CN107884579B - 选择适配体的方法和利用差别亲和力的多重免疫分析 - Google Patents

选择适配体的方法和利用差别亲和力的多重免疫分析 Download PDF

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Abstract

本发明提出了利用捕捉配体与目标分析物之间的结合对间的差别亲和力的多重免疫分析。描述了选择对目标分析物具有所需亲和力的适配体的窗口磁力辅助的快速适配体选择(窗口‑MARAS)方法，和通过利用所选适配体作为试剂中的捕捉配体来产生在一次分析中进行多重免疫分析或多重检测的试剂的方法，并且所述方法用于基于捕捉配体与目标分析物之间的结合对的差别亲和力，证实多重免疫分析的可行性。

Description

选择适配体的方法和利用差别亲和力的多重免疫分析
技术领域
本发明大体上涉及一种利用差别亲和力(differential affinity)的多重免疫分析(multiplex immunoassay)方法和产生用于多重免疫分析的适配体类试剂(aptamer-based reagents)的方法。具体地说，本发明涉及一种产生适配体类试剂的磁力辅助的差别亲和力选择方法和一种使用适配体类试剂的利用差别亲和力的多重免疫分析方法。
背景技术
多重免疫分析已经广泛地用于基础生物医学研究中，因为其能够将大量不同的分析全部在单一反应容器中用相对较小的样品体积高效地进行。在多重免疫分析中，高亲和力高特异性的捕捉配体呈并行阵列固定在平面阵列中或编码的微米球上。当与样品一起培养时，目标分析物分别结合于对应的捕捉配体，并形成配体-目标复合物。在进行洗涤以去除未结合的物质后，与检测标记结合的报导配体附接到所结合的复合物。接着检测装置用于定量检测标记，接着使用预定校准曲线来转化成目标分析物的质量浓度。在单个实验中可分析的目标分析物的数目高达数百。因此，多重免疫分析变成基础生物医学研究中强有力的分析工具。但是，除了复杂性和昂贵外，仍然存在大量的问题和挑战，包含各种分析物的大量高度特异性捕捉配体的可用性、捕捉配体与分析物和分析稀释剂之间的交叉反应性、基质效应的干扰、当研发多个分析时所需的分析参数的折衷以及对用于检测的预先标记的报导分子的需求。
另一方面，出于临床诊断的目的，多重免疫分析也变得至关重要，因为其能够鉴别广泛疾病的多种生物标记物。即使多重免疫分析在一次分析中能够分析高达百种分析物，其在诊断疾病也只需要几种生物标记物(理想地，至多四种生物标记物)。需要发展一种特别用于临床应用的多重免疫分析平台。
包含结合袋(binding pockets)的适配体以高特异性和亲和力结合于多种目标分析物，从小分子(例如有机分子、离子、肽、蛋白质、核酸)、大分子甚至到全细胞、病毒、寄生虫或组织。一旦鉴别出用于目标分析物的适配体的序列，就可以通过化学合成来产生整个适配体。此外，经官能团修饰的适配体会增加其在可能对核酸有害的各种生物应用中的稳定性。适配体不仅潜在能够成为靶向致病性和恶性细胞或组织并取代抗体的优良工具，而且还可以用于纯化、诊断学、生物传感器和抗感染剂。因为适配体在许多方面具有潜能，所以已经发展一种有效选择方法—磁力辅助的快速适配体选择(Magnetic-Assisted RapidAptamer Selection,MARAS)，所述方法足够简单明了，从而快速筛选对目标分析物具有高亲和力和特异性的适合适配体。
发明内容
本发明的一些方面涉及利用捕捉配体与对应的目标分析物之间的差别亲和力的多重免疫分析。本发明的一些方面涉及用于合成能够在一次分析中进行多重检测的适配体类试剂的方法。并且，本发明的一些方面涉及一种特别用于临床应用的多重免疫分析平台，其使用适配体类试剂，利用差别亲和力，具成本低，操作简单，并且分析时间快。
本发明的一些方面提供了用于在单次分析中检测和/或定量多种分析物的方法，具体地说，基于差别亲和力(结合力)的多分析物分析。本发明的分析采用捕捉配体与目标分析物之间的结合对的差别亲和力来区别测试样品中不同的所捕捉的分析物并进行定量。
本发明的一些方面涉及使用窗口-磁力辅助的快速适配体选择(window-MARAS)来选择对不同目标分析物具有所需亲和力的单个适配体、合成能够在一次分析中进行多重检测的适配体类试剂并使用适配体类试剂检测和定量样品中的多种分析物的方法。窗口-MARAS是一种MARAS程序，其利用外部施加的振荡磁场的下限和上限频率/强度来从寡核苷酸库选择对目标分析物具有所需亲和力范围的适配体。
本发明的一些方面涉及使用窗口-MARAS选择对所对应的分析物具有所需亲和力的不同适配体、合成能够在一次分析中进行多重检测的适配体类试剂以及使用所述适配体类试剂检测和定量样品中的多种分析物的方法。
本发明提供了一种适配体选择方法，其利用生物官能化的磁性粒子从DNA库筛选能够结合于目标分析物的寡核苷酸。
本发明提供了一种亲和力区分装置，其在多重免疫分析期间利用生物官能化的磁性粒子联合外部施加的振荡磁场来区别样品中的适配体与目标分析物之间的结合对的亲和力。
为了使本公开的前述以及其它特征和优点易于理解，伴随附图，下文详细描述若干示例性实施例。
附图说明
包含所述附图以提供对本公开的进一步了解，并且并入本说明书中并构成本说明书的一部分。所述图式说明本公开的实施例，并且与描述一起用于解释本公开的原理。
图1示意性地说明根据本发明的一些实施例，利用捕捉配体与目标分析物之间的差别亲和力的多重免疫分析方法。
图2示意性地说明根据本发明的一些实施例，使用窗口-MARAS方法选择能够以差别亲和力结合多个目标分析物的适配体的方法。
图3示意性地说明根据本发明的一些实施例，使用窗口-MARAS方法选择能够以所需亲和力范围结合特定目标分析物的适配体的方法。
图4示意性地说明根据本发明的一些实施例，使用窗口-MARAS筛选具有各种解离常数(差别亲和力)的适配体的频率相依性。
图5A是根据本发明的一个实施例，旋转磁场磁力辅助的快速适配体选择(RO-MARAS)方法的实验设置的示意图。
图5B是根据本发明的一个实施例，交变磁场磁力辅助的快速适配体选择(AC-MARAS)方法的实验设置的示意图。
图6A-6F绘示根据本发明的一些实施例，经由定量实时PCR(q-PCR)获得的六种多重结合适配体进行反向验证的结果。
图7A-7F绘示根据本发明的一些实施例，MP-1适配体对多个目标分析物的平衡解离常数(Kd)。
图8A-8C绘示根据本发明的一些实施例，通过基于适配体的ELISA来验证MP-1适配体以差别亲和力结合多个目标分析物的重复照片影像(上排和下排)。
图8D绘示对照、P1、P2以及P3的所测量的光密度。
图9A-9C绘示通过q-PCR，使用MP-1适配体作为捕捉配体的目标分析物的标准校准曲线，分别是相对表达水平对比BD缓冲液中的CRP、HBs Ag以及HCV NS3量。
图10绘示根据本发明的一些实施例，使用含有MP-1适配体作为捕捉配体的试剂，在样品中回收的目标分析物的量。
图11绘示根据本发明的一些实施例，对获得的适配体经由q-PCR进行反向验证的结果。
图12绘示根据本发明的一些实施例，对获得的适配体的交叉反应实验经由q-PCR的实验结果。
图13A-13F绘示根据本发明的一些实施例，适配体K1-1、K2-4以及K3-1适配体对不同目标分析物的平衡解离常数。
图14A-14C绘示通过q-PCR分析，使用K1-1、K2-4以及K3-1适配体作为捕捉配体的目标分析物的标准校准曲线，分别是K1-1的相对表达水平对比BD缓冲液中的CRP量、K2-4的相对表达水平对比BD缓冲液中的HBs Ag量以及K3-1的相对表达水平对比BD缓冲液中的HCVNS3量。
图15A-15D绘示根据本发明的一些实施例，使用含有K1-1、K2-4以及K3-1适配体作为捕捉配体的试剂，在样品中回收的目标分析物的量。
具体实施方式
本发明的一些方面涉及利用捕捉配体与对应的目标分析物之间的差别亲和力的多重免疫分析。本发明的一些方面涉及用于选择对不同的目标分析物具有差别亲和力的单个适配体的窗口-MARAS方法。本发明的一些方面涉及用于选择对分析物具有所需亲和力的适配体的窗口-MARAS方法。本发明的一些方面涉及通过利用所选适配体作为试剂来产生在一次分析中进行多重免疫分析或多重检测的试剂的方法。并且，本发明的一些方面涉及一种使用所合成的适配体类试剂检测和测定样品中多种目标分析物的量的方法。
一般来说，结合对的亲和力根据平衡解离常数，在数百纳摩尔到较低皮摩尔的范围内。通过小心地挑选具所需亲和力的捕捉配体和结合目标分析物的结合对，使得多重分析中的不同组的捕捉配体与目标分析物间的结合强度不同，并应用亲和力区分机制区分不同结合对，可实现多重免疫分析。图1示意性地说明多重免疫分析的概念，其利用样品中捕捉配体与目标分析物之间的结合对间的差别亲和力。一般来说，捕捉配体应用于多重免疫分析以检测或定量样品中的目标分析物。在混合及培养后，各种捕捉配体与样品中对应的目标分析物(生物分子)形成配体-分析物复合物，又称为结合对。取决于结合对的捕捉配体及目标分析物，不同类型的结合对具有不同结合强度或不同亲和力。随后，配体-分析物复合物经受亲和力区分装置以通过不同结合亲和力来区分不同类型结合对。由捕捉配体与捕捉的分析物形成的结合对包含(但不限于)以下各对：抗体-抗原、DNA/RNA适配体-捕捉的分析物和DNA/RNA序列与其互补序列(核酸杂交)。在某些实施例中，捕捉配体可以特异性地结合于单个目标分析物。在其它实施例中，捕捉配体能够结合于多个目标分析物。前一状况意谓一种类型捕捉配体只能特异性地结合于其对应目标分析物。后一状况意谓一种类型捕捉配体可以分开或同时特异性地结合于多个目标分析物。每种类型结合对具有不同结合强度，取决于形成此对的捕捉配体和目标分析物。此外，捕捉配体包含(但不限于)抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及抗体片段)、核苷酸(例如寡核苷酸、聚核苷酸、核酸、核酸配体、DNA/RNA适配体)以及已知可以结合于至少一个目标分析物的任何其它配体。另外，目标分析物包含(但不限于)所有类型抗原，例如蛋白质、多糖以及偶合于蛋白质、肽、核酸(DNA和RNA)、碳水化合物、抗生素、有机分子、离子、细胞、病毒、寄生虫或组织的小分子。用于区分结合对的亲和力区分装置提供亲和力区分机制并且包含(但不限于)机械力(例如，在复合物自由悬浮于水溶液中的情况下，由配体-分析物复合物的运动所诱发的拉伸力，例如在水溶液中磁性粒子与配体-分析物结合，由振荡磁场驱动的运动)；在复合物附接到固定衬底或截留(例如流体通道)的情况下由严格洗涤诱发的流体动力；以及在圆盘实验室(lab-on-a-disc)中通过使附接于固定衬底或捕获(例如流体通道)的配体-分析物复合物旋转所诱发的离心力；电磁力(例如，在使用磁性物质的情况下由梯度磁场诱发的静态磁力和在使用带电物质的情况下由电场诱发的静态电力)；或以上各力的任何组合。为了执行亲和力区分机制，可以使用通过改变水溶液中的磁性粒子运动所产生的拉伸力、通过改变流体通道中的缓冲液洗涤速度所产生的流体动力、通过使圆盘以不同旋转速率旋转所产生的离心力以及通过改变梯度磁场和/或电场的强度所产生的电磁力。应注意，亲和力区分机制能够用于选择具有所需亲和力范围的结合对以及还能够在检测和定量阶段期间区分配体-分析物复合物的结合对。
一般来说，适合于本发明的实施例的免疫分析的载体类型包含固体载体免疫分析、可移动载体免疫分析以及组合载体免疫分析。对于固体载体免疫分析来说，捕捉配体或目标分析物连接并固定到表面，接着目标分析物/捕捉配体分别结合于捕捉配体/目标分析物，因此形成配体-分析物复合物。对于可移动载体免疫分析，微米或纳米粒子用于替换固定表面，并且配体-分析物复合物结合在粒子表面上，形成配体-分析物-粒子或分析物-配体-粒子复合物，其中如果使用磁性粒子或介电粒子，那么可以分别使用磁场或电场来操控配体-分析物-粒子/分析物-配体-粒子复合物。在免疫分析的一些过程(例如洗涤步骤或分离步骤)期间，用于可移动载体免疫分析的粒子自由悬浮在水溶液中并可移动，并且任选地通过各种收集装置来收集，例如使用永久磁铁捕获或收集磁性粒子、电场捕捉介电粒子或几何形状捕获粒子，并且此类免疫分析称为组合载体免疫分析(combined-supportimmunoassays)。
在本发明的某些实施例中为检测和定量样品中的分析物，使用与标记或标签结合的报导配体。报导配体键结于配体-分析物复合物，并采用检测装置测量标记的量。在本发明的另一实施例中，例如无标记的分析法，不需要报导配体和/或标记。一般来说，在有或无标记或标签下捕捉配体、目标分析物和/或报导配体之间的结合可以分类成三种类型：直接、夹心和竞争类型，如ELISA中常用的那些操作。本发明是针对利用差别亲和力的多重免疫分析，并且可以采用免疫分析领域的技术人员已知的任何可行的检测方法或结合类型，不意图限制检测方法或结合类型。接着经由预定校准曲线，将测量的量转化成分析物的质量浓度/量。标记为(但不限于)放射性物质、酶、脂质体类标记、生色团、荧光团、染料或其组合。在本发明的其它实施例中，不使用报导配体，其中标记直接结合于捕捉配体。适合用于本发明的检测方法包含(但不限于)光学/荧光检测、放射性化学检测、电化学检测、阻抗检测、磁性检测(条件是磁性粒子用作配体-分析物复合物的可移动载体)或生物医学分析中常用的任何检测。
在示范多重免疫分析前，制备能够以差别亲和力结合于多个目标分析物的捕捉配体以产生用于多重免疫分析的试剂。在本发明中，使用窗口-MARAS获得的适配体用作捕捉配体来检测或定量免疫分析中的目标分析物，以证实本发明的可行性。如图2及图3中所示，示意性说明筛选(或产生)具有上述特征的适配体的选择方法的程序。在图2或图3中描绘的程序中，涉及四个主要部分：(1)材料准备；(2)阴性选择；(3)阳性选择；以及(4)后分析，包含PCR扩增、克隆、测序、反向验证以及平衡解离计算，并且下文描述四个主要部件的某些方法步骤或细节。
在材料准备的过程中，经预处理以去除极少或低浓度干扰蛋白质的若干生物样品(j)(例如人类血清样品)(又称为空白样品或空白血清)个别地进行生物素化并接着与链霉抗生物素蛋白涂布的磁性纳米粒子(SA-MNPs)结合以形成阴性血清-磁性纳米粒子(NS-MNPs(j))，并且干扰蛋白质可以是血清或其它类似蛋白质中天然存在的主要目标分析物。并且，纯主要目标分析物(i)个别地进行生物素化并接着与SA-MNPs结合以形成目标分析物-磁性纳米粒子(PS-MNPs(i))。NS-MNPs和PS-MNPs的下标j和i分别独立地是从1开始的整数。应注意在产生适配体和使用适配体类试剂的多重免疫分析的整个实施例中，所用磁性粒子(MPs)不限于磁性纳米粒子(MNPs)并且磁性微米粒子(MMPs)的使用在以下实验中将类似于MARAS程序的实验中的实现一样达到类似的结果。寡核苷酸库包含在两端侧接引物用于进行PCR扩增的随机化寡核苷酸序列。一组引物标示正向引物(Lab-forward primer)和标示反向引物(Lab-reverse primer)用于在PCR扩增期间使所得寡核苷酸(适配体)简并区(degenerating region)退火。通用T7引物用于对所选适配体的核苷酸测序。2013年10月28日提交的先前美国专利申请第14/065,382号的全部内容以引用的方式并入本文中并构成本说明书的一部分。
对于阴性选择来说，将寡核苷酸库与NS-MNPs(1)一起在结合缓冲液(BD：50毫摩尔浓度NaH2PO4、pH 8.0、150毫摩尔浓度NaCl、5毫摩尔浓度KCl、2毫摩尔浓度MgCl2、0.05％(v/v)吐温-20(Tween-20))中培养。培养后，进行磁性分离，以去除结合混合物并收集含有未与NS-MNPs(1)结合的剩余寡核苷酸的上清液。接着将收集的上清液与下一NS-MNPs(2)一起培养，并重复所述过程，直到完成所有NS-MNPs(j)的阴性选择。多次阴性选择操作的目的是将所选适配体与样品中除目标分析物外的物质之间进行结合的可能性降到最低，以便减少免疫分析应用期间可能的假阳性检测。相同的原理可以应用于单一免疫分析以增强检测灵敏度，在单一免疫分析中所选适配体只能与单个目标分析物结合。理论上，阴性选择操作次数进行得越多，在免疫分析期间可以达到的灵敏度越高(假阳性检测越少)。收集完成阴性选择后的最终上清液用于以下阳性选择。或者，使用来自所有NS-MNPs(j)混合的NS-MNPs的一次阴性选择操作替换使用个别NS-MNPs(j)的多次阴性选择操作将达到相同结果。但是，必须注意，使用混合NS-MNPs，BD缓冲液中的MNPs的浓度可能变得过高，使得MNPs变得容易聚结，并对选择产生不利的影响。
对于阳性选择来说，将从阴性选择收集的上清液与PS-MNPs(1)一起在结合缓冲液(BD)中培养。进行磁性分离以收集结合混合物并使结合混合物分散于BD缓冲液中，同时丢弃上清液中未结合的寡核苷酸。溶液经受具有下限频率f1L的第一旋转磁场下的窗口-MARAS，通过磁性分离来去除上清液，并使收集的结合混合物再分散于BD缓冲液中。接着，施加具有上限频率f1U的第二旋转磁场以分离以所需亲和力与第一目标分析物结合的适配体。进行磁性分离以去除结合混合物并收集含有对第一目标分析物具有所需亲和力范围的所得适配体的上清液。接着将上清液与下一阳性目标分析物PS-MNPs(2)一起培养，并重复程序，直到完成所有PS-MNPs(i)的阳性选择。接着在完成阳性选择操作后收集的上清液用于以下后分析，例如PCR扩增、克隆、测序、反向验证以及平衡解离常数计算。图2中示意性地说明用于产生能够与多个目标分析物结合的单一适配体的程序，包含阴性和阳性选择。或者，在阳性选择的最后一次操作，在施加具有下限频率的旋转磁场后，使收集的结合混合物再分散、加热、洗提并磁性分离，以获得最终上清液用于后分析。一旦已验证所选适配体，就可以将其用作用于免疫分析或多重免疫分析的试剂的捕捉配体以检测或定量目标分析物的量。此合成试剂仅仅含有一种能够以差别亲和力与多个目标分析物结合的适配体。
在施加旋转磁场期间，值得注意的是，磁场强度因使用功率放大器的性能而保持恒定。但是，场强度可调节。此外，为确保所得适配体对不同目标分析物具有差别亲和力，对施加的旋转磁场的频率(f)施加约束条件，即fiL<fiU≤f(i+1)L。类似地，在场强度(H)可调节的情况下，约束条件变成fiL<fiU≤f(i+1)L和/或HiL<HiU≤H(i+1)L。此外，对于相同窗口-MARAS方法，具有下限和上限频率/强度(fiL、HiL、fiU以及HiL)的交变磁场亦可以用于实现相同结果，其条件是fiL<fiU≤f(i+1)L和/或HiL<HiU≤H(i+1)L。还值得注意的是，如果样品中若干目标分析物的组合量是主要关注点，那么在阳性选择期间相同频率范围可以用于这些若干目标分析物。
或者，含有多个(不同类别)适配体作为捕捉配体的试剂将用于多重免疫分析，而每种适配体能够与其对应的目标分析物结合并且不同适配体对其对应的目标分析物的结合亲和力是不同的(差别亲和力)。与图2概述的程序相比，图3描绘的程序中，对部分(2)阴性选择和(3)阳性选择进行一些修改。为产生对特定目标分析物具有所需亲和力的适配体，阳性选择操作将除特定目标分析物外的这些目标分析物除去并添加到阴性选择操作。因此，在图2中概述的阴性选择操作完成后，使用除特定主要目标分析物(i)外的辅助目标分析物(k)的PS-MNPs作为NS-MNPs并根据阴性选择的相同程序，进行额外阴性选择操作。对于阳性选择来说，仅仅需要一次使用特定目标分析物(i)的PS-MNPs的操作。图3中说明用于产生能够以所需亲和力范围结合特定目标分析物(i)的适配体的程序。进行图3的程序以获得所有目标分析物的对应适配体。接着可以将从此程序获得的能够与其对应目标分析物结合的所有类别适配体混合以形成用于多重免疫分析的试剂。应注意，仍然应该使用图2上施加的旋转磁场频率施加约束条件，fiL<fiU≤f(i+1)L，以便获得能够结合于其对应目标分析物的亲和力与不同类别适配体对其对应目标分析物的亲和力不同的一类适配体。类似地，上文针对振荡磁场的频率和/或强度所提及的约束条件、阴性选择的替代方式和阳性选择的最后一次操作的替代方式仍然适用。此外，值得注意的是，对于图2和图3中概述的程序，可以在阴性选择操作前进行阳性选择操作，达到类似于标准MARAS程序般的相同结果。
图4中，在概念上绘示MARAS中施加的磁场频率与通过MARAS筛选的适配体的解离常数(Kd)的关系，并可以通过施加下限频率和上限频率来选择具有所需结合亲和力范围(或所需Kd值或范围)的适配体。可以通过在不重叠频率范围下改变所施加的振荡磁场的下限频率(f(i)L)和上限频率(f(i)U)，获得对目标分析物具有差别亲和力的适配体。
MARAS的实验设置
如下描述用于进行MARAS方法的实验设置。实验设置包含至少两组用于产生振荡磁场的线圈100、功率放大器200、信号发生器300并用LABVIEW计算机程序操作。用于MARAS之振荡磁场在旋转磁场-MARAS(RO-MARAS)的情况下可以是旋转磁场，或在交变磁场-MARAS(AC-MARAS)的情况下是交变磁场。对于RO-MARAS来说，通过两组垂直放置的亥姆霍兹线圈(Helmholtz coil)100来产生旋转磁场。LABVIEW程序300经由NI BNC-2110捕捉盒用于发送两个信号cos(ωt)和sin(ωt)到双通道功率放大器200(HCA3030D)。接着同等地放大此两个信号，来同时驱动两组线圈产生旋转磁场。实验设置示意性地绘示于图5A中。图中，将样品放在两组亥姆霍兹线圈100的中心线的交叉点处。但是，还可以使用其它替代设置来产生旋转磁场。对于AC-MARAS来说，通过由信号发生器300和电流产生器单元200驱动的单个激励螺线管(excitation solenoid)100来产生磁场，如图5B中示意性地绘示，其中样品放在螺线管100内。应注意，如果计算机程序仅仅发送一个信号到一组亥姆霍兹线圈来产生AC磁场，那么图5A的设置也能够用于AC-MARAS。此外，其它替代设置也可以用于产生交变磁场。此外，其它类型的振荡磁场也适用，例如椭圆形磁场，其可以通过针对来自信号发生器300的正弦和余弦信号使用功率放大器200的不同放大系数，使用图5A中描绘的设置来产生。
在示例性实施例中，捕捉配体是ssDNA适配体并且目标分析物是蛋白质。首先，一个示例性实施例展示用于从随机化寡核苷酸库选择一类单个ssDNA适配体(一类)的方法能够以差别亲和力结合于三种不同目标分析物。所得ssDNA适配体充当试剂中的捕捉配体以检测和定量此三种特定目标分析物用于多重免疫分析。但使用相同的以上三种目标分析物，另一示例性实施例展示用于选择能够分别以不同所需亲和力范围结合于其对应目标分析物的三类ssDNA适配体(三类)的方法；将所得适配体混合以形成能够检测和定量这些目标分析物的试剂用于多重免疫分析。此外，使用以上试剂和目标分析物，其它示例性实施例使用定量实时PCR(q-PCR)实验证实利用差别亲和力的多重免疫分析的适用性。
材料准备
在进行窗口-MARAS方法前，需要准备材料。材料准备包含准备随机寡核苷酸库，准备目标分析物并将目标分析物与随机寡核苷酸库一起培养。这些准备步骤将在以下章节概述。
寡核苷酸库和引物
最初寡核苷酸库的长度是50聚体，并由随机化20聚体中段(N20)和在两端具有15聚体固定区段的两个引物组成。寡核苷酸序列是(5'-AGCAGCACAGAGGTC-N20-GCGTGCTACCGTGAA-3')，由生工(MDBio)(台湾台北的生工公司(MDBio,Taipei,Taiwan))合成并进行PAGE纯化。一组引物(标示正向Lab-F：5'-AGCAGCACAGAGGTC-3'和标示反向Lab-R：5'-TTCACGGTAGCACGC-3')用于在PCR扩增期间库的5'和3'简并区的退火。具有与上述相同序列的5'-生物素化的引物Lab-生物素-F和Lab-生物素-R用于分别将生物素-正向单股和正向单股核苷酸从双股PCR产物分离。通用T7引物用于对所选适配体的核苷酸测序(T7：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')。值得注意的是，可以使用不同长度和序列的随机寡核苷酸库和其对应引物，而不改变本发明的结果。
CRP、HBs Ag、HCV NS3和血清涂布的生物官能化的磁性粒子
在此研究中，对于阳性选择来说，人类C反应蛋白(CRP)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和丙型肝炎病毒非结构蛋白3(HCV NS3)购自迈博生(MyBioSource)(美国圣地亚哥的迈博生(MyBioSource,San Diego USA))并分别用作结合目标-1(P1)、结合目标-2(P2)和结合目标-3(P3)。六名健康志愿者提供三个阴性选择和三个盲法测试的血清。志愿者的血清的CRP、HBs Ag和HCV NS3蛋白质浓度不可检测(CRP浓度，<0.02微克/毫升，加利福尼亚州富勒顿的贝克曼公司的贝克曼DxC分析器(Beckman DxC analyzer,Beckman Corporation,Fullerton,CA)；HBV DNA不可检测，<15国际单位/毫升，q-PCR；HCV DNA不可检测，<15国际单位/毫升，q-PCR)。即使CRP含量在检测极限以下，CRP仍然存在于血清中。因此，为避免在适配体选择阶段和验证阶段期间干扰，在实验前去除存在于所有血清中的CRP(空白血清)。将200微升每个健康人类血清与过度剂量的乳胶粒子一起培养，所述乳胶粒子由聚苯乙烯芯和亲水性壳组成，与抗CRP单克隆抗体(德国埃施博恩西门子医疗诊断公司(SiemensHealth-care Diagnostics,Eschborn,Germany))共价结合。存在于血清中的CRP与乳胶粒子形成抗原-抗体复合物。离心(10,000转数/分，5分钟)后，去除存在于血清中的CRP并小心地收集上清液。三种健康人类血清被命名为阴性血清-1、阴性血清-2以及阴性血清-3，并且另三种被命名为盲血清-1、盲血清-2以及盲血清-3。应注意，如果直接使用具有低浓度干扰蛋白质的血清(又称为最小干扰血清)作为阴性选择的阴性样品，那么除选择适合适配体的功效因在阴性选择期间去除一些结合于干扰蛋白质的可能候选寡核苷酸而降低外，本发明实验例的结果将相同。通过将链霉抗生物素蛋白涂布在磁性纳米粒子(SA-MNPs)的最外表面上来将磁性纳米粒子生物官能化，并分散于PBS(pH＝7.4)中以形成SA-MNP试剂，并购自磁量生技(Magqu)(台湾台北的磁量生技(Magqu,Taipei,Taiwan))。试剂中SA-MNPs的平均流体动力学直径是50纳米。试剂具有0.3emu/g的SA-MNP浓度。生物素化试剂盒(EZ-Link磺酸基-NHS-生物素化试剂盒)购自皮尔斯(Pierce)(美国伊利诺伊州罗克福德(Rockford,IL,USA))。根据制造商的说明书，将200微克纯CRP、HBs Ag以及HCV NS3蛋白质(阳性选择)、三种阴性血清(阴性选择，阴性血清-1、阴性血清-2以及阴性血清-3)以及三种盲血清(盲法测试，盲血清-1、盲血清-2以及盲血清-3)生物素化。接着所有生物素化分子(阳性蛋白质、阴性血清以及盲血清)个别地与50微升SA-MNP试剂一起培养。链霉抗生物素蛋白与生物素之间的高亲和力结合确保磁性纳米粒子(MNPs)与生物素化目标分析物(CRP、HBs Ag以及HCV NS3)、阴性血清(阴性血清-1、阴性血清-2以及阴性血清-3)和盲血清(盲血清-1、盲血清-2以及盲血清-3)中的生物素化物质之间的结合。所制备的生物官能化的磁性纳米粒子试剂包含含有CRP-MNPs(P1)、HBs Ag-MNPs(P2)以及HCV NS3-MNPs(P3)的试剂用于阳性选择；阴性血清-1MNPs(N1)、阴性血清-2MNPs(N2)以及阴性血清-3MNPs(N3)的试剂用于阴性选择；盲血清-1MNPs(B1)、盲血清-2MNPs(B2)以及盲血清-3MNPs(B3)的试剂用于盲法测试。需要时，通过磁性分离分别从对应的阳性、阴性血清或盲血清试剂获得阳性、阴性血清或盲血清MNPs。所收集的阳性、阴性血清或盲血清MNPs用BD缓冲液洗涤3次并最后使用磁性架收集。
实例1：用于产生对不同目标分析物具有不同的所需结合亲和力范围的适配体的程序
图2中描绘通过窗口-MARAS来产生对多个目标分析物具有不同的所需结合亲和力范围的适配体的示意性程序并，且描述实例1的详细方法步骤。提供随机化寡核苷酸库作为起始库。使100微摩尔浓度的库溶解于BD缓冲液中并在微管中用BD缓冲液稀释到10微升，加热到95℃历时5分钟，接着快速冷却在4℃下，以形成二级结构，并保持在室温下达30分钟。首先，通过在室温下将库与阴性血清-1MNPs(N1)一起培养30分钟来进行阴性选择，阴性血清-1MNPs是通过磁性分离从5微升阴性血清-1MNP试剂来获得。磁性分离后，去除与阴性血清-1MNPs结合的寡核苷酸。接着将收集的上清液依序与阴性血清-2MNPs(N2)和阴性血清-3MNPs(N3)一起培养并磁性分离以去除结合混合物。收集最终上清液用于以下阳性选择。如下描述阳性选择：将通过磁性分离从5微升CRP-MNP试剂获得的CRP-MNPs(P1)添加到含有来自阴性选择的最终上清液的微管中并在室温下培养30分钟。用磁性架去除未结合的寡核苷酸并用1毫升BD缓冲液洗涤结合混合物两次。添加100微升BD缓冲液以使结合混合物在微管中再分散，并将微管放在RO-MARAS设置中。实验中始终使用旋转磁场的强度是14高斯。接着结合混合物的溶液首先经受室温下频率f1L＝15千赫兹的下限旋转磁场10分钟。为了避免因磁场对磁性纳米粒子的作用而聚结，通过每2.5分钟用移液器来搅拌结合混合物的溶液，此搅拌方法也适用于以下窗口-MARAS程序。进行磁性分离以去除上清液中分离的寡核苷酸，并添加100微升BD缓冲液以使结合混合物再分散。接着结合混合物的溶液经受室温下频率f1U＝20千赫兹的上限旋转磁场下的窗口-MARAS达10分钟。进行另一磁性分离以收集上清液，上清液含有在频率范围15千赫兹≤f≤20千赫兹下选择并可以结合于CRP蛋白质的适配体。通过磁性分离从5微升HBs Ag-MNP试剂获得的HBsAg-MNPs(P2)添加到含有收集的上清液的微管中并在室温下培养30分钟。通过磁性分离和洗涤来去除未结合的寡核苷酸后，添加100微升BD缓冲液以使结合混合物再分散。接着结合混合物的溶液经受室温下频率f2L＝20千赫兹的下一下限旋转磁场10分钟。进行磁性分离以去除上清液中分离的寡核苷酸，并添加100微升BD缓冲液以使结合混合物再分散。结合混合物的溶液经受室温下频率f2U＝27千赫兹的下一上限旋转磁场下的窗口-MARAS达10分钟。进行磁性分离以收集上清液，上清液含有分别在频率范围15千赫兹≤f≤20千赫兹和20千赫兹≤f≤27千赫兹下选择并可以结合于CRP和HBs Ag蛋白质的适配体。通过磁性分离从5微升HCV NS3-MNP试剂获得的HCVNS3-MNPs(P3)添加到含有收集的上清液的微管中并在室温下培养30分钟。在洗涤和磁性分离以去除未结合的寡核苷酸后，添加100微升BD缓冲液以使结合混合物再分散。结合混合物的溶液经受室温下频率f3L＝27千赫兹的最终下限旋转磁场下的窗口-MARAS达10分钟。进行磁性分离以去除上清液并保留结合混合物。保留在混合物中的结合的寡核苷酸通过在100微升BD缓冲液中加热到95℃历时5分钟来从HCV NS3-MNPs洗提。进行磁性分离以收集含有分别在频率范围15千赫兹≤f≤20千赫兹、20千赫兹≤f≤27千赫兹以及27千赫兹≤f下选择并能够与CRP、HBs Ag以及NS3蛋白质结合的多重结合适配体(MP-适配体)的上清液。在加热过程期间，HCV NS3蛋白质也从磁性粒子分离。接着进行纯化步骤以通过使用DNA提取小规模纯化系统(Miniprep System)(台湾台北的维基因公司(Viogene,Taipei,Taiwan)从上清液去除HCV NS3蛋白质，并在20微升ddH2O中洗提所得适配体。特别值得注意的是，为利用具有差别亲和力的适配体分析多个目标分析物，对所施加的旋转磁场的频率施加约束条件f1L<f1U＝f2L<f2U＝f3L。
实例2：用于产生对所对应的目标分析物具有不同结合亲和力的适配体的程序
图3中描述通过窗口-MARAS产生结合于不同目标分析物的对多个目标分析物具有不同的所需结合亲和力的适配体的示意性程序。本文中将不重复类似于实例1或图2中描述的步骤的某些详细方法步骤。进行多个阴性选择的操作并且多个阴性选择的目的是将非特异性结合降到最低并于诊断时降低假阳性结果的可能性。如图3中所示，在开始针对第一目标分析物CRP-MNPs(P1)的阳性选择前，进行额外阴性选择以确保所得适配体仅仅结合于特定阳性目标分析物(第一目标分析物)而不是其它目标分析物。额外阴性选择的其它目标分析物充当额外阴性目标分析物，包含HBs Ag-MNPs(P2)和HCV NS3-MNPs(P3)。将从阴性选择操作收集的上清液与通过磁性分离从5微升HBs Ag-MNP试剂获得的HBs Ag-MNPs(P2)一起在室温下培养30分钟，并进行磁性分离以去除结合混合物。接着收集的上清液与通过磁性分离从5微升HCV NS3-MNP试剂获得的HCV NS3-MNPs(P3)一起在室温下培养30分钟。在磁性分离后，去除与包含HBs Ag-MNPs(P2)和HCV NS3-MNPs(P3)的额外目标分析物结合的寡核苷酸并收集上清液用于阳性选择。如下描述阳性选择：将通过磁性分离从5微升CRP-MNP试剂获得的CRP-MNPs(P1)添加到含有来自额外阴性选择的最终上清液的微管中并在室温下培养30分钟。用磁性架去除未结合的寡核苷酸并用1毫升BD缓冲液洗涤结合混合物两次。添加100微升BD缓冲液以在微管中使结合混合物再分散并将微管放在RO-MARAS设置中。整个实验中使用的旋转磁场的强度是14高斯。结合混合物的溶液首先经受室温下频率f1L＝15千赫兹的下限旋转磁场10分钟。为了避免因磁场对磁性纳米粒子的作用而聚结，通过每2.5分钟以移液器来搅拌结合混合物的溶液，此搅拌方法也适用于以下窗口-MARAS程序。进行磁性分离以去除上清液中分离的寡核苷酸，并添加100微升BD缓冲液以使结合混合物再分散。接着结合混合物的溶液经受室温下频率f1U＝20千赫兹的上限旋转磁场下的窗口-MARAS达10分钟。进行另一磁性分离以收集上清液，上清液含有在频率范围15千赫兹≤f≤20千赫兹下选择且只能结合于CRP蛋白质的适配体(K1适配体)。结合于HBs Ag-MNPs(P2)的适配体的产生方法与上述相同，并且使用CRP-MNPs(P1)和HCV NS3-MNPs(P3)作为额外阴性目标分析物。并使用频率f2L＝20千赫兹的下限旋转磁场和频率f2U＝27千赫兹的上限旋转磁场。所得适配体为在频率范围20千赫兹≤f≤27千赫兹下选择并只能结合于HBs Ag蛋白质(K2适配体)。最后，为产生可以结合于HCVNS3-MNPs(P3)的适配体，使用CRP-MNPs(P1)和HBs Ag-MNPs(P2)作为额外阴性目标分析物，重复相同方法。旋转磁场的下限频率是f3L＝27千赫兹。施加下限磁场后，进行磁性分离以去除分离的寡核苷酸。保留在混合物中的结合的寡核苷酸通过在100微升BD缓冲液中加热到95℃历时5分钟来从HCV NS3-MNPs洗提。进行磁性分离以收集含有结合HCVNS3的适配体(K3适配体)的上清液。三种收集的上清液含有分别在频率范围15千赫兹≤f≤20千赫兹、20千赫兹≤f≤27千赫兹以及27千赫兹≤f下选择的能够结合于CRP、HBs Ag以及HCV NS3的适配体(K1、K2和K3适配体)。最后一个上清液也含有HCVNS3蛋白质，此蛋白质因加热过程而从磁性粒子分离。接着进行纯化步骤以通过使用DNA提取小规模纯化系统从上清液去除HCV NS3蛋白质，并在100微升BD缓冲液中洗提所得适配体。特别值得注意的是，为利用具有差别亲和力的适配体分析多个目标分析物，对所施加的旋转磁场的频率施加约束条件f1L<f1U＝f2L<f2U＝f3L。
如上文所论述，DNA适配体为结合于特定目标分析物并来自寡核苷酸库(大型随机序列池)的寡核苷酸。将通过以上提及的窗口-MARAS选择方法选择的适配体进行后分析，例如PCR扩增、克隆、测序以及结合亲和力计算(根据解离常数)。
所选适配体的PCR扩增、克隆以及测序分析
从每一窗口-MARAS实验收集的上清液用1毫升100％冷醇沉淀并用100微升ddH2O稀释，用于以下PCR扩增。收集的上清液随后通过PCR，利用Lab-F和Lab-R引物进行扩增。在以下条件下进行PCR反应，所述反应含有1.25U DNA聚合酶(英杰公司(Invitrogen))、0.1毫摩尔浓度dNTPs、0.5毫摩尔浓度MgSO4、0.5纳摩尔浓度引物，反应条件：95℃下5分钟；35次循环的95℃下40秒、60℃下40秒、72℃下40秒；以及72℃下10分钟。通过使用DNA提取小规模纯化系统来纯化PCR产物。纯化产物亚克隆到pGEM-T易思(Easy)载体(美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,WI,USA))中。根据制造商的说明书进行克隆程序。通过使用高速质粒微型试剂盒(台湾台北的旭基公司(Geneaid,Taipei,Taiwan))来纯化所挑选的群落的质粒。通过使用应用生物系统公司(Applied Biosystems)普锐斯(PRISM)3730DNA自动测序仪和比格戴(Big Dye)终止子循环测序试剂盒(美国加利福尼亚州福斯特市(Foster City,CA,USA))将质粒测序。
针对实例1中的所选适配体
所选MP-适配体的反向验证
按照如图2中所示的选择程序，六个适配体(MP-适配体)用于验证选择方法。对于从克隆实验挑选的每种质粒，使用10纳克适配体克隆质粒作为PCR模板，利用Lab-生物素-R和Lab-F引物来产生MP-适配体的双链DNA(dsDNA)。PCR条件和程序如上所述。完成PCR扩增后，将PCR产物与SA-MNPs混合，SA-MNPs是通过磁性分离从5微升SA-MNP试剂获得。通过与0.15当量浓度新鲜NaOH一起培养5分钟，使正向单链MP-适配体(未生物素化链)与固定的互补链分离。用磁性架去除结合的SA-MNPs。将相同量的0.15当量浓度HCl添加到收集的上清液，以调整最终pH值到7.0，接着用1毫升100％冰冷醇使正向ssDNA MP-适配体沉淀。利用纳多(NanoDrop)2000c光谱仪(美国特拉华州威明顿的赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific,Wilmington,DE,USA))测定单链MP-适配体的浓度。将含100纳摩尔浓度MP-适配体的20微升BD缓冲液加热到95℃，历时五分钟，并冷却在4℃下，以形成二级结构。将MP-适配体溶液分别与CRP-MNPs(P1)、HBs Ag-MNPs(P2)、HCVNS3-MNPs(P3)以及阴性血清-MNPs(N1、N2以及N3)一起在室温下培养30分钟，其中蛋白质MNPs是经由磁性分离从5微升对应试剂获得。进行磁性分离以收集结合混合物。收集的结合混合物用BD缓冲液洗涤两次并再分散于20微升BD缓冲液中。再进行磁性分离以去除上清液并收集结合混合物。结合混合物再分散于100微升ddH2O中并加热到95℃历时5分钟，以使适配体从CRP-MNPs(P1)、HBs Ag-MNPs(P2)、HCV NS3-MNPs(P3)以及阴性血清-MNPs(N1、N2以及N3)的MNPs洗提。进行磁性分离以去除MNPs并收集上清液。通过基于SYBR的q-PCR，一式两份地测量上清液中从MNPs洗提的适配体的量。每个q-PCR操作的混合物是10微升，含有2微升核酸、2.5微升SYBR绿PCR预混液(应用生物系统公司)以及0.5纳摩尔浓度引物。反应条件如下：95℃下3分钟；40次循环的94℃下30秒、60℃下30秒以及72℃下30秒。引物Lab-F和Lab-R用于q-PCR以使核酸扩增。
存在六个多重结合适配体(MP-适配体)：MP-1、MP-2、MP-3、MP-5、MP-8以及MP-9，其通过窗口-MARAS来分离，并且表1中列出通过窗口-MARAS筛选的MP-适配体的20N区域的序列。通过反向靶向阳性对照(CRP、HBs Ag以及HCV NS3-MNPs)和阴性对照(血清-1MNPs、血清-2MNPs以及血清-3MNPs)，来验证按照图2程序的适配体选择方法。结果绘示于图6A-6F中。对阳性对照的结合水平比阴性对照高得多。正如所料，MP-适配体仅仅与目标分析物结合，而不与血清中存在的其它分子结合。这些结果证实MP-适配体选择程序是成功的。选择MP-1适配体并用于进一步分析。
表1
通过q-PCR测定平衡解离常数
MP-适配体对CRP、HBs Ag以及HCV NS3目标分析物的亲和力由平衡解离常数(Kd)描述，平衡解离常数分别通过q-PCR测量。如上所述产生单链MP-适配体。对于每种目标分析物，将含一系列逐步稀释的MP-适配体(200纳摩尔浓度到1.5625纳摩尔浓度)的20微升BD缓冲液加热到95℃，历时5分钟，并冷却在4℃下，以形成二级结构。部分稀释的MP-适配体保留为输入对照(输入)。对于目标1，将通过洗涤和磁性分离5微升CRP-MNP(P1)试剂所获得的CRP-MNPs(P1)添加到含有经稀释的MP-适配体的每个微管中并在室温下培养30分钟。进行磁性分离以收集结合混合物。将结合混合物用100微升BD缓冲液洗涤两次。通过在20微升ddH2O中在94℃下加热结合混合物10分钟，从CRP-MNPs洗提结合的MP-适配体。用磁性架去除溶液中的CRP-MNPs，并收集上清液。输入对照与洗提的MP-适配体都用1毫升100％冰冷醇来沉淀。使输入对照和洗提的MP-适配体个别地溶解于填充有100微升ddH2O的试管中。通过q-PCR来计算包含输入对照管和洗提的MP-适配体管在内的每个试管中的MP-适配体的量。用迈可安(MicroAmp)光学96孔反应板进行q-PCR，并使用最大相关系数法，利用斯旺普(StepOnePlus)实时PCR系统软体2.0版(应用生物系统公司)自动计算阈值循环(ct)。每个q-PCR操作的混合物是10微升，含有2微升核酸、2.5微升SYBR绿PCR预混液(应用生物系统公司)以及0.5纳摩尔浓度引物标示正向引物和标示反向引物。反应条件如下：95℃下3分钟；40次循环的94℃下30秒、60℃下30秒以及72℃下30秒。使用200纳摩尔浓度MP-适配体作为最大结合的指示，计算输入对照和洗提的MP-适配体中MP-适配体的浓度。接着通过经由曲线拟合程序CurveExpert1.3(curveexpert.webhop.net)，基于实验数据拟合饱和结合曲线，来测定所选MP-适配体的Kd值。对每个q-PCR操作，一式两份地测定所选MP-适配体的Kd值，并表示为来自进行的三个分开实验的平均值±标准偏差。对目标2和目标3HBs Ag-MNPs(P2)和HCV NS3-MNPs(P3)重复相同程序，以测定MP-适配体的Kd。
图7A-7F中绘示解离常数的代表性拟合曲线和计算结果。图7A-7F绘示MP-1适配体对多个目标分析物的平衡解离常数；目标分析物分别是图7A-7B中的CRP，图7C-7D中的HBsAg以及图7E-7F中的HCV NS3蛋白质。结果展示MP-1适配体对CRP的Kd值是33.98±3.5纳摩尔浓度，HBs Ag是28.34±0.1纳摩尔浓度，并且HCV NS3是23.26±2.62纳摩尔浓度。结果表明所选MP-1适配体能够与三种不同的目标分析物结合并且可以用于多重免疫分析。MP-1适配体的解离常数值随目标1、目标2以及目标3依次降低。这些结果与先前结果一致：通过MARAS平台产生的适配体取决于磁场条件的频率和强度，并且施加的磁场频率越高，获得的解离常数越低。MP-1适配体对各种目标分析物的解离常数的依次降低归因于在筛选过程期间对于这三种目标分析物，恒定场强度下磁场频率增加所诱发的竞争机制增强。
通过酶联免疫吸附分析(ELISA)验证适配体结合
如下进行基于适配体的ELISA，以验证MP-适配体的结合。合成生物素化MP-适配体并购自生工公司。将每个含有10纳摩尔浓度生物素化MP-适配体的20微升BD缓冲液的微管加热到95℃，历时5分钟，并冷却在4℃下，以形成二级结构。将通过磁性分离从5微升对应试剂获得的CRP-MNPs(P1)、HBs Ag-MNPs(P2)以及HCV NS3-MNPs(P3)分别与10纳摩尔浓度生物素化MP-适配体一起在微管中在室温下培养30分钟。在洗涤和进行磁性分离以去除未结合的寡核苷酸后，添加100微升BD缓冲液以使结合混合物再分散。结合混合物的溶液经受室温下频率(15千赫兹)的旋转磁场10分钟。进行磁性分离以去除上清液中分离的寡核苷酸并命名为“<15千赫兹”洗提份。添加100微升BD缓冲液以使结合混合物再分散。依次用20千赫兹和27千赫兹进行以下过程。收集所有分离的对应寡核苷酸洗提份并命名为“15-20千赫兹”和“20-27千赫兹”。最后，添加100微升BD缓冲液以使结合混合物再分散，并加热到95℃，历时5分钟，以从目标MNPs洗提适配体。进行磁性分离以收集上清液并命名为“>27千赫兹”。每一组收集的上清液包含所有三个目标分析物的“<15千赫兹”、“15-20千赫兹”、“20-27千赫兹”以及“>27千赫兹”洗提份。将收集的上清液与100微升链霉抗生物素蛋白-HRP(美国密苏里州的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Missouri,USA))一起在微管中在室温下培养1小时。通过磁性分离分别从1微升CRP-MNP、HBs Ag-MNP以及HCV NS3-MNP试剂获得的CRP-MNPs(P1)、HBs Ag-MNPs(P2)以及HCVNS3-MNPs(P3)分别添加到这三组微管中，并在室温下培养一小时。微管中的结合混合物通过磁性分离来保留并用200微升BD缓冲液洗涤3次。通过添加100微升3,3′,5,5′-四甲基-联苯胺(TMB，西格玛-奥德里奇公司)底物溶液并将混合物置于室温下5分钟来显色。通过添加100微升2当量浓度HCl来终止反应，并通过使用易麦(EMax)精确微板读数器(美国加利福尼亚州的分子装置公司(Molecular Devices,CA,USA))，在405纳米下一式两份地测量吸光度。
利用重复照片影像和在不同磁场条件下分析CRP、HBs Ag以及HCV NS3的对应光强度，结果绘示于图8A-8D中。图8A-8C绘示通过基于适配体的ELISA验证MP-1适配体能够以差别亲和力结合多个目标分析物的重复照片影像(上排和下排)，而图8A中的目标分析物是CRP(P1)，图8B中是HBs Ag(P2)，以及图8C中是HCV NS3(P3)。图8D绘示对照(<15千赫兹)、P1(15-20千赫兹)、P2(20-27千赫兹)以及P3(>27千赫兹)的测量到的光密度。MP-1适配体可以与CRP-MNPs、HBs Ag-MNPs以及HCV NS3-MNPs结合。MP-1适配体与CRP-MNPs结合，但在20千赫兹频率和14高斯强度的磁场下分离。此外，在14高斯强度和高达27千赫兹频率范围的磁场条件下，MP-1适配体结合于HBs Ag-MNPs。最后，在频率27KHz和强度14高斯的磁场下，MP-1适配体仍然结合于HCV NS3-MNPs。应注意，此处使用的磁场条件与选择阶段期间的磁场条件相同。结果显示，MP-1适配体与不同目标分析物之间的结合亲和力取决于窗口-MARAS条件。换句话说，可以在选择阶段期间改变窗口-MARAS条件，以获得对目标分析物具有不同的所需亲和力的适配体，并且所得适配体能够以差别亲和力结合于多个目标分析物。通过利用此特定的未来，利用差别亲和力的适配体类多重免疫分析变得可行。
通过q-PCR建立标准校准曲线
通过使用通过磁性分离分别从1微升CRP-MNP(目标1)、HBs Ag-MNP(目标2)以及HCV NS3-MNP(目标3)试剂获得的CRP-MNPs、HBs Ag-MNPs以及HCV NS3-MNPs在10微升BD缓冲液中的连续稀释液，个别地确定标准校准曲线。经稀释的溶液中对应的目标量是4000、2000、1000…，最后31.25纳克。将1微摩尔浓度MP-适配体分散于10微升BD缓冲液中并加热到95℃，历时5分钟，并冷却在4℃下，以形成二级结构。通过磁性分离从每种经稀释的溶液获得的目标MNPs(目标1、2以及3)添加到含有MP-适配体的每个BD缓冲液中并在室温下培养30分钟。用磁性架收集结合混合物并去除上清液。通过在最终体积100微升的ddH2O中在94℃下加热10分钟，从MNPs洗提结合的适配体。通过磁性分离收集上清液并去除MNPs。每个收集的上清液中洗提的寡核苷酸的量通过q-PCR来分析。如先前所描述，一式两份地进行q-PCR分析。通过2-ct，计算荧光强度达到设定循环阈值(ct)的PCR循环次数(表示为相对表达水平)，对比目标量。从十六个实验数据点线性拟合标准曲线。最佳拟合法用于计算R2值并获得线性等式。标准校准曲线可以在未来分析用于测定样品中的目标分析物的量。
图9A-9C分别绘示CRP、HBs Ag以及HCV NS3的MP-1适配体的标准校准曲线。正如所料，相对表达水平与样品中的目标分析物的量成线性比例。结果显示测量的动态范围取决于免疫分析期间试剂中存在的MP-适配体的量。
使用MP-1适配体分析人类血清时的回收率的测定
三个志愿者的盲血清用作盲样品，用于测定MP-适配体作为捕捉配体的回收率，其中CRP、HBs Ag以及HCV NS3浓度不可检测，血清被命名为：盲血清-1(B1)、盲血清-2(B2)以及盲血清-3(B3)。盲血清MNP的制备如材料部分中所述。将通过磁性分离从0.4微升对应MNP试剂获得的相同量(各1.6微克蛋白质)的CRP、HBs Ag以及HCV NS3MNP的纯蛋白质的混合物外加到微管中的40微升BD缓冲液中。四分之一混合物溶液(10微升)用作对照，并命名为“BD缓冲液中的目标”。剩余的混合物溶液同等分成三部分(各10微升)，其中每部分个别地外加通过磁性分离从0.1微升盲血清MNP试剂获得的盲血清MNPs，并命名为“血清-1中的目标”、“血清-2中的目标”以及“血清-3中的目标”，分别对应于盲血清-1(B1)、盲血清-2(B2)以及盲血清-3(B3)。对于“BD缓冲液中的目标”的回收率实验，将微管中5000纳摩尔浓度MP-适配体的20微升BD缓冲液加热到95℃，历时五分钟，并冷却在4℃下，以形成二级结构，接着在室温下将通过磁性分离从“BD缓冲液中的目标”获得的蛋白质MNPs添加到微管中，历时30分钟。微管中的上清液用磁性架去除，并收集结合混合物并分散于100微升BD缓冲液中。将结合混合物的溶液放在室温下RO-MARAS平台内在15KHz磁场频率的初始窗口-MARAS条件下10分钟。进行磁性分离以去除上清液并添加100微升BD缓冲液以使保留的结合混合物分散。结合混合物的溶液经受室温下20千赫兹磁场频率的第二窗口-MARAS条件10分钟。进行磁性分离以收集上清液并命名为“15-20千赫兹”。添加100微升BD缓冲液以使保留的结合混合物分散。结合混合物的溶液经受室温下27KHz频率的第三窗口-MARAS条件10分钟。进行磁性分离以收集上清液并命名为“20-27千赫兹”。添加100微升BD缓冲液以使保留的结合混合物分散。将结合混合物的溶液在94℃下加热10分钟，以使适配体从MNPs洗提。进行磁性分离以收集上清液并命名为“>27千赫兹”。所有收集的上清液“15-20KHz”、“20-27KHz”以及“>27KHz”用1毫升100％冰冷醇沉淀，并个别地溶解于填充有100微升ddH2O的试管中。如先前所描述，通过q-PCR，一式两份地分析每个试管中的寡核苷酸的量，并经由标准校准曲线的对应线性等式计算，以确定“BD缓冲液中的目标”样品中的CRP、HBs Ag以及HCV NS3量。对“血清-1中的目标”、“血清-2中的目标”以及“血清-3中的目标”重复相同程序。
使用MP-1适配体作为捕捉配体回收的目标分析物的量的结果绘示于图10中。目标分析物的回收率是基于理想地各0.4微克的外加的目标分析物的量计算，并且在107.59％与94.39％之间。BD缓冲液、盲血清-1、盲血清-2以及盲血清-3中测量的目标分析物的量之间无显著差异。在不同磁性频率范围下蛋白质回收量类似。应注意，理论上，由于血清中存在的除目标分析物外的蛋白质进行非特异性结合，所以血清中回收的目标分析物的水平应等于或高于BD缓冲液中回收的目标分析物的水平，并且其偏差可以归因于由q-PCR放大的实验误差。但是，通过比较有或无盲人类血清下的结果，显示盲血清中除目标蛋白外的蛋白质的干扰有限。此结果清楚地说明MP-1适配体可以特异性结合于BD缓冲液和人类血清中的目标1、2以及3，并且可以用于多重免疫分析以在单次分析中检测CRP、HBs Ag以及HCV NS3蛋白质的浓度。
针对实例2中的所选适配体
所选适配体的反向验证
通过实例2的选择方法，按照如图3中所示的程序来选择和产生八个结合CRP蛋白质的适配体、五个结合HBs Ag蛋白质的适配体以及两个结合HCV NS3蛋白质的适配体。适配体(CRP是K1-1、HBs Ag是K2-4以及HCV NS3是K3-1)代表性地用于验证按照如图3中所示的程序选择方法，并且如后面证实，基于适配体的低交叉反应，选择这些适配体。使用实例1([0059])中概述的相同程序，产生正向单链适配体(未生物素化链)，包含K1-1、K2-4以及K3-1适配体。将5000纳摩尔浓度K1-1适配体在120微升BD缓冲液中加热到95℃，历时五分钟，并冷却在4℃下，以形成二级结构。相同量(20微升)的K1-1适配体溶液分别与CRP-MNPs(P1)、HBs Ag-MNPs(P2)、HCV NS3-MNPs(P3)以及阴性血清-MNPs(N1、N2或N3)一起在室温下培养30分钟，其中蛋白质MNPs係通过磁性分离从1微升对应试剂获得。进行磁性分离以收集结合混合物。收集的结合混合物用BD缓冲液洗涤两次并再分散于20微升BD缓冲液中。再进行磁性分离以去除上清液并收集结合混合物。结合混合物再分散于100微升ddH2O中并加热到95℃历时5分钟，以使适配体从CRP-MNPs(P1)、HBs Ag-MNPs(P2)、HCV NS3-MNPs(P3)以及阴性血清-MNPs(N1、N2以及N3)的蛋白质MNPs洗提。进行磁性分离以去除MNPs并收集上清液。通过基于SYBR的q-PCR分析，一式两份地测量上清液中从MNPs洗提的适配体的量。每个q-PCR操作的混合物是10微升，含有2微升核酸、2.5微升SYBR绿PCR预混液(应用生物系统公司)以及0.5纳摩尔浓度引物。反应条件如下：95℃下3分钟；40次循环的94℃下30秒、60℃下30秒以及72℃下30秒。引物Lab-F和Lab-R用于q-PCR以使核酸扩增。q-PCR的结果(表示为相对表达水平)指示K1-1与样品CRP-MNPs(P1)、HBs Ag-MNPs(P2)、HCV NS3-MNPs(P3)以及阴性血清-MNPs(N1、N2以及N3)之间的结合。对K2-4和K3-1适配体重复相同程序。图11绘示经由q-PCR反向验证所得适配体K1-1、K2-4以及K3-1的结果。对所对应的阳性对照结合的水平比除特异性外的阳性对照和噪声水平的阴性对照高得多。举例而言，K1-1适配体仅仅结合CRP，而不结合于其它阳性对照(HBs Ag和HCV NS3)和阴性对照(血清-1、血清-2和血清-3)。K2-4和K3-1适配体也获得类似结果。
所选适配体的交叉反应研究
进行交叉反应实验以检查适配体之间的相互作用。如下描述所选适配体的交叉反应研究。适配体(CRP是K1-1、HBs Ag是K2-4以及HCV NS3是K3-1)用于代表性地示范交叉反应研究，其基于适配体的低交叉反应来选择适配体。研究包含三个分开实验，即，K1-1与K2-4、K1-1与K3-1以及K2-4与K3-1的相互作用。在每个实验中，制备含有未生物素化的适配体(适配体-1)的溶液并同等划分：第一半用作输入对照并且第二半与相同量的另一生物素化适配体(适配体-2)混合并一起培养。在第二半中，一部分适配体-1由于杂交而将与适配体-2缔合。与SA-MNPs一起培养后，适配体混合物进行磁性分离以去除此部分。所收集的上清液含有不与适配体-2杂交的适配体-1。通过q-PCR，将上清液中剩余的适配体-1的量与输入对照相比。之间的差异指示适配体-1与适配体-2之间的相互作用的水平。其中适配体-1(未生物化适配体)如先前所描述产生；对于生物素化适配体(适配体-2)，用磁性架收集通过与实例1的[0059]中所述相同的程序产生的结合的SA-MNPs，包含结合的固定互补链。添加20微升BD缓冲液以使结合SA-MNP的混合物分散。将结合SA-MNP的混合物溶液在70℃下加热1秒。接着进行磁性分离以收集上清液，上清液含有生物素化适配体。此处，K1-1和K2-4适配体代表性地用于说明下文描述的交叉反应实验。对于K1-1和K2-4适配体的交叉反应实验，将10纳摩尔浓度K1-1和生物素化K2-4适配体在10微升BD缓冲液中个别地加热到95℃，历时五分钟，并冷却在4℃下，以形成二级结构。将K1-1适配体(未生物素化适配体)与生物素化K2-4适配体一起在室温下培养30分钟。接着将混合物与通过磁性分离从5微升SA-MNP试剂获得的SA-MNPs混合并一起培养。生物素化K2-4适配体将因生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用而结合于SA-MNPs。归因于杂交，一部分未生物素化K1-1适配体将与生物素化K2-4适配体缔合。进行磁性分离以去除结合的SA-MNPs，并且用1毫升100％冰冷醇使上清液沉淀并溶解于填充有100微升ddH2O的试管中。如先前所描述，通过q-PCR分析，一式两份地分析试管中的寡核苷酸的量。关于K1-1与K3-1适配体以及K2-4与K3-1适配体之间的交叉反应的研究，进行相同方法。
图12绘示CRP的K1-1、HBs Ag的K2-4以及HCV NS3的K3-1之间的交叉反应的结果，其具有最低交叉反应。图12中，空心柱给出来自q-PCR的输入对照的相对表达水平，并且实心柱给出去除杂交适配体后样品中残留的适配体的相对表达水平。通过将反应表达水平从输入对照表达水平减去，结果除以输入对照表达水平并乘以100％来计算交叉反应水平。K3-1与K1-1、K3-1与K2-4以及K2-4与K1-1的交叉反应分别是5.66％、11.89％以及15.18％。在完成反向验证和交叉反应实验后，对从克隆进程挑选的所选适配体CRP的K1-1、HBs Ag的K2-4以及HCV NS3的K3-1的质粒测序，并且通过窗口-MARAS筛选的适配体的20N区域的序列在表2中列出。对于进一步实验，化学合成适配体K1-1、K2-4以及K3-1并购自生工公司。交叉反应将降低形成试剂的适配体在多重免疫分析中的分析功效，并且交叉反应越高，分析多个目标分析物时适配体类试剂的动态范围越小。特别值得注意的是，预期以上所展示的交叉反应在检测期间低得多，因为其是在不存在任何目标分析物下基于寡核苷酸杂交获得的。在检测时，来自目标分析物的竞争将降低适配体与另一适配体杂交的机会。此外，试剂中适配体的量可以增加，以考虑到适配体因交叉反应而造成的损失，从而维持检测所需的动态范围。
表2
通过q-PCR测定平衡解离常数
K1-1、K2-4以及K3-1适配体分别对CRP、HBs Ag以及HCV NS3目标分析物的亲和力通过平衡解离常数(Kd)描述，平衡解离常数通过q-PCR来测量。对于K1-1适配体对CRP目标分析物，将含一系列逐步稀释的K1-1适配体(200纳摩尔浓度到1.5625纳摩尔浓度)的20微升BD缓冲液加热到95℃，历时5分钟，并冷却在4℃下，以形成二级结构。部分稀释的适配体保留为输入对照(输入)。将通过磁性分离从5微升CRP-MNP试剂获得的CRP-MNPs(P1)添加到含有稀释的K1-1适配体的每个微管中并在室温下培养30分钟。进行磁性分离以收集结合混合物。将结合混合物用100微升BD缓冲液洗涤两次。通过在20微升的ddH2O中在94℃下加热10分钟，从CRP-MNPs洗提结合的适配体。用磁性架去除溶液中的CRP-MNPs，并收集上清液。输入对照与洗提的适配体都用1毫升100％冰冷醇来沉淀。使输入对照和洗提的适配体个别地溶解于填充有100微升ddH2O的试管中。如先前所描述，通过q-PCR来计算包含输入对照管和洗提的适配体管在内的每个试管中的适配体的量。用迈可安光学96孔反应板进行q-PCR分析，并使用最大相关系数法，利用斯旺普实时PCR系统软体2.0版(应用生物系统公司)自动计算阈值循环(ct)。使用200纳摩尔浓度适配体作为最大结合的指示，计算输入对照和洗提的适配体中K1-1适配体的浓度。接着通过经由曲线拟合程序CurveExpert1.3(curveexpert.webhop.net)，基于实验数据拟合饱和结合曲线，来测定K1-1适配体对CRP的Kd值。对每个q-PCR操作，一式两份地测定K1-1适配体对CRP的Kd值，并表示为来自进行的三个分开实验的平均值±标准偏差。分别使用HBs Ag和HCV NS3目标分析物，重复相同程序，以测定K2-4和K3-1适配体的Kd值。
K1-1、K2-4以及K3-1适配体的解离常数的代表性拟合曲线和详细结果绘示于图13A-13F中。图13A-13F绘示适配体K1-1、K2-4以及K3-1对不同目标分析物的平衡解离常数；并且适配体对目标分析物如下，图13A-13B：K1-1对比CRP，图13C-13D：K2-4对比HBs Ag，以及图13E-13F：K3-1对比HCV NS3蛋白质。结果展示K1-1适配体对CRP的Kd值是38.47±0.30纳摩尔浓度，K2-4适配体对HBs Ag的Kd值是31.41±0.62纳摩尔浓度，并且K3-1适配体对HCV NS3的Kd值是15.88±0.69纳摩尔浓度。结果表明所选的K1-1、K2-4以及K3-1适配体能够与对应的目标分析物结合并且可以用于多重免疫分析。K1-1对CRP、K2-4对HBs Ag以及K3-1对HCV NS3的解离常数值依次减少。K1-1、K2-4以及K3-1适配体对其对应的目标分析物的解离常数的依次降低归因于在筛选这三种适配体的过程期间，磁场频率增加所诱发的竞争机制增强。
通过q-PCR建立标准校准曲线
通过使用通过磁性分离分别从1微升CRP-MNP(P1)、HBs Ag-MNP(P2)以及HCV NS3-MNP(P3)试剂获得的CRP-MNPs、HBs Ag-MNPs以及HCV NS3-MNPs在含有10微升BD缓冲液的微管中的连续稀释液，个别地确定标准校准曲线。此处省去如上所述的类似方法步骤。使用K1-1、K2-4以及K3-1适配体作为捕捉配体的目标分析物的标准校准曲线通过q-PCR获得，并获得相对表达水平分别对比样品中CRP、HBs Ag以及HCV NS3的量的线性关系。K1-1、K2-4以及K3-1适配体的q-PCR表达水平作为样品中CRP、HBs Ag以及HCV NS3目标分析物的量的函数的标准校准曲线的结果分别绘示于图14A-14C中。
在分析外加目标的人类血清时使用含有K1-1、K2-4以及K3-1适配体作为捕捉配体的试剂的回收率的测定
三个志愿者的盲血清用作盲样品，用于测定MP-适配体作为捕捉配体的回收率，其中CRP、HBs Ag以及HCV NS3浓度不可检测，血清被命名为：盲血清-1(BS-1)、盲血清-2(BS-2)以及盲血清-3(BS-3)。盲血清MNPs的制备如材料部分中所述。通过将相同量(各1.6微克蛋白质)的通过从0.4微升对应MNP试剂磁性分离获得的CRP、HBs Ag以及HCVNS3MNPs混合来制备混合的蛋白质MNPs，并接着外加到40微升BD缓冲液中以形成混合的蛋白质MNP溶液。四分之一包含CRP、HBs Ag以及HCV NS3在内的混合的蛋白质MNP溶液被命名为“BD缓冲液中混合蛋白质”。其余部分同等分成三部分，其中每个部分个别地外加经由磁性分离分别从0.1微升对应盲血清MNP试剂获得的盲血清MNPs(BS-1、BS-2以及BS-3)，并命名为“BS-1中的混合蛋白质”、“BS-2中的混合蛋白质”以及“BS-3中的混合蛋白质”。将5000纳摩尔浓度的K1-1、K2-4以及K3-1适配体个别地加热到95℃，历时五分钟，并冷却在4℃下，以形成二级结构，接着混合，以形成BD缓冲液中的“混合适配体试剂”。将20微升“混合适配体试剂”与通过磁性分离从“BD缓冲液中的混合蛋白质”溶液获得的蛋白质MNPs一起在室温下培养30分钟。通过磁性架去除上清液并且收集结合混合物并分散于100微升BD缓冲液中。将微管中结合混合物的溶液放在RO-MARAS平台内并经受室温下15千赫兹磁场频率的初始窗口-MARAS条件10分钟。进行磁性分离以去除上清液并添加100微升BD缓冲液以分散保留的结合混合物。接着结合混合物的溶液在室温下经受20千赫兹磁场频率的第二窗口-MARAS条件10分钟。进行磁性分离以收集上清液并命名为“15-20千赫兹”。添加100微升BD缓冲液以使保留的结合混合物分散。最后结合混合物的溶液在室温下经受27KHz磁场频率的第三窗口-MARAS条件10分钟。进行磁性分离以收集上清液并命名为“20-27千赫兹”。添加100微升BD缓冲液以使保留的结合混合物分散。将结合混合物的溶液在94℃下加热10分钟，以使适配体从MNPs洗提。进行磁性分离以收集上清液并命名为“>27千赫兹”。所有收集的上清液“15-20KHz”、“20-27KHz”以及“>27KHz”都用1毫升100％冰冷醇沉淀，并个别地溶解于填充有100微升ddH2O的试管中。如先前所描述，通过q-PCR，一式两份地分析每个试管中的寡核苷酸的量，并经由标准校准曲线的对应线性等式计算，以确定“BD缓冲液中的混合蛋白质”中的CRP、HBs Ag以及HCV NS3量。针对“BS-1中的混合蛋白质”、“BS-2中的混合蛋白质”以及“BS-3中的混合蛋白质”重复相同程序。此外，通过使用CRP-MNPs、HBs Ag-MNPs或HCV NS3-MNPs替换混合蛋白质MNPs，相同程序也应用于单个目标分析物。通过使用CRP作为一个实例，将通过磁性分离从0.4微升CRP-MNP试剂获得的CRP-MNPs(1.6微克CRP)外加到40微升BD缓冲液中。四分之一(10微升)CRP-MNP溶液命名为“BD缓冲液中的CRP”。其余部分同等分成三部分，其中每个部分个别地外加通过磁性分离分别从盲血清-1(BS-1)、盲血清-2(BS-2)以及盲血清-3(BS-3)获得的盲血清MNPs，并命名为“BS-1中的CRP”、“BS-2中的CRP”以及“BS-3中的CRP”。按照上述相同程序，使用“混合适配体试剂”，经由CRP标准校准曲线，确定“BD缓冲液中的CRP”、“BS-1中的CRP”、“BS-2中的CRP”以及“BS-3中的CRP”中外加CRP的量。
使用由K1-1、K2-4以及K3-1适配体制成的“混合适配体试剂”作为捕捉配体，在各种样品中回收的目标分析物的量的结果绘示于图15A-15D中，并且表3中列出对应的回收率。图15A-15D绘示使用K1-1、K2-4以及K3-1适配体作为捕捉配体回收的样品中目标分析物的量，而图15A中目标分析物是CRP，图15B中是HBs Ag，图15C中是HCV NS3蛋白质，并且图15D中是混合蛋白质。表3中，基于理想地各0.4微克的外加目标分析物的量，计算回收率，并且在94.19％与107.17％之间。K1-1、K2-4以及K3-1适配体可以在窗口-MARAS的上限频率下结合于对应目标分析物。举例来说，在低于20千赫兹频率下K1-1适配体结合于“BD缓冲液中的CRP”样品中的CRP-MNPs。当旋转磁场频率高于上限(>20千赫兹)时，K1-1适配体与CRP-MNPs分离。27千赫兹的旋转磁场频率获得相同结果。通过q-PCR测量结合于CRP-MNPs的K1-1适配体的量，并经由CRP的标准校准曲线计算CRP的量。应注意，在检测阶段期间施加的旋转磁场的频率范围与产生适配体阶段中使用的频率范围相同。除施加的旋转磁场的频率范围外，K2-4和K3-1适配体的结果类似于K1-1。此外，使用混合蛋白质MNPs代替样品中的纯蛋白质MNPs，回收的蛋白质的量之间无显著差异。对于使用混合蛋白质MNPs，与使用单个蛋白质MNPs比较，在不同磁性频率范围下蛋白质回收率类似。结果显示在检测阶段期间，来自样品中多个目标分析物的干扰具有最小的作用。应注意，理论上，由于血清中存在的除目标分析物外的蛋白质进行非特异性结合，所以血清中回收的目标蛋白质的水平应等于或高于BD缓冲液中回收的目标蛋白质的水平，并且偏差可以归因于由q-PCR放大的实验误差。但是，通过比较有或无盲人类血清下的结果，显示盲血清中除目标蛋白外的蛋白质的干扰有限。此结果清楚地说明了K1-1、K2-4以及K3-1适配体可以分别特异性结合于BD缓冲液和人类血清中的CRP、HBs Ag以及HCV NS3，并且由这三个适配体制成的试剂可以用于多重免疫分析以在单个分析中检测CRP、HBs Ag以及HCV NS3蛋白质的浓度。
表3
以上结果证实使用窗口-MARAS程序，利用施加的旋转磁场的指定磁场频率范围，从随机寡核苷酸库筛选能够以所需亲和力结合于特定目标分析物的适配体。通过改变频率范围，获得能够以差别亲和力结合于特定分析物的适配体。所得适配体可以用作多重免疫分析中的试剂中能够结合于多个目标分析物的捕捉配体。通过在检测阶段期间施加相同磁场条件，可以通过q-PCR鉴别样品中不同分析物的量。通过进行阴性选择，例如多个阴性选择循环和额外阴性选择，将样品中除目标分析物外的其它分子的干扰减到最少。这些结果建议，如果获得对分析物具有所需Kd的适配体(即捕捉配体与分析物之间的亲和力控制在所需范围内)，那么使用此类适配体作为试剂中的捕捉配体的多重免疫分析能够经由差别亲和力检测分析物。这些分析法尤其适用于临床应用中仅仅需要确定患者血清中少数生物标记物的浓度的疾病诊断。
总的来说，通过利用捕捉配体(所选适配体)与其(它们)对应目标分析物之间的差别亲和力，呈现和证明多重免疫分析技术。通过使用窗口-MARAS方法选择的所得适配体能够通过改变适配体选择方法期间的磁场条件以差别亲和力结合于多个分析物。此外，可以通过恰当地挑选窗口-MARAS方法的施加的振荡磁场的下限和上限磁场频率和/或磁场强度来选择对目标分析物具有特异性并且对目标分析物具有预先估计的结合亲和力(即解离常数在所需范围内)的一或多种适配体。此外，由所得适配体构成的试剂可以用于多重免疫分析。使用适配体类的试剂，在检测阶段期间施加相同磁场条件，可以经由q-PCR或ELISA确定样品中不同目标分析物的量。特别值得注意的是，影响竞争机制和亲和力区分机制的所有参数，例如施加的振荡磁场的频率和/或强度以及磁性粒子的尺寸，在多重免疫分析的适配体产生阶段和检测阶段期间应该保持相同，以使相对于适配体与目标分析物之间的键结，具有相同拉伸力，当磁场作用于磁性粒子的偶极矩时，拉伸力由水溶液中磁性粒子的旋转或振荡运动产生，并由磁性驱动力和耗散力诱发。此外，本发明实施例中，包含适配体产生阶段和检测阶段中，使用的磁性粒子结合的复合物的结构是适配体-分析物-磁性粒子，如果在检测阶段期间改变结构，例如分析物-适配体-磁性粒子，那么拉伸力将因结构中最外组分的尺寸(适配体尺寸远小于分析物)而改变，所述改变是因为更大尺寸的最外组分产生更高的耗散力。因此，如果检测阶段中使用的磁性粒子的尺寸和磁性粒子结合的复合物的结构不同于适配体产生阶段中使用的尺寸和结构，那么亲和力区分机制的磁场条件必须在多重免疫分析前以实验方式进行确定。可以通过小心地设计阴性选择，例如多个阴性选择循环，将样品中除目标分析物外的分子的干扰减到最少。从结果推断，如果捕捉配体与分析物之间的亲和力可以控制在所需范围下，那么可以合成能够利用差别亲和力进行多重免疫分析的试剂，尤其用于临床应用中仅仅需要确定患者血清中少数生物标记物的浓度的疾病诊断。
尽管上文已显示并阐述了本公开的示例性实施例，然而，所属领域的技术人员应明白，在不背离由随附权利要求书所界定的本公开精神及范围的条件下，可作出修改及变化。
序列表
<110> 洪振义
洪姮娥
<120> 选择适配体的方法和利用差别亲和力的多重免疫分析
<130> 175686TF
<150> 15/281,077
<151> 2016-09-30
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcagcacag aggtc 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgtgctacc gtgaa 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcacggtag cacgc 15
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taatacgact cactataggg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgcatcacg aagcctggca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggtcctccg aatgggacta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccggaacacc agaagcacgt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccgtcacct atttttccgt 20
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acaggggaag aagcgtcacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccttggcatg attgtctcct 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctaacgatg cgacatgggg 20
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaaccggaa tctgcacctc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cccatgtcca cctttctgtg 20

Claims (16)

1.一种选择适配体的方法，而所述适配体能够以差别亲和力与多个目标分析物结合，所述方法包括：
a)提供具有多个寡核苷酸的随机序列库；
b)准备多个与阴性样品(j)结合的磁性粒子(NS-MPs(j))并准备多个与目标分析物(i)结合的磁性粒子(PS-MPs(i))，其中所述磁性粒子是纳米尺寸或微米尺寸，并且其中i或j独立地是从1开始的整数；
c)将经过加热和淬火以形成二级结构的所述随机序列库与所述NS-MPs(j)在第一结合缓冲液中一起培养，其中所述随机序列库与所述NS-MPs(j)逐个一起培养或与所有所述NS-MPs(j)一批一起培养；
d)通过使用磁性架进行第一次磁性分离来去除与所述NS-MPs(j)结合的寡核苷酸，并收集含有未与所述NS-MPs(j)结合的剩余寡核苷酸的上清液供后续流程使用或作为一种随机序列库供下一轮步骤c)使用，其中如果在步骤c)中所述随机序列库与所述NS-MPs(j)逐个一起培养，那么所述方法步骤c)和d)进行j次，或如果所述随机序列库与所有所述NS-MPs(j)一批一起培养，那么所述方法步骤c)和d)进行一次；
e)将含有所述剩余寡核苷酸的所述收集的上清液与所述PS-MPs(i)一起培养；
f)通过使用所述磁性架进行第二次磁性分离来收集含有与所述PS-MPs(i)结合的寡核苷酸的结合混合物，去除含有未与所述PS-MPs(i)结合的寡核苷酸的上清液，并使含有与所述PS-MPs(i)结合的寡核苷酸的所述收集的结合混合物再分散于第二结合缓冲液中；
g)使所述混合物溶液经受具有下限频率fiL和/或下限强度HiL的第一振荡磁场下的窗口-MARAS，以将对所述PS-MPs(i)具有第一结合亲和力的寡核苷酸与所述PS-MPs(i)分离，并通过使用所述磁性架进行第三次磁性分离，接着去除含有与所述PS-MPs(i)分离的所述寡核苷酸的上清液，来收集含有与所述PS-MPs(i)结合的寡核苷酸的所述结合混合物；
h)使含有与所述PS-MPs(i)结合的寡核苷酸的所述收集的结合混合物再分散于第三结合缓冲液中；
i)使所述混合物溶液经受具有上限频率fiU和/或上限强度HiU的第二振荡磁场下的窗口-MARAS，以将对所述PS-MPs(i)具有第二结合亲和力的寡核苷酸与所述PS-MPs(i)分离，并通过使用所述磁性架进行第四次磁性分离，接着收集含有对所述PS-MPs(i)具有第二结合亲和力的所述寡核苷酸的上清液来去除与所述PS-MPs(i)结合的对所述PS-MPs(i)具有第三结合亲和力的寡核苷酸，
其中重复步骤e)至i)ⅰ次，或者重复步骤e)至i)i-1次并接着进行步骤e)至h)一次，从所述PS-MPs(i)洗提对所述PS-MPs(i)的结合亲和力比对所述PS-MPs(i)的第一结合亲和力强的寡核苷酸，通过使用所述磁性架进行第五次磁性分离来收集含有对所述PS-MPs(i)的结合亲和力比对所述PS-MPs(i)的第一结合亲和力强的所述寡核苷酸的上清液，其中所述第二结合亲和力比所述第一结合亲和力强，并且所述第三结合亲和力比所述第二结合亲和力强，并且其中fiL<fiU≤f(i+1)L和/或HiL<HiU≤H(i+1)L；以及
j)获得能够与PS-MPs(i)结合的所述寡核苷酸作为对所述目标分析物(i)具有差别亲和力的适配体。
2.根据权利要求1所述的选择适配体的方法，其中步骤b)准备多个与阴性样品(j)结合的磁性粒子(NS-MPs(j))并准备多个与目标分析物(i)结合的磁性粒子(PS-MPs(i))包括：
预处理多个生物样品以从样品去除干扰目标分析物(i)作为阴性样品(j)，或直接使用多个具有低浓度干扰目标分析物(i)的生物样品作为阴性样品(j)，并使所述阴性样品(j)与所述磁性粒子结合以形成所述NS-MPs(j)；以及
提供所述目标分析物(i)并使所述目标分析物(i)与所述磁性粒子结合以形成PS-MPs(i)。
3.根据权利要求2所述的选择适配体的方法，其中使所述阴性样品(j)或所述目标分析物(i)与所述磁性粒子结合包括经由分别附接到所述磁性粒子和阴性样品(j)或所述目标分析物(i)的接合对将所述阴性样品(j)或所述目标分析物(i)接合到所述磁性粒子。
4.根据权利要求3所述的选择适配体的方法，其中所述接合对由链霉抗生物素蛋白和生物素构成；其中所述链霉抗生物素蛋白与所述磁性粒子结合并且所述生物素与所述阴性样品(j)或所述目标分析物(i)结合。
5.根据权利要求1所述的选择适配体的方法，其中步骤g)使所述混合物溶液经受具有下限频率fiL和/或下限强度HiL的第一振荡磁场下的窗口-MARAS包括通过施加具有所述下限频率fiL和/或所述下限强度HiL的第一旋转磁场或第一交变磁场来进行磁力辅助的筛选。
6.根据权利要求1所述的选择适配体的方法，其中步骤i)使所述混合物溶液经受具有上限频率fiU和/或上限强度HiU的第二振荡磁场下的窗口-MARAS包括通过施加具有所述上限频率fiU和/或所述上限强度HiU的第二旋转磁场或第二交变磁场来进行磁力辅助的筛选。
7.一种选择适配体的方法，而所述适配体能够以不同亲和力与目标分析物结合，所述方法包括：
a)提供具有多个寡核苷酸的随机序列库；
b)准备多个与阴性样品(j)结合的磁性粒子(NS-MPs(j))，准备多个与辅助目标分析物(k)结合的磁性粒子(PS-MPs(k))，并准备多个与主要目标分析物(i)结合的磁性粒子(PS-MPs(i))，其中所述磁性粒子是纳米尺寸或微米尺寸，并且其中i、j或k独立地是从1开始的整数并且所述辅助目标分析物(k)与所述目标分析物(i)不同；
c)将经过加热和淬火以形成二级结构的所述随机序列库与所述NS-MPs(j)在第一结合缓冲液中一起培养，其中所述随机序列库与所述NS-MPs(j)逐个一起培养或与所有所述NS-MPs(j)一批一起培养；
d)通过使用磁性架进行第一次磁性分离来去除含有与所述NS-MPs(j)结合的寡核苷酸的结合混合物，并收集含有未与所述NS-MPs(j)结合的剩余寡核苷酸的上清液供后续流程使用或作为一种随机序列库供下一轮步骤c)使用，其中如果在步骤c)中所述随机序列库与所述NS-MPs(j)逐个一起培养，那么所述方法步骤c)和d)进行j次，或如果所述随机序列库与所有所述NS-MPs(j)一批一起培养，那么所述方法步骤c)和d)进行一次；
e)将含有所述剩余寡核苷酸的所述收集的上清液与所述PS-MPs(k)一起培养，其中所述收集的上清液与所述PS-MPs(k)逐个一起培养或与所有所述PS-MPs(k)一批一起培养；
f)通过使用所述磁性架进行第二次磁性分离来去除含有与所述PS-MPs(k)结合的寡核苷酸的结合混合物，并收集含有未与所述PS-MPs(k)结合的剩余寡核苷酸的上清液，其中如果在步骤e)中所述收集的上清液与所述NS-MPs(k)逐个一起培养，那么所述方法步骤e)和f)重复k次，或如果所述收集的上清液与所有所述PS-MPs(k)一批一起培养，那么所述方法步骤e)和f)进行一次；
g)将含有所述剩余寡核苷酸的所述收集的上清液与所述PS-MPs(i)一起培养；
h)通过使用所述磁性架进行第三次磁性分离来收集含有与所述PS-MPs(i)结合的寡核苷酸的所述结合混合物，并去除含有未与所述PS-MPs(i)结合的寡核苷酸的所述上清液；
i)使含有与所述PS-MPs(i)结合的寡核苷酸的所述收集的结合混合物再分散于第二结合缓冲液中；
j)使所述混合物溶液经受具有下限频率fiL和/或下限强度HiL的第一振荡磁场下的窗口-MARAS，以将对所述PS-MPs(i)具有第一结合亲和力的寡核苷酸与所述PS-MPs(i)分离，并通过使用所述磁性架进行第四次磁性分离，接着去除含有与所述PS-MPs(i)分离的所述寡核苷酸的上清液，来收集含有与所述PS-MPs(i)结合的寡核苷酸的所述结合混合物；
k)使含有收集的与所述PS-MPs(i)结合的寡核苷酸的所述结合混合物再分散于第三结合缓冲液中；
l)使所述结合混合物溶液经受具有上限频率fiU和/或上限强度HiU的第二振荡磁场下的窗口-MARAS，以将对所述PS-MPs(i)具有第二结合亲和力的寡核苷酸与所述PS-MPs(i)分离，并通过使用所述磁性架进行第五次磁性分离，接着收集含有对所述PS-MPs(i)具有第二结合亲和力的寡核苷酸的上清液，来去除与所述PS-MPs(i)结合的对所述PS-MPs(i)具有第三结合亲和力的寡核苷酸，
其中重复所述方法步骤a)至l)ⅰ次，或者重复所述方法步骤a)至l)i-1次并接着进行步骤a)至k)一次，从所述PS-MPs(i)洗提对所述PS-MPs(i)的结合亲和力比对所述PS-MPs(i)的第一结合亲和力强的寡核苷酸，并通过使用所述磁性架进行第六次磁性分离来收集含有对所述PS-MPs(i)的结合亲和力比对所述PS-MPs(i)的第一结合亲和力强的寡核苷酸的上清液，其中所述第二结合亲和力比所述第一结合亲和力强，并且所述第三结合亲和力比所述第二结合亲和力强，并且其中fiL<fiU≤f(i+1)L和/或HiL<HiU≤H(i+1)L；以及
m)获得能够与PS-MPs(i)结合的所述寡核苷酸作为对所述主要目标分析物(i)具有差别亲和力的适配体。
8.根据权利要求7所述的选择适配体的方法，其中步骤b)准备多个与阴性样品(j)结合的磁性粒子(NS-MPs(j))，准备多个与辅助目标分析物(k)结合的磁性粒子(PS-MPs(k))，并准备多个与主要目标分析物(i)结合的磁性粒子(PS-MPs(i))包括：
预处理多个生物样品以从样品去除干扰目标分析物(i)作为阴性样品(j)，或直接使用多个具有低浓度干扰目标分析物(i)的生物样品作为阴性样品(j)，并将所述阴性样品(j)与所述磁性粒子结合以形成所述NS-MPs(j)；
提供所述辅助目标分析物(k)并使所述辅助目标分析物(k)与所述磁性粒子结合以形成PS-MPs(k)；以及
提供所述主要目标分析物(i)并使所述主要目标分析物(i)与所述磁性粒子结合以形成PS-MPs(i)。
9.根据权利要求8所述的选择适配体的方法，其中使所述阴性样品(j)、所述辅助目标分析物(k)或所述主要目标分析物(i)与所述磁性粒子结合包括经由分别附接到所述磁性粒子和所述阴性样品(j)、所述辅助目标分析物(k)或所述主要目标分析物(i)的接合对将所述阴性样品(j)、所述辅助目标分析物(k)或所述主要目标分析物(i)接合到所述磁性粒子。
10.根据权利要求9所述的选择适配体的方法，其中所述接合对由链霉抗生物素蛋白和生物素构成；其中所述链霉抗生物素蛋白与所述磁性粒子结合并且所述生物素与所述阴性样品(j)、所述辅助目标分析物(k)或所述目标分析物(i)结合。
11.根据权利要求7所述的选择适配体的方法，其中步骤j)使所述混合物溶液经受具有下限频率fiL和/或下限强度HiL的第一振荡磁场下的窗口-MARAS包括通过施加具有所述下限频率fiL和/或所述下限强度HiL的第一旋转磁场或第一交变磁场来进行磁力辅助的筛选。
12.根据权利要求7所述的选择适配体的方法，其中步骤l)使所述混合物溶液经受具有上限频率fiU和/或上限强度HiU的第二振荡磁场下的窗口-MARAS包括通过施加具有所述上限频率fiU和/或所述上限强度HiU的第二旋转磁场或第二交变磁场来进行磁力辅助的筛选。
13.一种用于检测样品中的目标分析物的基于适配体的多重免疫分析，包括：
a)提供对所述目标分析物具有差别亲和力的适配体；
b)通过供应一或多种类型所述适配体，作为试剂并提供到所述多重免疫分析，其中所述适配体分散于结合缓冲液中，经过加热和淬火以形成二级结构，作为能够结合多个目标分析物的捕捉配体；
c)准备多个磁性粒子(MPs)与所述样品结合以形成样品-MPs，其中所述磁性粒子是纳米尺寸或微米尺寸；
d)将所述样品-MPs与所述试剂一起培养以形成所述多重免疫分析中的适配体-分析物混合物；
e)使所述适配体-分析物混合物经受亲和力区分装置以进行区分，其中使所述适配体-分析物混合物经受亲和力区分装置包括：
e')使所述适配体-分析物混合物经受具有下限频率fiL和/或下限强度HiL的第一振荡磁场下的窗口-MARAS，以将对与目标分析物(i)结合的磁性粒子(PS-MPs(i))具有第一结合亲和力的适配体与所述PS-MPs(i)分离，并接着通过使用磁性架进行第一次磁性分离来去除含有与所述PS-MPs(i)分离的所述适配体的上清液，收集剩余的适配体-分析物混合物，并将所述适配体-分析物混合物再分散于结合缓冲液中，其中i是从1开始的整数；以及
e")使所述适配体-分析物混合物经受具有上限频率fiU和/或上限强度HiU的第二振荡磁场下的窗口-MARAS，以将对所述PS-MPs(i)具有第二结合亲和力的适配体与所述PS-MPs(i)分离，接着通过使用所述磁性架进行第二次磁性分离来分离并收集含有对所述PS-MPs(i)具有第二结合亲和力的所述适配体的上清液和含有与所述PS-MPs(i)结合的对所述PS-MPs(i)具有第三结合亲和力的适配体的结合混合物，并将含有与所述PS-MPs(i)结合的对所述PS-MPs(i)具有第三结合亲和力的适配体的所述结合混合物再分散于结合缓冲液中(适配体-分析物混合物溶液)，其中重复所述方法步骤e')和e")ⅰ次，或者重复步骤e')和e")i-1次并接着进行步骤e')一次，从适配体-分析物混合物溶液中的PS-MPs(i)洗提对所述PS-MPs(i)的结合亲和力比对所述PS-MPs(i)的第一结合亲和力强的适配体，并通过使用所述磁性架进行第三次磁性分离来收集含有对所述PS-MPs(i)的结合亲和力比对所述PS-MPs(i)的第一结合亲和力强的所述适配体的上清液，其中所述第二结合亲和力比所述第一结合亲和力强，并且所述第三结合亲和力比所述第二结合亲和力强，并且其中fiL<fiU≤f(i+1)L和/或HiL<HiU≤H(i+1)L；以及
f)通过测量每一轮执行所述方法步骤e)所收集含从所述适配体-分析物混合物分离的所述适配体的所述上清液中的所述适配体的量，以检测所述适配体-分析物混合物中的所述目标分析物，并针对每种类型所述目标分析物，使用预定标准校准曲线，定量所述样品中的所述目标分析物。
14.根据权利要求13所述的多重免疫分析，其中步骤c)准备多个与所述样品结合的磁性粒子以形成样品-MPs包括：
提供所述样品并经由接合对使所述样品与所述磁性粒子结合以形成所述样品-MPs，其中所述接合对由链霉抗生物素蛋白和生物素构成，并且链霉抗生物素蛋白与所述磁性粒子结合并且生物素与所述样品结合。
15.根据权利要求13所述的多重免疫分析，其中提供对所述目标分析物具有差别亲和力的适配体包括提供对多种类型所述目标分析物具有差别亲和力的单一类型适配体。
16.根据权利要求13所述的多重免疫分析，其中提供对所述目标分析物具有差别亲和力的适配体包括提供对多种类型所述目标分析物具有差别亲和力的多种类型适配体。
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