CN107860905B - 对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物的测定方法及应用 - Google Patents

对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物的测定方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物的测定方法及应用，方法包括：步骤1，确定诱集源：以接种青霉菌的苹果为诱集源；步骤2，捕集挥发物：对接种青霉菌的苹果挥发物进行顶空捕集与洗脱；步骤3，鉴定挥发物：用气相色谱‑质谱联用仪对捕集的挥发物鉴定，确定需筛选的化合物；步骤4，测定EAG电生理反应，获取测定数据；步骤5，测定Y型嗅觉仪行为反应，计算选择百分率；步骤6，对获取的数据进行分析，测出对桃蛀螟成虫引诱作用最强挥发性活性化合物为异戊醇。该方法能准确测定哪种挥发性活性化合物对桃蛀螟具有较好的引诱作用，为制作具有较好引诱效果的桃蛀螟引诱剂提供了准确依据，为治理桃蛀螟虫害提供有力保障。

Description

对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物的测定方法及 应用
技术领域
本发明涉及桃蛀螟的引诱剂制备领域，特别是涉及一种对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物的测定方法及应用。
背景技术
桃蛀螟Conogethes punctiferalis(Guenée)隶属于鳞翅目、螟蛾科，是一种杂食性、钻蛀性害虫。目前已报道的寄主植物包括板栗、桃、玉米等40多种果树、林木和农作物，由于其幼虫孵化后很快蛀入果实内部取食为害，致使幼虫期防治十分困难。有关成虫的防治措施多采用性诱剂和灯光诱杀，而性诱剂只对雄蛾有效，若雄蛾在诱杀之前已完成交配，对压低下一代虫口基数的作用就会大打折扣。因此，探索和利用对雌蛾和雄蛾均具有引诱作用的挥发性活性物质来诱杀桃蛀螟这类钻蛀性害虫的新技术和新策略已成为近年来国内外学者关注的焦点，但在众多的挥发性化合物中，哪些化合物对桃蛀螟具有较好的引诱作用呢？如何测定、并鉴定该挥发性活性化合物的种类是需要解决的问题。
发明内容
基于现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物的测定方法及应用，能准确测定对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物，为有效诱杀桃蛀螟提供准确依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明实施方式提供一种对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物的测定方法，包括：
步骤1，诱集源的确定：
以对桃蛀螟具有显著引诱作用的接种青霉菌的苹果作为诱集源；
步骤2，挥发物的捕集：
对接种青霉菌的苹果培养6天后进行挥发物顶空捕集与洗脱提取；
步骤3，挥发物的鉴定：
采用气相色谱-质谱联用仪对所述步骤2捕集的挥发物进行鉴定，从中确定需要筛选的挥发性活性化合物；
步骤4，EAG电生理反应测定：
取已交配桃蛀螟雌蛾，分别测定其对筛选出的各挥发性活性化合物的EAG电生理反应，获取相关测定数据；
步骤5，Y型嗅觉仪行为反应测定：
将预先准备好的待测桃蛀螟雌蛾逐头引入Y型嗅觉仪出气端直管内，分别将筛选出的各挥发性活性化合物的气味吹送到所述待测桃蛀螟雌蛾位置，根据记录的所述待测桃蛀螟雌蛾行为数据，计算选择百分率；
步骤6，对所述步骤4、5获取的数据进行分析，测定出对桃蛀螟成虫引诱作用最强的挥发性活性化合物为异戊醇。
本发明实施方式还提供一种挥发性活性化合物异戊醇作为桃蛀螟的引诱剂的应用。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物的测定方法，其有益效果为：
由于确定接种青霉菌的苹果具有较强的诱集作用，因此，以接种青霉菌的苹果作为诱集源，通过对接种青霉菌的苹果挥发物进行顶空捕集与洗脱提取，确定需要筛选的能引诱桃蛀螟的挥发性活性化合物，再通过测定EAG电生理反应和Y型嗅觉仪行为反应等步骤配合，获取相关数据，最后经数据分析，从接种青霉菌的苹果所释放的众多挥发物中，筛选出对桃蛀螟成虫引诱作用最强的挥发性活性化合物为异戊醇，即3-methyl-1-butanol。该方法能准确测定出哪种挥发性活性化合物对桃蛀螟具有较好的引诱作用，为筛选具有较好引诱效果的桃蛀螟引诱剂提供了准确依据，为治理桃蛀螟虫害提供有力保证。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为本发明实施例提供的测定方法中桃蛀螟在接种青霉菌的PDA培养基(PP)、无损伤苹果(IA)、机械损伤苹果(MA)和接种青霉菌的苹果(PA)间的产卵选择对比图；
图2a为本发明实施例提供的测定方法中未交配桃蛀螟雌蛾对四个处理的四臂嗅觉仪行为反应对比图；
图2b为本发明实施例提供的测定方法中已交配桃蛀螟雌蛾对四个处理的四臂嗅觉仪行为反应对比图；
图1、2a、2b中，PP表示接种青霉菌的PDA培养基；IA表示无损伤苹果；MA表示机械损伤苹果；PA表示接种青霉菌的苹果；
图3为本发明实施例提供的测定方法涉及的四种处理的挥发性气味化合物总离子流色谱对比图；
图4为本发明实施例提供的测定方法中已交桃蛀螟雌蛾对不同浓度样品的EAG行为反应测定结果；
图5为本发明实施例提供的测定方法中已交配桃蛀螟雌蛾对不同浓度样品的四臂嗅觉仪行为反应测定结果；
图6为本发明实施例提供的测定方法中，以石蜡油为对照，桃蛀螟雌蛾对12种化合物的Y型嗅觉仪行为选择对比图；
图4、5中：(1)2-甲基丁酸甲酯，即methyl 2-methylbutyrate；(2)异戊醇，即3-methyl-1-butanol,；(3)2-甲基丁酸乙酯，即ethyl-2-methylbutyrate；(4)2-甲基丁基乙酸酯，即2-methybutyl acetate；(5)苯乙烯，即styrene；(6)己酸甲酯，即methylcaproate；(7)己酸乙酯，即ethyl caproate；(8)乙酸己酯，即hexyl acetate；(9)2-甲基丁酸己酯，即hexyl 2-methylbutyrate；(10)辛酸正丁酯，即butyl caprylate；(11)正十四烷，即n-tetradecane；(12)α-法呢烯，即α-farnesene。
具体实施方式
下面结合本发明的具体内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明实施例提供一种对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物的筛选与测定方法，包括：
步骤1，诱集源的确定：
以对桃蛀螟具有显著引诱作用的接种青霉菌的苹果作为诱集源；
具体的，将无损伤苹果进行表面消毒，消毒方式为：用质量浓度75％的酒精浸泡1min，用质量浓度1％的次氯酸钠溶液浸泡3min，用无菌水冲洗3次，晾干后于无菌条件下用灭菌打孔器在消毒后的苹果肩部的两个对称位置各打一直径为7mm的圆孔，将两块直径为7mm的青霉菌片覆在苹果上的圆孔处进行接种，随后用蘸有无菌水的灭菌脱脂棉进行覆盖保湿；接种青霉菌后的苹果放入预先消毒的塑料保鲜盒内，加入无菌水保湿，保鲜盒置于30℃恒温生化培养箱内，培养6天后即可作为桃蛀螟诱集源使用。
在桃蛀螟饲养过程中，发现其更喜欢聚在长霉菌的饲料周围或喜欢在感染霉菌的苹果上产卵，经鉴定，该霉菌为青霉菌。因此，对该菌(青霉菌)进行了分离、纯化，并将其接种到苹果上(接种青霉菌的苹果，PA)，以无损伤苹果(IA)、机械损伤苹果(MA)和青霉菌片(PP)为对照，通过产卵选择实验和四臂嗅觉仪行为反应测定，进一步验证桃蛀螟是否更喜欢接种青霉菌的苹果，从而确定，以接种青霉菌的苹果作为诱集源。
步骤2，挥发物捕集：
对接种青霉菌的苹果培养6天后进行挥发物顶空捕集与洗脱提取；
步骤3，挥发物鉴定：
采用气相色谱-质谱联用仪对所述步骤2捕集的挥发物进行鉴定，从中确定需要筛选的挥发性活性化合物；
步骤4，EAG电生理反应测定：
取已交配桃蛀螟雌蛾，分别测定其对筛选出的各挥发性活性化合物的EAG电生理反应，获取相关测定数据；
步骤5，Y型嗅觉仪行为反应测定：
将预先准备好的待测桃蛀螟雌蛾逐头引入Y型嗅觉仪出气端直管内，分别将筛选出的各挥发性活性化合物的气味吹送到所述待测桃蛀螟雌蛾位置，根据记录的所述待测桃蛀螟雌蛾行为数据，计算选择百分率；
步骤6，对所述步骤4、5获取的数据进行分析，测定出对桃蛀螟成虫引诱作用最强的挥发性活性化合物为异戊醇(即3-methyl-1-butanol)。
上述测定方法的步骤1中，对桃蛀螟具有显著引诱作用的诱集源的确定过程如下：
实验材料的选取：
(1)无损苹果：选用成熟度适中、大小一致(果实直径6～8cm)、无伤病的红富士苹果，将苹果表面消毒(75％酒精浸泡1min，用1％次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗3次)备用。
(2)接种青霉菌的苹果：将健康的苹果进行表面消毒(同上)；晾干后于无菌条件下用灭菌打孔器在苹果肩部的两个对称位置各打一直径为7mm的圆孔，将2块直径约为7mm的青霉菌片覆在圆孔处进行接种，随后用蘸有无菌水的灭菌脱脂棉进行覆盖保湿。接种后的青霉苹果放入预先消毒的塑料保鲜盒(24.5cm×17.8cm×12cm，亿星HF0421型3.6L长方形保鲜盒)内，加入无菌水保湿，保鲜盒置于30℃恒温生化培养箱内，培养6d后备用。
(3)机械损伤苹果：方法同青霉苹果的接种处理方法，所不同的是将青霉菌片换成灭菌的PDA培养基片进行接种即可。
(4)青霉菌片：用灭菌打孔器在青霉菌平板上打孔(直径6-8cm)备用。
产卵选择实验：取新羽化的桃蛀螟雌、雄蛾各5头置于养虫笼内饲养，将上述4个处理的实验材料的外面分别包一层纱布随机置于笼内四角，供桃蛀螟产卵。同时以6～8％的蜂蜜水饲喂成虫，试验重复5次。每天中午12:00观察、记录产卵情况，直至笼内成虫全部死亡。
四臂嗅觉仪行为测试：四臂嗅觉仪是用玻璃制成的“十”字型管，两臂之间的夹角为45度，中部顶端拉伸成管状。四臂均由两节玻璃管嵌套而成，玻璃管之间以磨砂口连接以加强密封效果；其中，靠近基部的主臂长10cm，内径2.5～3.0cm，短臂长10cm，端部以磨砂口与玻璃帽相连以达到密封效果；玻璃帽长约6cm，底部内径2cm，细长的顶部内径约5～6mm，用于连接胶皮管。
具体测试过程为：空气由大气采样仪(QC-1S，北京市劳动保护科学研究所)抽出后进入蒸馏水瓶和活性碳过滤瓶以湿润和净化，之后气体沿着Teflon管进入装有相应气味源的火鸡袋(Reynolds Co,482mm×596mm)底部，袋口另一端接气体流量计(LZM-6T，广州蓝林机电设备有限公司)，出气端气体流量控制在300mL/min，随后气体沿着玻璃帽顶端依次进入四臂嗅觉仪的短臂、长臂内，最后由中部顶端的玻璃管送出，不同部件间用洁净的胶皮管无缝连接。四臂所连接的火鸡袋内分别放置2个已培养6d的接种青霉菌的苹果、机械损伤苹果、无损伤苹果及4块青霉菌菌片。每次实验不同处理随机摆放位置。实验过程中，在四臂嗅觉仪的正下方放置红色光源(15W)作为照明光源。
实验于黑暗条件下(18:00-23:00)进行，每次实验前先打开实验室窗户换气4～5h。测试前，先打开大气采样仪，使干净空气通过测试装置，以便祛除一些可能存在的杂质气味。已用的玻璃装置用洗涤灵(北京金鱼科技股份有限公司)清洗并高温烘干备用。四臂嗅觉仪和吸附剂过滤管在使用前先在170℃电热鼓风干燥箱(DHG-9070A型，上海一恒科学仪器有限公司)中干燥活化2h，以消除味源残留。
将备好的雌蛾逐头引入四臂嗅觉仪中部出气端直管内，随着不同处理的气味被吹送到成虫位置，观察其行为选择。每次送入雌蛾1头，当雌蛾爬过短臂的1/3处并持续30s以上视为选择，2min内无反应则记为不选择。试验共测试未交配雌蛾241头，已交配雌蛾211头。
上述测定方法的步骤2中，对接种青霉菌的苹果挥发物进行顶空捕集与洗脱，具体过程为：
空气由所述大气采样仪抽出并监测气体流量为450～600mL/min后依次进入蒸馏水瓶和活性碳过滤瓶，之后气体沿着Teflon管进入装有接种青霉菌的苹果的火鸡袋底部，火鸡袋袋口另一端接入装有吸附剂的玻璃管，所述吸附剂在使用前先在170℃下活化2h，然后用甲醇、无水乙醚和色谱纯正已烷各3mL淋洗、吹干，所述吸附剂过滤管中的吸附剂将挥发物捕集后，剩余气体再通过一个气体流量计于出气端排出，并通过该气体流量计监测出气端气体流量为350～450mL/min；不同部件间用洁净的胶皮管进行无缝连接；
按上述方式持续抽提4h；
捕集结束后用350μL色谱纯正已烷洗脱被吸附剂吸附的挥发物于色谱瓶中，然后吸取200uL洗脱液置于另一色谱瓶中，并向其中加入浓度为1.28mg/μL的乙酸正壬酯1uL作为内标，用漩涡仪充分震荡摇匀后于-18℃冷藏(冷藏柜，FC-175AZ型，合肥美菱股份有限公司)，即完成挥发物的捕集与洗脱。
上述测定方法的步骤3中，采用气相色谱-质谱联用仪对步骤2捕集的挥发物进行鉴定，从中确定需要筛选的挥发性活性化合物，具体过程为：
采用气相色谱-质谱联用仪，按如下条件鉴定：毛细管柱为DB-5，氦气作载气，流速26cm/s，进样量1μL，不分流进样；
进样温度为250℃；程序升温为：先37℃保持6min；再以2℃/min，从37℃升至70℃，保持5min；再以5℃/min，从70℃升至200℃，保持5min；
平衡时间为0.5min，气谱/质谱接口温度为280℃，质谱离子源温度为230℃，四极杆温度150℃，电离能为70eV，扫描范围为30～300m/z；
通过核对NIST图库中的质谱图，对提取的挥发物组分进行定性，确定需要筛选的挥发性活性化合物包括：(1)2-甲基丁酸甲酯，即methyl 2-methylbutyrate；(2)异戊醇，即3-methyl-1-butanol,；(3)2-甲基丁酸乙酯，即ethyl-2-methylbutyrate；(4)2-甲基丁基乙酸酯，即2-methybutyl acetate；(5)苯乙烯，即styrene；(6)己酸甲酯，即methylcaproate；(7)己酸乙酯，即ethyl caproate；(8)乙酸己酯，即hexyl acetate；(9)2-甲基丁酸己酯，即hexyl 2-methylbutyrate；(10)辛酸正丁酯，即butyl caprylate；(11)正十四烷，即n-tetradecane；(12)α-法呢烯，即α-farnesene，共12种挥发性化合物。
上述测定方法的步骤4中，取已交配桃蛀螟雌蛾，分别测定其对筛选出的各挥发性活性化合物的EAG电生理反应，获取相关测定数据，具体过程为：
取已交配桃蛀螟雌蛾置于解剖镜下，选取其一根触角，用手术刀沿触角基部切下，并切去触角顶端1-2个鞭节，使供试的桃蛀螟触角长度在6～9mm之间，然后用导电胶将其触角两端分别粘于参考电极和记录电极上，电极通过银-氯化银丝与交/直流放大器连接，放大器信号输出端与微型电子计算机相连，用Spike软件采集和分析数据；
先用连续气流吹供试离体触角，直至基线平稳后再进行测定；取10μL浓度为10-2(v/V)作为待测样品的挥发性活性化合物溶液滴于5×50mm滤纸条上，用镊子将滤纸条塞进巴斯德管内，巴斯德管两端用Parafilm封口膜封上直至用于刺激；同法取10μL石蜡油滴滴于滤纸上作为对照，每个样品刺激时间为300毫秒，刺激间隔至少60秒；
试验结果以桃蛀螟对样品刺激的EAG相对值表示，计算方法为：用相邻两次标准参照的EAG平均值减去相邻两次对照刺激的EAG平均值作为标准参照值，再用供试样品的EAG值减去对照的EAG平均值作为样品EAG绝对值而后再除以标准参照值进行标准化校正，即得到对测试样品刺激的EAG相对值，每个待测样品在不同的昆虫触角上重复15次。
上述测定方法的步骤5中，将预先准备好的待测桃蛀螟雌蛾逐头引入Y型嗅觉仪出气端直管内，分别将筛选出的各挥发性活性化合物的气味吹送到所述待测桃蛀螟雌蛾位置，根据记录的所述待测桃蛀螟雌蛾行为数据，计算选择百分率，具体过程为：
采用用玻璃制成的Y型管作为Y型嗅觉仪，主臂长13.0cm，内径2.5cm，两侧臂均采用两节玻璃管的嵌套结构，长度均为22.0cm，两臂夹角45度；该Y型嗅觉仪两臂分别依次用Teflon管连接转子流量计、活性炭瓶、蒸馏水瓶及大气采样仪；
测试前，取已配好的浓度为10-2(v/V)作为待测样品的挥发性活性化合物溶液10uL滴于10×20mm滤纸片上，随机放入一个测试臂最前端的玻璃帽内，另一玻璃帽内放入滴加等量石蜡油的滤纸片作为对照，让干净空气流通于臂内10min，流速为300mL/min；
将预先准备好的待测桃蛀螟雌蛾逐头引入所述Y型嗅觉仪出气端直管内，将气味吹送到所述待测桃蛀螟雌蛾位置，观察其行为；每次接入一头成虫，每个测试样品共测试80头雌蛾；当待测桃蛀螟雌蛾爬过某短臂1/3处并持续30s以上视为选择，2min内无反应则记为不选择；
通过以下公式计算选择百分率：
样品反应率＝选择样品的虫数/(选择样品的虫数+选择对照的虫数)×100％；
对照反应率＝选择对照的虫数/(选择样品的虫数+选择对照的虫数)×100％。
上述步骤5的测试在18:00～22:00点于黑暗条件下进行，每次测试前先开启测试室的排气装置换气1h；每测试40头待测桃蛀螟雌蛾后调换Y型嗅觉仪两臂的方向，已用过的玻璃装置均用洗涤灵清洗并高温烘干后再用，以消除味源残留，每次测试前更换全新的Y型嗅觉仪，测试过程中在Y型嗅觉仪正前方放置红色光源作为照明光源。
上述测定方法的步骤6中，对所述步骤4、5获取的数据进行分析具体为：
采用SPSS 16.0软件进行统计分析，不同处理间的差异显著性采用单因素方差分析及LSD法进行比较，Y型嗅觉仪的行为反应测定结果用卡方检验，并用SigmaPlot 12.0作图对比。
本发明实施例还提供一种挥发性活性化合物异戊醇(3-methyl-1-butanol)作为桃蛀螟的引诱剂的应用。
下面对本发明实施例具体作进一步的详细描述。
参照图1至图6，本实施例提供一种对桃蛀螟具有引诱作用的挥发性活性化合物的测定方法，包括以下步骤：
步骤1，诱集源的确定：
在桃蛀螟饲养过程中，发现其更喜欢聚在长霉菌的饲料周围，经鉴定，该霉菌为青霉菌。因此，我们对该菌(青霉菌)进行了分离、纯化，并将其接种到苹果上(接种青霉菌的苹果，PA)，以无损伤苹果(IA)、机械损伤苹果(MA)和青霉菌片(PP)为对照，通过产卵选择实验和四臂嗅觉仪行为反应测定，进一步验证桃蛀螟是否更喜欢接种青霉菌的苹果，从而发现和筛选出诱集源。
步骤2，挥发物的捕集：
以接种青霉菌的苹果(PA)为主要研究对象，以无损伤苹果(IA)、机械损伤苹果(MA)和接种青霉菌的PDA培养基(PP)为对照，对其挥发物进行顶空捕集与洗脱提取，具体过程为：空气由大气采样仪抽出并监测气体流量后(450～600mL/min)依次进入蒸馏水瓶和活性碳过滤瓶，以达到湿润和净化的目的，之后气体沿着Teflon管进入装有接种青霉菌的苹果的火鸡袋(Reynolds Co,482mm×596mm)底部，袋口另一端接入装有吸附剂的玻璃管(吸附剂在使用前先在170℃下活化2h，然后用甲醇(99.5％，北京化工厂)、无水乙醚(99.9％，北京化工厂)和色谱纯正已烷(99.9％，Fisher Scientific)各3mL淋洗、吹干)，吸附剂将挥发物捕集后，剩余气体再通过一个气体流量计，以监测出气端气体流量(350～450mL/min)。不同部件间用洁净的胶皮管进行无缝连接，整套装置持续抽提4h。采样结束后立即用350μL色谱纯正已烷洗脱被吸附剂吸附的挥发物于色谱瓶中，然后吸取200uL洗脱液置于另一色谱瓶中，并向其中加入浓度为1.28mg/μL的乙酸正壬酯1uL作为内标，用漩涡仪充分震荡摇匀(Barnstead|Thermolyne Type 37600Mixer)后置于-18℃冷藏柜(FC-175AZ型，合肥美菱股份有限公司)冷藏备用。测试设4个重复。
步骤3，挥发物的鉴定：
挥发性化合物的鉴定采用气相色谱-质谱联用技术。分析条件如下：毛细管柱为DB-5(Polyethylene Glycol 20000,60m×0.25mm×0.15μm,Agilent，美国)。氦气作载气，流速26cm/s。进样量1μL，无分流进样。进样温度250℃。程序升温为：先37℃保持6min；再以2℃/min，从37℃升至70℃，保持5min；再以5℃/min，从70℃升至200℃，保持5min。平衡时间0.5min，气谱/质谱接口温度280℃，质谱离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电离能70eV，扫描范围30–300m/z。通过核对NIST图库中的质谱图，对提取的挥发物组分进行定性；各组分的定量通过其峰面积与内标化合物峰面积的比较进行折算。
步骤4，EAG电生理反应测定：
EAG测定所用的设备和技术见赵新成等(2004)的描述。取已交配雌蛾一头置于解剖镜下，选取一根触角，用手术刀沿触角基部切下，并切去触角顶端1至2个鞭节，使供试桃蛀螟触角长度在6～9mm之间，然后用导电胶(Electrode Gel,250Gram Tube，Parker Laboratories Inc)将其触角两端分别粘于参考电极和记录电极上，电极通过银-氯化银丝与交/直流放大器(Syntech UN-06)连接，放大器信号输出端与微型电子计算机相连，用Spike软件(Syntech公司)采集和分析数据。
先用连续气流吹供试离体触角几分钟，待基线平稳后即可测定。取10μL待测样品溶液滴于滤纸条上(5×50mm)，立即用镊子将滤纸条塞进巴斯德管内，巴斯德管两端用Parafilm封口膜封上直至用于刺激。同法取10μL石蜡油滴于滤纸上作为对照，每个样品刺激时间为300毫秒，刺激间隔至少60秒。
试验结果以桃蛀螟对样品刺激的EAG相对值表示，计算方法为：用相邻两次标准参照的EAG平均值减去相邻两次对照刺激的EAG平均值作为标准参照值，再用供试样品的EAG值减去对照的EAG平均值作为样品EAG绝对值而后再除以标准参照值进行标准化校正，即得到对样品刺激的EAG相对值。每个待测样品在不同的昆虫触角上重复15次。
步骤5，“Y”型嗅觉仪行为反应测定：
“Y”型嗅觉仪是用玻璃制成的“Y”型管，主臂长13.0cm，内径2.5cm，两侧臂均采用两节玻璃管的嵌套结构，两臂夹角约45度，长度均为22.0cm。两臂分别用Teflon管依次连接转子流量计、活性炭瓶、蒸馏水瓶及大气采样仪等。测试前，取已配好的10-2(v/V)待测样品10uL滴于滤纸片(10×20mm)上，随机放入一个测试臂最前端的玻璃帽内，另一玻璃帽内放入滴加等量石蜡油的滤纸片作为对照，让干净空气流通于臂内(约10min，流速为300mL/min)。
将预先准备好的待测桃蛀螟雌蛾逐头引入“Y”型嗅觉仪出气端直管内，随着气味被吹送到成虫位置，观察其行为。每次接入1头雌蛾，每个样品共测试80头雌蛾。当桃蛀螟雌蛾爬过某短臂1/3处并持续30s以上视为选择，2min内无反应则记为不选择。
通过以下公式计算选择百分率：
样品反应率＝选择样品的虫数/(选择样品的虫数+选择对照的虫数)×100％；
对照反应率＝选择对照的虫数/(选择样品的虫数+选择对照的虫数)×100％。
测试在18:00-22:00h于黑暗条件下开展，每次测试前先开启试验室的排气扇换气1h。每测试10头雌蛾后调换“Y”型管两臂的方向。已用的玻璃装置均用洗涤灵清洗并高温烘干待用，以消除味源残留，每次测试前更换全新的“Y”型管。测试过程中在“Y”型管正前方放置红色光源(15W)作为照明光源。
步骤6，数据统计：
测试结果用SPSS 16.0软件进行统计分析，不同处理间的差异显著性采用单因素方差分析(ANOVA)及LSD法进行比较，Y型嗅觉仪的行为反应测定结果用卡方检验，并用Sigmaplot 12.0作图对比。
结果和分析：
产卵选择实验表明：桃蛀螟在4种处理上的落卵量由高到低依次为青霉苹果>机械损伤苹果>无损苹果>青霉菌片，且青霉苹果上的落卵量与其他3个处理差异极显著(图1)。四臂嗅觉仪行为反应测试结果表明，在测试的241头桃蛀螟未交配雌蛾和211头已交配雌蛾中，对4种处理的选择反应率的排列顺序与产卵选择顺序完全相同，仍然以青霉苹果为最高；其中，未交配和已交配雌蛾对青霉苹果的选择率分别为38.6％和42.0％，均与其他三个处理形成显著差异(P<0.05，图2a，2b)。
综合上述两个实验结果来看，接种青霉菌的苹果从产卵选择和行为选择两方面都对桃蛀螟雌蛾具有更强的引诱作用。由此可以推测，苹果接种青霉菌后所释放的某些挥发性气味化合物能对桃蛀螟雌蛾的产卵和行为起到更强的引诱作用。因此，接下来需对上述4个处理所释放的挥发性气味化合物进行捕集，并将青霉苹果的挥发物种类及其含量与其他3个处理进行统计和比较分析，进而通过电生理和行为反应实验鉴定并探求究竟哪种(或哪些物质)对引诱桃蛀螟起关键性作用。
接种青霉菌的苹果的挥发性气味化合物通过动态顶空采集法，经吸附、洗脱、气相色谱-质谱分析后，进而经计算机对各峰质谱图NIST标准库的检索及根据质谱裂解规律进行核对，4个处理共鉴定出37种化合物(图3)。对于接种青霉菌的苹果而言，共鉴定出24种化合物，其中，醇类、烯烃类、单链烷烃、芳香烃各1种，其余20种均为酯类，分别占总含量的0.43％、49.7％、0.24％、2.1％和47.53％。
由于前期研究发现接种青霉菌的苹果对桃蛀螟有显著引诱作用，且测试最终以制作挥发物诱芯为目的，因此，将接种青霉菌的苹果所释放的24种化合物与无损苹果、机械损伤苹果及青霉菌菌片所释放的挥发物相比对，从中选取接种青霉菌的苹果所释放的特有的化合物及相对含量较其他3个处理有所提升的化合物；同时，排除易变性、光照易分解、对人畜及环境等有毒害的物质，并兼顾经济成本问题，最终选取12种挥发性化合物进行电生理和行为反应测试，以筛选出对桃蛀螟引诱作用较强的活性化合物，以期用于田间引诱防治。
以石蜡油为对照，以浓度为10-2(v/V)的正己醇作为标准参照，利用触角电位仪测试了12种化合物分别在10-1、10-2、10-3和10-4(v/V)4个浓度梯度下，桃蛀螟雌蛾的触角电位反应值。结果发现，桃蛀螟雌蛾对12种化合物的触角电位反应值随样品浓度的升高而升高(图4)；四臂嗅觉仪对12种化合物在10-1、10-2、10-3和10-4(v/V)4个浓度梯度下的行为测试结果显示：桃蛀螟雌蛾对12种化合物的选择反应率均以浓度为10-2(v/V)为最高(图5)，即10-2(v/V)浓度下吸引的桃蛀螟雌蛾数量最多。据此，本测试以石蜡油为对照，进一步利用“Y”型嗅觉仪分别测定了桃蛀螟雌蛾对这12种化合物在10-2(v/V)浓度下的选择反应，从测试结果可以看出，桃蛀螟雌蛾对异戊醇的选择反应率达80.0％，而对照的选择反应率仅为20.0％，经卡方检验(x2＝10.80)，两者差异极显著，说明异戊醇对桃蛀螟的引诱作用最强(图6)。
到目前为止，国际上只有关于桃蛀螟性信息素诱剂配方的报道，尚未有利用寄主植物与微生物协同作用的挥发物作为诱剂的报道。发明人发现从接种青霉菌的苹果中提取的挥发性化合物异戊醇对桃蛀螟雌蛾有很好的引诱作用，而且，该化合物价格低廉、对人畜无毒、无环境污染，有望与桃蛀螟性信息素结合，开发为诱芯用于桃蛀螟田间种群发生动态监测与防治。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

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1.一种挥发性活性化合物异戊醇作为桃蛀螟的引诱剂的应用。
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