CN107881191A - 黄单胞菌抗性的甘蓝植物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了表现出对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性的甘蓝植物。此类植物可包含与来自结球甘蓝的抗病性相关的新型基因渗入的基因组区域。在某些方面，提供了包括新型多态性标记的组合物以及用于产生、育种、鉴定和选择具有抗病性表型的植物或种质的方法。

Description

黄单胞菌抗性的甘蓝植物
技术领域
本发明涉及农业领域，且更具体地涉及用于产生对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)表现出改进的抗性的甘蓝(Brassicaoleracea)植物的方法和组合物。
序列表并入
名称为“SEMB024USP1_ST25.txt”的文件中含有的序列表通过电子方式提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表如在
Microsoft Windows操作系统中所测量大小为10千字节并且创建于2016年9月29日。
背景技术
抗病性是农业中、特别是粮食作物生产中的重要性状。虽然在芸苔属(Brassica)中已经鉴定到抗病性等位基因，但是将这些等位基因引入到栽培品系中的工作受到缺乏与等位基因连锁的特异性标记、导致不可接受的植物质量的连锁累赘以及缺乏广谱抗性的阻碍。在植物育种方法中使用标记辅助的选择(MAS)使得可以基于与感兴趣的性状连锁的遗传标记来选择植物。然而，即使与性状相关的基因已经得到表征，用于在植物中鉴定和追踪所需性状的准确标记也经常难以获得。这些困难由于以下因素而进一步复杂化：如多基因遗传或数量遗传、上位性以及经常对所需表型的表达下的遗传背景的了解不完全。
发明内容
本发明提供了一种包含来自结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)3号染色体的基因渗入的甘蓝植物的栽培品种，所述基因渗入相对于缺乏基因渗入的植物赋予对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性，且其中所述抗性是共显性和累加性的。在某些实施方案中，基因渗入缺乏与其遗传连锁的等位基因，从而赋予延缓的植物生长。在另一些实施方案中，基因渗入包含来自结球甘蓝的染色体区段，其在植物中侧接有标记NH0265157(SEQ ID NO:5)和标记NH0266951(SEQ ID NO:12)。在其他实施方案中，基因渗入包含在植物的标记NH0265597(SEQ ID NO:11)处的来自结球甘蓝的染色体区段。在另一些实施方案中，基因渗入的大小为约2cM或更小。在又一些实施方案中，植物对于基因渗入是纯合的。在另外的实施方案中，包含基因渗入的种子样品保藏在ATCC保藏号PTA-123409下。
在某些方面，广谱抗性包括对多种野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病变型的抗性。举例来说，广谱抗性包括对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病变型1和4的抗性。举另一实例来说，广谱抗性包括对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病变型1、4、6和9的抗性。在其他实施方案中，植物是西兰花、花椰菜、花茎甘蓝、抱子甘蓝、白球甘蓝、红球甘蓝、皱叶甘蓝、羽衣甘蓝、球茎甘蓝或葡萄牙甘蓝植物。在又一些实施方案中，植物不是白球甘蓝植物。
本发明另外提供了一种产生包含来自结球甘蓝3号染色体的基因渗入的甘蓝植物的栽培品种的种子，所述基因渗入相对于缺乏基因渗入的植物赋予对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性，且其中所述抗性是共显性和累加性的。本发明还提供了一种来自包含来自结球甘蓝3号染色体的基因渗入的甘蓝植物的栽培品种的植物部分，所述基因渗入相对于缺乏基因渗入的植物赋予对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性，且其中所述抗性是共显性和累加性的。在某些实施方案中，所述植物部分是细胞、种子、根、茎、叶、头、花或花粉。
此外，本发明提供了一种包含侧接有标记NH0265157(SEQ ID NO:5)和标记NH0266951(SEQ ID NO:12)的来自结球甘蓝的染色体区段的基因渗入片段、包含在标记NH0265597(SEQ ID NO:11)处的来自结球甘蓝的染色体区段的基因渗入片段、以及包含来自结球甘蓝的染色体区段的基因渗入片段，其中所述片段赋予对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性并且缺乏与所述片段遗传连锁的等位基因，从而赋予延缓的植物生长。
本发明还提供了一种包含来自结球甘蓝3号染色体的基因渗入的西兰花或花椰菜植物，所述基因渗入相对于缺乏基因渗入的植物赋予对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性，且其中所述抗性是共显性和累加性的。
本发明进一步提供了一种用于产生具有改进的对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的抗性的甘蓝植物的栽培品种的方法，所述方法包括将来自结球甘蓝3号染色体的染色体区段基因渗入到植物品种中，所述基因渗入相对于缺乏基因渗入的植物赋予对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性，且其中所述抗性是共显性和累加性的。在某些实施方案中，所述基因渗入包含使包含所述染色体区段的植物与其自身或与不同基因型的第二种甘蓝植物杂交以产生一个或多个子代植物，以及选择包含所述染色体区段的子代植物。在具体的实施方案中，选择子代植物包括检测侧接有标记NH0265157(SEQ ID NO:5)和标记NH0266951(SEQ ID NO:12)的至少一个等位基因。在其他实施方案中，选择子代植物包括检测在标记NH0265597(SEQ ID NO：11)处的至少一个等位基因。在另一些实施方案中，子代植物为F2-F6子代植物。在选定的实施方案中，所述杂交包括回交。在另外的实施方案中，所述回交包括2-7代回交。
在某些实施方案中，植物品种是西兰花、花椰菜、花茎甘蓝、抱子甘蓝、白球甘蓝、红球甘蓝、皱叶甘蓝、羽衣甘蓝、球茎甘蓝或葡萄牙甘蓝植物品种。在其他实施方案中，所述抗性包括对多种野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病变型的抗性。在又一些实施方案中，所述抗性包括对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病变型1和4的抗性。在再一些实施方案中，所述抗性包括对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病变型1、4、6和9的抗性。在另外的实施方案中，包含染色体区段的种子样品被保藏在ATCC保藏号PTA-123409下。
本发明进一步提供了一种具有改进的对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的抗性的甘蓝植物的栽培品种，其通过将来自结球甘蓝3号染色体的染色体区段基因渗入到植物品种中来产生，所述基因渗入相对于缺乏基因渗入的植物赋予对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性，且其中所述抗性是共显性和累加性的。本发明还提供了产生食物或饲料的方法，所述方法包括获得具有改进的对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的抗性的甘蓝植物或其部分，所述甘蓝植物或其部分包含来自结球甘蓝3号染色体的基因渗入的染色体区段，所述基因渗入相对于缺乏基因渗入的植物赋予对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性，其中所述抗性是共显性和累加性的；以及由所述植物或其部分来生产所述食物或饲料。
附图说明
图1：此图提供了具有正常生长和延缓生长的植物的实例。具有延缓生长的植物较小，并且经常有紫色叶子。
图2：C517QTL以2cM标度来鉴定，并且标记在QTL区(5cM)提供。用于筛选植物材料的标记用箭头表示。
图3：此图提供了总植物重量与抗性之间的相关性。在X轴上提供平均总植物重量，且在Y轴上提供对Xcc的平均抗性。对Xcc的抗性以从1(＝抗性)至9(＝易感)的标度来测量，且总植物重量以千克(kg)来测量。最紧密连锁的标记在这些品系中分开：加号表示纯合抗性，减号表示纯合易感性，且点表示杂合子品系。图右上角的黑点是BRL51-99品系。右下角的圆圈中的植物表示具有高水平的抗性而在植物重量上没有连锁累赘的品系。
具体实施方式
黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)引起的十字花科的细菌性疾病。Xcc通过直接感染发育中的种子来传播。Xcc存在于广泛的地理区域中，且尤其是通过降低产量和质量来影响甘蓝的栽培品种。黑腐病或Xcc对甘蓝的栽培品种造成显著的经济损害，所述栽培品种包括但不限于抱子甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花和羽衣甘蓝。虽然先前曾多次努力开发抗性品种并且在甘蓝的栽培品种中并入抗性基因，但没有一个成功地用于在甘蓝的栽培品种中获得广谱抗性，并且特别是用于在西兰花和花椰菜中提供抗性。
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的致病变型或生理小种的分类已经由各种团体进行，其中生理小种或致病变型的分类和数量有一些变化。已经鉴定了Xcc的至少7种致病变型，Vicente等,Phytopathology 91:492-499,2001；Fargier和Manceau,PlantPathology56:805-818,2007；Jensen,等,Plant Disease 94:298-305,2010。这些致病变型经常与一种显性致病变型共同出现。生理小种1和4被认为是至关重要的。重要的是鉴定抗性等位基因，优选单个基因，并且对于等位基因提供针对Xcc的两种以上生理小种的抗性。另外，重要的是鉴定可用于开发对多种Xcc生理小种具有抗性(“广谱抗性”)的甘蓝植物的栽培品种的等位基因。特别重要的是鉴定可用于开发对多种Xcc生理小种具有抗性(“广谱抗性”)的西兰花或花椰菜的栽培品种的等位基因。
本发明代表了提供单一抗性QTL的显著进步，所述单一抗性QTL提供对至少两种Xcc致病变型的抗性，且更具体地提供至少对致病变型1和4的抗性。这种QTL可被基因渗入到甘蓝栽培品种的良种品系中。这些品种可以包括但不限于西兰花、花椰菜、花茎甘蓝、抱子甘蓝、白球甘蓝、红球甘蓝、皱叶甘蓝、羽衣甘蓝、球茎甘蓝或葡萄牙甘蓝的栽培品种。另外，本发明提供了一种没有相关等位基因的抗性基因座，其相对于缺乏相关等位基因的植物赋予延缓生长。此类延缓生长可包括较慢的植物生长速率，以及降低的总体成熟植物大小。
虽然许多团体试图鉴定可用于在甘蓝栽培品种中提供抗性的Xcc抗性的来源，但育种者未能成功地将所述抗性转移到其他甘蓝类型的商业上可接受的品种中或者获得具有对多种Xcc致病变型的抗性的品种。没有鉴定出具有至少对生理小种1和4的抗性的来自甘蓝的来源。此外，尚未鉴定出单一的共显性的累加性等位基因。因此，本发明提供了一种提供广谱抗性的新型等位基因，其可被并入到甘蓝的栽培品种中，且尤其是并入到西兰花和花椰菜中。
已在卷心菜(结球甘蓝)中鉴定了多个抗性基因座(Camargo等,Genetics 85:1296-1300,1995("Carmargo,1995")；Camargo等,The Journal of Heredity 88:57-60,1997("Carmargo,1997"))。Camargo于1995年报道的QTL最初是在分开的连锁群上鉴定。然而，使用Camargo于1997年公布的基因图数据对这些数据的后续分析显示，这两个QTL是连锁的(距离30cM)。由于两个基因座是连锁的，所以育种者在选择抗性最强的植物的过程中，不仅将抗性基因座从供体卷心菜植物转移到受体植物中，而且将其转移到不需要的区域中，这产生了园艺上和商业上不可接受的甘蓝类型。在从回交中选择期间，这个区域不会被去除。另外，还在卷心菜中鉴定了两个隐性的抗性基因座(美国专利9,000,258)。然而，这些抗性等位基因都必须存在以获得有效的抗性表型。
虽然已鉴定了对多种Xcc分离株有抗性的甘蓝宿主(Taylor,2002)，但是发现这些抗性限于较为不常见的生理小种，且没有一个对生理小种1和4二者都提供抗性。在其他情况下，发现所述抗性是部分的和定量的(Lema等,Plant Breeding 131:607-613,2012("Lema,2012"))。生理小种非特异性抗性取决于各种基因的组合作用，每种基因具有很小的效果。因此，这些抗性难以在栽培种之间进行管理和转移。大部分出版物已得出结论，抗性遵循基因对基因模型，并且提供的抗性是生理小种特异性的。一般据信每种不同的抗性基因提供对一种致病变型的抗性。Saha等(Plant Breeding 133:268-274,2014)鉴定了来自花椰菜来源的单一显性抗性QTL。不过，这种QTL显示仅具有对生理小种1的抗性。
在3号染色体(O3)上鉴定了本发明的单一抗性QTL。发现鉴定的初始抗性等位基因与延缓生长植物类型基因座密切相关。然而，本发明还提供了一种破坏连锁的较小的基因渗入片段。令人惊讶地发现，可以生成缺乏有害的延缓生长植物类型的重组染色体片段。使用标记辅助的育种技术鉴定重组的基因渗入片段，并且生成的基因渗入片段的大小为约2厘摩(cM)。这种染色体区段的作图发现，黄单胞菌(Xanthomonas)抗性的QTL位于标记NH0265597(76.45cM)处。此外，QTL侧接有标记NH0265157(74.98cM)和NH0266951(77.14cM)。此QTL造成对几种不同Xcc致病变型(包括致病变型1和4)的抗性，而无有害的延缓生长植物类型。
基于重组基因渗入的抗性是累加性的。因此，优选QTL在杂交植物(特别是商业杂交种)中是纯合的。一般还优选使用包括黄单胞菌抗性的最小基因渗入片段，因为其他相关等位基因的纯合存在可引起有害隐性性状的表达。
本发明提供的重组基因渗入已显示提供对多种不同致病变型(包括目前普遍存在的致病变型1、4、6和7以及若干未分类的分离株)的抗性。针对从世界各个区域所鉴定的一组来自甘蓝作物(西兰花、花椰菜、卷心菜)的157个Xcc分离株测试抗性QTL。使用Vicente,2001的改进的鉴别植物系列(这是科学界的现行标准)对所述分离株进行分类，并且大多数分离株可分为致病变型群1、4、6和9。然而，一些分离株不能分类。Vicente的鉴别组由不同的芸苔属植物物种组成，并且基于相容的(易感性)和不相容的(抗性)相互作用能够实现致病变型鉴别。因此，该组可用于在表型上确认本发明赋予的广谱抗病性。
I.甘蓝植物
芸苔属是十字花科(brassicaceae)(以前称为十字花科(cruciferae))的一个植物属。这个属的成员也被称为卷心菜或芥菜。芸苔属包括许多商业上和农业上重要的物种。在所有那些物种中，甘蓝是最多样化的，其含有至少十种不同的商业栽培品种，包括西兰花、花椰菜、花茎甘蓝、抱子甘蓝、白球甘蓝、红球甘蓝、皱叶甘蓝、羽衣甘蓝、球茎甘蓝或葡萄牙甘蓝。这些类型之间的育种是常见且容易实现的，因为这些类型虽然在表型上具有高度多样性，但它们是相同的物种，这意味着可以进行不同类型之间的杂交，而不必克服任何遗传物种屏障。然而，在栽培种间的杂交仍然可能存在明显的连锁累赘，特别是当在(遗传)遥远的栽培种之间杂交时(例如白球甘蓝与西兰花或花椰菜之间的杂交)。因此，虽然物种屏障的不存在允许在所有栽培种之间进行杂交，但连锁累赘将可能与此类杂交相关。
II.与甘蓝植物的黑腐病(Xcc)抗性相关的基因组区域、等位基因和多态性
黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)引起的甘蓝中的细菌性疾病。虽然已经鉴定了一些黑腐病抗性的来源，但这种抗性尚未成功转移到甘蓝的栽培品种中，特别是西兰花和花椰菜中。另外，先前尚未鉴定出单一的共显性的累加QTL。
因此，需要鉴定赋予所需黑腐病(Xcc)抗性的特定的基因组区域。还需要用单一基因提供抗性，并且提供具有更耐久的抗性的基因。此类区域不应包括与有害性状相关的等位基因。另外，与单一基因相关的抗性在育种期间不太可能被破坏，这导致更耐久的抗性。先前尚未实现本文鉴定的基因渗入或具有降低的基因渗入大小的任何基因渗入。此外，没有描述与抗性紧密连锁的有效标记。
申请人使用本发明的遗传标记和测定能够令人惊讶地鉴定出来自结球甘蓝的新型耐Xcc抗性区域，所述结球甘蓝在众所周知的卷心菜品系C517与良种西兰花品系(BRL51-99sc)之间的杂交中鉴定出。这种基因渗入的作图表明，Xcc抗性的QTL位于标记NH0265597(76.45cM)处，并且侧接有标记NH0265157(74.98cM)和NH0266951(77.14cM)。本领域技术人员将理解，间隔值可以基于以下因素而变化：如所使用的参考图、测序覆盖度和组装软件设置。然而，此类参数和作图方案是本领域已知的，并且本领域技术人员可以使用本文提供的标记序列，使用此种方法来以物理和遗传方式将本文所述的基因渗入锚定到任何给定的图。本发明的新型基因渗入赋予了比先前公开的Xcc抗性基因渗入更独特且显著改进的农艺特性。
III.与抗病性相关的基因组区域的基因渗入
标记辅助的基因渗入涉及将由一个或多个标记所限定的染色体区域从第一遗传背景转移到第二遗传背景。含有基因渗入的基因组区域的杂交后代可以通过具有来自第一遗传背景的所需基因渗入的基因组区域的特征的标记与具有第二遗传背景特征的连锁和非连锁标记的组合来鉴定。
本发明提供用于鉴定和追踪来自结球甘蓝的一个或多个基因组区域的基因渗入的新型标记，所述结球甘蓝最初在卷心菜品系C517(公共来源)与良种西兰花品系(BRL51-99sc)之间的杂交中鉴定出，在本文中公开为栽培的甘蓝品系。本发明还提供用于在植物育种期间鉴定和追踪本文公开的新型基因渗入的标记，其包括标记NH0265597(76.45cM)、NH0265157(74.98cM)和NH0266951(77.14cM)。
在本发明的任何基因组间隔内或与本发明的任何基因组间隔连锁的标记可以用于多种育种工作，这包括将与抗病性相关的基因组区域基因渗入到所需遗传背景中。例如，本文所述的与抗病性相关的标记的20cM、15cM、10cM、5cM、2cM或1cM内的标记可以用于与耐病性表型相关的基因组区域的标记辅助的基因渗入。
还提供了包含与所需表型相关的一个或多个基因渗入区域的甘蓝植物，其中至少10％、25％、50％、75％、90％或99％的剩余基因组序列携带具有种质特征的标记。还提供了包含基因渗入区域的甘蓝植物，所述基因渗入区域包含与本文提供的且与Xcc抗病性表型相关的基因组区域和标记紧密连锁或相邻的区域。
IV.抗病性甘蓝品种的开发
出于大多数育种目标，商业育种者在“栽培类型”或“良种”的种质内工作。此种质更容易用来育种，因为它在园艺性能评估时一般表现良好。已经开发了许多良种甘蓝作物的栽培品种(栽培种)，包括但不限于西兰花、花椰菜、花茎甘蓝、抱子甘蓝、白球甘蓝、红球甘蓝、皱叶甘蓝、羽衣甘蓝、球茎甘蓝或葡萄牙甘蓝。然而，栽培种质或良种种质所提供的性能优点可被缺乏等位基因多样性抵消。育种者一般接受此折衷，因为在用栽培材料工作时比用遗传上不同来源育种时进展更快。
将所需抗性基因从非栽培品系基因渗入到良种栽培品系中而同时避免连锁累赘或低遗传力的问题的过程是一个漫长而又艰巨的过程。因此，部署衍生自野生近缘种的等位基因的成功很大程度上取决于缺乏不利效果的最小或截短的基因渗入以及代替表型筛选的可靠的标记测定。成功还通过简化关键属性的遗传学来进一步限定，以允许将重点放在数量性状(如抗病性)的遗传获得量上。此外，通过信息标记的可用性可以极大地促进基因渗入来自非栽培品系的基因组区域的过程。
因此，本领域技术人员将理解，由本发明提供的等位基因、多态性和标记允许追踪本文鉴定的任何基因组区域并将其引入到任何可以与芸苔属物种杂交的遗传背景内。另外，与本文公开的抗病性相关的基因组区域可以从一种基因型基因渗入另一种基因型，并以表型或遗传方式进行追踪。因此，申请人开发的用于选择抗病性的标记促进了具有有益表型的甘蓝植物的开发。例如，可以使用本发明的标记对植物和种子进行基因分型，以便开发包含所需抗病性的品种。此外，标记辅助选择(MAS)允许鉴定纯合或杂合的所需基因渗入的植物。
减数分裂重组对于植物育种是必要的，因为它能够跨越遗传背景转移有利的等位基因、去除有害的基因组片段并且聚合遗传上密切连锁的性状。在不存在准确标记的情况下，有限的重组迫使育种者扩大用于子代筛选的分离群体。此外，表型评估是耗时的、资源密集的且在每个环境中都不可再现的，特别是对于像抗病性的性状。本发明提供的标记提供了有效的替代方案，且因此代表了本领域的显著进步。
V.分子辅助育种技术
可用于本发明的实践中的遗传标记包括但不限于限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增的片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR)、简单序列长度多态性(SSLP)、单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失多态性(Indel)、可变数量串联重复序列(VNTR)和随机扩增多态性DNA(RAPD)、同功酶及本领域技术人员已知的其他标记。蔬菜育种者使用分子标记来查询作物的基因组，并且基于遗传差异而非表型差异对材料进行分类。先进的标记技术是基于基因组序列，即一个物种内的不同的多态性基因型的核苷酸顺序。除了使用随机分布在整个基因组中的标记的种质的组织外，此类平台还能够选择具有与有利等位基因连锁的标记的园艺性状。在过去，缺乏对于目前已被测序的主要蔬菜作物的基因组的先验知识。科学家利用序列同源性而不是已知的多态性来开发标记平台。当在DNA聚合酶存在下成对杂交时，人造DNA分子用于引发基因组片段的复制。这种由热循环条件来调节的合成在聚合酶链反应(PCR)中控制DNA链的杂交和复制，以扩增长度取决于每个引物对之间距离的DNA片段。然后将这些片段作为标记进行检测，且通常已知的实例包括AFLP和RAPD。第三种技术RFLP不包括DNA扩增步骤。扩增片段长度多态性(AFLP)技术降低了基因组的复杂性。首先，通过消化酶以序列特异性方式裂解DNA链。然后根据其大小来选择片段，且最终使用选择性寡核苷酸来复制，每个寡核苷酸与基因组片段的亚组同源。因此，AFLP技术不断横跨基因型、实验和实验室来扩增DNA片段。
可以多种方式来测定包含少至单个核苷酸变化的多态性。例如，检测可以通过电泳技术来完成，所述电泳技术包括单链构象多态性(Orita等,Genomics 8:271-278,1989)、变性梯度凝胶电泳(Myers,EP 0273085)或裂解片段长度多态性(Life Technologies,Inc.,Gathersberg,MD)，但是DNA测序的广泛可用性经常使得更容易直接对扩增产物进行简单测序。一旦已知多态性序列差异，便可以设计用于子代测试的快速测定，所述子代测试通常涉及一些版本的特异性等位基因的PCR扩增(PASA；Sommer等,Biotechniques 12:82-87,1992)或多个特异性等位基因的PCR扩增(PAMSA；Dutton和Sommer,Biotechniques 11:700-702,1991)。
多态性标记用作测定植物以确定品系或品种的同一性程度的有用工具(美国专利号6,207,367)。这些标记形成了用于确定与表型的相关性的基础，并且可用于驱动遗传获得量。在本发明方法的某些实施方案中，多态性核酸可用于在甘蓝植物中检测与抗病性相关的基因型，鉴定具有与抗病性相关的基因型的甘蓝植物，并且选择具有与抗病性相关的基因型的甘蓝植物。在本发明方法的某些实施方案中，可使用多态性核酸来产生在其基因组中包含与抗病性相关的基因渗入基因座的甘蓝植物。在本发明的某些实施方案中，可使用多态性核酸来育种包含与抗病性相关的基因座的子代甘蓝植物。
遗传标记可包括“显性”或“共显性”标记。“共显性”标记显示存在两个或更多个等位基因(每个二倍体个体两个)。“显性”标记显示仅存在单一的等位基因。标记优选以共显性方式遗传，使得二倍体基因座处的两个等位基因或者三倍体或四倍体基因座中的多个等位基因的存在都易于检测，并且它们没有环境变异，即它们的遗传力为1。标记基因型通常包含二倍体生物体中每个基因座处的两个标记等位基因。每个基因座的标记等位基因组成可以是纯合的或杂合的。纯合性是其中基因座处的两个等位基因的特征为相同的核苷酸序列的条件。杂合性是指基因座处的等位基因的不同条件。
用于确定遗传多态性是否存在(即，用于基因分型)的基于核酸的分析可以在育种程序中用于鉴定、选择、基因渗入等。用于分析遗传多态性的广泛多种遗传标记是本领域技术人员可用并已知的。所述分析可用于选择基因、基因的部分、QTL、等位基因或基因组区域，它们包含与甘蓝植物中的抗病性相关或连锁的遗传标记或者与所述遗传标记连锁。
如本文所用，核酸分析方法包括但不限于基于PCR的检测方法(例如，TaqMan测定)、微阵列方法、基于质谱的方法和/或核酸测序方法(包括全基因组测序)。在某些实施方案中，通过使用核酸扩增方法可促进DNA、RNA或cDNA样品中多态性位点的检测。具体地，此类方法增加跨越多态性位点或包括位于其远侧或近端的位点和序列的多核苷酸的浓度。此类扩增的分子可以通过凝胶电泳、荧光检测方法或其他手段很容易地检测。
实现此类扩增的一种方法采用聚合酶链反应(PCR)(Mullis等,Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.51:263-273,1986；欧洲专利50,424；欧洲专利84,796；欧洲专利258,017；欧洲专利237,362；欧洲专利201,184；美国专利4,683,202；美国专利4,582,788；和美国专利4,683,194)，其使用能够与限定其双链形式的多态性的近端序列杂交的引物对。也可以使用基于质谱的DNA分型方法。此类方法在美国专利号6,613,509和6,503,710以及其中的参考文献中公开。
可通过本领域中熟知的多种有效方法来检测或分型DNA序列中的多态性，所述有效方法包括但不限于以下专利中公开的那些：美国专利号5,468,613、5,217,863；5,210,015；5,876,930；6,030,787；6,004,744；6,013,431；5,595,890；5,762,876；5,945,283；5,468,613；6,090,558；5,800,944；5,616,464；7,312,039；7,238,476；7,297,485；7,282,355；7,270,981和7,250,252，其全部以引用的方式整体并入本文。然而，本发明的组合物和方法可与任何多态性分型方法结合使用以在基因组DNA样品中为多态性分型。所使用的这些基因组DNA样品包括但不限于直接从植物分离的基因组DNA、克隆的基因组DNA或扩增的基因组DNA。
例如，可通过与等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交来检测DNA序列中的多态性，如美国专利号5,468,613和5,217,863中所公开的。美国专利号5,468,613公开了等位基因特异性寡核苷酸杂交，其中核酸序列中的单个或多个核苷酸变异可通过以下过程在核酸中检测：在所述过程中包含核苷酸变异的序列被扩增、点在膜上并用标记的序列特异性寡核苷酸探针处理。
靶核酸序列也可以通过探针连接方法来检测，例如如美国专利号5,800,944中所公开的，其中感兴趣的序列被扩增并与探针杂交，然后连接以检测探针的标记部分。
微阵列也可用于多态性检测，其中寡核苷酸探针组以重叠的方式组装以表示单个序列，使得靶序列在一个点处的差异将导致部分探针杂交(Borevitz等,Genome Res.13:513-523,2003；Cui等,Bioinformatics 21:3852-3858,2005)。在任何一个微阵列上，预期将存在多个靶序列，其可表示基因和/或非编码区，其中每个靶序列由一系列重叠寡核苷酸而不是单个探针来表示。这个平台提供多个多态性的高通量筛选。美国专利号6,799,122；69,13,879；和6,996,476中公开了通过基于微阵列的方法对靶序列的分型。
用于检测SNP和Indel的其他方法包括单碱基延伸(SBE)方法。SBE方法的实例包括但不限于美国专利号6,004,744；6,013,431；5,595,890；5,762,876；和5,945,283中公开的那些。
在用于检测多态性的另一种方法中，可以通过美国专利号5,210,015；5,876,930；和6,030,787中公开的方法来检测SNP和Indel，其中寡核苷酸探针具有共价连接到所述探针的5'和3'端的5'荧光报告染料和3'淬灭染料。当探针完整时，报告染料与淬灭染料的接近导致报告染料荧光的抑制，例如，通过Forster型能量转移。在PCR期间，正向引物和反向引物与侧接多态性的靶DNA的特异性序列杂交，而杂交探针与扩增的PCR产物内的含多态性的序列杂交。在随后的PCR循环中，具有5'→3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶裂解探针并将报告染料与淬灭染料分离，从而造成报告物的荧光增加。
在另一实施方案中，可使用核酸测序技术对感兴趣的一个或多个基因座直接测序。用于核酸测序的方法是本领域中已知的，并且包括由以下提供的技术：454LifeSciences(Branford,CT)、Agencourt Bioscience(Beverly,MA)、Applied Biosystems(Foster City,CA)、LI-COR Biosciences(Lincoln,NE)、NimbleGen Systems(Madison,WI)、Illumina(San Diego,CA)和VisiGen Biotechnologies(Houston,TX)。此类核酸测序技术包括以下格式：如平行珠阵列、连接法测序、毛细管电泳、电子微芯片、“生物芯片”、微阵列、平行微芯片和单分子阵列。
定义
提供了以下定义来更好地限定本发明以及指导本发明的普通技术人员实践本发明。除非另外指出，否则术语应按照相关技术领域的普通技术人员的常规用法来理解。
如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、可再生甘蓝植物的组织培养的植物细胞、植物愈伤组织、植物块以及在植物或植物部分(如花粉、花、种子、叶、茎等)中完整的植物细胞。
如本文所用，术语“群体”意指具有共同亲本衍生的植物的遗传异质的集合。
如本文所用，术语“品种”和“栽培种”意指通过其遗传谱系和性能可以从同一物种内的其他品种中鉴定出的一组类似植物。
如本文所用，“等位基因”是指染色体上给定基因座处的基因组序列的两种或更多种替代形式之一。
“数量性状基因座(QTL)”是编码影响表型的表现度的至少第一等位基因的染色体位置。
如本文所用，“标记”意指可以用于区分生物体的可检测特征。此类特征的实例包括但不限于遗传标记、生物化学标记、代谢物、形态特征和农学特征。
如本文所用，术语“表型”意指可以受基因表达影响的细胞或生物体的可检测特征。
如本文所用，术语“基因型”意指植物的特异性等位基因组成。
如本文所用，“良种品系”或“栽培品系”是指由优异的农学性能的育种和选择产生的任何品系。“原种植物”是指属于良种品系的植物。许多良种品系是甘蓝育种领域的技术人员可获得的且已知的。“良种种群”是在给定作物物种(诸如甘蓝品系)的农学上优异的基因型方面可以用于代表现有技术水平的良种个体或品系的分类。类似地，“良种种质”或种质的良种株系是农学上优异的种质。甘蓝的栽培品种不旨在包括C517白球甘蓝来源。
如本文所用，术语“基于渗入的”当用于参考遗传基因座时，是指已经被引入新的遗传背景(诸如通过回交)中的遗传基因座。遗传基因座的基因渗入可通过植物育种方法和/或分子遗传学方法来实现。此类分子遗传方法包括但不限于标记辅助选择。
如本文所用，术语“连锁的”当在核酸标记和/或基因组区域的情况下使用时，意指标记和/或基因组区域位于同一个连锁群或染色体上，使得它们在减数分裂时倾向于一起分离。
如本文所用，“抗性基因座”意指与抗病性或耐病性相关的基因座。例如，在一个实施方案中，根据本发明的抗性基因座可控制对黑腐病的抗性或易感性。
如本文所用，“抗性等位基因”意指与抗病性或耐病性相关的核酸序列。
如本文所用，植物对病症的“抗性”或“改进的抗性”指示与较低抗性的更“易感”的植物相比，植物在产量、存活力和/或其他相关的农学量度方面受病症的影响较小。抗性是相对术语，其指示与在相似病症下生长的不同(较低抗性的)植物相比，“抗性”植物在病症下存活和/或产生更好的产量。如本领域所用，“耐病性”有时可与“抗病性”互换使用。技术人员将理解植物对病症的抗性变化很大，并且可以代表更高抗性或更低抗性的表型谱。然而，通过简单观察，技术人员一般可以确定不同植物、植物品系或植物科在病症下的相对抗性或易感性，并且此外，还将识别“抗性”表型等级。
术语“约”用于指示一个值包括用于确定所述值的装置或方法的误差的标准偏差。除非明确指明仅指代替代物或替代物相互排斥，否则权利要求书中所用的术语“或”用于意指“和/或”，尽管本公开支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。当在权利要求书中与词语“包含(comprising)”或其他开放语言结合使用时，除非确切指出，否则词语“一个(a)”和“一种(an)”表示“一个(种)或多个(种)”。术语“包含(comprise)”、“具有(have)”和“包括(include)”是开放式连系动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”，也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有这一个或多个步骤并且还覆盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个形状的任何植物不限于仅具有这一个或多个形状并且还覆盖其他未列出的形状。
VI.保藏信息
保藏物由至少2500粒花椰菜株系C517xBRL51-99的种子组成，所述花椰菜株系包含来自结球甘蓝的基因渗入，如本文所述。所述保藏物在美国典型培养物保藏所(AmericanType Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA)中完成。保藏物被指定ATCC保藏号PTA-123409，并且保藏日期为2016年8月4日。在本申请未决状态期间，享有保藏物权利的人可以请求获得所述保藏物。所述保藏物将保存在作为公共保藏处的ATCC保藏处，为期三十年或最近一次请求后的5年或者专利的可实施寿命(以较长者为准)，如果在此期间不能存活，将被替换。申请人并不放弃根据本专利或任何其他形式的品种保护(包括“植物品种保护法”(美国法典第7篇2321及以下))授予的权利的任何侵权。
实施例1
Xcc抗性等位基因的鉴定和作图
构建双单倍体(DH)群体以鉴定抗性等位基因。将卷心菜育种品系(C517)与来自Seminis Vegetable Seeds,Inc.的良种西兰花品系(BRL51-99sc)杂交以产生杂交种。所述杂交种用于产生DH植物。这些DH0植物是自交的，且后续的DH1群体用于在温室条件下进行黑腐病测试。简单来说，黑腐病测试涉及以下工序：将5-6真叶期的芸苔属幼苗用作测试材料。所述幼苗在正常的温室条件下在12cm的土壤盆中生长。使用浓度为1x 106个细胞/mL的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的悬浮液来接种所述幼苗。通过使用注射器在两个不同的点处将0.2mL的Xcc悬浮液注射到茎中，来使所述幼苗感染细菌。当对照开始显示预期的反应时，一般在感染后14天左右，记录所述幼苗的反应。症状以1-9的等级上来计分，其中1为无症状(抗性)，且9为许多坏死斑点和/或植物死亡(易感)。中间表型为：2：整个植物可见约两个小斑点(植物的总体印象为抗性)；3：叶片上有很少褪绿斑点(植物的总体印象是抗性的)；4：叶片表面和整个植物约30％有褪绿斑点(植物的总体印象为IR)；5：叶片表面约40％有褪绿斑点(总体印象为IR)，6：叶片和整个植物约50％有褪绿斑点和坏死斑点(IR)；7：叶片表面约60％有褪绿斑点和坏死斑点(易感)；8：叶片表面和整个植物超过70％有坏死斑点(易感)。每个实验将包括与测试幼苗进行比较的对照。这些对照可包括作图群体的原始亲本。
使用SSR基因座构建分子标记图。将所述图与定量疾病数据结合能够检测O3染色体上黑腐病抗性的一个主要QTL(图2)。
实施例2
多重分离株抗性
从全世界的甘蓝作物(西兰花、花椰菜、卷心菜)收集了157个Xcc分离株。在这个集合中，使用改进的鉴别植物系列(Vicente,2001)对分离株进行分类，主要为致病变型1、4、6和9。根据Vicente,2001的方法，一些分离株不能分类为致病变型群。全世界的致病变型分布与地理无关，这对应于先前的发现(Vicente,2001；Taylor,2002)。发现每个大陆上都存在所有主要的致病变型。这表明全球所有生长区域的Xcc都有变异。然后按照实施例1中所述的方案，针对抗性QTL测试所有分离株。发现抗性QTL对所有测试的分离株都提供抗性(表1)。
表1.使用从不同国家收集的分离株人工感染C517。结果针对C517的易感(S)、中等抗性(IR)和抗性(R)反应的数量来表示。NP＝非致病的。
实施例3
在西兰花中除去连锁累赘
Xcc抗性育种品系(C517)与西兰花品系(BRL51-99sc)之间的初始杂交产生与抗性基因座相关的连锁累赘。这些植物表现出延缓生长和/或小株型(图1)。原始DH1群体进一步与BRL51-99sc回交且随后自交以产生更多的重组体，其可用于Xcc抗性基因座的精细基因作图以及连锁累赘的除去。来自这些科的种子在未加热温室的播种盘中播种并生长6周。将幼苗种植在试验田上的随机完整区块设计中(2个重复并且每个地块20个植物)。大约三个月后评估植物。在地块内根据头部质量和叶片类型将植物随机分开。在整个试验中，存在分开用于延缓生长(参见图1)。根据这种性状来为植物评分，其中1＝延缓生长，3＝正常生长，2＝中间生长且0＝未观察。
然后根据如图2所示的位于QTL周围的六个标记来筛选植物筛。对从未分开用于延缓生长的地块获得的四(4)个植物进行取样，并对分开用于延缓生长的地块的所有植物进行取样。延缓生长性状与标记NH0267115至NH0267108的抗性QTL高度相关，并且似乎是隐性的(表2)。具有从NH0267115至sN10957的纯合O3基因渗入的重组体以及NH0265157和NH0267108的轮回亲本(HP99)未表现出延缓生长。
表2.黑腐病的QTL周围标记的观察到的基因型以及这些基因型的每个植物评分的植物的数量。1＝延缓生长，3＝正常生长，2＝中间生长且0＝未观察
基于QTL作图(图2)和连锁累赘结果(表2)，基于sN10957与NH0265157之间的重组来选择植物。抗性位于sN10957左侧，而累赘位于sN10957右侧。鉴定了24株重组植物和一些校验，并将其带入温室中以产生种子用于实验。由这些种子产生的植物在田地测试黄单胞菌的抗性和植物重量。在植物重量和抗性水平之间的相关性中，选择没有连锁累赘的植物(图3)。发现所有这些植物在3号染色体上具有较小的来自C517的基因渗入。这种基因渗入的基因作图发现，黄单胞菌抗性QTL的大小最多为2cM且位于标记NH0265597(76.45cM)处。此外，QTL侧接有标记NH0265157(74.98cM)和NH0266951(77.14cM)。
表2中的探针、引物和标记的序列如表3所示。
表3
*************
本文所公开和要求的所有组合物和/或方法都可根据本公开在无不当实验的情况下制备和进行。尽管本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案加以描述，但对本领域技术人员显而易见的是在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可使本文所述的组合物和方法以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序发生变化。更具体地，显而易见的是在化学上和生理学上都相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时达到相同或相似结果。对本领域技术人员来说显而易见的是所有此类相似的替代和修改被认为在如由随附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (10)

1.一种西兰花或花椰菜植物，其包含来自结球甘蓝3号染色体的基因渗入，所述基因渗入相对于缺乏所述基因渗入的植物赋予针对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性，且其中所述抗性是共显性和累加性的。
2.如权利要求1所述的植物部分，其中所述植物部分是细胞、种子、根、茎、叶、头、花或花粉。
3.一种基因渗入片段，其包含来自结球甘蓝的染色体区段，其中所述片段赋予对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性并且缺乏与其遗传连锁的等位基因，从而赋予延缓的植物生长，其中包含所述基因渗入的种子样品保藏在ATCC保藏号PTA-123409下。
4.如权利要求3所述的基因渗入片段，其中所述片段包含来自结球甘蓝的染色体区段，其侧接有标记NH0265157(SEQ ID NO:5)和标记NH0266951(SEQ ID NO:12)。
5.一种用于产生具有改进的对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的抗性的甘蓝植物的栽培品种的方法，所述方法包括将来自结球甘蓝3号染色体的染色体区段基因渗入到所述植物品种中，所述基因渗入相对于缺乏所述基因渗入的植物赋予对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的广谱抗性，且其中所述抗性是共显性和累加性的。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述基因渗入包含：
a)使包含所述染色体区段的植物与其自身或与不同基因型的第二种甘蓝植物杂交以产生一个或多个子代植物；以及
b)选择包含所述染色体区段的子代植物。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述抗性包括对多种野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病变型的抗性。
8.如权利要求5所述的方法，其中包含所述染色体区段的种子样品保藏在ATCC保藏号PTA-123409下。
9.一种甘蓝植物，其通过如权利要求5所述的方法产生。
10.一种生产食物或饲料的方法，所述方法包括获得根据权利要求1或9所述植物或其一部分，以及由所述植物或其部分产生所述食物或饲料。
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