CN107884566B - 可规模化生物元素分析 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测样品中的一种或多种分析物的方法。所述方法至少部分基于添加至该样品中的功能化颗粒部分地或完全地抑制电磁辐射经过含该样品的反应容器中的检测表面而传播到样品中及从中传播出来的能力。以微阵列形式，本发明能够用于筛选数百万、数亿或者更多的生物元素，诸如生物体、细胞、蛋白质、核酸、脂质、糖、代谢物或小分子。本发明还描述了方法、装置和试剂盒。
Description
本申请是申请日为2013年6月26日、申请号为201380045761.2、 发明名称为“可规模化生物元素分析”的中国发明专利申请的分案申 请。
背景技术
技术领域
本发明涉及对样品或系列样品中的一个或多个分析物进行检测。 更具体而言，本发明涉及用于测定生物元素种群中的一种或多种生物 元素(例如生物细胞)的方法。
相关技术
利用常规技术，可对生物学文库筛选含有例如细胞、抗体、蛋白 质、肽和核酸的组分。这些技术包括噬菌体展示、核糖体展示、酵母 细菌展示、体外区分、微雕法和空间寻址(spatial addressing)。这类 体系具有很多缺点，包括需要经由选择步骤(包括例如“淘洗”)来富 集所需克隆，该步骤固有地导致潜在结合候选物的损失。此外，难以 利用常规技术建立正信号的精确起源，这是因为常规技术从异源种群 获取混合信号，而不能被去卷积。通常，这些技术涉及利用噬菌体、 核糖体和特定细胞的选择过程，大部分过程在体外进行。
文库筛选上的改进已经引入了空间寻址的概念，以便在选择过程 中保持所筛选组分的身份。这类寻址可基于包括机器人学、酶联免疫 吸附测定或基于细胞的测定在内的技术。尽管空间寻址例如能够鉴定 特定细胞克隆以产生原种，但是这些方法不利于高通量筛选技术来选 择性分离并纯化已鉴定克隆以便迅速用于疾病诊断和治疗。目前筛选 方法另一缺点在于其通常局限于约5-10万之间的细胞数。
对于进行基于细胞的筛选，最特别的挑战之一在于以允许实施随 后的筛选步骤的方式来分离小的细胞种群。传统的分离细胞的装置和 方法不适于在不执行可潜在改变细胞功能或活性的步骤的情况下提供 小的细胞种群的分离。细胞分离不仅在筛选方面是重要的，而且在涉 及监控、测量和/或利用细胞活性或功能(例如抗体制备)输出的过程 中也是重要的。
因此，对从背景种群中分离少量特定细胞的需求是普遍的，其应 用于病理学、临床诊断、克隆和细胞生物学研究。目前的筛选方法具 有很多技术挑战，包括：所展示的蛋白质的尺寸必须要小，复合感染 要高以便避免多样性损失，对噬菌体活性的依赖性、多重淘洗过程是 必需的(需要1周或更多)，由于噬菌体、抗体，高度非特异性结合以 可溶形式可能不能很好行使功能(通常表达截短的克隆)，和/或亲和力 效应可能阻碍对高亲和力克隆的选择。
因此，本发明人已经认识到在本领域中对鉴定、分离及表征生物 种群组分的更有效的方法存在需求。
发明内容
在一个方面，本发明涉及用于检测样品中的分析物的方法。所述 方法部分基于样品中的微粒部分或完全抑制电磁辐射经过含样品的容 器中的检测表面而传播到样品中及从中传播出来的能力。在一个实施 方式中，该方法包括向含样品溶液的反应容器中添加第一颗粒和发射 电磁辐射的第一标记，其中该第一标记结合于第一颗粒，或者由于所 述样品中存在或缺乏分析物之故，该第一标记变得结合于第一颗粒。 第一颗粒积聚在第一检测表面处，以抑制电磁辐射经由该表面传播进 入样品中以及从中传播出来。检测从该第一检测表面发射出的电磁辐 射的存在或其量。第一颗粒可由于施加于样品的力之故而积聚于检测 表面处，其中该力选自重力、磁力、电力、离心力、对流力和声学力。 在一个方面，标记结合于颗粒，且由于样品中分析物的存在或缺乏之 故而被释放。
在进一步的实施方式中，本发明的方法包括向容器中添加发射电 磁辐射的第二标记以及至少形状、尺寸、密度、磁导率、电荷及光学 涂层中至少之一而不同于第一颗粒的第二颗粒，其中该第二标记结合 于第二颗粒，或者由于所述样品中存在或缺乏第二分析物之故，该第 二标记变成结合于第二颗粒。第二颗粒积聚在第二检测表面处，以抑 制电磁辐射经由该第二检测表面传播进入样品中以及从中传播出来。 检测在该第二检测表面处发射出的电磁辐射的存在或量。在该实施方 式的各种方面中，第一颗粒由于第一力而积聚于第一检测表面处，而 第二颗粒由于第二力而积聚于第二检测表面处，其中第一力和第二力独立选自重力、磁力、电力、离心力、对流力和声学力，并且其中第 一力和第二力被同时或顺序施加于样品。或者，第二颗粒可积聚在第 一检测表面处，以抑制电磁辐射经由该第一检测表面传播进入样品中 以及从中传播出来，其中第一颗粒由于第一力而积聚于第一检测表面 处，而第二颗粒由于第二力而积聚于第一检测表面处，其中第一力和 第二力独立选自重力、磁力、电力、离心力、对流力和声学力，其中 第一力和第二力被顺序施加于样品。可在该第一检测表面处检测从第 一颗粒和第二颗粒发射出的电磁辐射的存在或其量。
仍更进一步，本发明涉及从生物元素的异源种群中检测靶标生物 元素的方法。该方法包括：将生物元素的异源种群分布到容器阵列中； 向该阵列容器中添加颗粒和激活后发射电磁辐射的第一标记，其中第 一标记结合于第一颗粒，或者由于样品中的分析物存在或缺乏之故第 一标记变成结合于第一颗粒的；向阵列施加力，以使颗粒积聚于各容 器中的样品表面上；鉴定由容器发射的电磁辐射的存在或其量，从而 鉴定出含有靶标生物元素的容器。容器阵列可以是具有多个纵向融合 的毛细管的微腔阵列，毛细管的直径为约1至约500微米。另外，阵 列可具有每平方厘米阵列约300-64,000,000个毛细管。样品可以以意图在各容器中引入至多单个生物元素的浓度加至阵列中。
在本发明的各种实施方式中，容器或器皿是具有检测表面的微腔， 所述检测表面是微腔中样品溶液的弯液面。可用于通过施加磁场混合 样品，以使颗粒在样品溶液内移动，其中颗粒是磁性的。
另外，生物元素可以是微生物、细胞、蛋白质、核酸、脂类、糖 类、代谢物或小分子。例如，细胞产生重组蛋白，诸如酶或抗体。
仍进一步，本发明涉及在微腔阵列中从与电磁辐射吸收材料相结 合的单微腔中提取包含生物元素的溶液。该方法包括将电磁辐射集中 在微腔处以产生材料或样品的膨胀或者样品的蒸发，这将至少部分样 品从微腔中排出。在各种实施方式中，材料包括在微腔中的颗粒，或 者材料是至少部分涂覆或覆盖微腔的高热膨胀材料。
附图简述
图1是本文公开方法的代表性实施方式的示意图。
图2图解了根据本公开使用的高密度阵列的一个实施方式的实例。
图3图解了向阵列容器中添加或加载含分析物和其他生物元素的 样品的一个实施方式。
图4图解了用于扫描并鉴定产生信号的孔的方法的一个实施方式。 由于已标记颗粒积聚于孔的检测表面出，这些孔表现为高强度斑点。 在一个如本文所实施的测定设计中，诸如夹心法，具有强信号的孔将 被选择用于提取和进一步的制备。在如本文所实施的另一测定设计中， 诸如酶活性测定，不选择具有强信号的孔。反而，将选择显示最少信 号或无信号的孔。
图5图解了颗粒抑制来自溶液中未结合于颗粒的标记的信号的能 力。
图6图解了蛋白质结合与检测测定可在如本文所公开的孔中直接 进行。在该实施方式中，阵列的所有孔包括荧光标记的(Atto 590)链霉 亲和素和涂覆有生物素(A部分：正对照)和寡聚(dT)25(Oligo(dT)25)(B 部分：负对照)的磁珠。
图7展示了所公开方法在单细胞水平上的特异性。在该实施方式 中，阵列的所有孔包含表达重组蛋白质GFP的大肠杆菌细胞。各孔还 含有涂覆有鼠抗-GFP抗体(正对照)的磁珠和涂覆有寡聚(dT)25(负对照) 的磁珠。
图8展示了本文公开的方法无需细胞溶解来进行分析物检测。在 这些实施方式中，阵列被加载表达重组蛋白质GFP的大肠杆菌细胞。 各孔也含有荧光标记(Atto 590)，其也结合于鼠抗-GFP抗体。两种正 对照孔含有与抗GFP抗体结合的磁珠，但是一个阵列的孔在检测前利 用超声处理来溶解。负对照阵列利用产生处理溶解，且含有寡聚-dT珠， 该珠普遍抑制来自阵列中所有孔的信号。
图9是一种单孔提取方法的示意图。
图10展示了试剂、颗粒或其他分子可以被加至含细胞的阵列中或 者从中去掉而不会干扰细胞。在不打扰预加载HEK 293细胞的情况下， 将碘化丙啶(PI)加载到微孔中。A部分：PI加载前，具有最小的背景信 号。B部分：加载已经被插入无活性的HEK 293细胞的弯液面中的PI 之后。
实施方式详述
本发明涉及用于检测样品中的分析物的方法、装置和试剂盒。在 各种实施方式中，本发明涉及筛选生物元素大种群中生物元素亚种群 或单一元素的存在或缺乏。本发明可用于从数百万或数亿生物元素的 异源种群中发现、表征和选择特异性相互作用。
本发明利用生物测定技术，其中功能化颗粒积聚在样品容器的表 面出并部分或完全地物理抑制电磁辐射传播进入样品液中和/或从中传 播出来。在具体实施方式中，通过检测自每个腔中发射的电磁信号来 筛选高密度微腔，例如微孔。可利用下述阵列实现高灵敏度：该阵列 的排列使得每个腔含有能够抑制进入每个腔和/或从中出来的电磁辐射(EM)的单个或数个生物元素和微粒。通过使用微腔阵列和基于同源颗 粒的测定，本发明的方法提供规模性单细胞分析。该方法可用于在大 的复合混合物中发现非常少的(|108之1)生物元素，例如细胞。
本发明提供优于其他生物元素种群筛选方法的若干优点。首先， 其允许数百万、数亿或更多的平行的生物相互作用的样品筛选。本发 明还允许分析物(诸如靶细胞)的展示和独立发现。另外，其平行地 提供数亿克隆的浓度对亲和性信息(例如，对每个所表达基因可提供对 生产效率的反馈)。
在一个实施方式中，公开了利用微腔阵列(例如多孔玻璃阵列) 从数千、数百万甚或数亿细胞克隆种群中选择产生亚种群抗体的生物 细胞克隆(例如，单个或若干细胞克隆)的方法。在一个实施方式中， 微腔被填充含有具有抗体(或任何感兴趣蛋白质)产生基因的生物细胞 克隆的溶液(例如，培养基)。细胞使抗体在培养基中生长并表达，该 抗体可与固定于培养基内的颗粒上的结合配体反应并结合。通过向培 养基中添加荧光试剂(例如，荧光标记的抗-分析物抗体)可检测抗原-抗 体复合物。
在一个实施方式中，所述方法包括从微孔阵列中回收生物细胞。 在一个实施方式中，生物细胞包括产生荧光蛋白质的细胞。在一个实 施方式中，生物细胞包括产生融合于非荧光蛋白质的荧光蛋白质的细 胞。
本发明可用于分离任何类型的生物细胞，包括但不限于：表达或 产生蛋白质类、糖类、酶类、肽类、激素类、受体类的细胞系；产生 抗体的其他细胞系；基因工程细胞；和激活细胞。此外，本发明可用 于筛选多种生物活性，包括但不限于：表面受体蛋白质的表达、酶生 产和肽生产。此外，本发明还用于筛选多种测试剂以测定该测试剂对 所述生物活性的效果。本领域技术人员将容易理解需要进行分离和筛 选的其他类型的细胞、需要进行检测的其他类型的生物活性以及待被 筛选的特异性测试剂。
定义
除非另外定义，本文使用的技术和科学术语与本领域技术人员通 常理解的具有相同的含义。本文所提及的所有公开、专利申请、专利 及其他参考文件如果没有例外指示，均通过参考明确引入。
如本文所用，单数形式“一个(″a，″″an″)”和“该(″the″)”，包括复 数指代，除非上下文明确另外指示。
如本文所用，术语″结合配体(binding partner)″、″配体(ligand)″或″ 受体(receptor)″可以是任意大量的不同分子或聚集体，并且所述术语可 互换使用。在各种实施方式中，结合配体可与被检测的分析物缔合或 结合。蛋白质、多肽、肽、核酸(核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸)、 抗体、糖类、多糖、脂类、受体、测试化合物(特别是那些太过组合 化学制备的化合物)每个可以是结合配体。
术语″生物细胞″是指来自生物体的任何细胞，包括但不限于病毒 细胞、昆虫细胞、微生物细胞、真菌细胞(例如，酵母)或动物(例如， 哺乳动物)细胞。
如本文所用，术语″生物元素(biological element)”是指任何生物 活性分子。这些分子的非限定性实例包括蛋白质、核酸、肽、抗体、 抗体片段、酶、激素、生物细胞和小分子。
“分析物”通常指样品中的感兴趣元素，例如，生物样品中的感兴 趣生物元素。
如本文所用，术语″结合″或″附着″包括包括任何物理连接或紧密缔 合，其可以是永久性的或临时性的。这些物理连接或紧密缔合可以是 相互作用。这些缔合的非限定性实例为氢键合、疏水力、范德华力、 共价键合和/或离子键合。这些相互作用可促进感兴趣分子与被测量分 析物之间的物理连接。″结合″相互作用可以是简短的，如在结合引发 化学反应发生的情况中，诸如例如，当结合组分是酶，而分析物是该 酶的底物时。
由结合剂与分析物之间的接触产生的特异性结合反应也在该定义 内。此类反应是例如抗体与例如蛋白质或肽之间的相互作用结果，使 得该相互作用取决于蛋白质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的 存在。换言之，抗体识别并结合于特异性蛋白质结构，而非通常的蛋 白质。例如，如果抗体对表位″A″具有特异性，则含表位A(或游离的 未标记的A)的蛋白质在含经标记″A″和抗体的反应中的存在将降低结 合于该抗体的经标记A的量。特异性结合相互作用也可发生于其他分 子之间，包括例如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-小分子相互作用、 抗体-小分子相互作用以及蛋白质、糖类相互作用。这些相互作用中的 每一种可以发生于细胞的表面。
术语″阵列″和″微阵列″可互换使用，区别通常仅在于大小。在各种 实施方式中，阵列通常含有多种(典型为100到超过1,000,000)不同的 反应空间，用于细孔、孔、腔、内容器或贮器，其中各容器可位于已 知的位置且含有单个或多个感兴趣组分。
如本文所用，术语″样品″以其最宽含义使用，且包括环境和生物 样品。环境样品包括来自环境(诸如土壤和水)的材料。生物样品可 以是包括人类在内的动物、流体(例如，血液、血浆和血清)、固体(例 如，粪便)、组织、液态食品(例如，牛奶)和固态食品(例如，蔬菜)。例 如，肺样品可通过支气管肺泡灌洗(BAL)来收集，其包含源自肺组织的 流体和细胞。生物样品可包括细胞、组织提取物、体液、分离自细胞 的同原染色体或染色体外元素、基因组DNA、RNA、cDNA等。
各实施方式描述
公开了检测样品中的分析物的方法。该方法包括向具有确定检测 表面的容器添加含分析物的样品溶液、颗粒及发射电磁辐射。颗粒可 由于施加于容器的力之故而积聚在检测表面处并抑制信号自样品中的 标记(可能附着于检测表面上积聚的颗粒的标记除外)发出。样品中 分析物的存在或缺乏控制着颗粒是否能够积聚在容器的检测表面和/或 可能结合于表面上的颗粒的标记是否能够发射电磁辐射。本发明可用 于本领域已知的的多种测定形式。
在一个方面，标记结合于颗粒，或者作为样品在分析物存在或缺 乏的结果，标记变成结合于颗粒。按照本公开的这种实施方式，颗粒 可以用结合分析物的结合配体功能化，其可用本领域技术人员熟知的 测定形式来分析，例如，夹心法和竞争免疫测定法。在夹心法中，将 颗粒用分析物的结合配体功能化并与标记相混合，该标记包括能够发 射信号的部分(例如，荧光部分)和分析物的结合配体。作为分析物与 颗粒和标记结合的结果，标记变成与颗粒结合。标记在颗粒上的存在 表明样品中分析物的存在。在竞争性检测形式中，使具有分析物结合 配体的颗粒以及包括作为分析物类似物的第二结合配体的标记与样品 混合。该类似物与样品中的分析物相竞争地结合于颗粒上的分析物的 结合配体。来自标记的信号的缺乏表明样品中分析物的存在。
在另一测定形式中，分析物是酶，而颗粒直接用充当标记的该酶 的底物官能化(例如，通过共价键合)，或者该酶作为特异性或非特 异性结合或其他相互作用的结果与所述颗粒结合。来自酶/标记的信号 的存在或缺乏指示了分析物/酶将标记从产生信号转化至无信号产生 (反之亦然)的活性。
另一测试形式利用分析物释放与颗粒结合的标记的能力。例如， 分析物可以是裂解标记与颗粒之间的连接体的酶。或者，分析物当存 在于样品中时可阻止连接体裂解以及标记自颗粒中释放。
在使结合或酶反应进行之后，使颗粒积聚于检测表面处，以便部 分或完全抑制电磁辐射经过该表面而传播到样品中及从中传播出来。 然后测定该检测表面处电磁辐射的存在或其量。因此，当颗粒积聚于 该表面时，可在该表面处检测来自附着至颗粒的标记的电磁辐射。但 是，所述颗粒在表面处充当遮蔽物，以便抑制来自未结合于颗粒的标 记的电磁辐射。因此，消除了样品中的未结合标记的背景信号。类似 地，当颗粒不含任何结合标记时，该颗粒将不会在检测表面处发生任 何电磁辐射，并且其充当遮蔽物，以便抑制来自样品溶液中的未结合 标记在表面处被检测到。
在另一实施方式中，反应容器包括位于容器壁上的结合配体。在 作为分析物存在或缺乏之故的结合反应中，颗粒被捕获或者未被捕获 在反应容器的表面上。然后，颗粒没有抑制来自样品中的标记的电磁 辐射经过检测表面传播出反应容器。在该实施方式中，标记无需参与 结合反应并且能够在溶液中保持未结合。结合反应控制着当力施加于 该反应容器时颗粒积聚在检测表面上的能力。在该实施方式中，当颗 粒及容器壁涂覆有分析物的结合配体时，在分析物存在情况下，颗粒 可变成结合于溶液的表面，其中分析物被夹在结合配体之间。在该实 施方式中，来自反应容器中的标记的信号表明分析物的存在，这是因为颗粒变得结合于反应容器的壁，而且不能抑制电磁辐射离开容器。 在竞争性测定方式中，在分析物缺乏的情况下，涂覆有分析物类似物 的颗粒将与涂覆有分析物结合配体的容器壁结合。因此，自容器中信 号的缺乏将表明存在着分析物。
当标记可通过外源激活时，例如通过电磁辐射可激发的荧光标记， 积聚于表面的颗粒将阻止电磁辐射激发结合于表面处的颗粒的标记除 外的任何标记。检测表面处的颗粒充当阻止电磁辐射进入样品溶液并 激发溶液中未结合标记的遮蔽物。因此，仅有附着至表面处的颗粒的 标记被激发，并且避免了来自未结合标记的背景信号。当标记通过电 磁辐射(例如，热、电、化学反应、酶促反应)之外的来源可激活时，来 自样品中的激活标记的电磁辐射被阻止经过检测表面离开容器，这是 由于积聚在检测表面的颗粒之故。
反应容器的尺寸仅受限于颗粒积聚在该容器的反应表面并部分或 完全抑制电磁辐射传播进入或离开该容器的能力。优选较小形式，因 为较小样品尺寸是以有效方式筛选多种生物元素所必需的。
适用于本发明的反应容器已经或者能够被构造成具有能否积聚官 能化颗粒的检测表面。该表面不限于特定材料，只要其能传递电磁辐 射即可。可选地，该表面不结合任何材料，而且可对环境开放，使得 该检测表面成为样品溶液的表面，例如，反应孔、微孔板、微孔、毛 细管或微腔中的样品溶液的弯液面。电磁辐射经过该表面的传播应当 不受阻碍，当颗粒积聚在该表面时除外。在大规模上，该表面可以是 试管或反应孔中的窗口。无论容器尺寸如何，该表面周围的面积应阻 止电磁辐射传播进入样品或离开样品，以使电磁辐射仅能经过该表面 进入样品中。反应容器可具有不止一个表面，例如诸如位于毛细管或 微管各开口端的多个窗口或弯液面。
颗粒在检测表面上的积聚可通过向样品施加力来实现，该力将颗 粒牵引至表面。该力应当足够，以使颗粒的积聚阻止至少50％的电磁 辐射经过该积聚颗粒。在具体实施方式中，当至少30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％、95％或100％的辐射被阻止经表面进入或离开 样品时，抑制电磁辐射经检测表面进入或离开样品。可用于使颗粒积 聚于检测表面的力的示例性类型包括重力、磁力、电力、离心力、对 流力和声学力。
重力可用于使颗粒沉降至反应容器的底部。当容器底部包括检测 表面时，来自与颗粒缔合的标记的信号可被检测到。施加于含磁性颗 粒的样品的磁力可用于将颗粒吸引至容器顶部或其他部位的检测表 面。在特定实施方式中，磁力通过磁铁来施加，例如，立方体钕磁铁 (B666，K&J Magnetics Inc.)。
类似地，可使用带电颗粒，受电力作用，其使颗粒贯穿样品移动 并朝向检测表面。在一些实施方式中，所述力是如美国专利申请第 2006/0078998号中所述的电动力，该专利申请通过参考以其整体引入 本文。在一些实施方式中，颗粒绝缘并抑制电力施用于样品，从而阻 止样品中电刺激标记的激活。
同样，可使用具有不同共振频率的不同形状的颗粒经历声波频率， 其将共振颗粒转移并积聚于声压节点。在一些实施方式中，该力是例 如在Laurell，T.，et al.，Chem.Soc.Rev.2007，36：492-506中描述的声学 力，该文献通过参考以其整体并入本文。
图1描绘了微孔阵列中的示例性抗原-抗体识别测定或“夹心”分析 法。在该实施方式中，颗粒是磁性微粒且与抗原缔合和/或结合。所描 述的分析物是通过样品中的细胞生产的靶蛋白。荧光标记与抗体缔合 或结合，该抗体对所述靶蛋白具有特异性和/或与其结合。图(A)是将任 何力施加于阵列之前一个或多个孔中存在的各种生物组分的示意图。由于结合于靶蛋白的抗原，所述颗粒与荧光标记缔合，该靶蛋白也与 经标记抗体结合。图(A)表示样品添加至孔中之后不久的时间点，这是 因为一些靶蛋白保持着未与抗原和/或抗体结合。在一些实施方式中， 然后将阵列温育和/或搅拌，以促进靶蛋白结合。在任选的温育之后， 图(B)描绘了通过施加磁力而使颗粒积聚于检测表面后的孔。在该实施 方式中，检测表面是孔中的液体的开放表面。在该实例中，从孔表面 检测到来自与磁性颗粒结合的标记的电磁(EM)信号。
在另外的实施方式中，提供了检测样品中的两种或更多种分析物 的方法。该方法包括向反应容器中添加发射电磁辐射的第二标记和基 于下述性能中至少一种而不同于所述第一颗粒的第二颗粒：形状、尺 寸、密度、磁导率、电荷及光学涂层。如上所述，第二标记与第二颗 粒结合，或者作为样品中第二分析物存在或缺乏的结果(例如，酶与颗 粒结合，或者作为竞争性测定或夹心测定的结果，标记变成结合的)， 该第二标记变成与第二颗粒结合。第二颗粒积聚在第二检测表面处， 以抑制电磁辐射经由该第二检测表面传播进入样品中以及从中传播出 来。在该第二检测表面处检测由第二颗粒发出的电磁辐射的存在或量。
在各种实施方式中，用于检测第一分析物的第一颗粒由于第一力 而积聚于第一检测表面处，而第二颗粒由于第二力而积聚于第二检测 表面处，其中第一力和第二力独立选自重力、磁力、电力、离心力、 对流力和声学力，如上所述。第一力和第二力被同时或顺序施加于样 品并完成检测。
颗粒
当颗粒具有遮蔽样品(例如，抑制来自溶液中荧光色素的激发能 以及背景信号向检测器的传播)能力时，通过将颗粒集中于检测表面 处实现高灵敏度。合适的颗粒很容易商业可得的，并且根据本文公开 的方法可使用各种颗粒，只要所述颗粒能够积聚并抑制电磁辐射经过 检测表面。在各种实施方式中，颗粒是部分或完全不透明的。在某些 实施方式中，颗粒稀释电磁辐射，例如，颗粒可以具有至少约10％的 吸收效率，例如，25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95或100％。
在各种实施方式中，颗粒的大小从纳米级至反应容器横截面大小 的三分之一。例如，当微腔直径为约20微米时，颗粒可基于约0.01-7 微米的直径。颗粒的大小应允许颗粒积聚在容器的检测表面处，使得 颗粒的积聚抑制电磁辐射进入或离开样品溶液。例如，当反应容器是 微孔时，样品溶液与微孔的壁形成弯液面。当微孔在两端敞开时，弯 液面形成于微孔的顶部和底部。颗粒应当能够积聚在微孔顶部和底部 的弯液面处，使得电磁辐射被阻止离开或进入微孔中的样品溶液。
在特定实施方式中，颗粒直径在约0.01微米至约50微米范围内， 这取决于所用的容器的尺寸。在各种实施方式中，颗粒尺寸范围为约 0.1-15微米、约0.5-10微米以及约1至约5微米。
在某些实施方式中，颗粒包含金属或碳。适宜金属的非限定性实 例包括金、银和铜。其他金属材料适用于结合测定，这是本领域技术 人员熟知的。
在一个实施方式中，颗粒具有磁性，以使磁力可用于将颗粒积聚 于各反应容器的检测表面上，例如微腔的弯液面。
可对颗粒的表面化学功能化，以提供与样品组分的结合，这是本 领域技术人员熟知的。例如，使颗粒与链霉亲和素、生物素、寡聚(dT)、 蛋白质A&G、标记蛋白和/或任何其他链接多肽偶联。在大量应用中利 用了链霉亲和素-生物素相互作用的非常高的结合亲和性。结合链霉亲 和素的颗粒将于生物素化核酸、抗体或其他生物素化配体和靶标结合。 生物素化抗原是可与用于筛选分析物的颗粒结合的产物的有用实例。 在具体实施方式中，颗粒为偶联于若干不同配体的
颗 粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，例如，寡聚(dT)、蛋白质A&G、标记蛋 白(His，FLAG)、二次抗体和/或链霉亲和素(Part No.112-05D，Invitrogen， Carlsbad，CA)。
在一些实施方式中，具有不同磁导率的颗粒可用于提供作用于颗 粒的磁力的独立控制。在其他实施方式中，颗粒的其他性能可用于扩 展在每个腔中进行的测定的复用能力。当添加至样品中时，颗粒与所 需靶标(细胞、病原微生物、核酸、肽、蛋白质或蛋白质复合物等)结合。 这种相互作用有赖于颗粒表面上的配体的特异性亲和力。或者，可将 与酶的底物缀合的颗粒添加至样品，在这种情况下样品中的酶/分析物 终止底物发荧光的能力或者将底物激活成荧光的(例如，底物的酶介 导裂解)。
另一实施方式利用具有不同形状、密度、尺寸、电荷、磁导率或 光学涂层的磁性颗粒。这允许将不同探针(即结合配体)采用不同颗粒， 并且通过调整如何或何时施加磁场或其他力，所述颗粒可被单独探测。 还可利用沉降率通过尺寸、形状和密度来分离颗粒并扩展各腔中进行 的测定的复用能力。
例如，一个颗粒能够含有将允许测定每个腔中所产生的抗体与靶 标的亲和性的靶标抗原。位于各腔中的另一颗粒可含有位于同一颗粒 上的多种抗原，其允许测量抗体的特异性。当没有磁场时，可以利用 具有不同尺寸或密度的颗粒的沉降时间。可通过在腔底部扫描检测表 面来检测具有较快沉降时间的颗粒。如果具有较慢沉降时间的颗粒具 有较高磁导率，则仅仅当施加磁场时其能够在其他颗粒之前被吸引至 腔的底部。
类似地，一些颗粒可以是磁性的，而其他则不是，并且磁性颗粒 可以通过施加的磁场被吸引至腔的顶部并在那里得到检测，而无磁性 颗粒沉降至腔的底部并能够在那里的得到检测。利用这些类型的方法， 可以在同一孔中测量灵敏度和特异性。
在某些实施方式中，颗粒用于混合容器中的内含物。例如，在温 育步骤中，使磁性颗粒交替或间歇地经历磁场。颗粒的运动和沉降导 致反应容器中的内含物混合。
可使用任何合适的结合配体，其对待被检测的分子(例如，标记 物)形式具有必需的特异性。如果分子(例如标记物)具有数种不同 形式，则结合配体的不同特异性是可能的。适宜的结合配体在本领域 是已知的且包括抗体、适体、外源凝集素和受体。有用且通用的结合 配体类型是抗体。
本文公开的检测样品中的分析物的方法允许同时测试每个孔中的 两种或更多种不同抗原。因此，在一些实施方式中，同时的正和负筛 选可发生于同一孔中。这种筛选设计改进了初始采样数的选择性。在 某些实施方式中，所测试的第二抗原可以是对照抗原。利用对照抗原 对贯穿阵列中的多个孔归一化生物元素浓度是有用的。非限定性实例 将是利用对感兴趣分析物具有特异性的第一抗原以及对所有蛋白质具 有非特异性的第二抗原，诸如-N或-C端。因此，感兴趣孔的结果可 通过使信号与总蛋白质浓度进行比较来量化。
在一些实施方式中，第二抗原与不同于第一颗粒的第二颗粒缔合。 所述颗粒在至少一种下述性能方面的可变的：形状、尺寸、密度、磁 导率、电荷及光学涂层。作为样品中第二分析物存在或缺乏的结果， 第二标记因此能够与第二颗粒缔合并利用如下所述的动力来处理。
在另一实施方式中，颗粒非特异性结合样品组分。例如，颗粒能 够被官能化，以便非特异性结合样品中的所有蛋白质，这允许对阵列 中的样品之间的蛋白质含量归一化。
抗体
如本文所用的，术语″抗体″是广义术语并以其常规含义使用，其 无限制地包括天然出现的抗体以及非天然出现的抗体，包括例如单链 抗体、嵌合抗体、双功能抗体以及人源化抗体，以及其抗原结合片段。 应理解，抗体形成以针对的分子的表位或区域的选择将确定其对例如 各种形式的分子(如果存在)的特异性，或者对全部(例如，所有或 基本所有)分子的特异性。
生产抗体的方法已经建立。本领域技术人员将意识到很多方法可 用于制备抗体，例如如Antibodies，A Laboratory Manual，Ed Harlow and David Lane，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)，Cold Spring Harbor， N.Y.中所述。本领域技术人员还将理解，模拟抗体的结合片段或Fab 片段可通过各种方法从遗传信息制备(AntibodyEngineering：A Practical Approach(Borrebaeck，C.，ed.)，1995，Oxford UniversityPress，Oxford；J. Immunol.149，3914-3920(1992))。针对分子(例如蛋白质)和标记物的单克隆和多克隆抗体也是商业可得的(R and D Systems，Minneapolis， Minn.；HyTestLtd.，Turk，Finland；Abcam Inc.，Cambridge，Mass.，USA，Life Diagnostics，Inc.，WestChester，Pa.，USA；Fitzgerald Industries International，Inc.，Concord，Mass.，USA；BiosPacific，Emeryville，Calif.)。
在一些实施方式中，抗体是多克隆抗体。在其他实施方式中，抗 体是单克隆抗体。
捕获结合配体和检测结合配体对，例如捕获和检测抗体对，可用 于本发明的实施方式中。因此，在一些实施方式中，使用异源测定方 案，其中，通常使用两种结合配体，例如两种抗体。一种结合配体是 捕获配体，通常固定在颗粒上，而另一种结合配体是检测结合配体， 通常带有附着的可检测标记。此类抗体对得自几种商业来源，诸如 BiosPacific、Emeryville、Calif。抗体对还可以通过本领域熟知的方法 设计和制备。
在具体实施方式中，抗体是生物素化的或生物素标记的。在另一 实施方式中，抗体是抗-GFP。
在一个实施方式中，存在第二成像组分，其非特异性结合感兴趣 分析物的所有成员。因此，可读取这种信号，以归一化孔与孔之间的 荧光量。一个实例是会在N或C端结合所有蛋白质的抗体。对于对照 组分而言，与靶标元素结合的微粒可被积聚在一个检测表面处，而与 对照元素结合的微粒积聚在另一检测表面处。或者，通过利用微粒中 的差异(该差异允许微粒在不同时间处于表面上)，能够在同一表面 上检测结合靶标和对照的微粒。因此，在检测窗口对标记进行检测可 顺序发生。
标记
可用于标记结合配体以便能够在颗粒混合物中进行其检测或区分 的数种策略在本领域是熟知的。可通过任何已知的手段附着标记，包 括利用非特异性或特异性相互作用的方法。另外，可直接或经由结合 配体来完成标记。
来自部分的发射(例如荧光)应足以使得利用检测器进行检测， 如本文所述。通常，本发明的组合物和方法利用高度荧光部分，例如 当在该部分的激发波长下被电磁辐射源刺激时能够发射电磁辐射的部 分。若干种部分适合本发明的组合物和方法。
通过电磁辐射之外的能量可激活的标记也可用于本发明。此类标 记例如可通过电、热或化学反应(例如，化学发光标记)激活。同样，多 种酶促激活标记是本领域技术人员熟知的。
通常，所述部分的荧光涉及量子效率与缺乏光褪色的组合，从而 足够使得所述部分在所公开的检测器中在背景值之上是可检测的，且 具有所需的检测极限、精确度和测定精度所需的一致性。
此外，所述部分具有与其在所选测定中的应用一致的性能。在一 些实施方式中，测定是免疫测定，其中荧光部分附着至抗体；该部分 必须具有下述性能，该性能使其不会与其他抗体或蛋白质聚集，或者 使其不会产生比与所需精确度和测定精度相一致的聚集更多的聚集。 在一些实施方式中，荧光部分使分子染色，所述分子具有下述的组合： 1)高吸收系数；2)高量子产率；3)高耐光性(低光漂白)；和4)与标记感 兴趣分子(例如，蛋白质)的相容，以便其可利用本发明的分析仪和体系 来分析(例如，不会引起感兴趣蛋白质的沉淀，或者已经附着了该部分 的蛋白质的沉淀)。
荧光部分可包括单一实体(量子点或荧光分子)多个实体(例如，多 个荧光分子)。应理解，当“部分”(如该术语用于本文中)是指一组荧 光实体(例如多个荧光染料分子)时，每个实体可单独附着至结合配 体，或者该实体可附着在一起，只要该实体作为一组提供待被检测的 足够荧光。
在一些实施方式中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚鎓 (indolium)环体系，其中该吲哚鎓环体系3-碳上的取代基含化学活性基 团或共轭物质。实例包括AlexaFluor分子。
在一些实施方式中，标记包含第一类型的标记和第二类型的标记， 诸如两种不同的ALEXA
染料(Invitrogen)，其中第一类型的染 料分子和第二类型的染料分子具有不同的发射光谱。
用于荧光部分中的有用的荧光实体的非涵盖性名单包括：ALEXA 
488、ALEXA
532、ALEXA
647、ALEXA 
700、ALEXA
750、荧光素、B-藻红蛋白、别藻蓝蛋 白、PBXL-3、Atto 590和Qdot 605。
标记可通过本领域已知的任何方法被附着至颗粒，包括吸收、共 价键和、生物素/链霉亲和素或其他结合对。另外，标记可通过连接体 附着。在一些实施方式中，标记被分析物裂解，从而从颗粒中释放标 记。或者，分析物可防止连接体裂解。
阵列
在一个实施方式中，用于本发明的反应容器包含在极度密集的多 孔阵列中。例如，在本文中考虑的微孔阵列可通过捆扎数百万或数亿 硅石毛细管并通过热工艺将其熔合在一起来制造。这类熔合过程包括 下述步骤，其包括但不限于：i)加热在拉力下被拉成单包层纤维的毛 细管单拉制玻璃；ii)通过捆扎、加热和拉伸从该单拉制玻璃产生毛细 管多拉制单毛细管；iii)通过额外的捆扎、加热和拉伸从该多拉制单毛 细管产生毛细管多-多拉制多毛细管；iv)通过在压块中堆叠从该多＝多 拉制多毛细管产生拉制玻璃的分段装配；v)通过利用热和压力处理从 该分段装配产生块状压块；及vi)通过以精确长度(例如，1mm)切割 该块状压块产生块成块(block forming block)。
在一个实施方式中，所述方法还包括切开硅石毛细管，从而形成 非常高密度的玻璃微孔阵列板。应理解，用于本发明的微孔阵列可通 过任何合适的方法形成。在一个实施方式中，毛细管被切割成约1mm 的高度，从而形成内径在约1.0微米与500微米之间的多个微孔。在一 个实施方式中，微孔在约10微米与1毫米的长度之间变动。在一个实 施方式中，微孔在约10微米与1厘米的长度之间变动。在一个实施方 式中，微孔在约10微米与10毫米的长度之间变动。在一个实施方式 中，微孔在约10微米与100毫米的长度之间变动。在一个实施方式中， 微孔在约0.5毫米与1米的长度之间变动。
此类方法形成可用于本发明中的非常高密度的微孔阵列。在示例 性阵列中，各微孔具有5μm直径和约66％开放空间(即，表示每个微 孔的内腔)。在一些阵列中，开放阵列的比例范围在约50％至约90％之 间，例如，约60至75％，诸如Hamamatsu提供的微孔阵列具有约67％ 的开放区域。在一个具体实例中，具有约5μm直径微孔和约66％开放 空间的10x10cm阵列具有约33亿微孔。见例如图2。
在各种实施方式中，微孔内径在约1.0微米与500微米之间的范围 内。在一些阵列中，所述微孔的每一个可具有在约1.0微米与300微米 之间的范围内的内径，任选在约1.0微米与100微米之间；还任选在约 1.0微米与75微米之间；仍进一步任选在约1.0微米与50微米之间， 仍进一步任选在约5.0微米与50微米之间。
在一些阵列中，阵列的开放区域包括多至90％的开放区域(OA)， 这样当孔隙大小在10μm-500μm之间变化时，每立方厘米阵列的微孔 数目在458-1,146,500之间变化，如下表所示的。在一个阵列中，阵列 的开放区域包括约67％的开放区域，这样当孔隙大小在10μm-500μm 之间变化时，每厘米阵列的微孔数目在341-853,503之间变化，如下表 所示的。应理解，在孔隙大小为1μm以及开放区域多达90％时，每立 方厘米阵列将容纳多达约11,466,000个微孔。
在一个具体实施方式中，微孔阵列可通过粘合数亿硅石毛细管并 经过热工艺将其熔合在一起来制造。之后，割掉切片(0.5mm或更多)， 形成非常高纵横比的玻璃微型穿孔阵列板。参见于2011年7月13日 提交的国际申请PCT/EP2011/062015(WO2012/007537)，其通过参考以 其整体并入本文。阵列也是商业可得的，诸如得自Hamamatsu PhotonicsK.K.，(Part No.J5022-19)以及其他制造商。在一些实施方式中，在一端 封闭阵列的微孔，且固体底物附着至阵列。
因此，除了更快且更易于应用，检测所产生的蛋白质的能力使这 种微孔阵列提供了相比依赖于在展示载体(即，噬菌体展示、核糖体展 示、哺乳动物细胞展示、细菌细胞展示或酵母展示)表面上表达的靶分 子的当前方法而言更高的分辨率。与噬菌体展示方法相比，这种阵列 的其他益处包括每孔同时测试两种(或更多种)靶分子的能力(即，正 和负筛选)，以及不受限于被检查的担蛋白质的大小，这是因为噬菌体 展示的蛋白质必须要小。
在另一实施方式中，本发明考虑了加载阵列的方法，包括使含多 个细胞的溶液与阵列接触形成加载阵列。在一个实施方式中，将抗体 分泌细胞(例如大肠杆菌)混合物均匀加载到所有微孔中包括将500μL 液滴置于阵列的上侧并将其在所有微粒上铺展开。可将异源细胞种群 加载到微孔阵列上。在一个实施方式中，500μL液滴中初始浓度约109个细胞产生约3细胞(或亚群)/微孔。在一个实施方式中，每个微孔具 有约20-80pL之间的体积(取决于250μm-1mm之间的玻璃毛细管板 的厚度)。在加载微孔并放置过夜后，各微孔然后应含有约2,000-3,000 个细胞/微孔。在一个实施方式中，细胞可被培养多达58小时而没有损 失活力，从而最大化增殖率。尽管理解本发明的机制不是必需的，但 是认为在全部微孔上“铺展”液滴提供细胞在多个微孔中的最优分布。 理论上，将液滴加至微孔阵列中应当均匀地填充所有孔。然而，经验 评价证实表面张力实际上阻止了该液滴进入中央的微孔。如果液滴被 均匀铺展在微孔阵列表面上，则将去除表面张力。因此，如果液滴被 直接向下放到微孔阵列上，由于表面张力仅有液滴边缘处的孔填充(此 外，蒸发致液滴回缩，使得液体不再保持处于悬浮)。这在检测适宜分 析物后引发光环效应(halo ring effect)。见WO2012/007537。
在一个实施方式中，溶液占约三(3)μL。在一个实施方式中，所述 多个细胞可选自动物细胞、植物细胞和/或微生物细胞。在一个实施方 式中，所述多个细胞包括大肠杆菌(E.coli)细胞。在一个实施方式中， 大肠杆菌细胞分泌至少一种感兴趣重组化合物。在一个实施方式中， 该感兴趣重组化合物对结合配体具有亲和性。
尽管理解本发明的机制并非必要，但是认为如果在约500μL溶液 中存在约109个细胞，则对于具有约3-4x 106微孔的阵列而言，平均起 来应当存在约约三个(3)细胞/微孔。应注意确切数目应取决于阵列中的 孔数。例如，如果阵列具有约3-4x 106个微孔，其因此将具有约500-100 个细胞/孔。在一个实施方式中，每个微粒包括范围在约20-80pL之 间的体积。
在某一实施方式中，腔的侧壁不能传输电磁辐射，或者腔涂覆有 阻止电磁辐射在阵列的腔之间传输的材料。合适的涂层应当不会干扰 腔内的结合反应或者向腔施加力。示例性涂层标记包括金、银和铂金 的溅射纳米层。
在一些实施方式中，阵列的腔具有能够自发将溶液吸收到孔中的 亲水表面。
样品稀释、制备和温育
含生物样品种群和/或文库的样品在分配至阵列之前可能需要制备 步骤。在一些实施方式中，这些制备步骤包括温育时间。温育时间将 取决于筛选的设计。示例时间包括5分钟、1小时和/或3小时。示例 范围为1秒至72小时。
在某些实施方式中，在添加和/或加载到阵列上之前将生物元素的 异源种群在培养基中展开。对于某些应用，在指数生长期同时将培养 基和元素混合物加载到阵列中。
在其他实施方式中，含生物样品种群和/或文库的样品在添加至阵 列之后可能需要制备步骤。在其他实施方式中，在温育期间展开各孔 的中各元素(生长细胞、繁殖噬菌体、表达及释放蛋白质等)。该温育时 间使生物元素产生生物活性分子。
对于一些实施方式，各孔具有将使某些生物元素复制的培养基体 积。在特定实施方式中，该培养基体积是约20pL，其提供足以使孔内 的大部分单一细胞复制多次的培养基。可任选在任何温度、湿度和时 间温育阵列，以使生物元素展开并产生靶蛋白。温育条件可基于试验 设计来确定，这在本领域是常规的。
浓度、条件和加载
在特定实施方式中，设计阵列，使得一些或所有孔含有单一生物 元素，以便筛选分析物。因此，根据阵列设计以及待鉴定的所需分析 物计算生物元素异源混合物的浓度。在其中筛选产蛋白质细胞的实施 方式中，该方法是有利的，这是因为其消除了克隆竞争并因此能够筛 选大得多的多样性。
在一个实施方式中，本发明的方法考虑了设置细胞异源种群悬浮 液的浓度以及阵列的尺寸，使得1-1000个生物元素，任选1-500个 生物元素，进一步任选1-100个生物元素，仍进一步任选1-10个生 物元素，仍进一步任选1-5个生物元素分配到至少一个所述阵列微孔 中。
液滴的体积将取决于若干变量，例如包括所需应用、异源混合物 的浓度和/或所需的生物元素稀释。在一个特定实施方式中，阵列表面 上所需体积是约1μL/mm2。确定浓度条件的确定使得生物元素以任何 所需的模式或稀释分布。在具体实施方式中，浓度条件的设置涉及在 阵列的大部分孔中，仅有单元元素存在。这使得单一元素的筛选最精 确。
这些浓度条件可容易地进行计算。举例来说，在细胞筛选中，如 果产蛋白质细胞与孔之比为约1-3，则具有109个孔的阵列可被加载6 mL体积约3x108个不同产蛋白质细胞(6mL＝20pL/孔x 3x 108个孔)， 巨大量的孔最多含有单克隆。在某些其他实施方式中，在各孔中单一 生物元素不是所需的。对于这些实施方式，异源种群浓度的设定使得 不止一种生物元素发现于各孔中。例如，图3显示了通过将1.0mL液 滴置于阵列一侧上并在所有孔中将其展开而将产蛋白质细胞(细菌细 胞：大肠杆菌)混合物加载至阵列孔中。
筛选还可用于富集生物元素(例如生物细胞)的种群。例如，如 果种群中生物元素的数目超出阵列中的孔数，则可利用各孔中的不止 一种元素来筛选种群。然后可以提取提供正信号的孔的内含物以提供 亚群。可以立即筛选亚群，或者当亚群是细胞时，可将其展开。可重 复筛选过程，直至阵列的各孔仅含有单一元素。筛选还可用于检测和/ 或提取显示所需分析物存在于其中的孔。选择孔之后，可使用其他常 规技术分离感兴趣的单独分析物，诸如提供较高水平的蛋白质生产的 技术。
在生物元素已被加载到阵列中之后，可在不干扰生物元素的情况 下添加额外的分子或颗粒或者可将其从阵列中移走。例如，可添加在 生物元素检测中有用的任何分子或颗粒。通过将含分子或颗粒的液体 试剂引入阵列顶部(诸如例如，通过如关于添加生物元素所述般的滴 加)，可将这些额外的分子或颗粒添加至阵列中。为从包含生物元素 的阵列中移走特定分子，可制备溶液，其不含待被移走的所选分子但 是含有以所需浓度存在于孔阵列中的所有剩余分子。如前所述将液滴 加至阵列中。在孔阵列的内含物用该溶液滴平衡之后，阵列中所选分 子的浓度将被降低。降低的量取决于所加液滴的体积以及阵列中所含的总体积。为进一步降低所选分子的浓度，在将第一滴从阵列顶部去 除然后添加第二液滴，可重复该步骤。可通过例如用纸巾或用移液管 吸干阵列而将液体从阵列顶部去除。
在某些实施方式中，样品添加至孔之后，用膜密封阵列顶部，以 减小培养基自孔中的蒸发。样品添加至孔之后，一种或多种基本不透 过气体和/或液体的膜可用于密封阵列的表面。例如，典型的饮食服务 型塑料包装(诸如聚偏二氟乙烯(PVDF))是合适的。在另一实施方 式中，膜使得水蒸气与孔中液体的顶部液层平衡，这可有助于防止蒸 发。例如，与微孔阵列的上表面接触放置的薄膜(且水置于薄膜顶部) 将捕捉各孔内的孔的内含物，但是其会使水或培养基流入孔中。有用 的膜的实例为硝基纤维素和
膜。类似的布置可利用具有非常 小的空穴(例如10-100nm)的多孔形式的聚四氟乙烯膜(例如， GORE-
织物)获得，该空穴会捕获孔中的任何细胞，但是允许水、 培养基和其他试剂进入孔中。
微腔内容物的提取
基于从与腔阵列相关的检测器收到的光学信息，鉴定具有所需性 能的目标腔，并提取其内含物以进一步表征和展开。所公开的方法是 有利的，这是因为其保持了腔中生物元素的整体性。因此，本文公开 的方法提供了从多达数亿靶标生物元素的种群中展示并独立发现目标 生物元素种群。这对于筛选细胞的实施方式是特别有利的。
例如，在将颗粒拉至孔的顶部或底部之后，扫描来自各孔的信号 以定位感兴趣的结合事件(见图4)。这鉴定出感兴趣的孔。可利用多 种方法提取含所需克隆的个体孔。对于所有提取技术，可经由培养或 扩增反应展开所提取的细胞或材料并对其进行鉴定以发现蛋白质、核 酸或其他生物元素。如上所述，还考虑多轮筛选。在各筛选之后，可 如本文所述提取一个或多个感兴趣腔。然后可再次筛选每个腔的内含 物，直到获得所需的特异性。在某些实施方式中，所需的特异性将是 单一生物元素/孔。在这些实施方式中，在腔仅包括单一元素之前，提 取可在每轮筛选之后进行。
在一个实施方式中，该方法包括通过压力引射分离位于微孔中的 细胞。例如，将分离的微孔阵列用塑料膜覆盖。在一个实施方式中， 该方法还提供能够经过塑料膜制备孔的激光，从而暴露经空间地址定 位的微孔。随后，暴露于压力源(例如，气压)使内含物从该空间寻址的 微孔中排出。见WO2012/007537。
另一实施方式涉及从微腔阵列的单一微腔中提取含生物元素的溶 液的方法。在该实施方式中，微腔与电磁辐射吸收材料缔合，使得该 材料位于腔内或者涂覆或覆盖该微腔。通过将电磁辐射聚焦于微腔以 产生样品或材料或二者的扩张，或者产生使至少部分样品从微腔中排 出的蒸发，发生提取。电磁辐射源可以与激发荧光标记的源相同或不 同(见图1，其描绘了相同的电磁辐射源用于激发标记以及提取阵列腔 的组分)。该源能够发出多种波长的电磁辐射，从而适应不同的吸收光 谱的材料和标记。
使已选微腔经历聚焦的电磁辐射能够引发电磁辐射吸收材料的膨 胀，这迫使样品内含物到达用于收集所排出的内含物的基底上。例如， 图9显示了对该感兴趣的特定微腔的提取。选择感兴趣腔，然后通过 聚焦20-30％强度功率的349nm固态UV激光器进行提取。在一个实 例中，所述源是三倍频脉冲固态Nd：YAG或Nd：YVO4激光源，其在约 50纳秒脉冲内发射约1μJ至约1mJ脉冲。可使用带光闸(shutter)的 连续波激光器和脉冲激光器源。激光器应具有足够的光束质量，以使 其能够聚焦成直径大致等同或小于孔直径的光斑大小。功率水平将取 决于腔的大小及其内含物。
如本领域技术人员所理解的，来自电磁辐射源的电磁辐射发射光 谱必须使得与腔缔合的电磁辐射吸收材料的吸收光谱中存在至少部分 重叠。然后可将所提取的内含物置于捕获表面上(见图9)。当所提取的 内含物包括细胞时，可将其展开以获得蛋白质、抗体或其他感兴趣元 素。
在一些实施方式中，捕获表面包括吸湿层，腔的内含物被排放至 其上。该吸湿层吸引水并阻止光学面形变，从而使腔内含物清晰成像。 在某些实施方式中，该层是吸湿性成分，诸如含甘油的溶液。该层例 如可通过铺展、擦拭或喷射来施用，并且应在表面上产生均匀分散。 典型地，该层厚度为约10-100μm，只要该层不扭曲经过该层的EM辐 射而且不会接触上面的阵列。
腔内的材料例如可以是如上所述结合测定中所用的颗粒。因此， 颗粒可具有使颗粒响应力的性能，以便在检测表面上积聚，并且颗粒 还包括电磁辐射吸收材料，例如
颗粒。在各种实施方式 中，在检测到检测表面处的信号之后(通过连续的或再施加的力)，颗粒 积聚在检测表面上的同时向其施加能量，或者力被移走以便颗粒返回 样品溶液中。或者，腔包括不参与结合反应但是其存在是为了提供如 本文所述的内含物提取的颗粒或其他材料。这些颗粒可被功能化，以 便其独立于该测定的结合反应而与微腔的壁结合。类似的材料可用于 涂覆或覆盖微孔，特别是高膨胀材料，诸如
涂层(瑞典， AkzoNobel)。在另一实施方式中，
材料可以粘结至阵列一 侧的粘合层的形式供应，这样每个孔均粘结至膨胀层。
在微腔中聚焦电磁辐射能引起电磁辐射吸收材料膨胀，这使得腔 的至少部分液体体积被排出。加热该材料也可引发腔内含物的迅速膨 胀。在一些实施方式中，通过加热一部分内含物(多至50％)膨胀多达 1600倍，这使得剩余内含物的一部分被从腔中排出。
不会使材料或腔内含物迅速膨胀，加热能引发内含物蒸发，通过 将内含物冷凝在基底上可对其进行收集。例如，所述基底可以是置于 腔开口或其附近的疏水性微柱。随着样品蒸发并在弯液面外的毛细管 壁上冷凝，也发生内容物的排出，这使得弯液面打破并释放毛细管的 内含物。
诸如微孔的微腔在两端可以是开放的，其中内含物通过流体静力 被保持在适当位置。在提取过程中，可覆盖腔的一个端以防止内含物 从错误的腔的一端排出。例如，可以与上述塑料膜般相同的方式覆盖 腔。同样，膨胀材料可作为层粘结至阵列的一侧。
装置
在一些实施方式中，按照本发明的分析物检测需要利用能够向样 品以及具体向容器阵列(诸如微阵列)施加电磁辐射的装置。所述装 置必须还能够检测从样品以及特别是从样品容器的检测表面发出的电 磁辐射。
根据本公开可使用任何类型的电磁辐射源而不背离本发明的范 围。在一个实施方式中，所述装置的电磁辐射源是广谱光源或单色光 源，其具有匹配样品中的至少一种标记的波长的波长。在进一步的实 施方式中，电磁辐射源是激光器，诸如连续波激光器。在又进一步的 实施方式中，电磁源是固态UV激光器。其他合适的电磁辐射源的非 限定性名单包括：氩激光器、氪、氦-氦、氦-氦型以及二极管激光器。 在一些实施方式中，电磁源是一种或多种连续波激光器、弧光灯或 LED。
在一些实施方式中，装置包括多个电磁源。在其他实施方式中， 多个电磁(EM)辐射源在相同波长下发射电磁辐射。在其他实施方式中， 该多个电磁源发射不同波长，以适应可能存在于样品中的各种标记的 不同吸收光谱。
在一些实施方式中，放置电磁辐射源，使得微孔阵列能与电磁辐 射接触。在一些实施方式中，放置电磁辐射源，使得容器的检测表面 能经历电磁辐射。
该装置还包括接收来自样品阵列中的标记的电磁(EM)辐射的检测 器。该检测器能鉴定从一个或多个标记发射电磁辐射的至少一种容器 (例如，微孔)。
在一个实施方式中，检测暴露于电磁辐射后由荧光标记发射的光 (例如，紫外、可见或红外范围的光)。检测器或多个检测器能够捕获来 自荧光部分的光子爆发的振幅和持续期间，并进一步将光子爆发的振 幅和持续期间转化为电信号。
在标记颗粒以使其可检测时，或者如果颗粒具有使其可检测的固 有特征，可使用本领域已知的任何合适的检测机制，而不背离本发明 的范围，例如CCD相机、视频输出模块相机、扫描相机、辐射热计、 光电二极管、光电二极管阵列、雪崩光电二极管和产生连续信号的光 电倍增管及其组合。可检测电磁辐射的不同特征，包括：发射波长、 发射强度、爆发大小、爆发持续期间、荧光偏振及其任何组合。
检测过程也可以是自动化的。其中装置包括自动化检测器，诸如 激光扫描显微镜。
在一些实施方式中，所公开的装置可包括至少一个检测器。在其 他实施方式中，所述装置可包括至少两个检测器，而且各检测器可被 选择并配置成检测由标记发出的特定波长范围的光能。例如，两个独 立的检测器可用于检测已经被不同标记标识的颗粒，其在用电磁源激 发后将发出具有不同光谱中的能量的光子。
试剂盒
在另一方面，本发明涉及用于检测分析物的试剂盒。在示例性实 施方式中，该试剂盒包括多个纵向熔合的毛细管的微孔阵列，该毛细 管具有约1微米至约500微米的直径。在某些实施方式中，毛细管最 小化毛细管直径的光或EM辐射传播。该试剂盒还可包括当经受动力 时能够在样品液内移动的颗粒，诸如磁性颗粒。这些颗粒可包括分析 物的结合配体或其他样品组分。在某些实施方式中，试剂盒包括已经 用分析物的结合配体功能化的磁性颗粒。另外，试剂盒可任选包括一 只或多种能够发生电磁辐射的标记，其中该标记可与分析物的结合配 体或其他样品组分缀合。试剂盒还可包括在样品中的第二、第三或第 四组等分析物，以便在阵列的微孔之间提供样品组分的归一化。防止 光或其他不利条件引起的试剂降解的稳定剂(例如，抗氧化剂)也可以是 试剂盒的一部分。在其他实施方式中，除了检测试剂和缓冲剂之外， 试剂盒含有对从感兴趣基因表达的蛋白质具有特异性的抗体。在其他 实施方式中，试剂盒含有对mRNA或cDNA检测具有特异性的试剂(例 如，寡核苷酸探针或引物)。
试剂盒任选包括指导材料，其含有提供使用微孔阵列来检测从生 物细胞分泌的各种生物化合物的说明书(即治疗方案)。尽管指导材料典 型地包括书面或印刷材料，但其并不限于此类材料。任何能够存储此 类指令并传达它们的介质均被本发明考虑在内。此类介质包括但不限 于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、磁拾音器、芯片)、光学介质(例 如，CDROM)等。此类介质可包括提供此类指导材料的互联网站点地 址。
在其他实施方式中，本发明提供用于检测、鉴定和/或表征蛋白质 和/或核酸的试剂盒。在一些实施方式中，除了检测试剂和缓冲剂之外， 该试剂盒含分析物(诸如感兴趣蛋白质)特异性抗体。在其他实施方 式中，该试剂盒含有对mRNA或cDNA检测具有特异性的试剂(例如， 寡核苷酸探针或引物)。在各种实施方式中，该试剂盒含有进行检测测 定所需的所有组分，包括所有对照、进行测定的指导以及分析与呈现 结果所需的任何软件。
生物识别测定
尽管理解本发明的机制不是必需的，但是认为上述阵列包括体积 足以将细胞温育0-240小时的微孔，使得感兴趣化合物从细胞中分泌 并与结合配体结合。因此，在每个微孔内部或之间可进行多种生物识 别测定。例如，一种此类识别测定可包括抗原-抗体结合。
在一个实施方式中，本发明考虑一种用于抗原-抗体结合的方法， 包括在37℃将多个细胞温育1-24小时，使得每个孔产生抗体并将抗 体分泌到微孔中。在一个实施方式中，抗体是重组抗体。在一个实施 方式中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方式中，至少一种细胞产生 不止一种抗体。尽管理解本发明的机制不是必需的，但是认为由于微 孔的结构，这种温育已经降低了蒸发损失，这是由于孔的入口很窄(因 此，暴露的表面积小)以及其非常长所致。在一个实施方式中，抗体受 到诱导剂的刺激。在一个实施方式中，诱导剂包括IPTG。见图3。
治疗药物的发现
在一个实施方式中，本发明考虑一种包括鉴定新治疗药物的方法。 例如，颗粒可用已知参与疾病状况的药物结合配体(即，例如，生物受 体和/或酶)涂覆。然后利用该极高密度微孔阵列筛选多个细胞，所述细 胞分泌多种疑似对结合配体具有亲和性的化合物。选择含有附着至具 有最高亲和性的结合配体-化合物复合物的颗粒的微孔，用于进一步的开发。
诊断抗体的发现
在一个实施方式中，本发明考虑一种包括鉴定诊断抗体的方法。 例如，颗粒可用已知参与疾病状况的结合配体(即，例如，抗原和/或表 位)涂覆。然后利用该极高密度微孔阵列筛选多个细胞，所述细胞分泌 多种疑似对结合配体具有亲和性的抗体。选择含有附着至具有最高亲 和性的结合配体-抗体复合物的颗粒的微孔，用于进一步的开发。
蛋白质-蛋白质相互作用研究
在一个实施方式中，本发明考虑一种包括鉴定蛋白质-蛋白质相互 作用的方法。例如，颗粒可用已知参与疾病状况的结合配体(即，例如， 蛋白质和/或肽)涂覆。然后利用该极高密度微孔阵列筛选多个细胞，所 述细胞分泌多种疑似对结合配体具有亲和性的蛋白质和/或肽。选择含 有具有固定化的亲和性最高的结合配体-蛋白质或肽复合物的颗粒的 微孔，用于进一步的开发。
蛋白质-核酸相互作用研究
在一个实施方式中，本发明考虑一种包括鉴定蛋白质-核酸相互作 用的方法。例如，颗粒可用已知参与疾病状况的结合配体(即，例如， 脱氧核糖核酸和/或核糖核酸和/或SOMAmer和/或核酸适配体)涂覆。 然后利用该极高密度微孔阵列筛选多个细胞，所述细胞分泌多种疑似 对结合配体具有亲和性的蛋白质和/或肽。选择含有具有固定化的亲和 性最高的结合配体-核酸复合物的颗粒的微孔，用于进一步的开发。
蛋白质-糖类相互作用研究
在一个实施方式中，本发明考虑一种包括鉴定蛋白质-糖类相互作 用的方法。例如，颗粒可用已知参与疾病状况的结合配体(即，例如， 寡糖和脂质糖(liposaccharide)，或蛋白糖(proteosaccharide))涂覆。然后 利用该极高密度微孔阵列筛选多个细胞，所述细胞分泌多种疑似对结 合配体具有亲和性的外源凝集素、蛋白质和/或肽。选择含有具有固定 化的亲和性最高的结合配体-糖类复合物的颗粒的微孔，用于进一步的 开发。
蛋白质检测
本文公开了是利用高度灵敏性体系从生物元素的异源种群来鉴定 蛋白质分析物。所公开的方法和体系提供了用于蛋白质工程的新型且 重要的工具。具体而言，本文公开的应用应导致发现新抗体的时间从14天显著降低带1-2天。在其他实施方式中，通过测量蛋白质或多肽 的表达可检测基因表达。
在一个实施方式中，所公开的方法用于检测蛋白质分析物。具体 分析物蛋白质的检测可在阵列的孔中直接进行。当颗粒聚集在孔的检 测表面上之后，获取图像，使得背景信号得以抑制。
生物化学传感可利用标准检测技术进行，包括夹心免疫测定或类 似的集合或杂交反应。结合磁性颗粒，与任选被标记(例如，附着至荧 光色素)的二次抗体一起加载培养基。
如果元素产生的靶蛋白与附着至颗粒表面的抗原结合的话，则二 次抗体与颗粒结合(见图3)。为最大化靶蛋白与抗体的结合能力，通过 定期(例如，约每20分钟)将磁性颗粒暴露于磁场使其保持悬浮，以 使颗粒遍及样品体积中所含的液体循环。
核酸检测
在一个实施方式中，分析物是核酸。例如，通过任何合适的方法 可测量DNA或mRNA表达。例如，通过特定结构的酶裂解检测RNA 表达(
测定，Third WaveTechnologies；见例如美国专利号 5,846,717；6,090,543；6,001,567；5,985,557；和5,994,069；其中各篇 通过参考引入本文)。通过使用结构特异性酶来裂解由重叠寡核苷酸探针杂交所形成的复合物，
测定检测特定核酸(例如，RNA) 序列。
在仍进一步的实施方式中，通过与寡核酸酸探针杂交检测RNA (或相应的cDNA)。利用多种技术进行杂交和检测的多种杂交测试是可 用的。例如，在一些实施方式中，利用
测定(PE Biosystems， Foster City，Calif；见例如美国专利号5,962,233和5,538,848，其中各篇 通过参考引入本文)。在PCR反应过程中进行该测定。TaqMan测定利用
GOLD DNA多聚酶的5′-3′外切核酸酶。由寡核苷酸与 5′-报告染料(例如，荧光染料)和3′-猝灭染料组成的探针包括在PCR反 应中。在PCR过程中，如果探针与其靶标结合，则
GOLD 多聚酶的5′-3′核溶解活性裂解报告染料与猝灭染料之间的探针。报告 染料与猝灭染料的分离导致荧光增加。随着每个PCR循环信号积聚并 能用荧光剂监控。
还在其他实施方式中，逆转录酶PCR(RT-PCR)用于检测RNA的 表达。在RT-PCR中，利用逆转录酶RNA被酶促转化成互补DNA或 ″cDNA″。cDNA然后用作PCR反应的模板。PCR产物可通过任何合适 的方法来检测，包括但不限于凝胶电泳法，以及用DNA特异性染色进 行染色，或者与标记探针杂交。在一些实施方式中，利用定量逆转录 酶PCR，其含有美国专利号5,639,606、5,643,765和5,876,978(其中各 专利通过参考引入本文)中所述的竞争性模板方法的混合物。
细胞检测
在另一实施方式中，分析物是生物细胞。在一个实施方式中，分 析物是至少一种生物细胞。
本文公开的检测可用于分离任何类型的生物细胞，包括但不限于： 表达或产生蛋白质类、糖类、酶类、肽类、激素类、受体类的细胞系； 产生抗体的其他细胞系；基因工程细胞；和激活细胞。此外，本发明 可用于筛选多种生物活性，包括但不限于：表面受体蛋白质的表达、 酶生产和肽生产。此外，本发明还用于筛选多种测试剂以测定该测试 剂对所需生物活性的效果。本领域技术人员将容易理解需要进行分离 和筛选的其他类型的细胞、需要进行检测的其他类型的生物活性以及 待被筛选的特异性测试剂。
在具体实施方式中，生物细胞是经转化的生物细胞。细胞的转化 可通过任何熟知的方法利用任何熟知的载体(诸如例如质粒或病毒) 产生。
在一个实施方式中，生物细胞是微生物、真菌、哺乳动物、昆虫 或动物细胞。在一个实施方式中，生物细胞是细菌细胞。在一个实施 方式中，生物细胞是大肠杆菌细胞。
在一个实施方式中，动物细胞包括稀有生物化学化合物。在一个 实施方式中，生物化学化合物选自蛋白质、肽、激素、核酸、糖类。
在另一实施方式中，生物细胞产生和/或表达荧光蛋白质。在又一 实施方式中，生物细胞产生荧光蛋白质(例如GFP)。
实施例
提供下述实施例阐述但非限定所要求保护的发明。
实施例1：磁珠信号阻断
该实施例展示了磁珠抑制来自溶液中未与颗粒结合的标记的高背 景信号的能力。
用10μM Alexa 488荧光色素(Sigma Aldrich)作为标记以及2.8μm 磁性颗粒加载干净且干燥的20μm孔径的阵列板(J5022-19，Hamamatsu Photonics K.K.)，使得各孔都接收标记可磁性颗粒。单独的荧光色素不 与磁珠颗粒结合或缔合。
阵列孔在检测之前不暴露于任何动力，这样磁性颗粒和标记都保 留在溶液中。温育后，使包含磁性颗粒和标记的此阵列经受EM辐射， 并利用显微镜使来自标记的荧光发射成像。正如预期的，如在图5A中 所示，所有孔显示显著信号，因为溶液中的未结合标记对EM辐射完 全暴露。利用CDC相机捕捉荧光图像。当量化像素数和强度时，信号 显示适宜强度下的像素数为约4x105。因此，在缺乏颗粒积聚的情况下， 溶液中的未结合标记将在几乎所有孔中发出信号，而不管其内含物如 何。
接下来，在同一阵列中，通过在阵列的底部(3mm内)放置10mm 立方体钕磁铁(B666，K&J Magnetics Inc.)60秒，将磁性颗粒积聚到阵 列的各反应容器的检测表面(例如，该实施例中的弯液面()。在颗粒 已经积聚之后，捕捉相同位置的另一荧光图像。如图5B所示，图像在 带信号的孔中显示显著的减小。的确，几乎所有孔都已经失去或减小 了其信号。当量化信号时，在积聚阵列中适宜强度下的信号降至零。 来自未结合标记的信号被磁珠抑制，而且仅有来自阵列的基础自发荧 光保留。惊人地，颗粒在样品检测表面处的积聚代表了从各孔的未结 合标记消除背景信号的新策略。
实施例2：测定制备
该实施例提供了检测分析物在阵列中存在或缺乏情况的代表性测 序体系。最终筛选涉及当然将取决于该实验及其目标特定的很多因素
在该测定中使用大肠杆菌菌株Imp4213，其含有表达GFP的质粒。 将约1.0百万至1千万GFP-表达细菌细胞加至5mL含25μg/ml卡那 霉素(KAN)的肉汤(LB)培养基中并在摇床(200RPM)在37℃膨胀 (expand)约3小时，直到细菌进入指数生长期，然后准备铺板。
本实施例中所用的颗粒是磁珠。具体而言，对于这些实施例，所 用的颗粒是与链霉亲和素(料号112-05D，Invitrogen，Carlsbad，CA)或寡 聚(dt)25配体(料号610-05，Invitrogen，Carlsbad，CA)结合的2.8μm直径 的磁珠(Dynabeads)。将磁珠用生物素化的兔抗-GFP抗体(A10259， Invitrogen，Carlsbad，CA)温育约30分钟，这使抗GFP-抗体经由生物素 -链霉亲和素相互作用与磁珠结合。因此产生抗-GFP磁珠。
在该实施例中，在细胞加至阵列之前，用磁珠和标记补充细胞。 将磁珠(抗-GFP珠检测分析物，或者寡(dt)25珠作为负对照)加至浓度 30mg/ml。通过使15μg/ml生物素化兔抗-GFP(A10259，Invitrogen， Carlsbad，CA)缀合至链霉亲和素(40709-1MG-F，SigmaAldrich)的荧光 色素Atto 590组合(其形成荧光标记的抗-GFP抗体)，产生标记。对 于该测定，可使用任何荧光团标记，只要其不在与GFP相同的波长附 近发射EM辐射。
通过将液滴置于阵列上并将分析混合物铺展到阵列板表面至约1 μl/mm2(图3)，将细胞加至干净且干燥的20μm孔径的阵列板(J5022-19， Hamamatsu Photonics K.K.)。同时将混合物经过亲水性孔表面分配至孔 中。
分配样品后，将阵列板置于固定器上，使得孔阵列板在捕捉表面 之上是80μl(
184 Silicone Elastomer Kit，Dow Coming)。固定 器由载玻片构成(12-550-14，Fisher Scientific)，其具有250μm厚的捕捉 表面，位于捕捉表面各侧上的两个80μm胶带间隔物。将孔阵列置于 固定器上之后，阵列的上侧用塑料包装(22-305654，FisherScientific)密 封。将完整设备置于100mm培养皿中，该培养皿具有两个10mm去 离子水湿润的棉纸球，用于湿度饱和。用保鲜膜密封培养皿并将其在 37℃温育19小时。
为选择含分析物的孔，通过在阵列的底部(3mm内)放置10mm立 方体钕磁铁(B666，K&J Magnetics Inc.)60秒，将磁性颗粒积聚到孔阵 列的底表面。然后将固定器上阵列加载到大角星激光捕获显微解剖系 统Arcturus Laser Capture Microdissection System(型号：Veritas，Applied Biosystems，USA)中以促进检测。
为检测含分析物的孔的荧光，通过用显微镜(其包括20x物镜和 594nm激发，630nm发射荧光盒)读取孔阵列板的底表面荧光，扫描 免疫测定结果。利用CCD相机进行图像捕捉。
实施例3：检测阵列中的分析物
该实施例阐述了利用本文公开的方法可直接在孔中进行蛋白质结 合和检测测定。在该实施方式中，根据实施例2中所述的步骤建立测 定体系。
第一阵列含有孔，该孔包含如实施例2所述而产生的抗-GFP磁性 颗粒和抗-GFP标记。温育后，如所述，使阵列暴露于磁力，其将颗粒 移动至样品的检测表面，在该实施例中该检测表面是各阵列容器的弯 液面。捕捉该阵列的图像。抗-GFP磁性颗粒与靶蛋白结合(GFP)，该 靶蛋白也被抗-GFP标记结合。磁力将所标记的颗粒移动至检测表面， 从而将发射信号的标记集中在检测表面处并抑制未结合的标记向检测 器或显微镜发射EM辐射。这种相互作用在孔内的示意图示于图1B中。
第二阵列含有与配体寡聚-dT而非链霉亲和素结合的颗粒。不含链 霉亲和素的情况下，与抗GFP抗体缀合的生物素不与磁性颗粒相互作 用或者不与其结合。因此，磁性颗粒、抗-GFP抗体和抗-GFP标记保 留于溶液中。温育后，使阵列暴露于磁力，其将颗粒移动至检测表面。 EM辐射暴露后使阵列成像。因为寡聚-dT磁性颗粒未与任何标记结合， 其因此积聚至检测表面并抑制EM辐射到达溶液中的标记。该颗粒还 可用于抑制检测器检测从未结合于磁性颗粒的标记发出的EM辐射。 如果量化来自各阵列的荧光的量，则来自特异性抗GFP磁珠的发射充 分高于负对照寡(dt)珠。
因此，该实验显示如公开的磁珠抑制方法通过专门抑制孔信号能 够选择含分析物的孔。
实施例3：单细胞特异性检测
下述实施例展示了所公开的方法用于检测单细胞水平的特异性。
在该实施方式中，根据实施例2所述的步骤建立测定体系，只是 在铺板细胞之前，将细菌细胞稀释到300细胞/μL，对其计算，在含直 径20μm的孔的阵列板上产生约0.1细胞/孔。当加至阵列时，该稀释 在大部分孔中将至多产生单细菌细胞。
如所述，将抗-GFP链霉亲和素珠和抗-GFP标记加至第一阵列。 当磁珠积聚之后EM辐射暴露于阵列时所见的相应信号示于图7A中。 很多细胞产生信号，其代表来自经由链霉亲和素-生物素键结合于抗 GFP抗体的链霉亲和素磁珠的荧光信号。施加磁力后，仅表达分析物 靶蛋白(GFP)并因此使珠与标记结合的细胞提供正信号。然而，伴随单 细胞稀释同样观察到的是具有减小的信号或没有信号的孔。这些孔最 可能缺乏任何GFP-产生细胞和/或含有不再表达GFP的细菌细胞。因 此，没有标记结合于磁性颗粒，而且是施加磁力时，磁性颗粒抑制检 测表面。
因此，含寡(dt)25珠的另一阵列描述了来自孔的非常少的荧光信号， 如图7B所示。在该阵列中，不存在结合于珠的抗-GFP抗体。施加磁 力后，表达分析物靶蛋白(GFP)的细胞无一提供信号，因为磁珠已经积 聚到无标记的检测表面。在该设置中，来自EM源的EM辐射不能到 达这些孔的溶液中的未结合标记。因此，在该阵列中没有观察到信号。 磁珠也可能积聚在样品与检测器之间，以抑制从标记向检测器的发射。
实施例4：检测无需细胞的溶解
该实施例显示了利用阵列中的珠进行夹心免疫测定无需细胞溶解 来进行分析物检测
在这些实施方式中，如先前实施例所述般制备阵列，其中两个正 队长阵列含有连接于抗-GFP抗体的磁珠。一个正对照阵列的细胞在检 测之前利用超声处理在5瓦特下进行细胞溶解1.5分钟，采用具有微板 角(Microplate horn)的Misonix 4000，而另一正对照阵列未进行细胞 溶解。
负对照阵列含有寡聚-dT珠，较早的实施例已经显示在其抑制该阵 列体系中来自所有孔的信号。负对照阵列利用与正对照阵列相同的超 声处理条件进行细胞溶解。结果表明(见图8A-C)，基于像素数的量化， 与细胞溶解(超声处理)步骤无关，两种正对照阵列具有类似的信号 水平。此外，细胞溶解步骤没有去除颗粒抑制的选择性，因为负对照 珠仍保持远低于正对照水平，图8A和8B。这表明，对于某些表达机 制，细胞溶解对于利用本文所述的方法检测分析物是不需要的。
实施例5：细胞的提取和回收
下述实施例展示了单靶标在数亿靶细胞中的展示及独立回收。
在本实施例中，如实施例2所述制备细胞、珠、标记和阵列。在 鉴定出一个或多个含分析物的孔之后，提取单孔中的溶液是期望的。
如图9中所述和所绘，将阵列置于固定器上，使得孔阵列在捕捉 表面上是约80μl(
184 Silicone Elastomer Kit，Dow Coming)。 固定器由载玻片构成(12-550-14，Fisher Scientific)，其具有250μm厚的 捕捉表面，位于捕捉表面各侧上的两个80μm胶带间隔物。将孔阵列 置于固定器上之后，阵列的上侧用塑料包装(22-305654，FisherScientific)密封。
对于回收，选择感兴趣孔，诸如高强度孔。然后通过在20-30％强 度功率下聚焦349μm固态UV激光并发射20μJ脉冲，提取该孔。然 后可将自靶标孔提取的细胞置于捕捉表面上，如图9所示。
提取后，从大角星激光捕获显微解剖系统移走固定器和阵列，并 将含有已提取细胞的捕捉表面置于5mL LB+25μg/ml KAN培养基中 并在摇床中于37℃温育19小时，以扩展已提取细胞。这些表达感兴 趣蛋白质的细胞然后准备用于任何类型的扩大化蛋白质制备和/或进一 步的处理。
实施例6：修改阵列孔中的试剂浓度
下述实施例展示了试剂和其他分子(诸如磁珠)可在阵列被加载 之后加至其中而不会干扰该阵列内的细胞。
在该实施方式中，将含有人胚肾293的Freestyle 293培养基以浓 度2,500细胞/μL加至孔径100μm为的微孔阵列中。这加载了约20 细胞/孔，且细胞活力为约50％。首先利用荧光显微镜在10x下成像细 胞，采用德克萨斯红滤光器块，测量该通道中的任何背景荧光(图10A)， 接下来，将含有2μg/mL碘化丙啶(PI)的50μL培养基滴置于微孔阵列 顶部。在660道尔顿，PI是相对小的分子并且室温下在水溶液中60秒 内扩散约400μm。因为微孔约1mm长，因此在微孔底部所加载的细 胞5分钟后应当暴露于PI分子。这通过在未存活HEK 293细胞的核中 检测到PI分子插入DNA而得到证实，如图10B所示。
其他实施方式：下述其他实施方式是非限定性的，其呈现于此以 进一步举例说明本公开的各方面：
一种用于检测靶生物元素的装置，包括：
微孔阵列，其内径为约1μm至约500μm，
磁源，其向所述阵列施加磁场，
电磁辐射源，其向所述阵列施加电磁辐射，和
检测器，其接收来自所述阵列的电磁辐射并鉴定发出辐射的至少 一个微孔的位置。
所述装置还包括在所述阵列的各孔中包含结合配体的磁性颗粒。
所述装置还包括将能量聚集在发出电磁辐射的微孔上的能源。
该装置的微孔不是透明的。
微孔被涂覆阻止孔之间的光传播的材料。
一种用于检测分析物的试剂盒，包括：微孔阵列，其包括多个直 径为约1μm至约500μm的纵向熔合纤维，以及磁性颗粒，其包含分 析物的结合配体。
微孔不是透明的。
微孔被涂覆阻止孔之间的光传播的材料。
尽管本发明的各种具体实施方式已经在本文进行描述，应理解， 本发明不限于那些精确的具体实施方式，而且各种改变或修饰可在其 中受本领域技术人员影响，而不背离本发明的范围和精神。
应理解，本发明不限于本文所述的特定的方法、方案和试剂等， 因为如本领域技术人员会意识到的，这些可能会变化。还应理解本文 使用的术语使用目的是仅仅在于描述特定实施方式，而非意图限定本 发明的范围。
应注意附图中所图解的特征不必按比例绘制，而且一个实施方式 的特征可用于其他实施方式，这是本领域技术人员理解的，即使本文 未明确陈述。
本文所述的任何数值包括从下限值到上限值以一个单位递增的所 有值，条件是在任意下限值与任意更高值之间存在至少两个单位的间 隔。作为示例，如果记载了组分的浓度或工艺变量(诸如例如尺寸、 角度大小、压力、时间等)的值，为例如1-90，具体为20-80，更具体 为30-70，则意在诸如15-85、22-68、43-51、30-32等的值均明确列举 与该说明书中。对于小于1的变量，一个单位被认为是0.0001、0.001、0.01或0.1，视情况而定。这些仅仅是特别有意的示例，在下限值与上 限值之间的所有可能的树脂组合被认为是以类似方式清楚地记载于本 说明书中。
本文引用的所有参考文献和出版物的公开以其整体通过残留明确 引入，其程度等同于每一篇均通过参考单独引入。
Claims (20)
1.在微腔阵列中从已选微腔中提取包含生物元素的液体样品溶液的方法，其中所述微腔阵列中的每个微腔具有1微米至500微米的直径，并且其中所述微腔阵列中的每个微腔与电磁辐射吸收材料相结合，所述方法包括：
提供电磁辐射源，其中所述电磁辐射包括激光，该激光具有小于或者等于所述每个微腔的所述直径的光斑大小；以及
通过将所述电磁辐射聚焦于所述已选微腔从而导致所述电磁辐射吸收材料的膨胀，使得至少部分所述液体样品溶液迅速膨胀。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述电磁辐射吸收材料至少部分涂覆或覆盖所述每个微腔。
3.如权利要求1所述的方法，其中包含所述生物元素的至少部分液体样品溶液被排出到吸湿性捕获表面。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述电磁辐射源的电磁辐射发射光谱与所述每个微腔中的所述电磁辐射吸收材料的电磁辐射吸收光谱至少部分重叠。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述电磁辐射吸收材料进一步包括粘结至所述微腔阵列一侧的高膨胀材料。
6.如权利要求1所述的方法，还包括覆盖微腔的一端以防止所述液体样品溶液从该端排出。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述电磁辐射吸收材料包括多个不透明的颗粒。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述多个颗粒响应于被施加到所述微腔的力。
9.如权利要求8所述的方法，其中通过施加力而使所述多个颗粒在微腔的表面处聚集。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述颗粒用结合试剂功能化。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述电磁辐射包括直径大小大致等同或小于所述微腔的所述直径的聚焦光斑。
12.如权利要求3所述的方法，其中所述吸湿性捕获表面包括具有吸湿性材料层的光学面。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述吸湿性材料层不使光学面变形。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述吸湿性材料层包括甘油。
15.如权利要求7所述的方法，其中所述颗粒具有至少10％的吸收效率。
16.在微腔阵列中从已选微腔中提取包含生物元素的液体样品溶液的方法，其中所述微腔阵列中的各微腔与电磁辐射吸收材料相结合，所述方法包括：
提供电磁辐射源，其中所述电磁辐射源的电磁辐射发射光谱与所述各微腔中的所述电磁辐射吸收材料的电磁辐射吸收光谱至少部分重叠；以及
将所述电磁辐射聚焦于所述已选微腔，以产生所述电磁辐射吸收材料的膨胀，从而将包含所述生物元素的至少部分所述液体样品溶液从所述微腔中排出。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述电磁辐射吸收材料包括覆盖所述各微腔的高膨胀材料。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述电磁辐射吸收材料至少部分涂覆或覆盖所述各微腔。
19.如权利要求16所述的方法，还包括覆盖所述微腔的一端以防止所述液体样品溶液从该端排出。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述电磁辐射吸收材料包括多个不透明的颗粒。
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