CN107873179A - 一种促进杜鹃兰种子萌发的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种促进杜鹃兰种子萌发的方法，属于植物组织培养技术领域。所述方法包括种子选择、种子表面处理、种子消毒以及种子培养的步骤。所述种子表面处理和种子消毒主要是采用植物消毒液进行浸泡，植物消毒液的活性成分是乙酰紫草素、芦荟汁、夹竹桃叶提取物；萌发培养基中添加了黄秋葵汁和辣木叶汁作为营养成分，并以NAA和GGR6作为生长素。本发明的方法能使杜鹃兰种子提早萌发，并能提高种子萌发率。

Description

一种促进杜鹃兰种子萌发的方法
【技术领域】
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种促进杜鹃兰种子萌发的方法。
【背景技术】
杜鹃兰属兰科杜鹃兰属多年生药用草本植物，以其干燥假鳞茎入药，外用可治蛇虫咬伤、皮肤烫伤等，内服可抗肝癌、乳腺癌等。由于人们对杜鹃兰药材的无节制采挖，导致其野生资源濒临枯竭。自然条件下，杜鹃兰几乎不能授粉结实。通过人工授粉虽可使其结果，但因其种胚发育不完全、种皮抑制等障碍因素，故其有性繁殖十分困难。人工种植中虽可采用假鳞茎繁殖，但繁殖系数极低，难以实现规模化生产。目前，有关杜鹃兰的研究主要集中在化学成分分析、药理毒理研究、组培快繁等方面，有性繁殖中如何突破其种子萌发这一难题尚鲜见报道。为此，研发筛选适宜杜鹃兰种子萌发的培养基，提升杜鹃兰有性繁殖技术水平，对杜鹃兰的人工种植具有重要的意义。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种促进杜鹃兰种子萌发的方法，本发明的方法能使杜鹃兰种子提早萌发，并能提高种子萌发率。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种促进杜鹃兰种子萌发的方法，该方法包括以下步骤：
(1)种子选择：选取成熟的杜鹃兰蒴果；
(2)种子表面处理：采摘杜鹃兰蒴果后，用流水冲洗进行表面清洁，然后置于超净工作台内，用75％的酒精浸泡2-3min，并用无菌水洗3-5次，接着再用植物消毒液浸泡5-10min，最后用无菌水洗3-5次，用无水滤纸吸干表面水分；
(3)种子消毒：以解剖刀纵向剖开蒴果，抖出杜鹃兰种子，先用75％的酒精消毒种子15-20s，无菌水洗3-5次，再植物消毒液浸泡8-12min；最后用无菌水洗3-5次，用滤纸吸干表面水分；
(4)种子培养：用无菌棉棒粘取消毒后的杜鹃兰种子涂布在萌发培养基上，暗处理8d后转置到光照下继续培养，培养温度25℃，光照强度为1500lx-2000lx，培养光照时间12h/d；
所述植物消毒液是由以下重量份的原料混合制成：乙酰紫草素0.05-0.08份，芦荟汁5-8份，夹竹桃叶提取物0.1-0.2份，吐温-60 2-4份，水75-100份；
所述萌发培养基为LS+0.10-0.20mg/LNAA+0.05-0.08mg/LGGR6+8.0-12.0g/L黄秋葵汁+12.0-15.0g/L辣木叶汁+20-40g/L蔗糖+6-8g/L琼脂，pH为5.4-5.6。
本发明中，优选地，所述成熟的杜鹃兰蒴果是指异株异花授粉、且生长期在180天-200天的蒴果。
本发明中，优选地，所述夹竹桃提取物的提取方法为：将新鲜夹竹桃叶捣碎成浆，用体积浓度为70％-75％的乙醇回流提取2-6次，乙醇与所述夹竹桃叶的液料比为5-8：1；合并滤液，浓缩、干燥得夹竹桃叶醇提物；以丙酮∶正丁醇体积比为3-4：1的混合液为提取剂，向所述夹竹桃叶醇提物中加入提取剂，提取2-5次，合并提取液，回收所述提取剂得到夹竹桃叶抑菌成分提取物。
本发明中，优选地，所述辣木叶汁通过以下方法得到，取新鲜辣木叶，先洗净原料，然后充分捣碎，再用纱布过滤，所述滤液即为辣木叶汁。
本发明中，优选地，所述黄秋葵汁是将新鲜黄秋葵表皮洗净后，用机器搅打成汁得到的。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明对杜鹃兰种子消毒时主要采用植物消毒剂进行浸泡，该植物消毒剂是由乙酰紫草素、芦荟汁、夹竹桃叶提取物加乳化剂吐温-60和水混合制成的；其中芦荟汁和夹竹桃叶均具有良好的杀菌抗病毒的作用，但两者复合使用时消毒效果和杀菌谱均不能满足种子消毒的需要，经本申请人反复试验后发现加入少量的乙酰紫草素配合可起到增效作用，能大大增加消毒的效果；采用该植物消毒液不仅可以大大降低外植体的损伤率，降低接种的污染率，还能降种子萌发的时间提前。
(2)本发明采用的培养基中添加了辣木叶汁和黄秋葵汁作为营养物质，采用NAA和GGR6作为生长素，采用LS作用基础培养基，其中辣木叶中含有多种矿物质、维生素、20种氨基酸、46种抗氧素和36种自然防炎体和矿物质，每100克的辣木中含有的维生素C是柑橘的7倍，铁是菠菜的3倍，维生素A是胡萝卜的4倍，钙质是牛奶的4倍，钾是香蕉的3倍，蛋白质是酸奶的2倍。黄秋葵的营养丰富，幼果中含有大量的粘滑汁液，具有特殊的香味；其汁液中混有果胶，牛乳聚糖及阿拉聚糖等；它的果胶为可溶性纤维，在现代保健新观念中极为重视；凡经常食用它有健胃肠，滋补阴阳之功效；据测定每百克嫩果中含蛋白质2.5克、脂肪0.1克、糖类2.7克，纤维素A660国际单位；维生素B1，0.2毫克、维生素B20.06毫克、维生素44毫克、钙81毫克、磷63毫克、铁0.8毫克。这两种物质的联合添加，与生长调节剂、基础培养基一起作用，可以显著提高提高种子的萌发率和缩短萌发时间。
(3)本发明中夹竹桃叶提取物在制备过程中，采用的提取方法是先醇提，然后用丙酮和正丁醇的混合剂进行提取，可以针对性地得到夹竹桃叶中的抗菌活性成份，得到的提取物抗菌活性较好。
【具体实施方式】
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
在本发明的实施例中，辣木叶汁、枸杞叶汁和芦荟汁的制备方法如下：
辣木叶汁：先洗净叶片然后充分捣碎，再用纱布过滤，所述滤液即为辣木叶汁。
黄秋葵汁：先洗净表皮然后充分捣碎，用机器搅打成汁即得。
芦荟汁：先将芦荟除去表皮后，用机器搅打成汁即得。
在本发明的一些实施例中，夹竹桃提取物通过以下方法得到：将新鲜夹竹桃叶捣碎成浆，用体积浓度为70％的乙醇回流提取2次，乙醇与所述夹竹桃叶的液料比为8：1；合并滤液，浓缩、干燥得夹竹桃叶醇提物；以丙酮∶正丁醇体积比为3：1的混合液为提取剂，向所述夹竹桃叶醇提物中加入提取剂，提取2次，合并提取液，回收所述提取剂得到夹竹桃叶抑菌成分提取物。
在本发明的另一些实施例中，夹竹桃提取物通过以下方法得到：将新鲜夹竹桃叶捣碎成浆，用体积浓度为75％的乙醇回流提取6次，乙醇与所述夹竹桃叶的液料比为5：1；合并滤液，浓缩、干燥得夹竹桃叶醇提物；以丙酮∶正丁醇体积比为4：1的混合液为提取剂，向所述夹竹桃叶醇提物中加入提取剂，提取5次，合并提取液，回收所述提取剂得到夹竹桃叶抑菌成分提取物。
上述方法得到的夹竹桃提取物的抗菌活性没有显著的差异，故在以下实施例中，不通过具体实施例进行赘述。
一、具体实施例
实施例1
一种促进杜鹃兰种子萌发的方法，该方法包括以下步骤：
(1)种子选择：选取异株异花授粉、且生长期在180天的杜鹃兰蒴果；
(2)种子表面处理：采摘杜鹃兰蒴果后，用流水冲洗进行表面清洁，然后置于超净工作台内，用75％的酒精浸泡2min，并用无菌水洗3次，接着再用植物消毒液浸泡5min，最后用无菌水洗3次，用无水滤纸吸干表面水分；所用植物消毒液是由以下重量份的原料混合制成：乙酰紫草素0.05份，芦荟汁5份，夹竹桃叶提取物0.1份，吐温-60 2份，水75份；
(3)种子消毒：以解剖刀纵向剖开蒴果，抖出杜鹃兰种子，先用75％的酒精消毒种子15s，无菌水洗3次，再植物消毒液浸泡8min；最后用无菌水洗3次，用滤纸吸干表面水分；
(4)种子培养：用无菌棉棒粘取消毒后的杜鹃兰种子涂布在萌发培养基上，所用萌发培养基为LS+0.10mg/LNAA+0.05mg/LGGR6+8.0g/L黄秋葵汁+12.0g/L辣木叶汁+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH为5.4；暗处理8d后转置到光照下继续培养，培养温度25℃，光照强度为1500lx，培养光照时间12h/d。
实施例2
一种促进杜鹃兰种子萌发的方法，该方法包括以下步骤：
(1)种子选择：选取异株异花授粉、且生长期在190天的杜鹃兰蒴果；
(2)种子表面处理：采摘杜鹃兰蒴果后，用流水冲洗进行表面清洁，然后置于超净工作台内，用75％的酒精浸泡2.5min，并用无菌水洗4次，接着再用植物消毒液浸泡8min，最后用无菌水洗4次，用无水滤纸吸干表面水分；所用植物消毒液是由以下重量份的原料混合制成：乙酰紫草素0.06份，芦荟汁6份，夹竹桃叶提取物0.15份，吐温-60 3份，水85份；
(3)种子消毒：以解剖刀纵向剖开蒴果，抖出杜鹃兰种子，先用75％的酒精消毒种子18s，无菌水洗4次，再植物消毒液浸泡10min；最后用无菌水洗4次，用滤纸吸干表面水分；
(4)种子培养：用无菌棉棒粘取消毒后的杜鹃兰种子涂布在萌发培养基上，所用萌发培养基为LS+0.15mg/LNAA+0.06mg/LGGR6+10.0g/L黄秋葵汁+13.0g/L辣木叶汁+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH为5.5；暗处理8d后转置到光照下继续培养，培养温度25℃，光照强度为2000lx，培养光照时间12h/d。
实施例3
一种促进杜鹃兰种子萌发的方法，该方法包括以下步骤：
(1)种子选择：选取异株异花授粉、且生长期在200天的杜鹃兰蒴果；
(2)种子表面处理：采摘杜鹃兰蒴果后，用流水冲洗进行表面清洁，然后置于超净工作台内，用75％的酒精浸泡3min，并用无菌水洗5次，接着再用植物消毒液浸泡10min，最后用无菌水洗5次，用无水滤纸吸干表面水分；所用植物消毒液是由以下重量份的原料混合制成：乙酰紫草素0.08份，芦荟汁8份，夹竹桃叶提取物0.2份，吐温-60 4份，水100份；
(3)种子消毒：以解剖刀纵向剖开蒴果，抖出杜鹃兰种子，先用75％的酒精消毒种子20s，无菌水洗5次，再植物消毒液浸泡12min；最后用无菌水洗5次，用滤纸吸干表面水分；
(4)种子培养：用无菌棉棒粘取消毒后的杜鹃兰种子涂布在萌发培养基上，所用萌发培养基为LS+0.20mg/LNAA+0.08mg/LGGR6+12.0g/L黄秋葵汁+15.0g/L辣木叶汁+40g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH为5.6；暗处理8d后转置到光照下继续培养，培养温度25℃，光照强度为2000lx，培养光照时间12h/d。
二、不同方法对杜鹃兰种子的萌发时间和萌发率比较试验
对比例1
种子选择时选取同株异花授粉生长期在180天的杜鹃兰蒴果，其他培养方法与实施例2相同，考察种子的选择对萌发时间和萌发率的影响。
对比例2
种子选择时选取异株异花授粉生长期在160天的杜鹃兰蒴果，其他培养方法与实施例2相同，考察种子的选择对萌发时间和萌发率的影响。
对比例3
种子表面处理和种子消毒时，植物消毒液采用质量浓度为0.1％的次氯酸钠溶液代替，其他培养方法与实施例2相同，考察消毒方式的不同对萌发时间和萌发率的影响。
对比例4
种子表面处理和种子消毒时，植物消毒液不添加乙酰紫草素，具体组成为：芦荟汁6份，夹竹桃叶提取物0.15份，吐温-60 3份，水85份，其他培养方法与实施例2相同，考察消毒方式的不同对萌发时间和萌发率的影响。
对比例5-7
种子培养时，萌发培养基的组成分别如下：
①采用MS代替LS：MS+0.15mg/LNAA+0.06mg/LGGR6+10g/L黄秋葵汁+13g/L辣木叶汁+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH为5.5；
②培养基中不添加GGR6：LS+0.15mg/LNAA+10.0g/L黄秋葵汁+13.0g/L辣木叶汁+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH为5.5。
③培养基中采用土豆泥代替辣木叶汁和黄秋葵汁：LS+0.15mg/LNAA+土豆泥75g/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH为5.5。
按照实施例1-3、对比例1-7中的方法进行种子萌发试验，每组处理50粒杜鹃兰种子，每组设3个重复，记录每组的种子萌发时间，即种子播种至种胚突破种皮开始萌发的时间，以天(d)计。统计自种子开始萌发后第30d的种子萌发率。公式如下：
种子萌发率＝(单位面积内的萌发种子数/供试种子总数)×100％。
试验结果如下表1：
表1 种子萌发时间和种子萌发率
从表1的结果可以看出，实施例1-3所处理的种子萌发率高，可达64％，且种子萌发时间可以缩短至30天左右。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (5)

1.一种促进杜鹃兰种子萌发的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)种子选择：选取成熟的杜鹃兰蒴果；
(2)种子表面处理：采摘杜鹃兰蒴果后，用流水冲洗进行表面清洁，然后置于超净工作台内，用75％的酒精浸泡2-3min，并用无菌水洗3-5次，接着再用植物消毒液浸泡5-10min，最后用无菌水洗3-5次，用无水滤纸吸干表面水分；
(3)种子消毒：以解剖刀纵向剖开蒴果，抖出杜鹃兰种子，先用75％的酒精消毒种子15-20s，无菌水洗3-5次，再植物消毒液浸泡8-12min；最后用无菌水洗3-5次，用滤纸吸干表面水分；
(4)种子培养：用无菌棉棒粘取消毒后的杜鹃兰种子涂布在萌发培养基上，暗处理8d后转置到光照下继续培养，培养温度25℃，光照强度为1500lx-2000lx，培养光照时间12h/d；
所述植物消毒液是由以下重量份的原料混合制成：乙酰紫草素0.05-0.08份，芦荟汁5-8份，夹竹桃叶提取物0.1-0.2份，吐温-602-4份，水75-100份；
所述萌发培养基为LS+0.10-0.20mg/LNAA+0.05-0.08mg/LGGR6+8.0-12.0g/L黄秋葵汁+12.0-15.0g/L辣木叶汁+20-40g/L蔗糖+6-8g/L琼脂，pH为5.4-5.6。
2.根据权利要求1所述的促进杜鹃兰种子萌发的方法，其特征在于：所述成熟的杜鹃兰蒴果是指异株异花授粉、且生长期在180天-200天的蒴果。
3.根据权利要求1所述的促进杜鹃兰种子萌发的方法，其特征在于：所述夹竹桃提取物的提取方法为：将新鲜夹竹桃叶捣碎成浆，用体积浓度为70％-75％的乙醇回流提取2-6次，乙醇与所述夹竹桃叶的液料比为5-8：1；合并滤液，浓缩、干燥得夹竹桃叶醇提物；以丙酮∶正丁醇体积比为3-4：1的混合液为提取剂，向所述夹竹桃叶醇提物中加入提取剂，提取2-5次，合并提取液，回收所述提取剂得到夹竹桃叶抑菌成分提取物。
4.根据权利要求1所述的促进杜鹃兰种子萌发的方法，其特征在于：所述辣木叶汁通过以下方法得到，取新鲜辣木叶，先洗净原料，然后充分捣碎，再用纱布过滤，所述滤液即为辣木叶汁。
5.根据权利要求1所述的促进杜鹃兰种子萌发的方法，其特征在于：所述黄秋葵汁是将新鲜黄秋葵表皮洗净后，用机器搅打成汁得到的。
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