CN107889490A - 抗lps免疫球蛋白治疗的临床应答的预测性生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预测需要的患者中抗LPS免疫球蛋白治疗的临床应答的生物标志物。具体地，本发明提供用于预测需要的患者中抗LPS免疫球蛋白治疗的临床应答的方法，所述方法包括评估所述患者中选自以下的预测性生物标志物的表达的步骤：CD14、CD68、TLR4、TLR7、IL6、IL8、IL10、IFN‑α、IGF1、CXCL1、CXCL9、CXCL10、RAGE、GDNF、BCHE和它们的组合。

Description

抗LPS免疫球蛋白治疗的临床应答的预测性生物标志物
技术领域
本发明涉及用于预测需要的患者中抗LPS免疫球蛋白治疗的临床应答的生物标志物。具体地，本发明提供用于预测需要的患者中抗 LPS免疫球蛋白治疗的临床应答的方法，所述方法包括评估所述患者中选自以下的预测性生物标志物的表达的步骤：CD14、CD68、TLR4、 TLR7、IL6、IL8、IL10、IFN-α、IGF1、CXCL1、CXCL9、CXCL10、 RAGE、GDNF、BCHE和它们的组合。
背景技术
越来越多的证据表明，肠内脂多糖(LPS)的全身易位引发、持续或增强各种慢性疾病[Pinzone等.2012]。细菌脂多糖(LPS)被认为引起多种器官功能障碍综合征[Louis等2013]和急性呼吸窘迫综合征[Bernard等,Am J Respir Crit Care Med 1994；149:818-824]。体外和体内研究均表明，施用LPS引起各种反应[Windsor等.1993；Louis等. 2013]。体外研究表明，LPS不直接诱导内皮细胞的凋亡。一些调查认为LPS诱导的肿瘤坏死因子α(TNF-α)是内皮细胞凋亡的原因 [Bazzoni和Beutler N Engl J Med 1996；334:1717-1725；Buchman等 Am J Physiol 1993,265:H165-170；Polunovsky等Exp Cell Res 1994,214:584-594；Robaye等Am J Pathol 1991,138:447-453；Takei等,J GastroenterolHepatol,1995,10:65-67；Munshi等J Immunol.2002Jun 1；168(11):5860-6]。
还已知LPS在单核细胞表面被CD14吸引[Devitt等1998； Tapping等Nature 1998；392:505-509]。有趣的是，普遍认为这反映了经由LPS的信号转导的第一步。
从临床的观点上看，另一个问题是涉及LPS逆转的治疗干预对总体细胞凋亡反应的影响。在这种情况下，长期而言，免疫球蛋白在患有亚临床免疫活化患者中可以发挥一些有益的免疫效果。这主要体现为针对细菌LPS分子的抗体和也具有很强的抑制性LPS活性的乳铁蛋白[Bellamy等.Biochim Biophys Acta 1992；1121:130-136, Appelmelk等Infection and Immunity 1994；62(2):2628-2632；Inubushi 等.2012]。然而，口服抗LPS免疫球蛋白的效应子机制的全谱效果和特异性尚未得到充分研究。一个关键的效应子基质可能与单核细胞中的细胞凋亡有关。
发明人已经证明，基于口服施用抗LPS抗体(免疫球蛋白)的新治疗方法在超过50％的需要这种治疗的患者(例如，患有慢性疼痛综合征)中引起显著的或完全的症状缓解(数据未公开)。
LPS易位和炎症引起的疾病的参数的适合用途、科学验证和总体临床资格可能会极大改变目前治疗这些疾病的前景。
预测性生物标志物与对特定治疗(药物)的敏感性或耐药性(应答)的可能性有关。预测性生物标志物的概念通常适用于个体患者，目的是为了定制疗法以使功效最大化。更具体且实用地说，本文所述的预测性生物标志物可以协助临床医生决定哪些患者是抗LPS免疫球蛋白治疗的应答者。
因此，本发明的一个目的是提供用于测定临床受益于口服免疫球蛋白疗法的个体患者(即，口服抗LPS免疫球蛋白治疗的应答者)并且避免向非应答者施用抗LPS免疫球蛋白治疗的可靠的预后分析。治疗患者之前选择应答者的方法允许个性化的治疗决定，这反过来对于患者是极大的心理益处，改善健康结果并为社会提供经济利益。
本发明的另一个目的是提供可以在患者的生物样品，优选血液样品上进行的预后分析。
本发明的进一步目的是提供高度特异性的预后分析，即，根据本分析诊断为应答者的患者中至少80％、或90％或更优选至少95％，甚至更优选至少98％确实是LPS免疫球蛋白治疗的真正应答者。
为满足这个需要，发明人进行了实验室筛选，其集中于口服抗LPS免疫球蛋白治疗之前和之后的患者中广谱免疫参数，并将结果与健康对照个体的进行比较。
因此，根据本发明的方法，可以在个体接受抗LPS免疫球蛋白治疗之前选择患者。这将缓减患者的精神压力，并节约成本。
发明人进行的筛选的结果表明，15个特异性的参数谱(即预测性生物标志物)能够区分计划的抗PLS免疫球蛋白治疗的应答者和非应答者。
发明简述
在一个方面，本发明涉及用于预测需要的患者中对抗LPS免疫球蛋白治疗的应答的方法，所述方法包括评估从所述患者获得的生物样品中一个或多个生物标志物的表达的步骤，所述一个或多个生物标志物选自由以下组成的预测性生物标志物：CD14、CD68、TLR4、TLR7、 IL6、IL8、IL10、IFN-α、IGF1、CXCL1、CXCL9、CXCL10、RAGE、 GDNF和BCHE。
更具体地，所述评估步骤包括：定量所述患者的生物样品中一个或多个选择的预测性生物标志物的表达以获得表达值的步骤，和将各表达值与对应的对照值，例如与来自健康志愿者的对应的表达值进行比较。在一些实施方案中，这种对照值可以是在健康受试者中观察到的对应生物标志物的归一化平均表达值。
在一个优选的实施方案中，所述抗LPS免疫球蛋白治疗是用于口服施用的组合物，例如IgY组合物。在一个具体的实施方案中，所述 IgY组合物包含IgY(或其抗原结合部分)，其获得自用革兰氏阴性细菌或其含有LPS的部分免疫接种的母鸡，优选获得自至少两个不同的细菌物种。
在可以与之前的实施方案组合的另一个具体的实施方案中，方法应用于患有由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的慢性疾病的人受试者。这种由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的慢性疾病包括但不限于：
-特发性慢性疼痛综合征，包括但不限于慢性广泛性疼痛、纤维肌痛和膀胱综合征；
-偏头痛、慢性头颈部减速创伤、上髁炎、撞击综合征；
-移植物抗宿主病(GVHD)、慢性炎性胃肠疾病，包括但不限于克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠易激综合征；
-冠状综合征、系统性红斑狼疮、寻常型天疱疮、硬皮病；和
-动脉粥样硬化。
在本发明方法的一个具体实施方案中，评估本发明的15个预测性生物标志物中的2个、3个、4个或5个生物标志物的表达。
在可以与之前的实施方案组合的另一个具体的实施方案中，生物样品是血液样品。
在可以与之前的实施方案组合的另一个具体的实施方案中，所述表达是通过实时定量PCR定量的基因表达。
在可以与之前的实施方案组合的另一个具体的实施方案中，所述表达是通过特异性抗体定量的蛋白质生物标志物表达。
在另一个方面，本发明涉及用于治疗由外周血中活化单核细胞 (CD14+)诱导的慢性疾病的方法，包括向患有所述慢性疾病的患者施用治疗有效量的抗LPS免疫球蛋白组合物，其中所述患者是所述抗 LPS免疫球蛋白组合物的应答者，且所述应答者已经通过评估选自 CD14、CD68、TLR4、TLR7、IL6、IL8、IL10、IFN-α、IGF1、CXCL1、 CXCL9、CXCL10、RAGE、GDNF和BCHE的一个或多个预测性生物标志物的表达来选择。通常，方法可以包括以下步骤：(a)提供来自患者的生物样品；(b)定量所述生物样品中如上定义的一个或多个预测性生物标志物的表达；和(c)只有当基于所述一个或多个生物标志物的表达水平预测所述患者是所述抗LPS免疫球蛋白组合物的应答者时，向所述患者施用治疗有效量的所述抗LPS免疫球蛋白组合物。
发明详述
本发明提供允许预测需要这种治疗的患者中对抗LPS治疗的应答的预后方法。具体地，本文提供允许预测患者对抗LPS治疗(例如抗LPS IgY治疗)的临床应答的方法和试剂盒，所述患者患有由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的慢性疾病。
根据本发明，鉴定了一组15个生物标志物，其单独或组合可以预测对抗LPS治疗的临床应答的高可能性。系统性定量应答者vs非应答者患者的外周血样品中大量细胞因子或细胞因子受体表达允许鉴定这些预测性生物标志物。
因此，本发明的第一个目的是用于预测需要的患者中对抗LPS 免疫球蛋白治疗的应答的方法，所述方法包括评估从所述患者获得的生物样品中一个或多个生物标志物的表达的步骤，所述一个或多个生物标志物选自由以下组成的预测性生物标志物：CD14、CD68、TLR4、 TLR7、IL6、IL8、IL10、IFN-α、IGF1、CXCL1、CXCL9、CXCL10、 RAGE、GDNF和BCHE。
如本文的实施例所示，当比较抗LPS治疗的应答者和非应答者患者之间的候选生物标志物的表达水平值时，发明人鉴定了当与健康受试者和非应答者受试者相比统计学差异表达的生物标志物，下文称为“预测性生物标志物”且列于下表1中。
需要抗LPS免疫球蛋白治疗的患者
本文可交替使用的术语“患者”和“受试者”是指动物界的任何成员，优选哺乳动物或人，包括例如患有或疑似患有由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的慢性疾病的受试者。
实际上，已经证明抗LPS免疫球蛋白治疗在患有由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的慢性疾病的患者中是有效的。所述CD14+ 单核细胞在胃肠道中由革兰氏阴性细菌或其部分激活，且导致单核细胞/巨噬细胞相关的细胞因子过量产生。
革兰氏阴性细菌是人胃肠道微生物群的一部分。在生理上健康的胃肠道环境中，这些革兰氏阴性细菌对人的健康没有任何风险，因为人的防御系统可以耐受一定程度的内毒素脂多糖LPS。实际上，作为对宿主免疫系统的正向反馈，它是需要的。
在病理情况下，可存在革兰氏阴性细菌的过度生长和由粘膜炎引起的胃肠粘膜通透性增加。这两者导致粘膜下层水平存在的脂多糖 (LPS)和革兰氏阴性细菌的其他成分例如鞭毛、表面蛋白等增加，从而与先天免疫系统的模式识别受体的接触增加。
Waaga-Gasser等2009[International Journal of Clinical Pharmacology andTherapeutics,Vol 47,No.7/2009(421-433)]已经表明，患有特发性疼痛综合征的患者具有这种活化单核细胞，它们在被 LPS激活后无法进入细胞凋亡。
因此，LPS触发巨噬细胞的激活，而后是在这些细胞中功能障碍诱导细胞凋亡。这两者的组合导致正向反馈环和LPS信号易位至身体的系统性部分，在本质上导致难以察觉的慢性炎症。
这种慢性炎症反过来导致症状性疾病特异性的表型。
因此，在具体的实施方案中，需要这种抗LPS治疗的那些患者患有一种或多种以下的慢性疾病，所有疾病的特征在于由LPS活化 (CD14+)单核细胞：
与易位机制相关的疾病：
-疼痛相关疾病，例如：特发性慢性疼痛综合征(包括但不限于慢性广泛性疼痛、纤维肌痛和膀胱综合征；
-偏头痛、慢性头颈部减速创伤、上髁炎、撞击综合征，
与肠道中局部LPS中和机制相关的疾病：
-移植物抗宿主病(GVHD)、慢性炎性胃肠疾病例如克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠易激综合征，
自身免疫性疾病，例如：
-冠状综合征、系统性红斑狼疮、寻常型天疱疮、硬皮病，
其他疾病，例如：
-动脉粥样硬化、骨关节炎、痴呆、阿尔茨海默氏症和精神疾病如抑郁症和精神分裂症。
在一个具体的实施方案中，本发明的方法向患有以下疾病的患者应用：特发性疼痛综合征、移植物抗宿主病(GVHD)和/或寻常型天疱疮和上髁炎、偏头痛、骨关节炎、冻结肩或肩周炎、口腔黏膜炎、腕管综合征。
抗LPS免疫球蛋白治疗
如本文所用，“抗LPS免疫球蛋白治疗”涉及包含由免疫球蛋白或其抗原结合部分制成的物质或组合物作为活性成分的任何治疗性疗法，所述免疫球蛋白或其抗原结合部分针对脂多糖(LPS)或产生这种脂多糖的微生物或其含有LPS的部分。
如本文所用，本领域已知“治疗”是用于获得有益或期望的结果，包括临床结果的方法。有益或期望的结果可以包括但不限于：减轻或改善一种或多种症状或状况、降低疾病程度、使疾病状态稳定(即，没有恶化)、防止疾病扩散、延迟或减缓疾病进展、疾病逆转、改善或缓和疾病状态、和缓解(部分或全部)。
如上所讨论，实际上已经证明这种抗LPS免疫球蛋白治疗在治疗患有由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的慢性疾病的患者中是有效的。
这种抗LPS免疫球蛋白治疗的优选实施例及其在患有由活化单核细胞诱导的慢性疾病的患者中的有益结果描述于WO2012136522 和WO2012136534。
在一个具体的实施方案中，这种抗LPS免疫球蛋白治疗包括针对表达LPS的微生物或含有LPS的部分，更优选革兰氏阴性细菌或其含有LPS的部分产生的多克隆抗体或单克隆抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体和其任何抗原结合片段或衍生物(即“抗原结合部分”)或单链。在具体的实施方案中，这种抗体或免疫球蛋白可以包括单克隆或多克隆抗体或免疫球蛋白，或从免疫接种的动物或重组细胞获得的免疫球蛋白，及其抗原结合部分。
在天然存在的抗体中，两条重链通过二硫键彼此连接，且每条重链通过二硫键与轻链连接。存在两种轻链，λ(l)和κ(k)。轻链包括两个结构域：一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域：一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域 (CH1、CH2和CH3，总称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区均决定结合识别，且是抗原特异性的。轻链(VL)和重链(VH) 的恒定区赋予重要的生物性质，例如抗体链连接、分泌、经胎盘的流动性、互补结合，和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N末端部分，由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高变区或框架区(FR)的残基影响总体结构域的结构，从而影响结合位点。互补决定区或CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别命名为LCDR1、LCDR2、 LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3。因此，抗原结合位点通常包括6个CDR，包含来自各重链和轻链V区的CDR组。框架区(FR) 是指插入CDR之间的氨基酸序列。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基末端至羧基末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同基因编码，可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，所述合成接头允许它们成为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单链蛋白(称为单链 Fv(scFv)；参见例如,Bird等,1988Science 242:423-426；和Huston等, 1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这种单链抗体也意欲涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，且以与完整抗体相同的方式筛选有用的片段。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对于具体的表位显示单个结合特异性和亲和性。
如本文所用，术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如从动物(如小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体、从转化以表达该抗体的宿主细胞(如从转染瘤)分离的抗体、从重组的组合抗体文库分离的抗体，和通过涉及将免疫球蛋白基因、序列的全部或部分剪切到其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。
术语“免疫球蛋白”还包括嵌合或人源化抗体。
术语“嵌合抗体”是指包含非人抗体的VH结构域和VL结构域以及人抗体的CH结构域和CL结构域的抗体。
根据本发明，术语“人源化抗体”是指具有来自人抗体的可变区框架和恒定区，但基本上保留非人抗体的相同CDR的抗体。
在具体的实施方案中，术语“抗原结合部分”是指包含可变结构域的抗体或免疫球蛋白的片段，所述可变结构域包含所述抗体的 CDR。基本的抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、dsFv等。例如，抗体片段也参见Holliger等，Nature Biotechnology 23,issue9 1126-1136(2005)的综述。
术语“Fab”是指在用蛋白酶木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段中，分子量为约50,000且具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链的N 末端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
术语“F(ab')2”是指在用蛋白酶胃蛋白酶处理IgG获得的片段中，分子量为约100,000且具有抗原结合活性的抗体片段，其比经由铰链区的二硫键结合的Fab略大。
术语“Fab'”是指分子量为约50,000且具有抗原结合活性的抗体片段，其通过切割F(ab')2的铰链区的二硫键获得。
单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异源二聚体，其通常由包含通过编码肽的接头连接的VH和VL编码基因的基因融合体表达。“dsFv”是由二硫键稳定的VH::VL异源二聚体。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的结合自发形成，或可以通过肽接头偶联单价scFv产生，例如二价sc(Fv)2。
母鸡的天然存在的免疫球蛋白与哺乳动物类似，在于具有通过二硫键桥接的轻链(L)和重链(H)。分子由具有抗原结合位点的可变部分和恒定部分组成。在母鸡的情况下，可以区分免疫球蛋白M (IgM)、Y(IgY)和A(IgA)。IgM的功能与哺乳动物的IgM相同。存在于所有脊椎动物中，IgM以其高分子量传递第一反应。最近的遗传研究结果表明，IgY分子在系统发育上是哺乳动物IgG和IgE的祖先。 IgY和哺乳动物IgG在结构上具有明显差异，因为母鸡IgY的重链具有额外的恒定结构域替代哺乳动物IgG的铰链区。因此，与IgG相比， IgY的分子量更高。与哺乳动物IgG类似，IgY是以其高血清浓度和低分子量传递第二反应的免疫球蛋白。在文献中，关于母鸡有时术语 IgG和IgY用作同义词，因此基于最新的发现，在国际ECVAM研讨会的框架内已经决定使用术语IgY。(Schade等2005)。然而，如本文所用，术语IgY也包括这种IgY的任何抗原结合部分。
“产生LPS的微生物”通常可以从革兰氏阴性细菌选择，最优选选自以下：念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、脑膜炎球菌(meningococcus)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、衣原体、螺旋体、蓝细菌、变性菌门的物种，尤其是肠杆菌科细菌(Enterobacteriaceae)(大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属 (Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、肠杆菌属(Enterobacter))、假单孢菌属 (Pseudomonas)细菌、军团杆菌属(Legionella)细菌、奈瑟氏菌属 (Neisseria)细菌、立克次体(Rickettsia)细菌、多杀性巴氏杆菌 (Pasteurellamultocida)细菌和拟杆菌门(Bacteroidetes)菌株的物种。
所述产生LPS的微生物的含有LPS的部分可以是能够针对产生 LPS的微生物产生的脂多糖引起免疫应答的任何抗原(也称为LPS抗原决定簇)。
在具体的实施方案中，所述抗LPS免疫球蛋白治疗包括以下或基本上由以下组成：免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E、免疫球蛋白M、免疫球蛋白G和/或免疫球蛋白Y，或其抗原结合部分。
在具体的实施方案中，所述抗LPS免疫球蛋白治疗包括牛IgG，更具体的源自初乳的牛IgG，或其抗原结合部分。
在优选的实施方案中，所述抗LPS免疫球蛋白治疗包括抗LPS IgY组合物，更优选的，针对革兰氏阴性细菌产生的多克隆IgY抗体，或其抗原结合部分。
在可以与之前的实施方案结合的优选实施方案中，IgY多克隆抗体已经至少部分从蛋黄粉，优选从脱脂或半脱脂蛋黄粉获得。
通过标准方法，优选使用超滤、水稀释、过滤、凝胶电泳、层析、己烷或超临界CO2获得脱脂或半脱脂蛋黄粉(从液体蛋黄或干燥的蛋黄粉除去脂肪)。除去脂肪后，脱脂的液体蛋黄或蛋黄粉通过冻干或喷雾干燥进行干燥。
从蛋黄获得的IgY组合物通常包含例如脂蛋白(如HDL和LDL) 和蛋黄的水溶性蛋白、α-卵黄蛋白(80kDa)、β-卵黄蛋白(45kDa)和/ 或γ-卵黄蛋白(150kDa)，其还包含鸡蛋中发现的大多数酶(Ternes, Acker和Scholtyssek,Ei und Eiprodukte,1994)。
为了从母鸡(或其鸡蛋)获得抗LPS IgY，有利地用产生LPS的微生物免疫接种母鸡。
在具体的实施方案中，所述抗LPS免疫球蛋白治疗包含从母鸡的蛋黄获得的抗LPSIgY组合物或其抗原结合部分，所述母鸡用革兰氏阴性细菌或其包含LPS的部分(优选来自至少两种不同的革兰氏阴性细菌物种)免疫接种。
例如，可以通过以下方法获得适用于制备抗LPS治疗的所述IgY 组合物：
a)免疫接种至少2个不同组的母鸡，每个组用产生LPS的革兰氏阴性细菌免疫接种，其中每个组给予不同的细菌物种，
b)从所述至少2个不同组的每一个获得含有抗体的级分，
c)混合所述至少2个含有抗体的级分，从而所得抗体制剂包含按重量计为总抗体含量的至少3％的针对各细菌物种或其含有LPS的部分的各抗体级分，优选针对各微生物物种的各特异性抗体的总量按重量计为总抗体含量的>＝7％。
根据上述具体的生产方法，抗LPS免疫球蛋白治疗可以是包含至少2个特异性抗体级分，例如2-10个特异性抗体级分的IgY组合物，所述抗体级分靶向不同的表达脂多糖的革兰氏阴性细菌；各种情况下的每个特异性抗体级分的抗体含量按重量计为抗体制剂的总抗体含量的至少3％；且优选的，这种针对表达脂多糖的微生物的特异性抗体级分按重量计为抗体制剂的总抗体含量的>＝7％。
在具体的实施方案中，所述IgY组合物包含针对革兰氏阴性细菌的抗体级分，所述革兰氏阴性细菌选自大肠杆菌、志贺氏菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属和肠杆菌属。更具体的，在一个优选实施方案中，所述IgY组合物包含由针对大肠杆菌的多克隆IgY组成的一个级分和由针对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的多克隆IgY组成的另一个级分。
更具体地，每个特异性抗体级分按重量计基于IgY组合物的总抗体含量占至少4％，甚至更优选的，所述特异性抗体的总量按重量计基于抗体制剂的总抗体含量分别为>＝10％。
在一个具体的实施方案中，所述抗LPS治疗配制为用于口服施用。
优选的，所述抗LPS治疗是用于口服施用的如上所述的IgY组合物。
预后方法
本发明的方法能够预测患者对抗LPS免疫球蛋白治疗的应答。
如本文所用，术语“预测”是指在治疗前能够以高水平可能性(统计学显著)测定患者是否对所述治疗应答的方法。因此，术语“预测”并不一定是绝对应答。相反，它可以是与群体中的平均可能性相比，能够测定患者有较高可能性是良好应答者的应答。
如本文所用，当与治疗前的症状相比，待用所述LPS免疫球蛋白治疗的疾病的所述至少一种症状在治疗后降低时，观察到“对抗LPS 免疫球蛋白治疗的应答”或同样的“对抗LPS免疫球蛋白治疗的临床应答”。在具体的实施方案中，所述慢性疾病的症状是疼痛，例如通过所述患者(NRS-疼痛评分值)的每日总结评分(NRS)测量的与慢性疾病相关的特定疼痛症状。在这个具体的实施方案中，对抗LPS 免疫球蛋白治疗的应答是治疗后(例如在5天时间期间)的NRS疼痛评分值的平均值与治疗前相应NRS疼痛评分值的平均值相比显著降低。
如本文所用，术语“降低”或“增加”是指对照值的统计学显著的降低或增加，优选对照值降低或增加至少10％、至少20％、至少 30％、至少40％、至少50％、至少90％或至少99％。
根据本发明的方法，基于治疗前对生物样品中一个或多个预测性生物标志物的表达的评估预测患者为应答者或非应答者。
如本文所用，术语“应答者”是指对抗LPS免疫球蛋白治疗表现或有可能表现积极治疗应答的患者。在一个实施方案中，应答者是患有特发性疼痛综合征的患者，其在治疗后表现或有可能表现至少一种疼痛症状的显著疼痛缓解或甚至完全缓解。
如本文所用，术语“非应答者”是指对抗LPS免疫球蛋白治疗不表现或不可能表现积极治疗应答的患者。在一个实施方案中，非应答者是患有特发性疼痛综合征的患者，其在治疗后不表现或不可能表现任何疼痛症状的任何显著疼痛缓解。
因此，本发明的方法包括以下步骤：(a)定量从所述患者获得的生物样品中一个或多个预测性生物标志物的表达，和(b)将所得表达值与对应的对照值进行比较。
如本文所用，术语“生物样品”意欲包括从受试者分离的组织、细胞、生物流体及其分离物，以及受试者中存在的组织、细胞和流体，前提是所述生物样品容易包括：(i)外周血细胞，或(ii)由患者的外周血细胞产生的核酸或蛋白。在具体的实施方案中，用于本发明方法的所述生物样品是血液样品，包括外周血细胞样品和蛋白质。
定量预测性生物标志物的表达
本发明的预测方法包括评估生物样品中一个或多个预测性生物标志物的表达的步骤。
如本文所用，术语“评估”通常包括以下步骤：(a)定量从所述受试者获得的生物样品中一个或多个选择的预测性生物标志物的表达以获得表达值，和(b)将所得的所述预测性生物标志物的各个表达值与对应的对照值进行比较，其中表达值与相应对照值相比的差异表明受试者是抗LPS免疫球蛋白治疗的应答者。
生物标志物的表达可以通过测定受试者的生物样品(例如血液样品)中预测性生物标志物的基因或蛋白表达来定量。定量可以是相对的(例如将生物标志物的量与具有已知量的生物标志物的对照进行比较，检测与该对照相比“更高”或“更低”的量)或更精确地，至少测定相对于已知对照量的特定量。
术语“核酸”和“多核苷酸”交替使用，是指任何长度的核苷酸的多聚形式，无论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任意的三维结构，且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、信使RNA(mRNA)、cDNA、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在多聚物的组装之前或之后赋予。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可以在聚合之后进一步修饰，例如通过与标记成分偶联。该术语也指双链和单链分子两者。除非另有说明或需要，多核苷酸的本发明的任何实施方案涵盖双链形式和已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个。“基因”是指包含至少一个开放阅读框(ORF)的多核苷酸，所述开放阅读框在转录和翻译后能够编码特定的多肽或蛋白。多核苷酸序列可以用于鉴定与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。“基因表达”、“基因产物”或“表达”全部在本文交替使用，是指基因转录和翻译时产生的核酸或氨基酸(例如肽或多肽)、生物标志物的cDNA 或RNA序列；生物标志物基因表达、生物标志物蛋白质表达、生物标志物mRNA表达；生物标志物蛋白的功能效果、生物标志物基因的功能效果、cDNA或mRNA、蛋白质、cDNA、基因或mRNA活性。
在具体的实施方案中，“基因表达”、“基因产物”或“表达”是指mRNA表达、cDNA表达、蛋白转录和蛋白表达。
术语“多肽”与术语“蛋白质”交替使用，其最广的含义是指两个或更多个亚单元氨基酸的化合物。亚单元可以通过肽键连接。
或者，这种定量方法可以包括检测和定量所述预测性生物标志物的对应的基因表达水平，其包括定量所述预测性生物标志物的对应mRNA，例如通过进行实时定量PCR以及通过使用DNA微阵列(即，在其上的确定位置具有结合核酸的底物，所述结合核酸与对应于所述预测性生物标准的扩增mRNA的cDNA特异性杂交)。
通常，在具体实施方案中，将从患者的生物样品获得的转录多核苷酸的混合物(mRNA)进行逆转录和定量扩增。所述cDNA或mRNA 可以通过体外技术，通过与DNA微阵列的严格杂交或Northern印迹来检测。
在任何情况下，这种检测和定量分析的一般原则涉及在合适条件下制备可以包含预测性生物标志物和探针的样品或反应混合物，所述制备的时间足以允许预测性生物标志物和探针相互作用和结合，从而在反应混合物中形成可以被检测(和定量)的复合物。
生物标志物的这些检测和/或定量分析可以各种方式进行。具体分析的合适条件及其成分是本领域技术人员已知的。
在具体的实施方案中，预测性生物标志物mRNA的水平可以通过生物样品的体外形式用本领域已知的方法来测定。
以下描述用于进行本发明的预测方法的定量生物标志物的具体方法。这些方法包括如实施例所述的Luminex和ELISA定量方法。
通过cDNA微阵列定量预测性生物标志物
根据该实施方案，可以基于本说明书全文公开的15个预测性生物标志物中的一个或2个、3个、4个、5个或6个的组合构建微阵列。可以将用于这些生物标志物的探针置于微阵列上。这些探针可以与PCR方法中所用的那些不同。然而，应当设计并在一定条件下使用它们，从而使仅具有预测性生物标志物的核酸(mRNA或cDNA或cDNA 材料的PCR扩增物)可以杂交且提供阳性结果。
在优选的实施方案中，阵列将进一步包括一个或多个对照探针。
在具体的实施方案中，所述探针可以是长度为约5至约500或约 5至约200个核苷酸，更优选约10至约100个核苷酸，最优选约15 至约70个核苷酸的寡核苷酸。在其他特别优选的实施方案中，探针的长度为约20或25个核苷酸。在另一个优选的实施方案中，测试探针是双链或单链DNA序列。DNA序列可以从天然来源分离或克隆，或用天然核酸作为模板从天然来源扩增。这些探针的序列与设计它们用于检测表达的预测性生物标志物的基因的特定亚序列互补。
除了与感兴趣的靶标核酸(对应的一个或多个预测性生物标志物的基因表达)结合的测试探针外，微阵列可以包括许多对照探针。对照探针可以分为三类，本文称为归一化对照；表达水平对照和错配对照。归一化对照是与加入核酸样品的标记参考寡核苷酸或其他核酸序列互补的寡核苷酸或其他核酸探针。杂交后从归一化对照获得的信号提供可能造成完美杂交信号在阵列之间变化的杂交条件、标记强度、“读取”效率和其他因素的变化的对照。在优选的实施方案中，将从阵列中所有其他探针读取的信号(例如荧光强度)除以来自对照探针的信号(荧光强度)，从而将测量值归一化。几乎任何探针可以作为归一化对照。然而，公认杂交效率随碱基组成和探针长度而变化。选择优选的归一化探针以反映阵列中存在的其他探针的平均长度；然而，可以选择它们来覆盖一个长度范围。还可以选择归一化对照来反映阵列中其他探针的(平均)碱基组成，然而在优选实施方案中，仅使用一个或几个探针，且选择它们使得它们很好地杂交(即，没有二级结构)并且不与任何靶标特异性探针匹配。
表达水平对照是与生物样品中组成型表达的基因特异性杂交的探针。几乎任何组成型表达的基因为表达水平对照提供合适的靶标。典型的表达水平对照探针的序列与包括以下的组成型表达的“管家基因”的亚序列互补：β-肌动蛋白基因、RNA18S、转铁蛋白受体基因、 GPDH基因、泛素C(UBC)基因、核糖体蛋白大P0(RPLP0)基因、β-2-微球蛋白(B2M)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)基因、TATA盒结合蛋白(TBP)基因、肽基脯氨酰异构酶A(PPIA) 基因、葡萄糖醛酸酶β(GUSB)基因和磷酸甘油酸酯激酶1(PGK1) 基因。
用于差异性表达基因的含有寡核苷酸探针的固体支持物可以是本领域技术人员已知的任何固体或半固体支持材料。合适的实例包括但不限于：膜、滤纸、组织培养皿、聚氯乙烯盘、珠子、测试条、基于硅或玻璃的芯片等。合适的玻璃晶片和杂交方式可广泛获得。可以使用寡核苷酸可以直接或间接、共价或非共价结合的任何固体表面。在一些实施方案中，可能期望将一些寡核苷酸共价连接和其他寡核苷酸非共价连接至相同的固体支持物。优选的固体支持物是高密度阵列或DNA芯片。这些在阵列的预定位置上包括特定寡核苷酸探针。每个预定位置可以包括超过一个探针分子，但预定位置内的每个分子具有相同序列。这种预定位置称为特征。
通过实时定量PCR定量预测性生物标志物
定量核酸(例如预测性生物标志物的mRNA)的方法可以包括实时定量PCR方法(RT-qPCR)。RT-qPCR是基于对随着每轮扩增PCR 产物的积累而增加的荧光报告分子的检测。荧光报告分子包括与双链 DNA结合的染料(例如SYBR Green I)或序列特异性的探针(例如分子信标或探针)。此类方法包括允许平行定量多个预测性生物标志物的表达的多重定量方法。
例如，为了通过使用RT-qPCR方法定量本发明的预测性生物标志物，收集患者的血细胞样品。裂解所述血细胞，并根据标准方法提取总RNA。
然后将总RNA提取物进行逆转录，随后进行实时定量PCR(例如，如实施例所述)。
检测并定量生物标志物多肽
生物标志物的表达水平还可以通过检查至少一种预测性生物标志物的蛋白表达或蛋白产物来测定。测定蛋白水平涉及测量从患者获得的样品中选择性识别并结合生物标志物多肽的抗体之间发生的任何免疫特异性结合的量，并将其与对照样品中至少一个生物标志物的免疫特异性结合的量相比较。当与对照表达相比时，生物标志物的蛋白表达量可能升高或降低。或者，可以分析超过一个预测性生物标志物的组合。
本领域已知检测这种生物样品中蛋白表达水平的各种方法，包括各种免疫分析方法。它们包括但不限于：放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、原位免疫测定(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光分析、流式细胞术、免疫组化、共聚焦显微镜、酶分析、表面等离子体共振和PAGE-SDS。
测定蛋白水平涉及例如测量从患者获得的样品中选择性识别并结合生物标志物多肽的抗体之间发生的任何免疫特异性结合的量。这些测定也可以包括标记抗体与靶标生物标志物的直接结合。
夹心测定是最有用且最常用的测定。存在很多夹心测定技术的变型，所有均意欲涵盖在本发明内。简言之，在典型的正向测定(forward assay)中，将未标记抗体固定在固体基质上，并将待测试的样品与结合分子接触。孵育足以允许形成抗体-抗原复合物的一段合适的时期后，加入抗原特异性的第二抗体(用能够产生可检测信号的报告分子标记)并孵育足以形成另一个抗体-抗原-标记抗体复合物的时间。洗掉任何未反应物质，通过观察报告分子产生的信号测定抗原的存在。结果可以是定性的(通过简单观察可见信号)或定量的(通过与含有已知量的生物标志物的对照样品相比较)。
正向测定的变型包括同时测定，其中向结合抗体同时加入样品和标记抗体。这些技术是本领域技术人员熟知的，包括显而易见的任何细微变化。在典型的正向夹心测定中，对生物标志物具有特异性的第一抗体与固体表面共价结合或被动结合。
结合过程是本领域熟知的，通常由以下组成：交联共价结合或物理吸收，洗涤聚合物-抗体复合物以制备测试样品。然后向固相复合物加入小份的待测试样品，并在合适条件下(例如从室温至40℃，例如25℃-32℃(包含))孵育足够的时期(例如2-40分钟或过夜(如果更方便))以允许抗体中存在的任何亚单元的结合。孵育期后，将抗体亚单元固相洗涤和干燥，并用对部分生物标志物特异性的第二抗体孵育。该第二抗体与用于指示第二抗体与分子标志物的结合的报告分子连接。
另一种方法涉及固定样品中的预测性生物标志物，然后将固定的生物标志物暴露于用或不用报告分子标记的特异性抗体。取决于生物标志物靶标的量和报告分子信号的强度，可以通过抗体的直接标记来检测结合的生物标志物靶标。或者，将第一抗体特异性的第二标记抗体暴露于靶标-第一抗体复合物以形成靶标-第一抗体-第二抗体三重复合物。该复合物通过报告分子发出的信号检测。
如本说明书所用，“报告分子”是指通过其化学性质提供允许检测抗原-结合抗体的分析可识别信号的分子。这种测定中最常用的报告分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。
在酶免疫测定或ELISA测定的情况下，通常通过戊二醛或高碘酸盐的方式将酶偶联至第二抗体。然而，将容易认识到，存在各种不同的偶联技术，这是本领域技术人员容易获得的。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。通常选择与特定酶一起使用底物以通过相应的酶水解产生可检测的颜色变化。合适的酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可以使用荧光底物，与上述显色底物不同，其产生荧光产物。在所有情况下，将酶标记抗体加入第一抗体-分子标志物复合物，允许其结合，然后洗掉多余试剂。然后向抗体-抗原-抗体复合物加入含有合适底物的溶液。底物将与连接至第二抗体的酶反应，产生定性的视觉信号，其可以被进一步定量(一般通过分光光度法)以指示样品中存在的生物标志物的量。
或者，可以将荧光化合物(例如荧光素和罗丹明)与抗体化学偶联而不改变其结合能力。当被特定波长的光照激活时，荧光素标记的抗体吸收光的能量，诱导分子的激发状态，随后发射出可以用光学显微镜可视检测的特征性颜色的光。如在EIA中，允许荧光标记抗体与第一抗体-分子标志物复合物结合。洗掉未结合试剂后，然后将剩余三重复合物暴露于合适波长的光，观察到的荧光表明目标分子标志物的存在。免疫荧光和EIA技术均是本领域良好确认的。然而，也可以使用其他报告分子，例如放射性同位素、化学发光或生物发光的分子。
将预测性生物标志物的表达水平与对照值比较
因此，在本发明的预测方法的具体实施方案中，定量步骤允许获得生物样品中测试的每个生物标志物的“表达水平”，其用于比较步骤。
为方便用于比较步骤，所述表达值可以是归一化(相对)值，其在比较绝对表达水平值和参考值后获得，所述参考值是例如生物样品中参考蛋白的表达水平值。
将定量治疗前患者中一个或多个预测性生物标志物的表达后获得的每个表达水平值与相应的对照值比较，从而测定患者是否是应答者或非应答者。
优选地，所述表达水平值是归一化相对值，其在比较绝对表达水平值和正常值后获得，所述正常值是组成型(或参考)基因，例如管家基因β-肌动蛋白、18S RNA或肽基脯氨酰异构酶A(PPIA)的表达水平值。
所述对照值可以是例如健康受试者、应答者患者和/或非应答者患者的归一化(相对)平均值的平均值。以下实施例给出了15个预测性生物标志物中每一个的这种归一化平均值的实例。
根据本发明方法使用的定量方法和预测性生物标志物，所述对照值也可以通过常规实验测定。
例如，所述对照值对应于非应答者患者观察到的表达水平值，当表达水平值统计学上不同于对照值时(例如与对照值相比升高，或与对照值相比降低)，预测患者为应答者。
或者，所述对照值对应于应答者患者观察到的表达水平值，当表达水平值没有统计学上不同于对照值时，预测患者为应答者。
本发明方法的步骤(b)所指的比较可以人工进行或计算机辅助进行。
对于计算机辅助的比较，表达值可以与计算机程序储存在数据库中的对照值比较。计算机程序可以进一步评估比较结果，即以合适的输出形式自动提供所需的评估。
如实施例所示，本文列举的根据本发明的每一个预测性生物标志物均与预测对抗LPS免疫球蛋白治疗的应答相关，因为所有生物标志物的P值均等于或小于0.0001，除了IL6和BCHE预测性生物标志物。
可以通过在测定中组合预测性生物标志物提高统计相关性。在具体的实施方案中，评估本发明的15个预测性生物标志物中的2个预测定生物标志物，或3个、4个、5个、6个、7个或甚至8个的表达水平。
本发明的方法涵盖两个、三个、四个或更多个预测性生物标志物的任何组合。以下列出本发明的方法使用的预测性生物标志物的特定组合：
(i)CD14+TLR4+IGF-1+IL-8+IFN-α+CXCL10+GDNF
(ii)CD14+TLR4+IGF-1+IL-8+IFN-α+RAGE
(iii)CD14+CD68+TLR4+IGF-1+IL-8+IFN-α
(iv)CD14+TLR4+IGF-1+IL-8+IFN-α
(v)CD14+TLR4+IGF-1+IL-8
(vi)CD14+TLR4+IGF-1+IFN-α
(vii)CD14+TLR4+IGF-1+RAGE
或与提及的标志物的其他组合。
比较步骤不是必需包括每个生物标志物的表达水平与其相应的对照值的单独比较。在具体的实施方案中，可以通过将表达水平值或其归一化值组合在一起获得多个生物标志物评分值，并将其与相应的多个生物标志物评分对照值相比较。
预测性生物标志物
以下根据GenBank命名通过其缩写名(本文称为“基因符号”) 来描述本发明的15个预测性生物标志物：
生物标志物 UniprotKB/Swiss-Prot1
CD14 P08571
CD68 P34810
TLR4 O00206
TLR7 Q9NYK1
IL6 P05231
IL8 P10145
IL10 P22301
IFNα P01562
IGF1 P05019
CXCL1 P09341
CXCL9 Q07325
CXCL10 P02778
RAGE(＝AGER) Q15109
GDNF P39905
BCHE P06276
表1：预测性生物标志物的列表
1http://www.uniprot.org/
在本发明中，当提及生物标志物时，如上已经解释的，其可以是指编码所述生物标志物的基因(多核苷酸)，或任何其表达产物，包括转录RNA分子或相应的cDNA或蛋白质和/或其翻译后修饰。
如实施例的表2所示，与非应答者患者中的相应的相对表达值相比，已经表明应答者患者中的预测性生物标志物CD14、C68、TLR4、 TLR7、IL2、IL6、IL8、IFNα、CXCL1、CXCL9、CXCL10、GDNF、 RAGE和IGF1的相对表达值dCt显著更低。
与非应答者患者中的相应的相对表达值相比，已经表明应答者患者中的预测性生物标志物BCHE的相对表达值显著更高。
测定生物标志物的表达和用抗LPS免疫球蛋白的治疗
一旦患者被预测为抗LPS免疫球蛋白治疗的应答者，可以在治疗过程中以一个剂量、连续或间歇地仅向所述应答者患者施用合适的抗 LPS免疫球蛋白治疗。
测定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员熟知的，且随着治疗所用的组合物、治疗的目的和待治疗的受试者而变化。可以用治疗医师选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。可以根据经验调整合适的剂型和施用试剂的方法。优选地，使用口服制剂。
如果患者被预测为抗LPS免疫球蛋白治疗的非应答者，优选其他治疗。
在使用抗LPS治疗之前，可以测定选自表1的至少一个生物标志物。或者，可以一起测定选自表1的超过1个，例如2个、3个、4 个、5个、6个、7个或8个，或所有15个生物标志物。
本发明的试剂盒
本发明还涉及用于实施如上所述的本发明的预测方法的试剂盒。试剂盒可以包含多种试剂，其每一种均能够特异性结合一个或多个预测性生物标志物(其核酸或蛋白质)。用于这种试剂盒的合适的试剂包括抗体或核酸。例如，这种试剂盒包括如上所述的DNA微阵列。或者，这种试剂盒可以包括引物和探针，其用于对表1所列的一个或多个预测性生物标志物进行RT-qPCR。
因此，本发明的监测或预测试剂盒包括多种试剂，其每一种均能够特异性结合一个预测性生物标志物特异性的基因或蛋白质。特异性结合蛋白质生物标志物的合适的试剂包括但不限于抗体。
在具体的实施方案中，试剂盒包括用于定量下组生物标志物的特定试剂：
(i)CD14+TLR4+IGF-1+IL-8+IFN-α+CXCL10+GDNF；
(ii)CD14+TLR4+IGF-1+IL-8+IFN-α+RAGE；
(iii)CD14+CD68+TLR4+IGF-1+IL-8+IFN-α；
(iv)CD14+TLR4+IGF-1+IL-8+IFN-α；
(v)CD14+TLR4+IGF-1+IL-8；
(vi)CD14+TLR4+IGF-1+IFN-α；
(vii)CD14+TLR4+IGF-1+RAGE；
或与上述特异性标志物的其他组合。
具体实施方式
制备抗LPS IgY治疗
以下样品的原料药的制备过程包括四个主要步骤。第一步是用抗原制剂免疫接种六群母鸡(家鸡(Gallus gallus domesticus))产生IgY 鸡蛋，所述抗原制剂分别是大肠杆菌F18、鼠伤寒沙门氏菌、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、产气荚膜梭菌C(Clostridium perfringens C)、变形链球菌(Streptococcus mutans)的灭活全细胞细菌和白色念珠菌(Candida albicans)的真菌细胞。抓住六群不同的母鸡。每群用上述抗原之一免疫接种。第二步是鸡蛋加工，包括分离蛋黄、巴氏杀菌和蛋黄喷雾干燥。第三部是用己烷脱脂和用寡糖稳定，随后是第四步，通过混合等量的来自六群免疫接种母鸡的脱脂蛋黄粉末制备原料药。没有进一步配制混合的脱脂蛋黄粉末(原料药)。将它提供给患者，并用水吞服。或者，可以将其与原味酸奶混合，然后食用。通过竞争性ELISA用各自的内部标准测量特异性IgY活性。
实施例1：患有特发性慢性疼痛综合征的患者中的预测性生物标志物研究的患者队列
患者如果患有慢性特发性疼痛，无论其分类如何，并且对任何对症治疗无可接受的应答(慢性难治性疼痛综合征)，则将其纳入(n＝ 40)。排除对鸡蛋成分过敏的那些。治疗患者4周的时间。开始两周 IgY治疗的剂量是1.25g，每天两次，然后最后两周是2.5g，每天两次。通过临床和实验参数评估治疗效果。因此，对实验室参数进行了盲法评估。所用的方案由当地医学伦理委员会批准，并在获得采样前由患者给予知情同意。
临床参数
患者疼痛日记包含疼痛的每日总结评分(数字等级量表NRS)和 5个生活质量参数。疼痛日记可以选择每天记录三种不同类的疼痛症状(患有长期特发性疼痛的患者多数情况下呈现超过一种慢性疼痛综合征)。在试验开始之前，将具有超过一个慢性疼痛实体的患者根据他们对疼痛强度的个人感觉分级(疼痛1＝最高等级，疼痛3＝最低等级)。
研究的主要临床终点被定义为三种疼痛症状中至少一种的两个平均NRS-疼痛评分值变化。
主要终点
研究开始前5天时间和研究结束前5天时间的疼痛日记VAS-疼痛评分平均值的变化。将三种持续疼痛综合征中至少一种的数字等级量表(NRS)降低至少2个点定义为积极的结果。示出了含有靶标IgY 的脱脂蛋黄粉末的功效。相应的患者称为“应答者”。
次要终点
(i)研究开始前5天时间和研究结束前5天时间的“生活质量参数”平均值的变化(疼痛日记数据)。将数字等级量表(NRS)降低至少2个点定义为积极的结果。
(ii)治疗前后生物标志物值的显著变化(表示应答者患者)。
(iii)应答者相对非应答者的平均治疗前实验值的显著实验差异 (用于鉴定预测应答的生物标志物)。
(iv)意外的不良反应的发生率和严重程度。
对于总计40位患者，分析了来自38位个体的外周血，并与未治疗的健康志愿者(n＝30)的外周血相比较。
实时PCR
如下进行qRT-PCR：在两个时间点从在德国维尔茨堡大学用IgY 治疗的患有慢性疾病(慢性疼痛综合征)的患者采集外周血：(i)开始用IgY治疗前(T1＝第0周)，和(ii)用IgY治疗4周后(T2＝第 4周)。
为此目的，在两个时间点均从患者采集40ml EDTA外周血。为获得血细胞，混合一份的EDTA-血液和五份的裂解缓冲液(Fa. Qiagen)，并在室温(RT)下保持15分钟。然后，通过311g将试管离心10分钟，弃掉上清液。用RPMI 1640培养基(Fa.Gibco)洗涤外周血单核细胞(PBMC)沉淀。进行该程序三次。将细胞计数，并用“冷冻培养基”(即，储存于-80℃的灭活胎牛血清(FCS,Fa.Gibco)+10％二甲基亚砜(DMSO,Fa.Sigma))稀释为5x106个细胞/ml。
用逆转录接着定量实时PCR(RT-qPCR)分析基因表达。根据制造商的说明，用HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies,Carlsbad,CA)将总RNA逆转录为cDNA。
根据制造商的说明，用以下进行基因定量：(i)Taqman Gene Expression MasterMix(Life Technologies)和Taqman Gene Expression Assays(Life Technologies)。在Biorad CFX96Touch Real-Time PCR Detection System(Biorad,Hercules,CA)上进行分析。用Biorad CFX Manager Analysis software(Biorad)和Microsoft Excel 2010(Microsoft Corporation,Redmond,WA)分析定量数据；和(ii)MESA GREEN qPCRMasterMix Plus forAssay(Eurogentec,Seraing,Belgium)和 RT2qPCR PrimerAssays(Qiagen,Hilden,Germany)。为制备反应混合物，将12.5μl用于Assay的MESA GREEN qPCR MasterMix Plus、9.5μl dH2O和1.0μl RT2qPCR Primer Assay混合，并加入2.0μl cDNA稀释液(含有100ng cDNA)。
根据制造商的说明，在Biorad CFX96Touch Real-Time PCR Detection System(Biorad,Hercules,CA)上进行分析。用Biorad CFX Manager Analysis software(Biorad)和Microsoft Excel 2010(Microsoft Corporation,Redmond,WA)分析定量数据。
将管家基因β-肌动蛋白、18S RNA和PPIA用于相对定量。每个样品重复两次证明再现性。平均阈值循环(Ct)值计算为报告基因的荧光达到固定阈值的循环数。评估靶标孔中样品的平均Ct值与管家基因的平均Ct值之间的差异(dCt)。
鉴定治疗应答的预测性生物标志物
在研究开始前(在第一剂DYP IgY产品摄入之前)和研究的最后一天采集血液样品。
分析以下生物标志物：白细胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-1Rα、IL-2、 IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、 IL-17、IL-18、干扰素(IFN)-α、IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-RI、 TNF-RII、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、CCL3、CCL4、CCL5、 CCL7、CCL8、CCL11、趋化因子受体(CXCR)3、趋化因子(C-X-C基序)配体1(CXCL1)、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、活化B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)、环氧合酶(COX)-2、高级糖化终产物受体(RAGE)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、热休克蛋白 (HSP)70、HSP90、CD14、CD19、CD20、CD21、CD45、CD68、toll 样受体(TLR)2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、P物质、白三烯B4(LTB4)、Fractalkin、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、硫代丁酰胆碱(BChE)。
测定蛋白质和基因表达水平。从Biosource(Camarillo,Germany) 购买捕获抗体涂层的小珠和标记的检测抗体的面板，用基于免疫小珠的多重测定(Luminex分析)重复测量两次血清样品中以下的蛋白水平：IL-1α、IL-1β、IL-1Rα、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IFN-α、IFN-γ、 TNF-α、TNF-RI、TNF-RII、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CXCR3、CXCL1、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、GM-CSF、EGF、VEGF和碱性FGF。试剂经过制造商的预先测试和鉴定，以确保抗体涂层的小珠之间不存在交叉反应性。用 Bio-Plex System(Biosource)进行测定。根据制造商的说明，用免疫测定(ELISA)测量患者血清中的人IGF-1、P物质、LTB4、RAGE和 BChE(R&DSystems,Wiesbaden,Germany)。
为测定细胞的量，根据制造商的说明，用流式细胞仪(FACS)分析在两个时间点的每一个从患者获得的并在上分离的外周血样品(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)。用以下染色细胞(5× 105)：PE偶联的抗CD14、抗CD68、FITC偶联的抗CD45和7AAD、PE偶联的抗CD25、FITC偶联的抗CD3和7AAD和PE偶联的抗小鼠IgG2a。所有抗体均从BeckmanCoulter(Krefeld,Germany)购买。在 FACS-Epics XL-MCL(Beckman Coulter)上进行四色流式细胞术，用 Expo 32采集软件(Beckman Coulter)分析细胞。门控活的淋巴细胞并收集105个事件。
结果
●38位患者(24位女性和14位男性)完成了研究；他们的平均年龄是54岁，疼痛史的平均持续时间是12.6年。
●所有38位患者记录至少一种疼痛的过程，30位患者记录至少两种的过程，26位记录三种不同类的疼痛综合征的过程。
●方差分析(ANOVA)表明应答者研究患者组对IgY治疗的显著疼痛缓解，此外，当应答者被分组在一起时，疼痛综合征1、2和3 的疼痛缓解是显著的。这意味着作为一组，应答者患者在一种疼痛综合征平均显示显著的缓解，在其第二和第三疼痛实体中具有同样的缓解。
●根据主要终点的定义，完成研究的38位受试者中，24位被鉴定为IgY应答者。
●所有24位IgY应答者均满足临床和实验室反应标准。
●14位受试者被鉴定为IgY非应答者，其不满足临床和实验室反应标准。
●相关的实验参数(基因表达)可以鉴定为治疗上与IgY功效相关的潜在预测性生物标志物。
●2位患者由于违反协议而退出研究，一位由于在研究结束前几天出现持续咳嗽而退出。
在研究的第二部分期间，在IgY剂量2x2.5g下产生主要的治疗效果。
统计分析和鉴定选为IgY治疗的潜在预测性标志物的预测性生物标志物
用T检验比较健康志愿者和非应答者或应答者以及非应答者和应答者之间的每一个所用的参数。此外，还用单因素ANOVA比较健康志愿者和非应答者以及应答者之间的每一个参数。所用的统计程序是GraphPad Prism5。将显著不同的、健康志愿者和非应答者以及应答者之间p<0.05的参数选为IgY治疗的潜在预测性标志物。
下表2示出了应答者和非应答者组之间每个预测性生物标志物的相对表达数据，其中P值表示统计显著性：
表2：应答者和非应答者中预测性生物标志物的表达值的比较。
结论
多价抗革兰氏阴性完整细菌免疫球蛋白Y提供了甚至在患有非常晚期的慢性化的患者中治疗特发性疼痛综合征的全新方法，并首次突出了作为广谱慢性疼痛表型的非常复杂的病因中的主要成分之一的新的共同致病机制。
口服应用多价抗革兰氏阴性完整细菌免疫球蛋白Y在超过60％的患者(治疗性应答者)中产生可持续的疼痛缓解。
鉴定了预测性生物标志物，不仅区分了健康受试者和疼痛患者，而且区分了对IgY治疗应答的患者和不应答的患者。该观察结果提供了应用口服多价抗革兰氏阴性完整细菌免疫球蛋白Y治疗应答测试之前的预后实验室筛选试验。
通过这种观察，潜在的预测性标志物的代表性实例允许鉴定在血液中具有这些标志物的患者群体作为抗LPS免疫球蛋白治疗的治疗应答标准。
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Claims (15)

1.一种用于预测需要的患者中抗LPS免疫球蛋白治疗的应答的体外方法，所述方法包括评估从所述患者获得的生物样品，例如血液样品中一个或多个生物标志物的表达的步骤，所述一个或多个生物标志选自CD14、CD68、TLR4、TLR7、IL6、IL8、IL10、IFN-α、IGF1、CXCL1、CXCL9、CXCL10、RAGE、GDNF和BCHE。
2.权利要求1所述的方法，其中所述评估步骤包括：(a)定量从所述患者获得的生物样品中一个或多个选择的生物标志物的表达以获得每个定量生物标志物的表达值，和(b)将步骤(a)获得的每个表达值与对应的对照值进行比较。
3.权利要求2所述的方法，其中所述对照值对应于在非应答者患者、应答者患者和/或健康受试者中观察到的表达值。
4.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述抗LPS免疫球蛋白治疗是IgY组合物，优选用于口服施用的IgY组合物。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述IgY组合物获得自用优选来自至少两个不同的革兰氏阴性细菌物种的革兰氏阴性细菌或其含有LPS的部分免疫接种的母鸡。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述患者是患有由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的慢性疾病的人受试者，优选地，所述慢性疾病是选自以下的疾病之一：
-特发性慢性疼痛综合征，包括但不限于慢性广泛性疼痛、纤维肌痛、冻结肩或肩周炎、口腔黏膜炎、腕管综合症和膀胱综合征；
-偏头痛、慢性头颈部减速创伤、上髁炎、撞击综合征；
-移植物抗宿主病(GVHD)、慢性炎性胃肠疾病，包括但不限于克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠易激综合征；
-冠状综合征、系统性红斑狼疮、寻常型天疱疮、硬皮病；
-骨关节炎和动脉粥样硬化。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中定量选择的生物标志物中2个、3个、4个或5个标志物的表达。
8.抗LPS免疫球蛋白组合物在用于治疗由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的慢性疾病的方法中的用途，其中已经通过评估所述患者中选自以下的一个或多个生物标志物的表达，将所述患者选为所述抗免疫球蛋白制剂的应答者：CD14、CD68、TLR4、TLR7、IL6、IL8、IL10、IFN-α、IGF1、CXCL1、CXCL9、CXCL10、RAGE、GDNF和BCHE。
9.根据权利要求8所述的抗LPS免疫球蛋白组合物的用途，其特征在于，所述方法包括将所述一个或多个选择的生物标志物的每一个的表达水平与相应的对照值进行比较的步骤。
10.根据权利要求8或9所述的抗LPS免疫球蛋白组合物的用途，其是优选用于口服施用的IgY组合物，更优选从用革兰氏阴性细菌或其含有LPS的部分免疫接种的母鸡获得的IgY组合物。
11.根据权利要求8-10任一项所述的抗LPS免疫球蛋白组合物的用途，其中由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的所述慢性疾病选自：
-特发性慢性疼痛综合征，包括但不限于慢性广泛性疼痛、纤维肌痛、冻结肩或肩周炎、口腔黏膜炎、腕管综合症和膀胱综合征；
-偏头痛、慢性头颈部减速创伤、上髁炎、撞击综合征；
-移植物抗宿主病(GVHD)、慢性炎性胃肠疾病，包括但不限于克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠易激综合征；
-冠状综合征、系统性红斑狼疮、寻常型天疱疮、硬皮病；和
-骨关节炎和动脉粥样硬化。
12.一种用于治疗由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的慢性疾病的方法，包括向患有所述慢性疾病的患者施用治疗有效量的抗LPS免疫球蛋白组合物，其中所述患者是所述抗LPS免疫球蛋白药物的应答者，其中已经通过评估选自以下的一个或多个生物标志物的表达水平选择所述应答者：CD14、CD68、TLR4、TLR7、IL6、IL8、IL10、IFN-α、IGF1、CXCL1、CXCL9、CXCL10、RAGE、GDNF和BCHE。
13.权利要求12所述的方法，包括以下步骤：
(a)提供来自患者的生物样品，例如血液样品；
(b)评估所述生物样品中一个或多个选择的生物标志物的表达；和
(c)只有当所述患者基于评估步骤(b)被预测为所述抗LPS免疫球蛋白治疗的应答者时才向所述患者施用治疗有效量的所述抗LPS免疫球蛋白治疗。
14.权利要求12或13所述的方法，其中所述抗LPS免疫球蛋白治疗是治疗有效量的IgY组合物，优选用于口服施用的IgY组合物，更优选从用革兰氏阴性细菌或其含有LPS的部分免疫接种的母鸡获得的IgY组合物。
15.权利要求12-14任一项所述的方法，其中由外周血中活化单核细胞(CD14+)诱导的所述慢性疾病选自：
-特发性慢性疼痛综合征，包括但不限于慢性广泛性疼痛、纤维肌痛、冻结肩或肩周炎、口腔黏膜炎、腕管综合症和膀胱综合征；
-偏头痛、慢性头颈部减速创伤、上髁炎、撞击综合征；
-移植物抗宿主病(GVHD)、慢性炎性胃肠疾病，包括但不限于克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠易激综合征；
-冠状综合征、系统性红斑狼疮、寻常型天疱疮、硬皮病；和
-骨关节炎和动脉粥样硬化。
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