CN107858294A

CN107858294A - 一种防治草莓重茬病的多功能菌株

Info

Publication number: CN107858294A
Application number: CN201711138797.1A
Authority: CN
Inventors: 魏希颖; 吴锦兰; 张鹏宇; 王磊; 芦娟
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2018-03-30
Anticipated expiration: 2037-11-16
Also published as: CN107858294B

Abstract

本发明公开了一种防治草莓重茬病的多功能菌株，经鉴定，该菌株属于新萨托菌属，命名为Neosartorya udagawae，保藏编号为CGMCC No.14788。该菌株能有效抑制草莓尖孢镰刀病菌，具有拮抗功能；能有效降解对羟基苯甲酸，具有降解功能；同时能有效杀死南方根结线虫，具有杀线功能。本发明的菌株属于内生菌株，稳定性好，定植能力强，具有多种功能，是一株实用性很强的拮抗菌株，在防治草莓重茬病中具有很强的开发利用价值。

Description

一种防治草莓重茬病的多功能菌株

技术领域

本发明涉及草莓种植领域，具体涉及防治草莓重茬病的多功能菌株的筛选。

背景技术

草莓(Fragaria ananassa Duch)为蔷薇科草莓属、多年生草本植物。草莓生长周期短、管理方便、果实营养丰富，有“水果皇后”之称。至2007年，中国草莓种植面积和总产量均居世界第一位。草莓重茬病(Strawberry replant disease)指同一种草莓在同一块土地连年种植时，即使在正常的栽培管理条件下也会出现长势变弱、根部病害日趋严重、产量和品质急剧下降的现象，也被称为再植病害。重茬病发生原因主要包括土壤微生物区系失衡、病原真菌积累，化感自毒作用明显，线虫增多，土壤理化性质恶化等。针对重茬病，生物防治具有防效较长、不会造成二次污染、安全性高且不易产生抗性等优点。它主要包括外加抗性微生物、外加降解微生物、外加生物代谢物等。

植物内生菌(Endophyte)是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的细菌、放线菌或真菌。研究表明植物内生菌与病原菌具有相同的生态位，在植物体内相互竞争空间、营养，使病原菌得不到正常的营养供给而消亡，从而增强宿主抵御病害的能力。另外植物内生菌可以分泌抗生素、毒素等代谢物质，这些代谢物质能够诱导植物产生系统抗性(ISR)。因此，对植物施用植物内生菌产生的抗菌剂、抗虫剂，来增强植物的抗逆性，起到生物防治效果，既减少了化学农药对环境的污染，又保证了植物的产量品质。

目前，国内外研究多数集中在对土壤功能菌株的筛选，并且所得菌株多为单功能，对于同时具备多种功能的菌株研究较少。Neosartorya udagawae在分类上属于新萨托菌株属，目前关于其功能的描述主要集中在其致病性上，例如，曲霉病等。未见到其在防治草莓重茬病或与草莓重茬病相关的杀虫、抑菌、降解上的应用报道。同时，目前也未见到相近种属的内生菌进行上述应用的报道。

草莓重茬病害逐年加重，给农民造成巨大的经济损失，已成为草莓产业发展的主要障碍之一，急需寻求一条安全有效的防治途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防治草莓重茬病的多功能菌株。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明筛选得到了一株多功能菌株SRF5(Neosartorya udagawae)，该菌株的保藏编号为CGMCC No.14788。

筛选上述多功能菌株SRF5的技术方案由下述步骤组成：

1)从草莓植株的根、茎、叶中分离得到草莓内生真菌；

2)以草莓尖孢镰刀病菌为指示菌筛选具有拮抗功能的菌株，得到的菌株具有抑菌功能(拮抗菌)；

3)以对羟基苯甲酸为指示剂对拮抗菌的降解性进行测定，确定菌株具有较强的降解功能；

4)以南方根结线虫为指示剂对拮抗菌的杀线能力进行测定，确定菌株具有杀线功能。

本发明的有益效果体现在：

本发明从草莓内生菌着手，综合考虑导致草莓重茬病的多方面因素，通过有针对性的筛选，分离得到一株拮抗性能好、同时具有降解功能和杀线功能的多功能内生菌株(Neosartorya udagawae，菌株SRF5)，该菌株为综合多方面因素研制出安全有效的专用型防治草莓连作障碍的药剂提供参考，在防治草莓重茬病中具有很强的开发利用价值。

附图说明

图1为菌株SRF5对尖孢镰刀菌的抑菌实验结果；其中，(a)对照；(b)五点对峙；(c)含药培养基对峙。

图2为菌株SRF5对对羟基苯甲酸的降解曲线。

图3为菌株SRF5无菌发酵液与南方根结线虫混合培养结果；其中，(a)对照培养8h；(b)对照培养24h；(c)对照培养48h；(d)处理培养8h；(e)处理培养24h；(f)处理培养48h。

图4为菌株SRF5的形态特征；其中，(a)菌落-正面；(b)菌落-背面；(c)孢子-正面；(d)孢子-背面。

图5为菌株SRF5的系统进化分析结果(括号内的数字是菌株编号)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明从草莓内生菌着手，综合考虑导致草莓重茬病的多方面因素(尖孢镰刀菌积累、线虫增多及由对羟基苯甲酸等引起的化感自毒作用)，筛选得到一株拮抗性能好，同时具有降解功能和杀线功能的新型多功能内生菌株，为开发草莓专用生防内生菌剂奠定实验基础，从而安全有效的防治草莓连作障碍。

(一)实验涉及的培养基组成(用量)和pH

1)PDA平板：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1000mL，自然pH。

2)PDA液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，自然pH。

3)无机盐培养基：氯化钠1g、磷酸二氢钾1g、磷酸氢二钾1g、硝酸铵1g、硫酸镁0.5g、氯化钙0.02g、蒸馏水1000mL，pH＝7。

(二)筛选实验

1.对洗净、表面消毒后的草莓根、茎、叶采用研磨、涂布及划线分离内生菌株

将草莓根、茎、叶用清水冲洗2h，无菌水冲洗10次，将植物组织在75％乙醇中消毒5min，无菌水冲洗3次，用0.1％HgCl₂处理3min，然后将处理后的根、茎、叶研磨，离心后取上清液涂抹于PDA平板上，以涂布无菌水为对照，28℃培养箱培养。待菌落长出后，挑取不同形态的菌株于PDA平板上划线纯化，得到草莓内生真菌。

2.以尖孢镰刀病菌为指示菌，采用五点对峙法进行拮抗菌的筛选，利用含药培养基对峙法测量抑菌率

于PDA平板中心接种尖孢镰刀致病真菌菌饼(直径＝5mm)，在菌饼的四周且距离菌饼为3cm处各接种待筛选菌株，每个菌株重复3次，以四周点接无菌水为对照，置28℃培养观察，直到对照的致病菌菌丝长满平板为止，测量抑菌带。将初筛得到的拮抗菌接种到PDA液体培养基中，28℃、160r/min培养7天后，将发酵液中的菌体离心分离，取上清液用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到无菌发酵液。吸取5mL无菌发酵液与15mL灭菌后的PDA液体培养基混合摇匀，制成含药培养基，待培养基凝固，在平板中央打孔，接入尖孢镰刀菌菌饼(d＝5mm)，每处理重复3次以无菌水替代无菌发酵液作对照处理，28℃下培养。待对照组尖孢镰刀菌菌丝长满平板后，用十字交叉法测量各平板尖孢镰刀菌菌落直径，并计算抑制率。抑制率(％)＝(对照组菌落直径-实验组菌落直径)/(对照组菌落直径-5mm)×100。

将筛选得到的一株拮抗性较好的菌株命名为SRF5，其抑菌结果见图1。结果表明，菌株SRF5抑菌带范围为5mm-7mm，抑菌率范围为70％-80％，表明该菌株具有良好的拮抗功能。

3.计算菌株SRF5接入含有对羟基苯甲酸的无机盐培养基中后对羟基苯甲酸的降解率

将菌株SRF5接入无机盐培养基中，培养基中对羟基苯甲酸作为唯一碳源，浓度为1000μg/mL，于160r/min、28℃震荡培养。每隔24小时，取出2mL菌液加入到无菌离心管中，8000r/min、25℃下离心8min后，取上清液测定OD₂₅₅值(用吸光值反映出含量，需要提前做好一个OD值与含量的标准曲线，带入样品测定的OD值，计算出对羟基苯甲酸含量)。重复3次，计算降解率。降解率(％)＝(处理OD₂₅₅-对照OD₂₅₅)/对照OD₂₅₅×100。对照组为不接菌株SRF5的无机盐培养基(培养基中对羟基苯甲酸作为唯一碳源，浓度为1000μg/mL)。

经计算，菌株SRF5的降解率结果见图2，可以看出，菌株SRF5在接种5d后对对羟基苯甲酸的降解率达98.61％，表明菌株SRF5具有高效的降解功能。

4.计算菌株SRF5的代谢液与线虫混合培养下线虫的校正死亡率

以收集得到的南方根结线虫为供试线虫，采用24孔板液体浸渍法对菌株SRF5无菌发酵液(代谢液)进行抗线虫活性的研究。在24孔板中分别加入100μL线虫悬液、400μL菌株SRF5的无菌发酵液，用移液枪轻轻吹打混匀，每个待测样品，设置三个重复，以空白发酵培养基(PDA液体培养基)代替无菌发酵液作为阴性对照，28℃培养箱中放置，每隔8h吸取定量的线虫悬液于凹槽载玻片上，在倒置显微镜下观察线虫生长(存活)情况，记录线虫死亡数(以针尖碰触虫体无反应判定为死亡)，计算幼虫校正死亡率。校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％，菌株SRF5对线虫的影响结果见图3。

经观察和计算，菌株SRF5的代谢液与南方根结线虫混合培养24h时，对根结线虫的校正死亡率达64.44％，幼虫大部分麻痹；48h校正死亡率达到97.37％，幼虫几乎全部失去活力，沉于孔底。结果表明菌株SRF5具有良好的杀虫效应。

5.通过形态学观察和分子生物学对菌株SRF5进行鉴定

按照《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》记载的方法，将菌株SRF5点接种于PDA平板上，28℃培养7d后观察菌落的特征。同时采用插片法获得生长良好的菌株培养物，将其脱水干燥后喷金，用电子扫描电镜观察孢子的显微形态。菌株SRF5的菌落形态及孢子形态特征如图4。

将菌株划线活化，挑取单克隆于3mL PDA液体培养基中28℃、160r/min震荡培养7天；按照试剂盒的具体操作步骤提取基因组，用琼脂糖凝胶(1％)电泳检测提取基因组的质量。将完整且纯度高的基因组DNA适当稀释作为模板，对菌株SRF5的rDNA-ITS区域进行PCR扩增，经PCR扩增获得1条574bp长的序列，将获得的扩增片段大小正确的PCR产物测序。将测序结果登录GenBank，利用Blastn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)与GenBank数据库中的序列进行比对，获得最相近菌株rDNA-ITS序列，用Clustalx1.8按照最大同源性的原则进行排序，采用MEGA6.0软件通过Neighbor-joining法构建系统发育树，自举法(bootstrap)对系统发育树进行检验，重复1000次。菌株SRF5的系统进化分析如图5。

菌株SRF5在PDA平板培养7d后菌落直径接近55mm，菌落接近圆形，质地为天鹅绒状，中间呈灰绿色，边缘呈白绒色，菌落背面呈棕黄色(图4a、图4b)。在电镜下观察PDA平板上培养7d后产生的分生孢子，子囊果球形，孢梗茎壁平滑，分生孢子近球形或椭圆形，直径2.2-3.0μm，壁平滑或稍粗糙(图4c、图4d)。测序得到的菌株SRF5的rDNA-ITS区域序列，在GenBank的核苷酸BLAST比对结果表明，菌株SRF5和新萨托菌属菌株Neosartorya udagawaestrain(JQ316519.1)序列同源性高达100％，且与其在系统发育树的同一分支(图5)，结合形态学特征将其鉴定为新萨托菌属菌株(Neosartorya udagawae)，是一株新型功能菌株，具有较强研究开发价值。

总之，本发明分离并鉴定了一株新型多功能菌株(即菌株SRF5)，其已于2017年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.14788，属于新萨托菌株属，分类命名为Neosartorya udagawae。该菌株(即菌株SRF5)能有效抑制草莓尖孢镰刀病菌，具有拮抗功能；能有效降解对羟基苯甲酸，具有降解功能；同时能有效杀死南方根结线虫，具有杀线功能。菌株SRF5属于内生菌株，稳定性好，定植能力强，具有多种功能，是一株实用性很强的拮抗菌株，在防治草莓重茬病中具有很强的开发利用价值。

Claims

1.一种具有抑菌、降解及杀线功能的菌株，其特征在于：该菌株(Neosartoryaudagawae)的保藏编号为CGMCC No.14788。

2.一种如权利要求1所述的菌株在制备用于防治草莓重茬病或草莓连作障碍的药物中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述菌株或菌株的发酵液用于抑制草莓尖孢镰刀菌。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述菌株用于降解对羟基苯甲酸。

5.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述菌株或菌株的发酵液用于杀灭草莓寄生线虫。

6.如权利要求3或5所述的用途，其特征在于：所述发酵液的制备方法包括以下步骤：将菌株接种于真菌液体培养基中，于28℃培养7天后离心，离心所得上清液即为发酵液。

7.一种如权利要求1所述的菌株在防治草莓重茬病或草莓连作障碍中的用途。

8.一种具有抑制尖孢镰刀菌功能的菌株，其特征在于：该菌株(Neosartoryaudagawae)的保藏编号为CGMCC No.14788。

9.一种具有降解对羟基苯甲酸功能的菌株，其特征在于：该菌株(Neosartoryaudagawae)的保藏编号为CGMCC No.14788。

10.一种具有杀灭线虫功能的菌株，其特征在于：该菌株(Neosartorya udagawae)的保藏编号为CGMCC No.14788。