CN107865446A

CN107865446A - 微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维

Info

Publication number: CN107865446A
Application number: CN201711010660.8A
Authority: CN
Inventors: 何怡江
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2018-04-03

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维，选用除杂晾晒后的苜蓿草，包括如下步骤：米曲霉菌株活化、扩大培养；制备营养盐溶液；称取2～5g粉碎后过50目筛的苜蓿草放入容器中，加入营养盐溶液，密封容器后进行灭菌处理，然后冷却至室温；于无菌条件下，按照13.5～14.5％的接种量，向上述容器中接入米曲霉菌，将容器再次密封后发酵培养；发酵后苜蓿草再次灭菌后，加水混匀，水浴，过滤，滤液浓缩；在浓缩液中加入无水乙醇或质量浓度≥95％的乙醇溶液，3～5℃静置10～14h，离心，将所得沉淀干燥后得苜蓿草水溶性膳食纤维。

Description

微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维

技术领域

本发明涉及一种苜蓿草水溶性膳食纤维的提取方法。

背景技术

膳食纤维(dietary fiber，DF)是指不易被人体消化吸收的“以多糖为主的大分子物质的总称”，按其溶解性能分为水溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)和水不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)。SDF可以作为食品添加剂应用于烘烤食品、饮料、乳制品、肉制品及冰淇淋等食品中，另外在预防结肠癌、心血管疾病和降低胆固醇等方面具有比IDF更强的生理功能。

目前国内外提取膳食纤维的方法主要有物理提取法(微波、超声波)、化学提取法、酶提取法、化学—酶结合提取法、膜分离法和发酵法等。其中，化学法污染大，损失多，得率低；酶提取法虽然作用条件温和，有利于环境保护，但成本高，不利于工业化生产；微生物发酵法虽然时间周期相对较长，但是操作方便、成本较低、产品性能较好，然而用微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维并未见文献记载。

硕士论文《沙棘水溶性膳食纤维固体发酵法制备的研究》告知了如下工艺流程：称取10g粉碎后过50目筛的沙棘粕于200mL三角瓶中，加入适量水后用封口膜封口，121℃灭菌20min后冷却至室温，接入孢子浓度为10⁶-10⁷个/mL的菌株(里氏木霉菌株)，置于适当条件下培养发酵，将发酵好的沙棘粕再次灭菌后烘干，并粉碎过50目，称取5g烘干粉碎的沙棘粕发酵粉末，按照料液比1：20与水混匀，60℃水浴提取水溶性膳食纤维30min，12000r/min离心10min取上清，95％乙醇4℃沉淀过夜，12000r/min离心10min后烘干称重，计算沙棘水溶性膳食纤维提取率。该方法所使用的菌株所产生的酶的种类和酶活并不清楚，醇沉之前没有浓缩会导致乙醇使用量加大，所以该方法存在资源消耗大的技术缺陷。

随着人们对健康的不断关注，水溶性膳食纤维类新食品将拥有广阔的消费市场，膳食纤维的开发和利用迫在眉睫，因此，对SDF的提取纯化方法进行研究将具有重要的现实意义和广阔的市场前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种过程简便、成本低廉、环保安全且易于实现工业化生产的提取苜蓿草水溶性膳食纤维的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维(即，苜蓿草水溶性膳食纤维的提取方法)，选用除杂晾晒后的苜蓿草(含水率≤10％)，包括如下步骤：

1)、米曲霉菌株活化、扩大培养，直至孢子浓度为10⁶～10⁷CFU/mL；

2)、营养盐溶液的制备：称取0.9～1.1g KH₂PO₄、2.4～2.6g NaCl、0.4～0.6gMgSO₄·7H₂O、0.9～1.1g(NH₄)₂SO₄、0.4～0.6g CaCl₂，用水定容至1L，调节pH至6.8～7.2；

3)、称取2～5g粉碎后过50目筛的苜蓿草放入容器中，按照1～5ml/g的加液量加入步骤2)所得的营养盐溶液，密封容器后进行灭菌处理，然后冷却至室温；

4)、于无菌条件下，按照13.5～14.5％(体积％)的接种量，向上述容器(完成步骤3)后的容器)中接入步骤1)培养的米曲霉菌，将容器再次密封后置于26～32℃恒温振荡培养箱中发酵培养3～10d；

5)、将步骤4)所得的发酵后苜蓿草再次灭菌后，加水混匀，60～95℃水浴90～120min，过滤，滤液浓缩至原体积的30％～40％；

步骤3)的苜蓿草与所述水的料液比1g/5～30ml(较佳为1g/15ml)；

6)、在步骤5)得到的浓缩液中加入浓缩液3～5体积倍(较佳为4体积倍)的无水乙醇或质量浓度≥95％的乙醇溶液，3～5℃(4℃)静置10～14h(过夜)，离心，将所得沉淀干燥后得苜蓿草水溶性膳食纤维。

作为本发明的微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维的改进，步骤5)中的滤液浓缩为：滤液真空旋转蒸发(0.1MPa的真空度、45℃的蒸发温度)至原体积30％～40％(例如为三分之一)。

作为本发明的微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维的进一步改进，所述营养盐溶液为：称取1g KH₂PO₄、2.5g NaCl、0.5g MgSO₄·7H₂O、1g(NH₄)₂SO₄、0.5g CaCl₂，定容至1L，调节pH至7.0。

作为本发明的微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维的进一步改进，所述步骤3)中的加液量为3ml/g。

在本发明步骤3)和步骤5)的灭菌均指：121℃灭菌20min。

本发明在发明过程中，步骤4)的接种量按照4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％进行实验对比，发现14％效果最佳；步骤5)的料液比(g/ml)按照1:5、1:10、1：15、1:20、1:25、1:30进行实验对比，发现1g/15ml的料液比效果最佳。

本发明具有如下技术优势：

1、选取的米曲霉经发酵后可以产生多种酶，例如脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，酶活相对较高，提高苜蓿草SDF的提取率；

2、生产过程简便、成本低廉；

3、提取的水溶性膳食纤维感官品质和理化特性更好；

4、很好地利用了苜蓿草弃用粗茎，减少资源浪费。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为发酵制备的苜蓿草SDF红外光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、一种苜蓿草水溶性膳食纤维的提取方法，依次进行如下步骤：

1)、米曲霉菌株活化、扩大培养：

米曲霉菌株可选用BNCC菌种库的编号为63501-2a19米曲霉菌株；

菌种活化：称取16.6g霉菌液体培养基(广东环凯微生物科技有限公司，型号021070)，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至培养基完全溶解，分装锥形瓶，121℃高压灭菌20min，得液体培养基。

于无菌条件下，用移液枪吸取0.2mL菌体悬浮液，加至装有50mL液体培养基的锥形瓶中，30℃培养箱中培养2～3d。扩大培养：用移液枪吸取1mL活化的菌体悬浮液，加至装有50mL液体培养基的锥形瓶中，30℃培养箱中培养(培养时间约为3～4d)，直至得孢子浓度为10⁷CFU/mL的米曲霉菌株培养液。

2)、营养盐溶液的制备：称取1g KH₂PO₄、2.5g NaCl、0.5g MgSO₄·7H₂O、1g(NH₄)₂SO₄、0.5g CaCl₂，用水定容至1L，再调节pH至7.0。

3)、苜蓿草除杂后晾晒至含水率≤10％(质量％)，然后粉碎后过50目筛，得苜蓿草粉；

称取5g苜蓿草粉于200mL三角瓶中，按照3ml/g的加液量加入适量步骤2)所得的营养盐溶液后用牛皮纸和纱布封口，121℃灭菌20min后冷却至室温。

4)、于无菌条件下，按照14％(体积％)的接种量向步骤3)中的三角瓶中接入步骤1)培养的米曲霉菌(孢子浓度为10⁷个/mL)，置于28～32℃恒温振荡培养箱中发酵培养6d；振荡频率200～300r/min。

5)、将步骤4)中发酵好的苜蓿草再次于121℃灭菌20min后，加入75ml的水混匀(即，料液比1g/15ml)，95℃水浴120min，用纱布过滤，保留滤液，经真空旋转蒸发(0.1MPa的真空度、45℃的蒸发温度)浓缩至原滤液体积的三分之一；

6)、在步骤5)得到的浓缩液中加入浓缩液4倍体积的无水乙醇(或≥95％的乙醇)，4℃静置过夜(约12h)，离心(3000r/min的转速下离心10分钟)得沉淀，将沉淀冷冻干燥(-30℃的冷冻温度下干燥24h)后，即为苜蓿草水溶性膳食纤维，得率为13.63％。

实验一、对所得的苜蓿草水溶性膳食纤维进行红外光谱分析，如图1所示，苜蓿草水溶性膳食纤维具有多糖类物质的特征反应和结构组成，为典型的多糖类物质。实施例1所得的苜蓿草水溶性膳食纤维的得率为13.63％，易复溶，可形成胶凝状。

对比例1、将实施例1中的步骤4)中的接种量由14％改成8％，其余等同于实施例1。苜蓿草水溶性膳食纤维的得率为9.16％。

对比例2、将实施例1中的步骤4)中的接种量由14％改成10％，其余等同于实施例1。苜蓿草水溶性膳食纤维的得率为8.65％。

对比例3、将实施例1中的步骤4)中的接种量由14％改成18％，其余等同于实施例1。苜蓿草水溶性膳食纤维的得率为8.70％。

对比例4、将实施例1中的步骤4)中的发酵培养天数由6d改成4d，其余等同于实施例1。苜蓿草水溶性膳食纤维的得率为10.89％。

对比例5、将实施例1中的步骤4)中的发酵培养天数由6d改成8d，其余等同于实施例1。苜蓿草水溶性膳食纤维的得率为10.76％。

对比例6、将实施例1步骤4)中的米曲霉菌改成里氏木霉菌，菌液的浓度不变，接种量不变，其余等同于实施例1。苜蓿草水溶性膳食纤维的得率为11.36％。

对比例7-1、将实施例1步骤4)中的米曲霉菌改成黑曲霉，菌液的浓度不变，接种量不变，其余等同于实施例1。苜蓿草水溶性膳食纤维的得率为10.88％。

对比例7-2、将实施例1步骤4)中的米曲霉菌改成红曲霉，菌液的浓度不变，接种量不变，其余等同于实施例1。苜蓿草水溶性膳食纤维的得率为11.02％。

对比例7-3、将实施例1步骤4)中的米曲霉菌改成绿色木霉，菌液的浓度不变，接种量不变，其余等同于实施例1。苜蓿草水溶性膳食纤维的得率为10.89％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维，其特征是：选用除杂晾晒后的苜蓿草，包括如下步骤：

2)、营养盐溶液的制备：称取0.9～1.1g KH₂PO₄、2.4～2.6g NaCl、0.4～0.6g MgSO₄·7H₂O、0.9～1.1g(NH₄)₂SO₄、0.4～0.6g CaCl₂，用水定容至1L，调节pH至6.8～7.2；

4)、于无菌条件下，按照13.5～14.5％的接种量，向上述容器中接入步骤1)培养的米曲霉菌，将容器再次密封后置于26～32℃恒温振荡培养箱中发酵培养3～10d；

步骤3)的苜蓿草与所述水的料液比1g/5～30ml；

6)、在步骤5)得到的浓缩液中加入浓缩液3～5体积倍的无水乙醇或质量浓度≥95％的乙醇溶液，3～5℃静置10～14h，离心，将所得沉淀干燥后得苜蓿草水溶性膳食纤维。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维，其特征是：

所述步骤5)中的滤液浓缩为：滤液真空旋转蒸发至原体积30％～40％。

3.根据权利要求1或2所述的微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维，其特征是：

所述营养盐溶液为：称取1g KH₂PO₄、2.5g NaCl、0.5g MgSO₄·7H₂O、1g(NH₄)₂SO₄、0.5gCaCl₂，定容至1L，调节pH至7.0。

4.根据权利要求1或2所述的微生物发酵法提取苜蓿草水溶性膳食纤维，其特征是：

所述步骤3)中的加液量为3ml/g。