞噬活性的方法，其包括将细胞与感光细胞外节(POS)孵育足以使细胞吞噬POS的时间和温度，其中POS在酸性pH下比在更高pH下发出更强的荧光，并检测孵育后细胞的荧光强度，其中与对照相比荧光增加指示细胞对POS的吞噬。
在一些实施方案中，细胞与POS在约室温至约37℃或约室温至约40℃的温度范围下孵育。在一些实施方案中，细胞与POS在约室温、约生理温度或约37℃下孵育。
在一些实施方案中，对照是与POS在低于室温下孵育的细胞。在一些实施方案中，对照是与POS在4℃下孵育的细胞。
本文还提供了用于评估贴壁细胞群中的吞噬活性的方法，其包括将贴壁细胞群与感光细胞外节(POS)孵育足以使细胞群中的细胞吞噬POS的时间和温度，其中POS在酸性pH下比在更高pH下发出更强的荧光，并且检测孵育后细胞群的荧光强度，其中与对照相比荧光的增加指示细胞对POS的吞噬。
在一些实施方案中，贴壁细胞群与POS在约17-40℃、或约25-40℃，或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育。在一些实施方案中，对照是与POS在约10-16℃的温度下孵育的细胞群。在一些实施方案中，对照是与POS在约12-15℃的温度下孵育的细胞群。
本文还提供了用于评估吞噬活性的方法，包括提供用荧光标记标记的感光细胞外节(POS)，当通过吞噬内化进入细胞的低pH隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号；将测试细胞与标记的POS在允许吞噬标记的POS的条件下孵育；并检测与标记的POS孵育后测试细胞中改变的荧光(如果有的话)，并由此定量测试细胞的吞噬活性。
在一些实施方案中，改变的荧光信号(当标记通过吞噬内化进入低pH隔室时)是荧光信号相对于当荧光标记细胞外存在时的强度增加。在一些实施方案中，通过流式细胞术能够检测改变的荧光信号(当标记通过吞噬内化进入低pH隔室时)。在一些实施方案中，改变的荧光信号将通过吞噬内化的标记的POS和结合在测试细胞表面但未内化的标记的POS区分开。在一些实施方案中，将在测试细胞中检测到的改变的荧光信号与用标记的POS孵育的对照细胞群进行比较以定量测试细胞的吞噬活性。
在一些实施方案中，测试细胞与标记的POS在约室温、约生理温度、约37℃、约15-40℃、或者室温至37℃、或者室温至40℃孵育。
在一些实施方案中，对照细胞群与标记的POS在低于室温(包括约4℃)下孵育。
还提供了用于评估吞噬活性的方法，包括提供用荧光标记标记的感光细胞外节(POS)，当通过吞噬内化进入细胞的低pH隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号；将贴壁的测试细胞与标记的POS在允许吞噬标记的POS的条件下孵育；并检测与标记的POS孵育后贴壁测试细胞中改变的荧光(如果有的话)，并由此定量贴壁测试细胞的吞噬活性。
在一些实施方案中，将测试细胞与POS在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将在贴壁测试细胞中检测到的改变的荧光信号与在保持细胞活力但仍然诱导低吞噬或不吞噬的温度下与标记的POS孵育的对照细胞群进行比较，任选地，这样的温度范围可以为从约12-15℃，以定量测试细胞的吞噬活性。在一些实施方案中，对照细胞群与POS在约10-16℃的温度下孵育。
本文还提供了用于评估测试细胞群的吞噬活性的标记的感光细胞外节(POS)制剂，所述POS用荧光标记标记，当通过吞噬内化进入细胞的低pH隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号。在一些实施方案中，改变的荧光信号(当标记通过吞噬内化进入低pH隔室时)是荧光信号相对于当荧光标记细胞外存在时的强度增加。在一些实施方案中，通过流式细胞术能够检测改变的荧光信号(当标记通过吞噬内化进入低pH隔室时)。在一些实施方案中，荧光标记是Red。在一些实施方案中，POS用Red和Red E.coli BioParticles标记。
本文还提供用于测量细胞群中的吞噬活性的方法，其包括测量与非FITC荧光标记的感光细胞外节(POS)接触的测试细胞群中的测试荧光，并将测量的测试荧光与对照荧光进行比较，其中非FITC荧光标记的POS在酸性pH下发荧光但在较高pH下不发荧光或发出最低限度的荧光。
在一些实施方案中，测试细胞群与非FITC荧光标记的POS在约室温至约生理温度包括例如约37℃(即约室温至约37℃)或约室温至约40℃的温度范围下接触。在一些实施方案中，使测试细胞群与非FITC荧光标记的POS在约15-40℃或约生理温度(包括例如约37℃)的温度下接触。在一些实施方案中，对照荧光是与非FITC荧光标记的POS在低于室温下接触的细胞群的荧光。在一些实施方案中，对照荧光是与非FITC荧光标记的POS在4℃下接触的细胞群的荧光。
本文还提供了用于测量贴壁细胞群中的吞噬活性的方法，包括测量与非FITC荧光标记的感光细胞外节(POS)接触的贴壁测试细胞群中的测试荧光，并将测量的测试荧光与对照荧光进行比较，其中所述非FITC荧光标记的POS在酸性pH下发荧光但在较高pH下不发荧光或发出最低限度的荧光。
在一些实施方案中，降测试细胞群与非FITC荧光标记的POS在约17-40℃、约25-40℃、约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下接触。
在一些实施方案中，对照荧光是与非FITC荧光标记的POS在约12-15℃的温度下接触的贴壁细胞群的荧光。在一些实施方案中，对照荧光是与非FITC荧光标记的POS在约10-16℃的温度下接触的贴壁细胞群的荧光。
本文还提供了用于测量吞噬活性的方法，其包括(1)测量与用Red染料标记的荧光标记的感光细胞外节(POS)在约室温至约生理温度包括例如约37℃、或约室温至约40℃的温度范围下孵育的细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和(2)测量与用Red染料标记的荧光标记的POS在低于室温下孵育的细胞群的第二等分试样中的对照荧光，其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
本文还提供用于测量吞噬活性的方法，其包括(1)测量与用Red染料标记的荧光标记的感光细胞外节(POS)孵育的贴壁细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和(2)测量与用Red染料标记的荧光标记的POS孵育的贴壁细胞群的第二等分试样中的对照荧光，其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
在一些实施方案中，贴壁细胞群的第一等分试样与标记的POS在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育。在一些实施方案中，贴壁细胞群的第二等分试样与标记的POS在约10-16℃或12-15℃的温度范围下孵育。
本文还提供了用于测量吞噬活性的方法，其包括(1)测量与仅用Red标记的感光细胞外节(POS)或用Red和Red E.coli BioParticles标记的感光细胞外节(POS)在约室温至约生理温度包括37℃、或约室温至约40℃的温度范围下孵育的细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和(2)测量与仅用Red标记的感光细胞外节(POS)或用Red和Red E.coli BioParticles标记的感光细胞外节(POS)在低于室温包括4℃下孵育的细胞群的第二等分试样中的对照荧光，其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
本文还提供用于测量吞噬活性的方法，其包括(1)测量与仅用Red标记的感光细胞外节(POS)或用Red和Red E.coli BioParticles标记的感光细胞外节(POS)在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育的贴壁细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和(2)测量与仅用Red标记的感光细胞外节(POS)或用Red和Red E.coliBioParticles标记的感光细胞外节(POS)在约10-16℃或约12-15℃的温度范围下孵育的贴壁细胞群的第二等分试样中的对照荧光，其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
各种实施方案同样适用于上述任何和所有方面。这些在下面叙述。
在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群与POS在约室温、在约生理温度、或约37℃、或约室温至约40℃、或约室温至约37℃、或约15-40℃下孵育。在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群与标记的POS在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下或在约37℃的温度下孵育。
在一些实施方案中，将对照细胞、对照细胞群、对照测试细胞或对照测试细胞群与POS在低于室温的温度、约10-16℃或约12-15℃的温度范围或约4℃的温度下孵育。
在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群包含视网膜色素上皮(RPE)细胞。在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群包含感光祖细胞。在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群是人细胞。
在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群是通过多能干细胞的体外分化产生的。
在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群是冷冻保存和在使用之前解冻的。
在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群作为汇合的单层提供。
在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群在使用前被酶消化。
在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群作为贴壁细胞群提供。
在一些实施方案中，POS是破碎的POS。在一些实施方案中，POS是超声波化的POS。
在一些实施方案中，荧光标记是Red。因此，在一些实施方案中，POS用Red染料标记。在一些实施方案中，POS用Red和RedE.coli BioParticles标记。在一些实施方案中，将细胞与Red标记的POS和Red E.coli BioParticles孵育。
在一些实施方案中，通过流式细胞术检测荧光。在一些实施方案中，使用酶标仪检测荧光。
在一些实施方案中，将细胞与POS孵育约15-30小时，或16-20小时，或20-28小时。
在一些实施方案中，细胞作为细胞培养物提供。在一些实施方案中，细胞是汇合的细胞培养物。
应该理解，测试和对照细胞可以是相同细胞群的不同等分试样。
在另一方面，本公开提供了分离的细胞群，其特征在于其感光细胞外节(POS)的吞噬率比相等数量的原代细胞的POS的吞噬率高至少50％。在一些实施方案中，细胞群是RPE细胞群。在一些实施方案中，细胞群是通过多能干细胞的体外分化而获得的RPE细胞群，而原代细胞是来自分离的成年眼的RPE细胞。在一些实施方案中，细胞群是感光祖细胞。
这些和各种其他方面和实施方案将在本文中更详细地描述。
附图简要说明
图1A-C.RPE吞噬的FACS分析。(A)FITC标记的ROS。(B)标记的ROS。显示的是未加入ROS的对照、加入ROS并在4℃下孵育细胞的对照和加入ROS并在37℃下孵育细胞的测试的曲线。(C)标记的BioParticles(细菌片段)。显示的是未加入颗粒的对照组、加入颗粒并在4℃下孵育细胞的对照组和加入颗粒并在37℃孵育细胞的测试的曲线。应该理解，POS和ROS在本文中可互换地用来指感光视杆细胞外节。
图2A-B.FITC(A)和(B)标记的ROS的荧光的pH依赖性。绘制的是在中性pH和酸性pH下的荧光。
图3A-F.单层ARPE19细胞吞噬荧光标记的ROS的FACS分析。当不同浓度的荧光标记的ROS与ARPE-19在细胞单层中孵育24小时时，没有观察到剂量依赖性的吞噬反应。(A)用6×106 Red标记的ROS在37℃孵育的ARPE-19。(B)用3×106 Red标记的ROS在37℃孵育的ARPE-19。(C)用1.5×106 Red标记的ROS在37℃孵育的ARPE-19。(D)用6×106 Red标记的ROS在15℃孵育的ARPE-19。(E)用3×106 Red标记的ROS在15℃孵育的ARPE-19。(F)用1.5×106 Red标记的ROS在15℃孵育的ARPE-19。在每个图中，显示的是没有用ROS孵育的细胞和用ROS孵育的细胞的曲线。
图4A-F.hESC衍生的RPE细胞吞噬荧光标记的ROS的FACS分析。当不同浓度的荧光标记的ROS与RPE在细胞单层中在37℃孵育24小时时，没有观察到剂量依赖性的吞噬反应。在重构过程中荧光标记的ROS的脉冲超声处理使吞噬增加约10％。(A)用没有超声处理重构的3.75×106 Red标记的ROS孵育的RPE细胞。(B)用没有超声处理重构的5×106 Red标记的ROS孵育的RPE细胞。(C)用没有超声处理重构的7.5×106 Red标记的ROS孵育的RPE细胞。(D)用没有超声处理重构的10×106 Red标记的ROS孵育的RPE细胞。(E)用超声处理重构的10×106 Red标记的ROS孵育的RPE细胞。(F)用超声处理重构的13.5×106 Red标记的ROS孵育的RPE细胞。
详述
可以通过对暴露于用Red染料(Life Technologies，MolecularProbes)标记的感光细胞外节(POS)的RPE培养物的定量荧光激活细胞分选(FACS)分析来评估吞噬(效能测定)。
可以通过使用用Red染料(Life Technologies，Molecular Probes)标记的POS的基于FACS的测定来评估吞噬。当内化于细胞内吞噬体的降低的pH环境中时，如此标记的染料和POS发荧光。POS可以如本文所述进行标记。
在一些实施方案中，RPE细胞培养物是汇合的。例如，汇合的RPE可以在多孔板中培养，并且可以与用Red染料标记的POS孵育，任选地在不依赖于CO2的培养基(Invitrogen)的存在下孵育。可以孵育足以使RPE细胞吞噬POS的任意时间。例如，可以孵育16-20小时。在足以使RPE细胞吞噬POS的温度下进行测定。在一些实施方案中，在约生理温度或约37℃下进行测定。在一些实施方案中，在室温下进行测定。在一些实施方案中，在4℃孵育对照(或阴性对照)板。可以在显微镜下检查细胞，使用酶标仪测量荧光，和/或可以在酶消化(例如胰蛋白酶消化)后收获细胞并通过流式细胞术分析。
示例性、非限制性的测定如下：
测试如前所述由多能干细胞(例如但不限于ES细胞和iPS细胞)制备的RPE的吞噬能力。冷冻保存的RPE可以是先前冷冻和在使用之前解冻的。将RPE细胞接种于合适培养基中的培养物中并培养至汇合并保持在培养物中，然后测试其吞噬经Red染料标记的POS的能力，所述染料在内化于RPE细胞的吞噬体的酸性环境中时发荧光。将RPE细胞与标记的POS在37℃孵育以允许吞噬，或在4℃孵育作为阴性对照。可以通过流式细胞术检测在37℃孵育的细胞荧光强度的偏移，表明吞噬了标记的POS。峰的统计积分产生每批RPE细胞和孵育温度的吞噬阳性细胞的百分比。
如通过本公开将理解的，通过将RPE细胞与在酸性吞噬体环境中以红色光谱发荧光的标记的POS孵育来检测吞噬。如通过流式细胞术检测的，在37℃或在4℃(阴性对照)孵育的细胞可以显示吞噬阳性细胞的百分比。
根据本文提供的方法，可以基于其吞噬活性来表征所得的RPE细胞群。可以确定吞噬率，并且如此表征RPE细胞。例如，RPE细胞可以表征为POS的吞噬率比相等数量来自分离的成年眼的RPE细胞的感光细胞外节(POS)的吞噬率高至少50％，或者比相等数量来自分离的成年眼的RPE细胞的感光细胞外节(POS)的吞噬率高至少75％、100％、150％或200％。可选地或另外地，RPE细胞可以表征为感光细胞外节(POS)的吞噬率为24小时后POS总浓度的至少20％，或者为24小时后POS总浓度的至少25％、30％、25％、40％或50％。
因此，使用本文所述的方法，已经获得RPE细胞群，其感光细胞外节(POS)的吞噬率比相等数量分离自成年(即25-80岁的成年人，更优选50-80岁的成年人)眼的RPE细胞的POS的吞噬率高至少50％，更优选高至少75％、100％、150％或甚至200％。
使用本文所述的方法，已经获得RPE细胞群，其感光细胞外节(POS)的吞噬率是24小时后POS总浓度的至少20％，更优选24小时后POS总浓度的至少25％、30％、25％、40％或甚至50％。
因此，本公开在一个方面中提供了一种方法，其包括检测或测量与非FITC荧光标记的荧光标记的感光细胞外节(POS)接触的RPE细胞(或RPE细胞群)中的荧光(被认为是测试荧光，或通常是“测试”))并将检测或测量的荧光与对照(被认为是对照荧光或通常是“对照”)进行比较。测试可以在约室温、或约15-40℃的温度下、或在约生理温度(例如约37℃)的温度下进行。对照可以在约4℃进行。因此，对照荧光可以是与非FITC标记的POS在4℃孵育RPE细胞之后检测或测量的荧光。非FITC荧光标记的POS是用不是FITC的荧光团标记的POS。非FITC荧光标记是在酸性pH例如吞噬体的pH下发荧光的标记物，特别是RPE细胞的吞噬体，但其在较高pH例如中性pH(或细胞外环境pH)下不发荧光或发出最低限度的荧光。非FITC荧光标记可用于区分表面标记和内化标记。这样的荧光团的实例是Red染料(Life Technologies，Molecular Probes)。测试中更高程度的吞噬由与对照相比更强的荧光指示。
因此，在另一方面，本公开提供了一种方法，包括：
(1)检测或测量与用Red染料标记的荧光标记的感光细胞外节(POS)在37℃下接触(并与其孵育)的RPE细胞(或RPE细胞群)的第一等分试样中的荧光(被认为是测试荧光，或通常是“测试”)，和
(2)检测或测量与用Red染料标记的荧光标记的感光细胞外节(POS)在4℃下接触(并与其孵育)的RPE细胞(或RPE细胞群)的第二等分试样中的荧光(被认为是对照荧光，或通常是“对照”)，和
(3)任选地比较、确定和/或定量测试和对照荧光，其中比对照荧光更强的测试荧光指示RPE细胞(或细胞群)的吞噬活性。
应该理解，本文所述的方法也可以用于测定感光祖(或前体)细胞中的吞噬活性。
在某些实施方案中，RPE和感光祖细胞具有吞噬活性，诸如吞噬分离的Red感光细胞外节、Red E.coli BioParticles或两者的能力，并且本文提供的方法测定这些功能中的一个或多个。
在一方面，本公开提供用于确定药物组合物的效能的测定，所述药物组合物包含：多个视网膜色素上皮(RPE)细胞或感光祖细胞；和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述多个RPE细胞的平均黑色素含量小于8pg/细胞。所述RPE细胞或感光祖细胞可以包含在悬浮液、凝胶、胶体、基质、底物、支架或移植物中。
所述药学上可接受的载体可以包含渗透压为约290mOsm/kg至约320mOsm/kg、或在约300mOsm/kg至310mOsm/kg或约305mOsm/kg的无菌溶液。所述药学上可接受的载体可以包含平衡盐溶液。所述平衡盐溶液可以在每mL水中包含氯化钠7.14mg，氯化钾0.38mg，氯化钙二水合物0.154mg，氯化镁六水合物0.2mg，磷酸氢二钠0.42mg，碳酸氢钠2.1mg，右旋糖0.92mg，谷胱甘肽二硫化物(氧化型谷胱甘肽)0.184mg和盐酸和/或氢氧化钠(将pH调节至约7.4)或由其组成或基本上由其组成。
所述药物组合物的体积可以为约100μL至1000μL，或者可以是至少约150μL。所述药物组合物可以包含约1,000至约1×109个活RPE细胞。所述药物组合物可包含约333个活RPE细胞/μL至约2,000个活RPE细胞/μL，约444个活RPE细胞/μL至约1766个活RPE细胞/μL之间，约333个活RPE细胞/μL，约444个活RPE细胞/μL，约666个活RPE细胞/μL，约888个活RPE细胞/μL，约999个活RPE细胞/μL或约1,333个活RPE细胞/μL。
所述药物组合物中RPE细胞的浓度可以足够高，使得在60分钟内不超过约30％的所述RPE细胞丧失活力，并且任选地在4小时内不超过约10％的所述RPE细胞丧失活力。所述RPE细胞的浓度可以是至少约1,000个细胞/μL，至少约2,000个细胞/μL，约1,000-10,000个细胞/μL，或约2,000-5,000个细胞/μL。
药物制剂可以包含少于约25％，20％，15％，10％，5％，1％，0.5％，0.1％，0.01％，0.001％或0.0001％的可能不是RPE细胞的细胞。
所述RPE细胞的平均黑色素含量可以小于8pg/细胞，小于7pg/细胞，小于6pg/细胞，小于5pg/细胞，小于4pg/细胞，小于3pg/细胞，细胞，小于2pg/细胞和至少0.1pg/细胞和任选地至少0.5pg/细胞或1pg/细胞；0.1-8pg/细胞，0.1-7pg/细胞，0.1-6pg/细胞，0.1-5pg/细胞，0.1-4pg/细胞，0.1-3pg/细胞，0.1-2pg/细胞，0.1-1pg/细胞，1-7pg/细胞，0.5-6pg/细胞，或1-5pg/细胞。
所述药物组合物中至少50％，至少60％，至少70％，或至少80％的细胞可以是卵黄状黄斑病蛋白+(bestrophin+)。所述药物组合物中至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％的细胞可以是PAX6+和/或MITF+。所述药物组合物中至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％的细胞可以是PAX6+和/或卵黄状黄斑病蛋白+。所述药物组合物中至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％的细胞可以是ZO-1+。药物组合物中至少50％，至少60％，或至少70％的细胞可以是PAX6+和卵黄状黄斑病蛋白+。所述药物组合物中至少90％，至少95％，或至少99％的细胞可以是PAX6+。
在示例性实施方案中，所述药物组合物中每100万个细胞不超过约一个细胞和任选每900万个细胞不超过两个细胞可以对于OCT-4和碱性磷酸酶(AP)表达都是阳性的。
针或注射插管可以包含至少一部分所述RPE细胞。加载到所述针或注射插管中时，所述RPE细胞的浓度可以为约444个活细胞/μL至约1766个活细胞/μL。从所述针头或注射插管递送的活RPE细胞的浓度可以为约333个活细胞/μL至约1,333个活细胞/μL。所述针或注射插管的直径可以为约0.3mm至约0.9。所述针或注射插管的直径可以为约0.5至约0.6mm。所述针或注射插管可以包括直径为约0.09mm至约0.15mm的尖端。所述插管可以是MEDONECannula25/38g(0.50mm(25g)×28mm插管，其具有0.12mm(38g)×5mm的尖端)或Synergetics Angled 39g Injection Cannula。
所述RPE细胞可以包含已被冷冻保存并解冻的RPE细胞。
所述RPE细胞可以是人的。
所述RPE细胞如人RPE细胞可以从包括多能细胞如胚胎干细胞或诱导的多能干细胞以及供体成人或胎儿组织的任何来源产生。所述多能干细胞可以对一种或多种标志物的表达呈阳性，所述标志物可以包含OCT-4，碱性磷酸酶，Sox2，TDGF-1，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和/或TRA-1-81。所述多能细胞可以是人多能细胞，其可以在多层群或类胚体中培养足以使色素上皮细胞出现在所述培养物中的时间。所述足以使色素上皮细胞出现在所述培养物中的时间可包括至少约1周，至少约2周，至少约3周，至少约4周，至少约5周，至少约6周，或至少约7周，至少约8周。所述多层群或拟胚体可以在可以包含DMEM的培养基中培养。所述培养基可以包含EB-DM，基本上由其组成，或由其组成。所述色素上皮细胞可以是分离的和培养的，从而产生RPE细胞群。所述分离可以包括酶解、化学或物理上从培养物解离细胞或细胞团，并且选择色素上皮细胞或细胞团可以包含色素上皮细胞。所述拟胚体可以悬浮培养和/或作为贴壁培养物(例如悬浮培养，然后贴壁培养)。所述作为贴壁培养物培养的拟胚体可以产生包含色素上皮细胞的一种或多种突起(outgrowth)。所述多能干细胞具有降低的HLA抗原复杂性。在RPE形成之前，可将所述多能细胞培养在可选自层粘连蛋白，纤连蛋白，玻连蛋白，蛋白聚糖，巢蛋白，胶原蛋白，胶原蛋白I，胶原蛋白IV，胶原蛋白VIII，硫酸乙酰肝素，Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂)，CellStart，人基底膜提取物及其任何组合的基质上。所述基质可以包含Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂)。
药物组合物可以包含缺乏一种或多种胚胎干细胞标志物的实质表达的细胞。所述一种或多种胚胎干细胞标志物可包含OCT-4，NANOG，Rex-1，碱性磷酸酶，Sox2，TDGF-1，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和/或TRA-1-81。
所述RPE细胞可以对一种或多种RPE细胞标志物的表达呈阳性。所述一种或多种RPE细胞标志物可以包含RPE65，CRALBP，PEDF，卵黄状黄斑病蛋白，MITF，Otx2，PAX2，PAX6，ZO-1和/或酪氨酸酶。
所述RPE细胞可以通过以下方法产生，所述方法包括将RPE细胞作为静止细胞维持足以获得所述平均黑色素含量的时间。所述RPE细胞可以通过以下方法产生，所述方法包括使RPE细胞作为静止细胞维持足以在至少50％的所述RPE细胞中产生卵黄状黄斑病蛋白表达的时间。
所述药物组合物可以基本上不含小鼠胚胎饲养细胞(MEF)和人胚胎干细胞(hES)。
RPE细胞可以符合表1中列举的标准中的至少一个和/或根据良好生产规范(GMP)制造。
所述冷冻保存的视网膜色素上皮(RPE)细胞或感光祖细胞可作为冷冻保存的组合物提供。
所述RPE细胞可以表现出比相等数量来自分离的成年眼的RPE细胞的感光细胞外节(POS)的吞噬率高至少50％，或者比相等数量来自分离的成年眼的RPE细胞的感光细胞外节(POS)的吞噬率高至少75％、100％、150％或200％的POS的吞噬率；或为24小时后POS总浓度的至少20％，或者为24小时后POS总浓度的至少25％、30％、25％、40％或50％的感光细胞外节(POS)的吞噬率。所述感光祖细胞可表现出比相等数量感光祖细胞的感光细胞外节(POS)的吞噬率高至少50％，或者比相等数量感光祖细胞的感光细胞外节(POS)的吞噬率高至少75％、100％、150％或200％的POS的吞噬率；或为24小时后POS总浓度的至少20％，或者为24小时后POS总浓度的至少25％、30％、25％、40％或50％的感光细胞外节(POS)的吞噬率。吞噬率和吞噬程度可能取决于细胞的培养时间和成熟度。根据细胞的成熟度和色素沉着，POS的结合率和内化率可以不同。基于细胞培养物的成熟度，能够吞噬细胞的百分比可能不同。
通过用在中性pH下非荧光或弱荧光但在酸化时变得发更强荧光的染料标记感光细胞外节，可能在吞噬测定中更灵敏地测量RPE细胞或感光祖细胞内化的POS。用于吞噬评估的大多数定量方法(FACS，荧光酶标仪)不区分内化和表面结合的荧光颗粒。此外，FITC荧光对pH敏感，并且FITC荧光在pH低于6时显著降低，而溶酶体和与溶酶体融合的吞噬体的pH低于5。因此，在一些情况下，FITC标记的OS的荧光不代表实际内化OS的量。根据其生产商(Life Technologies，Molecular Probes)，对pH敏感的基于罗丹明的Red染料在中性pH下不发荧光，酸化后变为鲜红色。染料既是荧光的，也是pH敏感的，因此可以用作吞噬事件的特定传感器，由此通过红色荧光指示吞噬后吞噬体的酸化。
使用在中性pH下非荧光或弱荧光但在酸化后变得发更强荧光的染料(例如Red和在酸性环境中也发最强荧光的CypHer5E，Life Technologies的LysoSensor染料)来标记感光体外节相对于现有技术的方法和试剂是显著的改进。我们使用这种对pH敏感的基于罗丹明的Red染料来标记牛OS来具体测量内化的颗粒。
当比较FITC标记的感光细胞外节、-BioParticles和-标记的感光细胞外节时，与4℃相比，在37℃吞噬测定中全部显示荧光显著增加(图1A-C)。然而，定量分析显示，当与FITC标记的颗粒孵育时，在吞噬测定中在37℃下只有约一半的RPE细胞群表现出相对于4℃对照的荧光增加(图1A)，并且在4℃对照中，约一半RPE细胞群也显示荧光显著增加，可能表明在细胞表面上存在结合的但非内化的颗粒。细胞表面上这样的颗粒可以代表特异性和非特异性结合。此外，FITC标记的感光细胞外节FACS数据的解释不是很准确，因为一些FITC荧光可能在低pH下丢失(图2)，所以一旦颗粒内化并且吞噬体与溶酶体融合，则在最终低pH(4.5-5.5)下，一些FITC荧光消失。因此，所测量的荧光包括来自内化颗粒的一些信号和来自表面上非特异性结合颗粒的附加信号的损失。标记的BioParticles和标记的感光细胞外节二者在4℃时都没有显示出任何荧光增加(图1B和1C)，但在37℃显示出增加，因此允许仅特异性测量与溶酶体融合的内化的颗粒。
如本文所述，-标记的ROS变成在低pH下发荧光，因此观察到的荧光偏移指示被内化的颗粒。使用FITC或其他对pH不敏感的染料标记的ROS往往显示在细胞表面上非特异性结合的颗粒，特异性结合但没有内化的POS，和/或内化但没有与溶酶体融合的POS。使用或其他对pH敏感的染料代替其荧光与酸度呈负相关的常规使用的FITC标记感光细胞外节，或使用标记的POS与其他对pH敏感和/或不敏感的染料改进吞噬测定的准确度，因为它允许测量生理相关的靶标的吞噬并且允许详细查究吞噬机制。
在一些实施方案中，POS在与感兴趣的细胞一起使用之前被破碎。POS可以使用例如超声处理或剪切或本领域中的其他方法来进行破碎。已经发现，在一些情况下，破碎的POS导致从细胞中读取更高的吞噬。这可能有助于区分阳性活性与对照活性。
可以使用单细胞细胞悬浮液进行吞噬测定，或者可以使用单层细胞进行吞噬测定。因此，细胞可以作为细胞悬浮液提供，或者它们可以作为单层、包括培养的单层提供。后一个实施方案是有用的，特别是如果细胞正常生长为单层，因为它允许细胞的吞噬活性如这样的细胞通常存在而被测定。细胞可以与标记的POS一起作为贴壁层(例如单层)孵育，然后可以酶消化(例如胰蛋白酶消化)以使它们成为单个细胞群，然后可以使用例如流式细胞术分析这些细胞群。
在一些实施方案中，细胞与POS在17℃或17℃以上，或18℃或18℃以上，19℃或19℃以上或20℃或20℃以上的温度孵育。温度范围的上限可以是等于或低于42℃，等于或低于41℃，等于或低于40℃，等于或低于39℃，等于或低于38℃，或等于或低于37℃。测试吞噬活性可以在这些温度下测量。细胞可以作为单层、包括培养的单层提供。
在一些实施方案中，将测试细胞或测试细胞群与POS在17-40℃，或20-40℃，或25-40℃，或30-40℃，或35-40℃的温度范围下，或约37℃的温度下孵育。阴性对照可对应于与POS在约4-16℃，5-16℃，6-16℃，7-16℃，8-16℃，9-16℃，10-16℃，11-16℃或12-16℃的温度范围下孵育的细胞。阴性对照可对应于与POS在约4-15℃，5-15℃，6-15℃，7-15℃，8-15℃，9-15℃，10-15℃，11-15℃或12-15℃的温度范围下孵育的细胞。细胞可以作为单层、包括培养的单层提供。
在一些情况下，细胞先前已冷冻保存，并解冻并短暂培养以产生单层。一旦细胞为单层的形式，可以如本文所述测试细胞的吞噬活性。
在一些实施方案中，细胞可暴露于未标记的POS一段时间，然后暴露于荧光标记的POS以测量后者POS的吞噬。通过这种方式，细胞可以在引入标记的POS之前已经被引发(prime)。
定义
为了可以充分理解本文描述的发明，提出以下详述。详细描述了本发明的各种实施方案，并且可以通过所提供的实施例进一步说明。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料相似或相当的方法和材料可以用于本发明或本发明的测试，但是下面描述合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而不是限制性的。本文提供以下术语和定义。
如本文描述以及所附的权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则“a”、“an”和“the”的含义包括复数指代。而且，如本文描述中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则“在...中”的含义包括“在...中”和“在...上”。
在整个文件中，词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化将被理解为暗示包含所陈述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整体组。
如本文所用，“胚胎干细胞”(ES细胞)广泛地指衍生自已作为细胞系连续传代的胚泡或桑椹胚的内细胞团的细胞。ES细胞可以衍生自用精子或DNA对卵细胞的受精，核转移，孤雌生殖，或通过产生在HLA区域中纯合性的ES细胞的方法。ES细胞还可以指衍生自融合精子和卵细胞产生的合子、卵裂球或胚泡阶段的哺乳动物胚胎的细胞，核转移，孤雌生殖或染色质的重编程，随后将重编程的染色质掺入质膜产生细胞。胚胎干细胞(无论其来源或用于生产它们的具体方法)可以基于以下进行鉴定：(i)分化成全部三个胚层的细胞的能力，(ii)至少表达Oct-4和碱性磷酸酶，和(iii)当移植到免疫受损的动物中时产生畸胎瘤的能力。该术语还包括从胚胎的一个或多个卵裂球分离的细胞，优选不破坏胚胎的其余部分(参见例如Chung et al.,Cell Stem Cell.2008Feb 7；2(2):113-7；美国授权前公开号(U.S.PGPub No.)20060206953；美国授权前公开号2008/0057041，其各自通过引用整体并入本文)。该术语还包括通过体细胞核转移产生的细胞，即使在该过程中使用非胚胎细胞。ES细胞可以衍生自用精子或DNA对卵细胞的受精，核移植，单性生殖，或通过产生在HLA区域中纯合性的ES细胞的方法。ES细胞还可以是衍生自融合精子和卵细胞产生的合子、卵裂球或胚泡阶段的哺乳动物胚胎的细胞，核转移，孤雌生殖或染色质的重编程，随后将重编程的染色质掺入质膜产生细胞。本公开的人胚胎干细胞可以包括但不限于MA01，MA09，ACT-4，No.3，H1，H7，H9，H14和ACT30胚胎干细胞。在某些实施方案中，用于产生RPE细胞的人ES细胞是根据GMP标准衍生和维持的。
如本文所用，“黄斑变性”广泛地指以与布鲁赫膜、神经视网膜和视网膜色素上皮异常有关的中枢视力逐渐丧失为特征的疾病。黄斑变性疾病包括但不限于年龄相关性黄斑变性，North Carolina黄斑营养不良，Sorsby’s眼底营养不良，眼底黄斑症，模式营养不良，贝斯特氏病，黄斑病变(malattia leventinese)，多因氏蜂窝状脉络膜炎，显性玻璃疣和桡玻璃疣。
如本文所用，“多能干细胞”广义地指能够在体外延长或实际上无限增殖同时保持其未分化状态的细胞，表现出稳定的(优选正常的)核型，并且具有在适当的条件下分化成所有三个胚层(即外胚层、中胚层和内胚层)的能力。
如本文所用，“RPE细胞”，“分化的RPE细胞”，“ES衍生的RPE细胞”可在全文中互换使用以广泛指从多能干细胞分化的RPE细胞，例如使用本文中公开的方法。该术语通常用于指代分化的RPE细胞，而不管细胞的成熟程度如何，因此可以涵盖不同成熟水平的RPE细胞。RPE细胞可以通过它们的鹅卵石形态和色素的初始外观被视觉识别。RPE细胞还可以基于胚胎干细胞标志物如Oct-4和NANOG的基本缺乏表达以及基于RPE标志物如RPE 65、PEDF、CRALBP和卵黄状黄斑病蛋白的表达而分子鉴定。例如，如果观察到预期的染色模式，例如定位在细胞核中的PAX6，以多边形模式定位在质膜中的卵黄状黄斑病蛋白(在该细胞周缘的清晰线处显示定位的卵黄状黄斑病蛋白染色)，以多边形模式勾画出细胞紧密连接处存在ZO-1染色，限于细胞核的MITF染色检测，则细胞被计数为针对给定的标志物为阳性。除非另有说明，否则本文使用的RPE细胞是指从多能干细胞体外分化的RPE细胞。
如本文所用，“成熟RPE细胞”和“成熟分化的RPE细胞”可以在全文中互换使用，以广泛地指在初始分化RPE细胞后发生的变化。具体而言，虽然可以部分基于色素的初始外观识别RPE细胞，但在分化后可以基于增强的色素沉着识别成熟的RPE细胞。
如本文所用，“色素化”广泛地指任何水平的色素沉着，例如当RPE细胞从ES细胞分化时最初发生的色素沉着。色素沉着可随着分化的RPE细胞的细胞密度和成熟度而变化。RPE细胞的色素沉着可以与RPE细胞的终末分化后的平均RPE细胞相同。RPE细胞的色素沉着可能比RPE细胞的终末分化后的平均RPE细胞的色素沉着更强烈。终末分化后，RPE细胞的色素沉着可能比平均RPE细胞的色素沉着更少。
“感光祖细胞”是指神经视网膜的细胞，其可以从胚胎干细胞或诱导的多能干细胞分化，并表达标志物PAX6而不表达标志物CHX10(即CHX10(-))。这些细胞在视网膜神经祖细胞阶段瞬时表达CHX10，但是当细胞分化成感光祖细胞阶段时CHX10表达被关闭。由感光祖细胞表达的其他标志物可以包括：Pax6，Nr2e3，Trβ2，Mash1，RORβ和NRL。而且，“感光细胞”可指从胚胎干细胞或诱导的多能干细胞分化并且表达细胞标记物视紫红质或三种视锥细胞视蛋白中的任一种，并任选表达视杆细胞或视锥细胞cGMP磷酸二酯酶的有丝分裂后细胞。感光细胞也可以表达在感光细胞中发现的标志物恢复蛋白。感光细胞可以是视杆细胞和/或视锥细胞。
细胞标志物：可以评估表达的示例性细胞标志物包括以下：PAX6，RX1，SIX3，SIX6，LHX2，TBX3，SOX2，CHX10，神经上皮干细胞蛋白，TRβ2，NR2E3，NRL，MASH1，RORβ，恢复蛋白，视蛋白，视紫红质，视杆细胞和视锥细胞cGMP磷酸二酯酶，其可以在蛋白质和/或mRNA水平评估(参见Fischer AJ,Reh TA,Dev Neurosci.2001；23(4-5):268-76；Baumer et al.,Development.2003Jul；130(13):2903-15,Swaroop et al.,Nat Rev Neurosci.2010Aug；11(8):563-76,Agathocleous and Harris,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.2009.25:45–69，其全部内容通过引用并入本文)。所述标志物标识符通常如文献和本领域中那样使用，特别是与本文中引用那些基因标识符的背景有关的领域，其可以包括与感光细胞，视杆细胞，视锥细胞，感光细胞分化，感光祖细胞，神经分化，神经干细胞，多能干细胞相关的文献，以及如上下文所示的其他领域。此外，标志物通常是人的，例如，除非上下文另有说明。可以使用本领域普通技术人员熟知的常规免疫细胞化学方法或常规PCR方法来鉴定细胞标志物。
如本文所用，疾病的“体征”广泛地指任何指示疾病的异常，在检查患者时可发现；这是疾病的客观指征，与作为疾病的主观指征的症状相反。
如本文所用，疾病的“症状”广泛地指患者所经历的任何疾病现象或偏离正常的结构、功能或感觉，并指示疾病。
如本文所用，“治疗(therapy、therapeutic、treating、treat或treatment)”广泛地指治疗疾病，阻止或减少疾病或其临床症状的发展，和/或减轻疾病，导致疾病或其临床症状消退。治疗包括预防，阻止，治疗，治愈，补救，减少，减轻和/或提供疾病、体征和/或症状的缓解。治疗包括减轻持续疾病体征和/或症状(例如失明、视网膜恶化)的患者体征和/或症状。治疗还包括“预防”和“阻止”。预防包括阻止在患者中治疗疾病之后疾病的发生或降低患者中疾病的发生率或严重程度。为了治疗的目的，术语“减少”广泛地指体征和/或症状的临床显著减少。治疗包括治疗复发或复发性体征和/或症状(例如，视网膜变性、视力丧失)。治疗包括但不限于随时排除体征和/或症状的出现以及减少现有体征和/或症状以及消除现有的体征和/或症状。治疗包括治疗慢性疾病(“维持”)和急性疾病。例如，治疗包括治疗或阻止复发或体征和/或症状(例如失明、视网膜变性)的复发。
制剂的RPE或感光祖细胞可以具有比相等数量分离自成年(即25-80岁的成年人，更优选50-80岁的成年人)眼的RPE细胞的POS的吞噬率高至少50％，更优选高至少75％、100％、150％或甚至200％的感光细胞外节(POS)的吞噬率。该制剂的感光祖细胞可以具有比相等数量分离自成年(即25-80岁的成年人，更优选50-80岁的成年人)眼的感光祖细胞的POS的吞噬率高至少50％，更优选高至少75％、100％、150％或甚至200％的感光细胞外节(POS)的吞噬率。
制剂的RPE或感光祖细胞可具有24小时后POS总浓度的至少20％，或者24小时后POS总浓度的至少25％、30％、25％、40％或50％的感光细胞外节(POS)的吞噬率。作为一个说明性的且非限制性的例子，可以使用Bergmann et al.FASEB Journal March2004vol.18pages 562-564描述的操作方案来测量POS吞噬，其具有本文描述的非FITC标记的POS的变化
RPE或感光祖细胞群可以包括不同成熟水平的分化的RPE细胞，或者对于特定成熟水平的分化的RPE细胞可以是基本上纯的。RPE细胞可以是包含不同水平的成熟/色素沉着的RPE细胞的基本上纯化的制剂
RPE细胞的冷冻保存制剂
RPE细胞或感光祖细胞可以通过本领域已知的任何适当的方法(例如，低温冷冻)储存并且可以在适于储存细胞的任何温度下冷冻。在使用这些细胞之前，可以在本发明的测定中测试它们以确定细胞的吞噬活性和/或效能。
在本发明的吞噬测定中显示出效能的RPE细胞或感光祖细胞可以用于治疗视网膜变性疾病，其是由于视网膜脱离，视网膜不典型增生，血管样条纹症，近视性黄斑变性，或视网膜萎缩或与多种视力-改变失调有关，其导致感光细胞损伤和失明，例如脉络膜血症，糖尿病性视网膜病变，黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性)，视网膜色素变性和眼底黄斑症。
本文提供的RPE或感光祖细胞可以是人RPE或感光祖细胞。但是请注意，人细胞可用于人患者，以及动物模型或动物患者。例如，可以在小鼠，大鼠，猫，狗或非人灵长类动物视网膜变性模型中测试。另外，人细胞可以在治疗上用于治疗有需要的动物，例如用于兽医学。
筛选测定
本公开提供了鉴定调节RPE细胞或感光祖细胞吞噬活性的试剂的方法。
实施例
现在概括描述本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，所述实施例仅被包括用于说明本发明的某些方面和实施方案的目的，而不旨在限制本发明。
RPE细胞如前所述(Klimanskaya et al,2004)从人胚胎干细胞(hESC)衍生而来，并且在从色素簇分化培养物中分离后用于传代2至5次时进行使用。细胞在EGM-2培养基(Lonza)中培养至汇合后，在实验中使用的细胞已经产生分化的RPE表型后细胞在RPE维持培养基(Klimanskaya et al,2004)中，所述分化的RPE表型特征在于六边形形态，不同水平的棕色色素，立方形细胞外观，极化和紧密连接。或者，细胞在它们完全成熟之前但仍然在它们汇合之后用于实验。
Bovine Rod Outer Segments(目录号98740)购自InVision Bioresources。FITC异构体(目录号F1906)I购自Life Technologies。Red PhagocytosisParticle Labeling Kit(目录号A10026)购自Life Technologies。
用FITC标记POS
在0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.5)中重悬一小瓶10mg FITC异构体I至2mg/mL。以3000g离心10分钟除去未稀释的颗粒，仅使用上清液标记牛ROS。解冻25只相当于ROS价值的牛眼球，并重悬于5mL洗涤缓冲液(含5mM牛磺酸的20mM磷酸盐缓冲液中的10％蔗糖，pH7.2)中。将1.5mL的2mg/mL的FITC上清液加入到重悬的ROS中，让它们在黑暗中在室温摇动孵育1小时。孵育后，以3000g离心ROS-FITC节段并重悬于10mL洗涤缓冲液中。重复这个洗涤步骤共2次。洗涤后，重悬于10mL DMEM(Gibco#11960)中的2.5％蔗糖中，并以3000g再次离心10分钟。最后，将细胞重悬于10mL DMEM中的2.5％蔗糖中，用血细胞计数器计数ROS-FITC颗粒，将浓度调整至DMEM中的2.5％蔗糖中的1×108个颗粒/mL，并在-80℃冷冻颗粒。
用标记POS
将25只相当于ROS价值的牛眼重悬于来自Red吞噬颗粒标记试剂盒的4.165mL 0.1M碳酸氢钠缓冲液中。将ROS等分到微量离心管中的4750μL等分试样中。以10000RPM将管离心1分钟，然后再次重悬于750μL 0.1M碳酸氢钠缓冲液中。将染料重悬于DMSO中至终浓度为10mM。将染料加入在碳酸氢钠缓冲液中的ROS至终浓度为0.5mM，并在黑暗中孵育45分钟。45分钟后，加入500μL“组分C”(来自试剂盒)并以10000RPM离心1分钟。吸出上清液并重悬于1mL 100％甲醇中。涡旋管30秒并以10000RPM离心1分钟。吸出甲醇并重悬在1mL“组分C”(来自试剂盒的洗涤缓冲液)中并再次以10000RPM离心1分钟。重复此洗涤步骤共2次。将所有颗粒重悬在总共20mL“缓冲液B”(来自试剂盒)中。以3000RPM离心10分钟，将重悬于DMEM中的2.5％蔗糖中，将浓度调整至DMEM中的2.5％蔗糖中的1×108个颗粒/mL，并在-80℃冷冻颗粒。
将RPE细胞与缀合的BioParticles或与用FITC或标记的牛外节在37℃孵育2至24小时的不同时间。之后，洗涤细胞，通过胰蛋白酶/解离缓冲液1:1收获，离心并通过流式细胞术分析。作为阴性对照，细胞在4℃孵育相同的时间。
另外，FITC标记的ROS FACS数据的解释不是很准确，因为一些FITC荧光可能在低pH下丢失(图2A和B)，所以一旦颗粒内化并且吞噬体与溶酶体融合，则在最终低pH(4.5-5.5)下，一些FITC荧光消失。因此，所测量的荧光包括来自内化颗粒的一些信号和来自表面上非特异性结合颗粒的附加信号的损失。
是对pH敏感的荧光染料，并且标记的BioParticles和ROS二者在4℃都没有显示出任何荧光增加(图1B和1C)，因此允许特异性测量与溶酶体融合的内化的颗粒。
用标记ROS可以提高吞噬测定的准确性，可以代替或补充FITC标记的ROS来详细查究吞噬的复杂机制。
用E.coli荧光生物颗粒标记
通过使用E.coli荧光生物颗粒(Invitrogen)的基于FACS的测定来评估吞噬，所述E.coli荧光生物颗粒在内化于细胞内吞噬体的降低的pH环境中时发荧光。根据制造商的说明书制备生物颗粒。将汇合的RPE与50-200μL生物颗粒/4孔板的一个孔在独立于CO2的培养基(Invitrogen)中在37℃孵育16-20小时。阴性对照板在4℃孵育。在显微镜下检查细胞，通过胰蛋白酶收获并通过FACS在C6流式细胞仪上计数10,000个事件进行分析。
表1 RPE细胞表征和安全性测试
RPE细胞对Red标记的ROS的吞噬。
将hESC衍生的RPE和ARPE-19细胞在由内皮细胞生长培养基(Lonza，目录号CC-3162，CC-3156)组成的RPE生长培养基(RPE-GM)中培养。
对于吞噬测定，将RPE细胞以5×105个细胞/cm2的密度接种于96孔培养板(Becton-Dickinson)中，并保持在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中。为了获得最佳的测定读数，RPE细胞在RPE-GM中培养3-5天，然后评估吞噬能力。如果细胞培养时间超过5天，则将RPE-GM转换为由补充有10％胎牛血清、GlutaMax和Normocin的DMEM组成的RPE维持培养基(RPE-MM)。培养基每2-3天更换一次以提供足够的营养。为了测定RPE细胞的吞噬活性，使用对pH敏感的基于罗丹明的Red标记的视杆细胞外节(ROS)(InVision Bioresources，目录号98740)。先前描述了用Red Microscale Labeling Kit(Thermo FisherScientific，目录号P35363)标记ROS。将汇合的RPE细胞的每个孔用0.1mL含有10％FBS和Normocin的DMEM培养基和0.1mL在补充有10％FBS和Normocin的DMEM中重构的标记的ROS接种。为了评估RPE细胞的最佳吞噬能力，测试了不同的ROS浓度：1.5×106，3×106，3.75×106，5×106，6×106，7.5×106，10×106和13.5×106ROS/96孔板的孔。为了减少ROS聚集并增加吞噬效率，在重构视杆细胞外节期间引入直接脉冲超声处理步骤。将RPE细胞和ROS在5％CO2和95％空气的气氛下、在37℃下孵育20-28小时以用于测试样品，在12-15℃下孵育用于阴性对照。第二天，ROS与RPE细胞单层孵育20-28小时后，吸出培养基，每孔用0.2mL无Ca/Mg的PBS(Gibco/Invitrogen#14190-250)洗涤3次。以1:1的比例向每个孔中加入0.2mL的0.25％胰蛋白酶/EDTA(Sigma，目录号T4049)加上细胞解离缓冲液(Gibco/Invitrogen，目录号13151)，并在室温下孵育直至单个细胞悬浮是可见的(10-20分钟)。将每个样品的细胞悬浮液转移至含有2mL DMEM加10％FBS的适当标记的圆底聚苯乙烯管中以中和反应，并以160g离心5分钟。倾出上清液留下约0.2-0.25mL的液体。涡旋样品管并如先前所述使用BDAccuri C6流式细胞仪评估RPE细胞的ROS摄取。
为了进一步增加吞噬能力，可按照上述步骤，在进行Red标记的ROS吞噬之前，通过进行或不进行回收步骤，将单层初始RPE细胞通过暴露于未标记的ROS规定的时间段来使得所述初始RPE细胞变得“有能力(competent)”。
参考文献
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Claims (73)

1.用于评估吞噬活性的方法，包括：
将细胞与感光细胞外节(POS)孵育足以使细胞吞噬POS的时间和温度，其中POS在酸性pH下比在更高pH下发出更强的荧光，
检测孵育后细胞的荧光强度，其中与对照相比荧光增加指示细胞对POS的吞噬。
2.权利要求1的方法，其中细胞与POS在约室温至约37℃或约室温至约40℃的温度范围下孵育。
3.权利要求1的方法，其中细胞与POS在约室温、约生理温度或约37℃下孵育。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞与POS孵育约16-20小时。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞作为细胞培养物提供。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞是汇合的细胞培养物。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞是RPE细胞。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞是人RPE细胞。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其中细胞是感光祖细胞。
10.权利要求1-6中任一项的方法，其中细胞是人感光祖细胞。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中POS用Red染料标记。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中对照是与POS在低于室温下孵育的细胞。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中对照是与POS在4℃下孵育的细胞。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中通过流式细胞术检测荧光。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中使用酶标仪检测荧光。
16.用于评估吞噬活性的方法，包括：
提供用荧光标记标记的感光细胞外节(POS)，当通过吞噬内化进入细胞的低pH隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号；
将测试细胞与标记的POS在允许吞噬标记的POS的条件下孵育；和
检测与标记的POS孵育后测试细胞中改变的荧光(如果有的话)，并由此定量测试细胞的吞噬活性。
17.权利要求16的方法，其中改变的荧光信号是荧光信号相对于当荧光标记细胞外存在时的强度增加。
18.权利要求16或17的方法，其中通过流式细胞术能够检测改变的荧光信号。
19.权利要求16-18中任一项的方法，其中改变的荧光信号将通过吞噬内化的标记的POS和结合在测试细胞表面但未内化的标记的POS区分开。
20.权利要求16-18中任一项的方法，其中将在测试细胞中检测到的改变的荧光信号与用标记的POS孵育的对照细胞群进行比较以定量测试细胞的吞噬活性。
21.权利要求20的方法，其中对照细胞群与标记的POS在低于室温下孵育。
22.权利要求16-21中任一项的方法，其中测试细胞包含视网膜色素上皮(RPE)细胞。
23.权利要求16-21中任一项的方法，其中测试细胞包含感光祖细胞。
24.权利要求22或23的方法，其中测试细胞是人细胞。
25.权利要求16-24中任一项的方法，其中测试细胞是通过多能干细胞的体外分化产生的。
26.权利要求16-24中任一项的方法，其中测试细胞是冷冻保藏并在使用之前解冻的。
27.权利要求16-24中任一项的方法，其中荧光标记是Red。
28.权利要求16-24中任一项的方法，其中POS用Red和RedE.coli BioParticles标记。
29.用于评估测试细胞群中的吞噬活性的标记的感光细胞外节(POS)制剂，POS用荧光标记标记，当通过吞噬内化进入细胞的低pH隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号。
30.权利要求29的制剂，其中改变的荧光信号是荧光信号相对于当荧光标记细胞外存在时的强度增加。
31.权利要求29或30的制剂，其中通过流式细胞术能够检测改变的荧光信号。
32.权利要求29-31中任一项的制剂，其中荧光标记是Red。
33.权利要求29-31中任一项的制剂，其中POS用Red和RedE.coli BioParticles标记。
34.用于测量细胞群中的吞噬活性的方法，包括
测量与非FITC荧光标记的感光细胞外节(POS)接触的测试细胞群中的测试荧光，
将测量的测试荧光与对照荧光进行比较，
其中非FITC荧光标记的POS在酸性pH下发荧光但在较高pH下不发荧光或发出最低限度的荧光。
35.权利要求34的方法，其中测试细胞群与非FITC荧光标记的POS在约室温至约生理温度或约室温至约40℃的温度范围下接触。
36.权利要求34的方法，其中对照荧光是与非FITC荧光标记的POS在低于室温下接触的细胞群的荧光。
37.权利要求34的方法，其中测试细胞群与非FITC荧光标记的POS在约15至40℃的温度下或在约生理温度下接触。
38.权利要求34-37中任一项的方法，其中对照荧光是与非FITC荧光标记的POS在4℃下接触的细胞群的荧光。
39.用于测量吞噬活性的方法，包括：
(1)测量与用Red染料标记的荧光标记的感光细胞外节(POS)在约室温至约生理温度或约室温至约40℃的温度范围下孵育的细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和
(2)测量与用Red染料标记的荧光标记的POS在低于室温下孵育的细胞群的第二等分试样中的对照荧光，
其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
40.权利要求39的方法，其中细胞群是RPE细胞群。
41.权利要求39的方法，其中细胞群是感光祖细胞群。
42.用于测量吞噬活性的方法，包括：
(1)测量与仅用Red标记的感光细胞外节(POS)或用Red和Red E.coli BioParticles标记的感光细胞外节(POS)在约室温至约生理温度、或约室温至约40℃的温度范围下孵育的细胞群的第一等分试样中的测试荧光，
(2)测量与仅用Red标记的感光细胞外节(POS)或用Red和Red E.coli BioParticles标记的感光细胞外节(POS)在低于室温下孵育的细胞群的第二等分试样中的对照荧光，
其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
43.权利要求42的方法，其中细胞群是RPE细胞群。
44.权利要求42的方法，其中细胞群是人RPE细胞群。
45.权利要求42的方法，其中细胞群是感光祖细胞群。
46.权利要求42的方法，其中细胞群是人感光祖细胞群。
47.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群在使用前被酶消化。
48.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群作为贴壁细胞群提供。
49.前述权利要求中任一项的方法，其中，POS是破碎的POS。
50.前述权利要求中任一项的方法，其中，POS是超声波化的POS。
51.用于评估细胞群中的吞噬活性的方法，包括
将贴壁细胞群与感光细胞外节(POS)孵育足以使细胞群中的细胞吞噬POS的时间和温度，其中POS在酸性pH下比在更高pH下发出更强的荧光，和
检测孵育后细胞群的荧光强度，其中与对照相比荧光增加指示细胞对POS的吞噬，任选地其中细胞群作为单层、进一步任选地汇合的单层提供。
52.权利要求51的方法，其中细胞群与POS在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育。
53.权利要求51或52的方法，其中细胞是RPE细胞或感光祖细胞。
54.权利要求51-53中任一项的方法，其中细胞是人细胞。
55.权利要求51-54中任一项的方法，其中POS用Red染料标记。
56.权利要求51-55中任一项的方法，其中对照是与POS在约12-15℃的温度下孵育的细胞群。
57.权利要求51-56中任一项的方法，其中使用酶标仪检测荧光。
58.用于评估吞噬活性的方法，包括：
提供用荧光标记标记的感光细胞外节(POS)，当通过吞噬内化进入细胞的低pH隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号；
将贴壁测试细胞与标记的POS在允许吞噬标记的POS的条件下、在约17-40℃的温度范围下孵育；和
检测与标记的POS孵育后贴壁测试细胞中改变的荧光(如果有的话)，以及由此定量贴壁测试细胞的吞噬活性。
59.权利要求58的方法，其中贴壁测试细胞与标记的POS在约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育。
60.权利要求58或59的方法，其中将在贴壁测试细胞中检测到的改变的荧光信号与在约12-15℃的温度范围下与标记的POS孵育的对照细胞群进行比较，以便定量贴壁测试细胞的吞噬活性。
61.权利要求58-60中任一项的方法，其中贴壁测试细胞包含视网膜色素上皮(RPE)细胞或感光祖细胞。
62.权利要求58-61中任一项的方法，其中贴壁测试细胞是人细胞。
63.权利要求58-62中任一项的方法，其中贴壁测试细胞是通过多能干细胞的体外分化产生的。
64.权利要求58-63中任一项的方法，其中荧光标记是Red。
65.权利要求58-64中任一项的方法，其中POS用Red和RedE.coli BioParticles标记。
66.用于测量贴壁细胞群中的吞噬活性的方法，包括
测量与非FITC荧光标记的感光细胞外节(POS)接触的贴壁测试细胞群中的测试荧光，以及
将测量的测试荧光与对照荧光进行比较，
其中非FITC荧光标记的POS在酸性pH下发荧光但在较高pH下不发荧光或发出最低限度的荧光。
67.权利要求66的方法，其中测试细胞群与非FITC荧光标记的POS在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下接触。
68.权利要求66或67的方法，其中对照荧光是与非FITC荧光标记的POS在约12-15℃的温度下接触的贴壁细胞群的荧光。
69.用于测量吞噬活性的方法，包括：
(1)测量与用Red染料标记的荧光标记的感光细胞外节(POS)在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育的贴壁细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和
(2)测量与用Red染料标记的荧光标记的POS在约12-15℃的温度范围下孵育的贴壁细胞群的第二等分试样中的对照荧光，
其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
70.用于测量吞噬活性的方法，包括：
(1)测量与仅用Red标记的感光细胞外节(POS)或用Red和Red E.coli BioParticles标记的感光细胞外节(POS)在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育的贴壁细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和
(2)测量与仅用Red标记的感光细胞外节(POS)或用Red和Red E.coli BioParticles标记的感光细胞外节(POS)在约12-15℃的温度范围下孵育的贴壁细胞群的第二等分试样中的对照荧光，
其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
71.权利要求51-70中任一项的方法，其中细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群在使用前被酶消化。
72.权利要求51-71中任一项的方法，其中POS是破碎的POS。
73.权利要求51-72中任一项的方法，其中POS是超声波化的POS。
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