CN107868124B - 一种玉米醇溶蛋白抗炎多肽及其制备方法 - Google Patents

一种玉米醇溶蛋白抗炎多肽及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米醇溶蛋白抗炎多肽及其制备方法，属于农产品精深加工及功能食品制备技术领域。本发明先采用超声预处理玉米醇溶蛋白，然后利用蛋白酶进行酶解制备玉米抗炎多肽，再通过模拟胃肠道消化追踪玉米抗炎多肽的活性，最后通过Caco‑2细胞模拟小肠上皮细胞吸收后，表征出了经过胃肠道消化，耐Caco‑2细胞分解并被Caco‑2细胞模拟小肠内壁吸收的高抗炎活性的玉米纯肽。本发明首次鉴定出了3种经过胃肠道消化，耐Caco‑2细胞分解并被Caco‑2细胞模拟小肠内壁吸收具有很强的抗炎活性玉米醇溶蛋白功能多肽。并结合模拟消化系统和Caco‑2模拟小肠内壁吸收系统去追踪玉米抗炎多肽的活性变化；研究了玉米多肽消化产物在Caco‑2模拟小肠内壁吸收系统的吸收率。

Description

一种玉米醇溶蛋白抗炎多肽及其制备方法
技术领域
本发明提供了一种玉米醇溶蛋白抗炎多肽及其制备方法，属于农产品精深加工及功能食品制备技术领域，可作为功能性添加剂用于功能性食品或药物等。
背景技术
慢性炎症参与人体多种疾病的发生发展，是多种疾病的致病基础。衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮细胞即血管内皮细胞在血管生物学中起着至关重要的作用，如调节血管紧张度、止血、嗜中性粒细胞募集、激素运输和液体过滤等。血管炎症是导致内皮功能失调的关键性因素之一，与多种疾病密切相关，包括动脉粥样硬化、糖尿病、冠状动脉疾病、高血压和高胆固醇血症。目前，临床上针对炎症的治疗药物主要包括甾体类和非甾体类两种。然而这些药物不仅对人体健康产生一定影响，还需要较大的经济投入。鉴于对长时间使用这些药物的副作用的担忧，以食源性功能食品作为抗炎药物的替代品成为了研究热点，前景广阔。
玉米是世界三大粮食作物之一，玉米醇溶蛋白占其胚乳蛋白质的50％左右。与此同时，玉米醇溶蛋白也是玉米淀粉深加工的主要副产物。玉米蛋白的高比例的非极性氨基酸残基和碱性、酸性氨基酸的缺乏决定了玉米醇溶蛋白的不水溶特性，利用效率低，营养价值不全。采用蛋白酶对玉米醇溶蛋白进行酶解后获得各种生理活性肽是提高玉米蛋白的综合利用率的一个重要研究手段。大量研究表明，玉米醇溶蛋白多肽展现出了显著的抗氧化活性、降血压活性、保肝护肝和抗癌活性、提高机体免疫力以及加速酒精代谢作用等。早在1993年，日本学者Ariyoshi等发现从α-玉米醇溶蛋白酶解物中得到的三肽(Leu-Pro-Pro)具有显著的ACE抑制活性，是目前研究中发现的效果最好的降血压肽，效果与西药卡托普利相当(Ariyoshi Y Angiotensin-converting enzyme inhibitors derived from foodproteins[J].Trends in Food Science&Technology.1993，4:139-144.)。赵金兰用嗜热菌蛋白酶水解玉米渣粉(玉米淀粉提取淀粉后的副产物)，获得了具有ACE抑制活性的功能多肽混合物(赵金兰.用玉米渣生产降血压活性肽[J].食品与机械,1998(5):7-8)。Miyoshi等利用嗜热菌蛋白酶水解玉米醇溶蛋白得到具有能明显降低血压的由五个氨基酸组成的多肽，结构式为Pro-Pro-Val-His-Leu(Susumu Maruyama，Shinsuke Miyoshi，Takasumi Osa，Hideoki Tanaka.Prolyl endopeptidase inhibitory activity of peptides in therepeated sequence of various proline-rich proteins[J].Journal of Fermentationand Bioengineering.1992,74(3):145-148.)。何慧等研究了大豆蛋白和玉米蛋白酶解肽及其生理活性，所得到的活性肽具有较好的抗油脂氧化能力和抑制羟基自由基能力(何慧,谢笔钧,杨卓.大豆蛋白和玉米蛋白酶解肽及其活性研究[J].粮油食品科技,2002,10(1):14-16.)；李鸿梅用玉米蛋白粉和玉米醇溶蛋白为原料，用碱性蛋白酶制备得到了两种玉米肽，其主要分子量分布范围都是400-600道尔顿(Da)，并且都富含谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)和亮氨酸(Leu)，两种肽都具有相近的抗氧化活性，且能提高乙醇脱氢酶的活力(李鸿梅.玉米功能肽的制备及其生理活性的研究[D].吉林：吉林大学,2008.)。但是关于玉米多肽对血管内皮细胞的抗炎活性以及其相关的抗炎多肽的制备方法至今无人报道。
现阶段关于玉米醇溶蛋白功能活性肽的制备方法的研究，主要集中在蛋白酶的筛选、酶解工艺的优化和高活性肽的分离、纯化和鉴定等方法。如王梅和谷文英等研究了碱性蛋白酶水解玉米黄粉蛋白制备可溶性肽的反应过程，分析了酶解温度、pH、玉米黄粉蛋白浓度、酶浓度及前处理对水解的影响(王梅,谷文英.酶解玉米黄粉蛋白制备可溶性肽[J].粮油食品科技,1999,7(1):1-3.)；他们还用高效凝胶过滤色谱法测定了玉米蛋白酶解产物寡肽的分子量分布，并利用二极管阵列检测寡肽样品中芳香族氨基酸是否被去除(王梅，戴军.高效凝胶过滤色谱法测定玉米蛋白酶解物寡肽的分子量分布[J].食品与发酵工业,1998,24(5):25-27.)。郑冬梅与孔保华等对玉米蛋白水解条件进行了优化，并对玉米蛋白的酶解方法、玉米蛋白肽的功能特性、生理活性及其苦味的去除方法进行了详细的综述(郑冬梅,李升福,孔保华.玉米蛋白水解条件的优化研究[J].食品科学,2002,23(3):52-56，郑冬梅,孔保华,李升福.玉米蛋白及其水解肽的研究动态[J].食品与发酵工业,2002,28(11):55-59.)。专利“玉米蛋白高F值低聚肽的生产方法”(200510017037.6)：以玉米蛋白粉为原料，利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶生产具有保肝护肝功效的高F值低聚肽；专利“一种酶解玉米蛋白粉制备抗氧化肽的方法”(201510685117.2)以碱性蛋白酶酶解玉米蛋白粉制备抗氧化多肽等等也是对玉米醇溶蛋白制备功能肽的工艺开发。
然而口服生物活性肽必须经过胃肠道消化，小肠内皮细胞吸收后，以活性肽形式达到目标器官，才能发挥生理活性作用。胃肠道中含有大量的胃蛋白酶，胰酶，对生物活性肽在吸收之前进行二次酶解；小肠内皮细胞分泌产生细胞酶对途经多肽进一步的分解；与此同时，小肠内皮细胞对多肽的吸收具有多种途经，如转运蛋白介导、跨细胞被动扩散以及细胞旁路转运。把体内胃肠道消化吸收考虑进生物活性肽的制备方法已成必然。专利“从皱纹盘鲍鲍鱼内脏中分离的抗炎肽及其用途”(201510594885.7)，虽然模拟胃肠道消化方法制备抗炎肽，却忽略了小肠上皮细胞对其选择性吸收的影响。综上所述，目前关于玉米醇溶蛋白制备功能多肽的方法都忽略了胃肠道的消化吸收，并不能真实的模拟生物活性肽在胃肠道消化以及小肠内皮细胞对多肽的吸收。
发明内容
鉴于上述不足之处，本发明先采用超声预处理玉米醇溶蛋白，其次蛋白酶进行酶解制备玉米抗炎多肽，再通过模拟胃肠道消化追踪玉米抗炎多肽的活性，然后Caco-2细胞模拟小肠上皮细胞吸收后，表征出了经过胃肠道消化后，耐Caco-2细胞分解并被Caco-2细胞模拟小肠内壁吸收的高抗炎活性的玉米纯肽。
本发明的目的是首次利用玉米醇溶蛋白水解产物模拟人体胃肠道消化及Caco-2细胞吸收制备得到三种玉米醇溶蛋白抗炎多肽。
其氨基酸序列为：Ile-Ile-Gly-Gly-Ala-Lle；
Pro-Pro-Try-Leu-Ser-Pro；
Phe-Lle-Pro-Pro-Val-Thr-Ser-Met-Gly。
本发明的另一个目的是提供了利用超声预处理玉米醇溶蛋白，蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白制备功能多肽，模拟人体胃肠道消化及Caco-2细胞吸收制备得到玉米醇溶蛋白抗炎多肽的方法，按照下述步骤进行：
(1)超声预处理玉米醇溶蛋白：定量称取玉米醇溶蛋白，加入蒸馏水配置成1～5％(m/v)悬浊液，进行超声波处理；
(2)玉米醇溶蛋白酶解液制备：调节上述蛋白溶液pH 7.5～8.0，加入蛋白酶，酶与底物的比例为1:20～50(w/w)，均匀混合，酶解温度50～70℃，酶解时间2～4h；酶解结束后调节混合液pH为7.0，并在沸水浴中灭酶10min，离心获得上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末。
(3)模拟胃肠道消化：配置人工胃液。在37℃下，将将步骤(2)制备得到的玉米醇溶蛋白水解物与胃液以1:20～50混合，在震荡频率为120～180rpm条件下模拟胃消化2～4h。用NaOH调节pH为6.8，以1:100(w/v)加入胰酶至混合液，继续酶解4～6h；沸水浴灭酶10min，离心取上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末。
(4)Caco-2模拟小肠上皮细胞吸收：构建Caco-2细胞转运模型，将步骤(3)制备得到的玉米醇溶蛋白多肽消化产物配置成20mg/ml，加入到Caco-2细胞的绒毛面AP侧(apical，肠腔侧)，0.5～4h后，收集基底面BL侧(basolateral，肠内壁侧)转运的玉米醇溶蛋白肽，脱盐、冷冻干燥。
(5)采用UPLC-MC鉴定及分析多肽序列：对步骤(3)制备得到的玉米醇溶蛋白多肽消化产物、步骤(4)经过Caco-2细胞吸收的玉米多肽进行鉴定及多肽序列分析，筛选出离子强度强，并存的多肽；分析得到三种玉米醇溶蛋白抗炎多肽，其氨基酸序列为：Ile-Ile-Gly-Gly-Ala-Lle；
Pro-Pro-Try-Leu-Ser-Pro；
Phe-Lle-Pro-Pro-Val-Thr-Ser-Met-Gly。
(6)多肽的合成以及活性验证。
对步骤(5)鉴定得到的三种玉米醇溶蛋白抗炎多肽进行人工合成，并验证其抗炎活性，发现人工合成的多肽具有很强的抗炎活性。
其中步骤(1)所述的超声波处理工艺条件如下：超声处理，超声处理时间10-30min，间歇比10s/3s，温度25℃；超声波处理频率及频率组合为：单频：20kHz、28kHz、40kHz；双频：20/28kHz、20/40kHz、28/40kHz；三频：20/28/40kHz。
其中步骤(2)所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶或嗜热蛋白酶；优选嗜热蛋白酶。
其中步骤(5)中的玉米醇溶蛋白抗炎多肽优选Phe-Lle-Pro-Pro-Val-Thr-Ser-Met-Gly。
上述玉米醇溶蛋白抗炎多肽作为保健食品应用，经过公知方法的制造成胶囊或者片剂，作为抗炎的保健食品或者功能食品。
本发明的优势在于：
(1)本发明首次报道了一种新颖的用于分离鉴定出可以经过胃肠道消化、吸收的抗炎肽的方法；
(2)本发明首次鉴定出了3种经过胃肠道消化后，耐Caco-2细胞分解并被Caco-2细胞模拟小肠内壁吸收具有很强的抗炎活性玉米醇溶蛋白功能多肽；
(3)本发明首次结合模拟消化系统和Caco-2模拟小肠内壁吸收系统去追踪玉米抗炎多肽的活性变化；
(4)本发明首次研究了玉米多肽消化产物在Caco-2模拟小肠内壁吸收系统的吸收率；
(5)本发明首次报道了玉米醇溶蛋白水解产物对血管内皮细胞具有良好的抗炎活性。
附图说明
图1为本发明的技术路线；
图2为玉米醇溶蛋白多肽消化物在Caco-2模拟小肠吸收的0.5h,1.0h,2.0h和4.0h相对应的细胞穿透率；
图3为玉米醇溶蛋白多肽消化物能被Caco-2吸收的多肽以及未吸收的多肽对TNF-α诱导EA.hy926细胞的炎症因子的VCAM-1(A)和ICAM-1(B)蛋白表达的影响。
具体实施方式
一、实验方法：
1、水解度和蛋白转化率的测定
使用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法测定玉米醇溶蛋白的水解度。
水解度的测定采用pH-stat方法，水解度(DH)即蛋白质在酶解的过程中，断裂的肽键数占总蛋白质肽键数的百分比。
Figure BDA0001465341860000051
式中：V—NaOH消耗量(mL)；N—NaOH的摩尔浓度(mol/L)；α—玉米醇溶蛋白中α-NH2的平均解离度，试验条件下为0.99；M—水解蛋白的质量(g)；htot—单位质量蛋白质中肽键的数量(mmol/g)，对于不同的蛋白质htot为不同值，取经验值玉米醇溶蛋白的htot＝7.35mmol/g。
通过凯氏定氮法测定玉米蛋白和其水解产物的总氮量，计算玉米蛋白的转化率。蛋白转化率(％)＝水解物含氮量/底物蛋白氮含量*100％
2、细胞培养：
人结肠腺癌细胞系Caco-2(HTB-37TM)和内皮细胞系EA.hy926(CRL-2922TM)细胞购自美国菌种保藏中心，细胞用含10％胎牛血清的、1％非必需氨基酸、1％抗生素和2.5％HEPES缓冲液的DMEM培养液，在37℃，5％CO2的培养箱中培养。每周更换3次培养液。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理将细胞传代培养。
3、细胞毒性实验：
使用Alamar Blue试剂检测玉米多肽对细胞的毒性。将Caco-2细胞以1×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中24小时，细胞用不同浓度(10～50mg/ml)的玉米醇溶蛋白多肽再处理24小时。处理24小时后，弃去培养液，加入含有10％Alamar Blue试剂的培养液，并在37℃再培养4小时。在激发波长560nm和发射波长590nm下测量荧光强度。细胞活力表示为相比于未处理细胞的百分比。
4、抗炎活性实验：
通过蛋白印记法分析血管内皮细胞即EA.hy926细胞炎症因子细胞间黏附分子(ICAM-1)和血管细胞黏附分子(VCAM-1)的表达水平来检测抗炎效果。代数<12的EA.hy926细胞转接到48孔板中，密度达到80-90％后，用2.5mg/ml的水解产物和消化物，0.2mM和3.0mM的合成肽处理18h。然后加入TNF-α(10ng/mL)刺激细胞6h产生炎症。
移去细胞培养液，使用含有50μM二硫苏糖醇(还原剂)和0.2％Triton X-100煮沸的Laemmle缓冲液裂解细胞。然后将细胞裂解物在9％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上跑电泳。将细胞蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并用ICAM-1/VCAM-1抗体进行免疫印迹。用α-tubulin标准化ICAM-1和VCAM-1的含量。tubulin内参抗体的用量为0.4μg/mL，其他的用量为0.1μg/mL。蛋白条带用Licor Odyssey BioImager扫描，并通过使用ImageStudio Lite 5.2(Licor Biosciences，Lincoln，NB，USA)的光密度测定法进行定量。所有数据表示为相应阳性对照(单独用TNF-α处理的细胞)的百分比。
5、Caco-2模拟小肠内皮吸收率的测定：
收集Caco-2细胞的AP和BL表面的多肽，通过UPLC测定多肽的吸收率，反相C18柱(100mm×2.1mm id，1.7μm，Waters，Milford，MA，USA)上样15μL，流动相A(含1％TFA的纯水)，溶剂B(含1％TFA的乙腈)。洗脱条件：100-75％A，25min；75-50％A，25-35min；流速为0.3ml/min；检测波长为220nm。多肽的吸收率表示为相应时间点(0.5h、1h、2h和4h)对应的BL收集多肽的吸收峰占加入到AP表面的多肽(0h)的吸收峰的积分面积比。
6、UPLC-MS分析多肽的序列：
液相色谱分析柱为nanoACQUITY BEH130C18(75μmx150mm，1.7μm)，流动相A为含0.1％甲酸的乙腈，流动相B含0.1％甲酸的水洗脱梯度为：1-6％B，0-2min；6-25％B，2-25min；25-45％B，25-40min；45-75％B 40-45min；75-95％B，45-50min；95％B，50-55min。质谱采用电喷雾正离子模式采集数据，毛细管电压为3.5kV，离子源温度为100℃，扫描范围m/z为200-1000。用Mass Lynx软件(Micromass U.K.Ltd)分析肽的氨基酸序列。Peaks Viewer4.5(Bioinformatics Solutions Inc.，Waterloo，ON，Canada)与手动测序结合来处理MS/MS数据。通过Genscript Corp(Piscataway，NJ)合成鉴定的肽序列(>98％纯度)并用于抗炎测定。
实施例1
超声处理玉米醇溶蛋白：定量称取玉米醇溶蛋白，加入蒸馏水配置成1％(m/v)悬浊液，单频(40kHz)超声处理。超声处理时间30min，间歇比10s/3s，温度25℃。
玉米醇溶蛋白酶解液制备：调节上述蛋白溶液pH 8，加入碱性蛋白酶，酶与底物的比例为1:20(w/w)，均匀混合，酶解温度50℃，酶解时间2h。酶解结束后调节混合液pH为7.0，并在沸水浴中灭酶10min混合液在沸水浴中灭酶10min，离心获得上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末。测玉米醇溶蛋白的水解度，蛋白转化率，以及其水解产物对EA.hy926细胞的抗炎活性。
模拟胃肠道消化：根据美国药典(USP30-NF25)配置人工胃液。在37℃下，将玉米醇溶蛋白水解物与胃液以1:20混合，在震荡频率为120rpm条件下模拟胃消化4h。用NaOH调节pH为6.8，以1:100(w/v)加入胰酶至混合液，继续酶解6h。沸水浴灭酶10min，离心取上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末。测4h和10h后的消化产物对EA.hy926细胞的抗炎活性。
相比于传统酶解，单频超声预处理后，玉米醇溶蛋白的水解度由20.21％提高到了25.4％，蛋白转化率由60.21％提高到了79.08％(表1)。碱性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白所得玉米醇溶蛋白酶解液对血管内皮细胞具有良好的抗炎效果，对血管内皮细胞VCAM-1炎症因子表达产生了显著影响，相比于对照组的，其表达量为55.3％；模拟胃消化后，其酶解液的消化产物对血管内皮细胞仍然具有良好的抗炎效果，VCAM-1炎症因子表达量相比于对照组为49.6％；模拟肠消化后，最终消化产物对血管内皮细胞依然保持良好的抗炎效果，VCAM-1炎症因子表达量相比于对照组为52.6％(表2)。
实施例2
超声处理玉米醇溶蛋白：定量称取玉米醇溶蛋白，加入蒸馏水配置成2％(m/v)悬浊液，双频(20/28kHz)超声处理。超声处理时间20min，间歇比10s/3s，温度25℃。
玉米醇溶蛋白酶解液制备：调节上述蛋白溶液pH 7.5，加入中性蛋白酶，酶与底物的比例为1:30(w/w)，均匀混合，酶解温度55℃，酶解时间4h。酶解结束后调节混合液pH为7.0，并在沸水浴中灭酶10min，离心获得上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末。测玉米醇溶蛋白的水解度，蛋白转化率，以及其水解产物对EA.hy926细胞的抗炎活性。
模拟胃肠道消化：根据美国药典(USP30-NF25)配置人工胃液。在37℃下，将玉米醇溶蛋白水解物与胃液以1:30混合，在震荡频率为150rpm条件下模拟胃消化3h。用NaOH调节pH为6.8，以1:100(w/v)加入胰酶至混合液，继续酶解4h。沸水浴灭酶10min，离心取上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末。测4h和10h后的消化产物对EA.hy926细胞的抗炎活性。
相比于传统酶解，双频超声预处理后，玉米醇溶蛋白的水解度由10.11％提高到了15.9％，蛋白转化率由28.04％提高到了3％(表1)。碱性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白所得玉米醇溶蛋白酶解液对血管内皮细胞具有良好的抗炎效果，对血管内皮细胞VCAM-1炎症因子表达产生了显著影响，相比于对照组的，其表达量为57.2％；模拟胃消化后，其酶解液的消化产物对血管内皮细胞仍然具有良好的抗炎效果，VCAM-1炎症因子表达量相比于对照组为50.4％；模拟肠消化后，最终消化产物对血管内皮细胞依然保持良好的抗炎效果，VCAM-1炎症因子表达量相比于对照组为60.8％(表2)。
实施例3
超声处理玉米醇溶蛋白：定量称取玉米醇溶蛋白，加入蒸馏水配置成5％(m/v)悬浊液，三频(20/28/40kHz)超声处理。超声处理时间10min，间歇比10s/3s，温度25℃。
玉米醇溶蛋白酶解液制备：调节上述蛋白溶液pH 8，加入嗜热蛋白酶，酶与底物的比例为1:50(w/w)，均匀混合，酶解温度70℃，酶解时间2h。酶解结束后调节混合液pH为7.0，并在沸水浴中灭酶10min，离心获得上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末，测其水解度，蛋白转化率，以及对EA.hy926细胞的抗炎活性。
模拟胃肠道消化：根据美国药典(USP30-NF25)配置人工胃液。在37℃下，将玉米醇溶蛋白水解物与胃液以1:50混合，在震荡频率为180rpm条件下模拟胃消化2h。用NaOH调节pH为6.8，以1:100(w/v)加入胰酶至混合液，继续酶解4h。沸水浴灭酶10min，离心取上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末。测4h和10后的消化产物对EA.hy926细胞的抗炎活性。
相比于传统酶解，三频超声预处理后，玉米醇溶蛋白的水解度由25.43％提高到了30.36％，蛋白转化率由79.19％提高到了84.02％(表1)。碱性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白所得玉米醇溶蛋白酶解液对血管内皮细胞具有良好的抗炎效果，对血管内皮细胞VCAM-1炎症因子表达产生了显著影响，相比于对照组的，其表达量为34.0％；模拟胃消化后，其酶解液的消化产物对血管内皮细胞仍然具有良好的抗炎效果，VCAM-1炎症因子表达量相比于对照组为46.7％；模拟肠消化后，最终消化产物对血管内皮细胞依然保持良好的抗炎效果，VCAM-1炎症因子表达量相比于对照组为49.1％(表2)。
表1.超声预处理对不同酶酶解玉米醇溶蛋白的水解度、蛋白转化率的影响
Figure BDA0001465341860000101
表2.不同玉米醇溶蛋白水解产物在模拟胃肠道消化前、消化中、消化结束后对TNF-α诱导EA.hy926细胞的炎症因子ICAM-1,VCAM-1表达
Figure BDA0001465341860000102
实施例4选择实施例3的消化产物多肽进行Caco-2模拟小肠内皮细胞吸收：
检测玉米多肽对Caco-2的细胞毒性。进行Caco-2模拟小肠内皮细胞吸收模型的建立：Caco-2细胞以2×105cells/mL接种于12孔Transwell板的滤膜上，隔天换一次培养液，21天后测定Caco-2细胞模型的评价指标：上皮细胞电阻，碱性磷酸酶活力，荧光素钠渗漏实验。实验开始前用HBSS缓冲液清洗Caco-2细胞，在绒毛面AP侧加入由HBSS缓冲液配制的玉米醇溶蛋白多肽0.5ml,浓度为20mg/mL，在BL侧加入HBSS缓冲液1.5mL，置于37℃，5％CO2培养箱中转运4h，在0.5h、1h、2h从BL侧吸取0.2ml转运的玉米醇溶蛋白多肽检测玉米多肽的Caco-2细胞的吸收率。在Caco-2模拟小肠内皮细胞吸收4h的时候收集所有的AP侧(apical，肠腔侧)和BL侧(basolateral，肠内壁侧)的多肽分别测定其对EA.hy926的抗炎活性；并且采用UPLC-MC分析肽序：对玉米醇溶蛋白多肽消化产物以及经过Caco-2细胞吸收的多肽进行多肽序列分析，筛选出离子强度强，在吸收过程中未被分解的多肽；并且对这些多肽进行合成，验证合成的多肽的抗炎活性。
表3显示加入玉米醇溶蛋白多肽后，Caco-2细胞的活力不仅没有下降，反而有所上升，该结果表明了玉米醇溶蛋白多肽对Caco-2细胞没有任何毒性；玉米水解产物的模拟消化后所得多肽经过Caco-2细胞的吸收，随着转运时间的延长，其多肽的转运率也随着增加，在4h结束转运的时候，其转运率达到了1.38％，表明了Caco-2细胞对多肽具有选择性的吸收(图1)；玉米醇溶蛋白多肽经过Caco-2模拟小肠内皮细胞吸收后，其BL侧的多肽对血管内皮细胞的抗炎效果大幅度提高，其VCAM-1炎症因子表达量相比于对照组为29.13％，和AP侧的多肽相比，其表达量降低了19.97％；于此同时，其ICAM-1的表达量相比于对照组为54.93％，然而，对于玉米醇溶蛋白酶解物、模拟消化后的产物以及AP侧的多肽对VCAM-1表达量相比于对照组几乎没有影响(表2)。上述结果表明了玉米醇溶蛋白多肽经过Caco-2模拟小肠内皮细胞吸收后，其抗炎活性大幅度提高，间接表明了吸收的多肽具有很好的抗炎活性(图2)。对玉米醇溶蛋白多肽消化产物以及经过Caco-2细胞吸收的多肽的结构进行鉴定、分析，筛选出离子强度强，在吸收过程中未被分解的三种多肽，其结构为Pro-Pro-Try-Leu-Ser-Pro、Phe-Lle-Pro-Pro-Val-Thr-Ser-Met-Gly、Phe-Lle-Pro-Pro-Val-Thr-Ser-Met-Gly。三种多肽都对血管内皮细胞具有良好的抗炎活性，在低浓度0.2mM的时候,其对VCAM-1炎症因子的表达量相比于对照组分别为52.2％、46.0％、61.1％；其对ICAM-1炎症因子的表达量相比于对照组分别为69.5％、63.5％、57.4％(表4)。
表3.玉米醇溶蛋白多肽(嗜热蛋白酶酶解)消化产物对Caco-2细胞的活力影响
多肽浓度(mg/ml) Caco-2细胞活力
对照 - 100
组1 5 125.8±4.7
组2 10 124.3±9.0
组3 20 110.2±10.8
组4 50 106.5±8.0
表4.不同玉米醇溶蛋白水解产物在模拟胃肠道消化前、消化中、消化结束后对TNF-α诱导EA.hy926细胞的炎症因子ICAM-1,VCAM-1表达
Figure BDA0001465341860000121

Claims (3)

1.玉米醇溶蛋白抗炎多肽，其特征在于其氨基酸序列为：
Phe-Leu-Pro-Pro-Val-Thr-Ser-Met-Gly。
2.一种玉米醇溶蛋白抗炎多肽的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(1)超声预处理玉米醇溶蛋白：定量称取玉米醇溶蛋白，加入蒸馏水配置成1～5％(m/v)悬浊液，进行超声波处理；
(2)玉米醇溶蛋白酶解物制备：调节上述蛋白溶液pH 7.5～8.0，加入蛋白酶，酶与底物的比例为1:20～50(w/w)，均匀混合，酶解温度50～70℃，酶解时间2～4h；酶解结束后调节混合液pH为7.0，并在沸水浴中灭酶10min，离心获得上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末；所述的蛋白酶为嗜热蛋白酶；
(3)模拟胃肠道消化：配制人工胃液；在37℃下，将步骤(2)制备得到的玉米醇溶蛋白酶解物与人工胃液以1:20～50混合，在震荡频率为120～180rpm条件下模拟胃消化2～4h；用NaOH调节pH为6.8，以1:100(w/v)加入胰酶至混合液，继续酶解4～6h；沸水浴灭酶10min，离心取上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末；
(4)Caco-2模拟小肠上皮细胞吸收：构建Caco-2细胞转运模型，将步骤(3)制备得到的玉米醇溶蛋白多肽消化产物配制成20mg/ml，加入到Caco-2细胞的绒毛面肠腔侧，0.5～4h后，收集基底面肠内壁侧转运的玉米醇溶蛋白肽，脱盐、冷冻干燥；
(5)采用UPLC-MC鉴定及分析多肽序列：对步骤(3)制备得到的玉米醇溶蛋白多肽消化产物、步骤(4)经过Caco-2细胞吸收的玉米多肽进行鉴定及多肽序列分析，筛选出离子强度强，在吸收过程中未被分解的多肽；分析得到玉米醇溶蛋白抗炎多肽，其氨基酸序列为：Phe-Leu-Pro-Pro-Val-Thr-Ser-Met-Gly；
(6)多肽的合成以及活性验证
对步骤(5)鉴定得到的玉米醇溶蛋白抗炎多肽进行人工合成，并验证其抗炎活性。
3.根据权利要求2所述的一种玉米醇溶蛋白抗炎多肽的制备方法，其特征在于其中步骤(1)所述的超声波处理工艺条件如下：扫频超声处理，超声处理时间10-30min，间歇比10s/3s，温度25℃；超声波处理频率及频率组合为：单频：20kHz、28kHz、40kHz之一；或者双频：20/28kHz、20/40kHz、28/40kHz之一；或者三频：20/28/40kHz。
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