JP7386206B2 - ヒト網膜色素上皮(rpe)細胞および視細胞前駆細胞の能力に関する改善されたアッセイ - Google Patents
ヒト網膜色素上皮(rpe)細胞および視細胞前駆細胞の能力に関する改善されたアッセイ Download PDFInfo
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Description
本出願は、2015年3月23日に出願された「IMPROVED ASSAYS FOR POTENCY OF HUMAN RPE CELLS AND PHOTORECEPTOR PROGENITORS(ヒトRPE細胞および視細胞前駆細胞の能力に関する改善されたアッセイ)」と題する米国仮特許出願第62/136,660号の米国特許法119条(e)に基づく利益を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
技術分野
FITC標識された視細胞外節(Photoreceptor Outer Segment)(OS)(通常、ウシまたはブタ)は、インビトロにおける網膜色素上皮(RPE)によるファゴサイトーシスを研究するために用いられてきた。しかしながら、ファゴサイトーシスの評価(FACS、蛍光プレートリーダー)に用いられる定量的方法の多くは、表面に結合した粒子と取り込まれた粒子とを区別しないため、ファゴサイトーシスにおける表面受容体の結合および取り込みの段階に関与するメカニズムに具体的に対処することを可能にしない。加えて、リソソームおよびリソソームに融合したファゴソームのpHが5未満である一方で、FITC蛍光はpH感受性であり、pH6未満で顕著に減少する。したがって、FITC標識されたOSは、取り込まれたOSの量を正確には表さないかもしれない。
いくつかの態様においては、コントロールは、室温未満でPOSとインキュベートされた細胞である。いくつかの態様においては、コントロールは、4℃でPOSとインキュベートされた細胞である。
いくつかの態様においては、コントロール細胞集団は、約4℃を含む室温未満で、標識されたPOSとインキュベートされる。
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、POSと、およそ室温で、およそ生理学的温度で、約37℃で、またはおよそ室温~40℃、またはおよそ室温~37℃、または約15~40℃で、インキュベートされる。いくつかの態様においては、コントロール細胞集団は、約4℃を含む室温未満で、標識されたPOSとインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、約17~40℃、または約25~40℃、または約34~40℃の範囲の温度で、あるいは約37℃の温度で、標識されたPOSとインキュベートされる。
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、多能性幹細胞のインビトロ分化により産生される。
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、凍結保存され、使用前に解凍される。
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、使用前に酵素で消化されている。
いくつかの態様において、細胞、細胞集団、試験細胞、または試験細胞集団は、付着細胞集団として提供される。
いくつかの態様において、POSは、断片化されたPOSである。いくつかの態様において、POSは、超音波処理されたPOSである。
いくつかの態様において、細胞は、POSと、約15~30時間、または16~20時間、または20~28時間の間インキュベートされる。
いくつかの態様において、細胞は、細胞培養として提供される。いくつかの態様において、細胞は、コンフルエントな細胞培養である。
試験およびコントロール細胞は、同じ細胞集団の異なる分割量(aliquot)であり得ることが理解されるべきである。
これらおよび種々の他の側面および態様は、本明細書においてより詳細に記載される。
ファゴサイトーシス(能力アッセイ)は、pHrodo(登録商標)Red色素(Life Technologies, Molecular Probes)により標識された視細胞外節(POS)に暴露されたRPE培養物の、定量的蛍光活性化セルソーティング(cell sorting)(FACS)解析により評価されてもよい。
ファゴサイトーシスは、pHrodo(登録商標)Red色素(Life Technologies, Molecular Probes)により標識されたPOSを用いたFACSに基づくアッセイにより評価されてもよい。そのように標識された色素およびPOSは、細胞内ファゴソームの減少したpH環境に取り込まれたときに蛍光を発する。POSは、本明細書において記載されたように標識されてもよい。
すでに記載されているとおり多能性幹細胞(ES細胞およびiPS細胞などであるが、これらに限定されない)から作製されたRPEを、その貪食能力について試験する。凍結保存されたRPEは、あらかじめ凍結されていて、使用前に解凍してもよい。RPE細胞のファゴソームの酸性環境における取り込みの際に蛍光を発する、pHrodo(登録商標)Red色素で標識されたPOSを貪食する能力を試験する前に、RPE細胞は、適切な培地中での培養下で播種し、コンフルエントになるまで増殖させて、培養下で維持する。RPE細胞は、ファゴサイトーシスが可能となるように37℃で、またはネガティブコントロールとして4℃で、標識されたPOSとインキュベートされる。蛍光強度のシフトは、37℃でインキュベートされた細胞についてフローサイトメトリーにより検出してもよく、これは標識されたPOSのファゴサイトーシスを示す。ピークの統計的統合は、各ロットのRPE細胞とインキュベーション温度についてのファゴサイトーシス陽性細胞の割合をもたらす。
(1)pHrodo(登録商標)Red色素で標識された、蛍光標識された視細胞外節(POS)と、37℃で、接触した(およびインキュベートされた)RPE細胞(またはRPE細胞集団)の、第一の分割量における蛍光(試験蛍光、または一般的に「試験」とみなされる)を検出または測定すること、および
(2)pHrodo(登録商標)Red色素で標識された、蛍光標識されたPOSと、4℃で、接触した(およびインキュベートされた)RPE細胞(またはRPE細胞集団)付着細胞集団の、第二の分割量における蛍光(コントロール蛍光、または一般的に「コントロール」とみなされる)を検出または測定すること、および
(3)任意に、試験およびコントロール蛍光を比較、決定および/または定量化すること、ここで、コントロール蛍光よりも強い試験蛍光は、RPE細胞(または細胞集団)のファゴサイトーシス活性の指標である、
を含む方法を開示する。
ある態様においては、RPEおよび視細胞前駆細胞は、単独のpHrodo(登録商標)Red視細胞外節、pHrodo(登録商標)Red E.coli BioParticlesまたはその両方を貪食する能力といった、ファゴサイトーシス活性を有しており、本明細書において提供される方法は、これらの機能の1種以上をアッセイする。
医薬品は、約25%、20%、15%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.01%、0.001%、または0.0001%未満の、RPE細胞でなくてもよい細胞を含み得る。
前記RPE細胞は、ヒトのものであってもよい。
ヒトRPE細胞などの前記RPE細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell)などの多能性細胞、ならびに成人ドナー組織もしくは胎児組織を含む、あらゆるソースから産生され得る。前記多能性幹細胞は、OCT-4、アルカリホスファターゼ、Sox2、TDGF-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、および/またはTRA-1-80を含み得る、1種以上のマーカーの発現について陽性であってもよい。前記多能性細胞は、培養中で色素性上皮細胞が出現するのに十分な時間、多層集団または胚様体中において培養されてもよい、ヒト多能性細胞であり得る。前記培養中に色素性上皮細胞が出現するのに十分な前記時間は、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、少なくとも約4週間、少なくとも約5週間、少なくとも約6週間、または少なくとも約7週間、少なくとも約8週間を含み得る。
前記RPE細胞は、1種以上のRPE細胞マーカーの発現について陽性であってもよい。前記1種以上のRPE細胞マーカーには、RPE65、CRALBP、PEDF、ベストロフィン、MITF、Otx2、PAX2、PAX6、ZO-1、および/またはチロシナーゼが含まれ得る。
胞を静止細胞として維持することを含む方法により産生されてもよい。前記RPE細胞は、前記RPE細胞の少なくとも50%においてベストロフィン発現を確立するのに十分な時間、RPE細胞を静止細胞として維持することを含む方法により産生されてもよい。
前記医薬組成物は、マウス胚性支持細胞(feeder cell)(MEF)およびヒト胚性幹細胞(hES)を実質的に含まなくてもよい。
前記の凍結保存された網膜色素上皮(RPE)細胞または視細胞前駆細胞は、凍結保存組成物として提供されてもよい。
いくつかの態様において、細胞は、一定時間、標識されていないPOSに暴露し、次いで、蛍光標識されたPOSに暴露して後者のPOSについてファゴサイトーシスを測定する。このようにして、標識されたPOSの導入に先だって、細胞を準備してもよい。
本明細書に記載される本発明が十分に理解され得るよう、以下の詳細な説明を記載する。本発明の様々な態様が詳細に記載され、そして提供される例によってさらに例証されることもあり得る。
別に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは同等の方法および材料を、本発明でまたは本発明の試験において使用し得るが、適切な方法および材料は下記に記載されている。材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定することは意図されていない。本明細書においては、以下の用語および定義が提供される。
本明細書全体を通じて「含む(comprise)」なる語、または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などのバリエーションは、記述される整数または整数群の包含を示唆するが、あらゆるその他の整数または整数群の排除を示唆しないと理解される。
疾患の「症状」は、本明細書において用いられるとおり、患者によって経験されて、疾患の指標である、あらゆる病的現象、または構造、機能、もしくは知覚における正常からの逸脱について、広く言及する。
RPE細胞または視細胞前駆細胞は、当該技術分野で公知のあらゆる適切な方法(例えば低温凍結)によって保存されてもよく、細胞の保存に適切ないずれの温度で凍結されてもよい。これらの細胞を使用する前に、これらは、本発明のアッセイにおいて試験されてもよく、細胞のファゴサイトーシス活性および/または能力を決定する。
本発明のファゴサイトーシスアッセイにおいて能力を示す、RPE細胞または視細胞前駆細胞は、網膜剥離、網膜異形成、網膜色素線条症、近視性黄斑変性または網膜萎縮による網膜変性疾患、あるいは、先天性脈絡膜欠如、糖尿病性網膜症、黄斑変性(例えば、加齢性黄斑変性)、網膜色素変性症およびスタルガルト病(黄色斑眼底)などの視細胞損傷と失明をもたらす、視覚を変化させる多くの疾患と関連付けられている網膜変性疾患を処置するために用いることができる。
本開示は、RPE細胞または視細胞前駆細胞の貪食活性を調節する薬剤を同定するための方法を提供する。
ここで本発明を一般的に記載しているが、下記例(これは、本発明の特定の側面および態様を単に例証する目的で含まれるものであって、本発明を限定することは意図していない)を参照することによって、より容易に理解される。
InVision Bioresourcesから入手したウシ桿体外節(catalog # 98740)。Life Technologiesから入手したFITC異性体(catalog # F1906)I。Life Technologiesから入手したpHrodo(登録商標)Red Phagocytosis Particle Labeling Kit(catalog # A10026)。
1バイアルのFITC異性体I 10mgを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)中に2mg/mLで再懸濁した。3000gで10分間遠沈し、希釈されなかった粒子を除いて、上清のみをウシROSを標識するのに用いた。ROSとして有効な25個のウシ眼球を解凍し、5mLの洗浄用緩衝液(5mMタウリンを含む、10%スクロース含有20mMリン酸塩緩衝液、pH7.2)中に再懸濁した。2mg/mLのFITC上清1.5mLを、再懸濁したROSに加え、暗所で揺らしながら室温にて1時間インキュベートした。インキュベーション後、ROS-FITC分画を3000gで遠沈し、10mLの洗浄用緩衝液中に再懸濁した。この洗浄ステップを全部で2回繰り返した。洗浄後、2.5%スクロース含有DMEM(Gibco # 11960)10mL中に再懸濁し、再度3000gで10分間遠沈した。最後に、細胞を2.5%スクロース含有DMEM10mL中に再懸濁し、血球計算板を用いてROS-FITC粒子を係数して、2.5%スクロース含有DMEM中、1×108粒子/mLの濃度に調整し、粒子を-80℃で凍結した。
ROSとして有効な25個のウシ眼球を、pHrodo(登録商標)Red phagocytosis Particle Labeling kitの0.1M重炭酸ナトリウム緩衝液4.165mL中に再懸濁した。ROSをマイクロ遠心チューブ中へ750μLずつ4つに分注した。チューブを10000RPMで1分間遠心し、次いで再度、0.1M重炭酸ナトリウム緩衝液750μL中に再懸濁した。pHrodo(登録商標)色素は、DMSO中10mMの最終濃度になるように再懸濁した。0.5mMの最終濃度になるようにpHrodo(登録商標)色素を重炭酸ナトリウム緩衝液中のROSに加え、暗所で45分間インキュベートした。(キットの)「コンポーネントC」500μLを加え、10000RPMで1分間遠心した。上清を吸引し、100%メタノール1mLに再懸濁した。チューブを30秒間ボルテックスし、10000RPMで1分間遠心した。メタノールを吸引し、(キットの洗浄用緩衝液)「コンポーネントC」1mLに再懸濁して、再度10000RPMで1分間遠心した。この洗浄ステップを全部で2回繰り返した。全粒子を総量20mLの(キットの)「バッファーB」に再懸濁した。ROS-pHrodo(登録商標)を3000RPMで10分間遠沈して、2.5%スクロース含有DMEMに再懸濁し、2.5%スクロース含有DMEM中、1×108粒子/mLの濃度に調整し、粒子を-80℃で凍結した。
pHrodo(登録商標)によるROSの標識は、ファゴサイトーシスアッセイの正確さを改善し、ファゴサイトーシスの複雑なメカニズムを詳細に解析するために、FITC標識されたROSの代わりにまたはこれを補完するものとして、用いることができる。
細胞内ファゴソームの低下したpH環境に取り込まれたとき蛍光を発する、pHrodo(登録商標) E.coli蛍光生体粒子(Invitrogen)を用いて、ファゴサイトーシスをFACSベースのアッセイにより評価する。生体粒子は製造者の使用説明書にしたがって調製した。コンフルエントなRPEは、CO2非依存性培地(Invitrogen)中で16~20時間、37℃にて、4ウェルプレートの1ウェルあたり生体粒子50~200μLとインキュベートした。ネガティブコントロールプレートは、4℃にてインキュベートした。細胞は、顕微鏡下で観察し、トリプシンにより回収して、C6フローサイトメーターで10,000イベントをカウントするFACSにより解析した。
hESC由来RPEおよびARPE-19細胞は、内皮細胞増殖培地(Endothelial Cell Growth Medium)(Lonza, cat# CC-3162, CC-3156)からなるRPE増殖培地(RPE-GM)中で培養した。
Schwartz SD, Hubschman JP, Heilwell G, Franco-Cardenas V, Pan CK, Ostrick RM, Mickunas E, Gay R, Klimanskaya I, Lanza R. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 2012 Feb 25;379(9817):713-20. doi:10.1016/S0140-6736(12)60028-2. Epub 2012 Jan 24. PubMed PMID: 22281388.
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Claims (18)
- 細胞集団が網膜変性疾患を処置するために好適であるかを決定する方法であって、
a)細胞集団および視細胞外節(POS)を含むファゴサイトーシスアッセイを実施すること;および
b)細胞集団によるPOSの貪食率を分析すること、
ここで、
(i)細胞集団によるPOSの貪食率が、成人の眼球から単離された同等数のRPEまたは視細胞前駆細胞によるPOSの貪食率よりも少なくとも50パーセント高い場合、細胞集団が、網膜変性疾患を処置するために好適であり、
ここで細胞集団が、多能性幹細胞のインビトロ分化により生産された網膜色素上皮(RPE)細胞集団または視細胞前駆細胞集団である、
を含み、
ファゴサイトーシスアッセイが、以下のステップ:
細胞集団中の細胞がPOSを貪食するのに十分な時間と温度で、細胞集団をPOSとインキュベートすること、ここで、POSは、より高いpHよりも酸性pHにおいてより強く蛍光を発する、蛍光標識により標識される、および
インキュベーション後に細胞集団の蛍光強度を検出すること、
ここで、コントロールと比較した蛍光強度の増加は、細胞集団によるPOSのファゴサイトーシスを示す、
ここで、細胞集団が25~40℃、または34~40℃の範囲の温度で、あるいは約37℃で、POSとインキュベートされ、および
ここで、コントロールは10~16℃、または12~15℃の範囲の温度でPOSとインキュベートされる細胞である、
を含む、前記方法。 - POSの貪食率が、成人の眼球から単離された同等数のRPE細胞または視細胞前駆細胞についてのPOSの貪食率よりも少なくとも75、100、150または200パーセント高いときに、細胞集団が、網膜変性疾患を処置するために好適である、請求項1に記載の方法。
- 細胞集団が網膜変性疾患を処置するために好適であるかを決定する方法であって、
a)細胞集団および視細胞外節(POS)を含むファゴサイトーシスアッセイを実施すること;および
b)細胞集団によるPOSの貪食率を分析すること、
ここで、
(ii)細胞集団が、24時間後にPOSの総濃度の少なくとも20パーセントを貪食する場合、細胞集団が、網膜変性疾患を処置するのに好適であり、
ここで細胞集団が、多能性幹細胞のインビトロ分化により生産された網膜色素上皮(RPE)細胞集団または視細胞前駆細胞集団である、
を含み、
ファゴサイトーシスアッセイが、以下のステップ:
細胞集団中の細胞がPOSを貪食するのに十分な時間と温度で、細胞集団をPOSとインキュベートすること、ここで、POSは、より高いpHよりも酸性pHにおいてより強く蛍光を発する、蛍光標識により標識される、および
インキュベーション後に細胞集団の蛍光強度を検出すること、
ここで、コントロールと比較した蛍光強度の増加は、細胞集団によるPOSのファゴサイトーシスを示す、
ここで、細胞集団が25~40℃、または34~40℃の範囲の温度で、あるいは約37℃で、POSとインキュベートされ、および
ここで、コントロールは10~16℃、または12~15℃の範囲の温度でPOSとインキュベートされる細胞である、
を含む、前記方法。 - 細胞集団が、24時間後にPOSの総濃度の少なくとも25、30、40または50パーセントを貪食する場合、細胞集団が、網膜変性疾患を処置するのに好適である、請求項3に記載の方法。
- POSが、細胞外に存在するときのその蛍光シグナルと比較して、細胞内の低pHコンパートメントにファゴサイトーシスにより取り込まれたときに増大する蛍光シグナルを有する蛍光標識で標識されている;および
ここで、方法が、標識されたPOSとのインキュベーション後の細胞集団における蛍光をコントロールと比較して検出すること、および細胞集団のファゴサイトーシス活性を定量化することを含む、
請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。 - 蛍光が、フローサイトメトリーにより、またはプレートリーダーを用いて検出される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞集団が、34~40℃の範囲の温度、または約37℃で、POSとインキュベートされる、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- コントロールが、12~15℃の範囲の温度で、POSとインキュベートされる細胞である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞集団およびコントロール細胞が、約16~20時間、POSとインキュベートされる、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞集団が、OCT-4、NANOG、Rex-1、アルカリホスファターゼ、Sox2、TDGF-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、およびTRA-1-81からなる群から選択される、1種以上の胚性幹細胞マーカーの発現を欠いている、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞集団が、RPE65、CRALBP、PEDF、ベストロフィン、MITF、Otx2、PAX2、PAX6、ZO-1、およびチロシナーゼからなる群から選択される、1種以上のRPE細胞マーカーを発現するRPE細胞集団である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 網膜変性疾患が、網膜剥離、網膜異形成、網膜色素線条症、網膜萎縮、先天性脈絡膜欠如、糖尿病性網膜症、黄斑変性、加齢性黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素変性症およびスタルガルト病(黄色斑眼底)からなる群から選択される、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- POSが、断片化されたPOS、または超音波処理されたPOSである、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- POSが、pHrodo(登録商標)Red色素により標識されている、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- RPE細胞がヒトRPE細胞であるか、または視細胞前駆細胞がヒト視細胞前駆細胞である、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞集団が網膜変性疾患を処置するために好適であるかを決定する方法であって、
細胞集団中の細胞が視細胞外節(POS)を貪食するのに十分な時間と温度で、細胞集団をPOSとインキュベートすること、ここで、POSは、より高いpHよりも酸性pHにおいてより強く蛍光を発する、蛍光標識により標識される、および
インキュベーション後に細胞集団の蛍光強度を検出すること、ここで、コントロールと比較した蛍光強度の増加は、細胞によるPOSのファゴサイトーシスを示し、さらに、細胞集団が網膜変性疾患を処置するために好適であることを示す、
ここで、細胞集団が25~40℃、または34~40℃の範囲の温度で、あるいは約37℃で、POSとインキュベートされ、および
ここで、コントロールは10~16℃、または12~15℃の範囲の温度でPOSとインキュベートされる細胞である、
を含む、前記方法。 - 細胞集団の増殖能を評価することをさらに含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 眼球ドナー由来の細胞の増殖能よりも高い増殖能が、細胞集団が移植に好適であることを示す、請求項17に記載の方法。
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