CN107850599B

CN107850599B - Wbp2与her2作为共预后因子对患者分层以进行治疗

Info

Publication number: CN107850599B
Application number: CN201680042719.9A
Authority: CN
Inventors: 林允斌
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2015-07-23
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: US20210003574A1; WO2017014694A1; CN107850599A; US20180209981A1

Abstract

本发明提供一种用于预后癌症患者的总体生存期、癌症复发或治疗应答的方法，所述方法包括：(a)检查来自患者的样品以确定患者是人表皮生长因子受体2(HER2)阳性还是阴性；和(b)测量所述患者样品中的WW结构域结合蛋白质2(WBP2)水平，其中步骤(a)中的结果和步骤(b)中的结果为患者提供总体生存期、癌症复发或治疗应答的预后。本发明还提供实施本发明方法的试剂盒。

Description

WBP2与HER2作为共预后因子对患者分层以进行治疗

技术领域

本发明涉及用于癌症，特别是乳腺癌的预后方法、系统和试剂盒。本发明还涉及用于癌症治疗，特别是乳腺癌治疗的患者群体的分层。本申请还涉及用于癌症，特别是乳腺癌预后的方法、系统和试剂盒中的癌症标志物的鉴定。

背景技术

以下对本发明背景的讨论旨在促进对本发明的理解。然而，应该理解的是，本讨论并不是承认或认可所提及的任何材料在任何管辖区中在本申请的优先权日之时是公布的、已知的或是公知常识的一部分。

全世界的乳腺癌是第二大最常见的癌症类型，并且也是人类癌症死亡最常见的原因之一。该疾病是女性最常见的癌症，并占美国女性癌症发生的三分之一。常规检查可提供信息以协助乳腺癌的诊断或预后，包括乳房X线检查和组织活检，然后结合组织学检查，用针对雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和/或HER2/neu蛋白质的抗体进行免疫组织化学检测。

目前对乳腺癌的治疗包括手术、化学疗法、放射疗法和免疫疗法。靶向性治疗，例如HER2/neu抗体(即赫塞汀(曲妥珠单抗))，是在20世纪90年代后期首次成为可用的。后来开发的HER2/neu抗体包括帕妥珠单抗(Pertuzumab)和拉帕替尼(Lapatinib)。

HER2是浸润性癌症的癌症生物标志物，其中HER2在约30％的乳腺癌中过表达。HER2的过表达也发生在卵巢癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)和子宫癌中。HER2受体蛋白是HER2拮抗剂如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和拉帕替尼的靶标。因此确定治疗性使用HER2拮抗剂的适合性的首要优先事项是证明(例如通过免疫细胞化学技术证明)HER2膜结构域的过表达。然而，并不是所有的HER2阳性癌症患者都对治疗有应答，而且一些HER2阳性癌症即使没有治疗也是自限性的。这表明HER2阳性癌症中有一些亚群更具侵袭性和/或对治疗(特别是赫赛汀(Herceptin)治疗)更具内在抵抗性。

对HER2的检测包括但不限于荧光原位杂交(FISH)以检测样品中存在的HER2基因的数目，以及免疫组织化学(IHC)以检测样品中HER2蛋白质的量。但是后一种方法是半定量的。

因此，需要确定癌症标志物并找到改进的方法、系统和试剂盒，以允许以高敏感性连续地、更加准确地量化癌症的预后，特别是乳腺癌或被证明存在表达HER2的ERBB2基因的扩增或过表达的其他癌症类型如胃癌(gastric cancer)。

需要替代的方法和试剂盒用于分层癌症患者以改善以上提及的至少一个问题。

发明概述

本发明的目的是依照本发明提供改进的方法和试剂盒。

相应地，本发明的一方面提供了预后患有癌症的患者的总体生存期、癌症复发或治疗应答的方法，所述方法包括：(a)检查来自患者的样品以确定基于人表皮生长因子受体2(HER2)的预定水平，患者是HER2阳性还是阴性；和(b)测量患者样品中的WW结构域结合蛋白质2(WBP2)水平，其中步骤(a)中的结果和步骤(b)中的结果为患者的总体生存期、癌症复发或对治疗的应答提供了预后。

本发明的另一个方面提供了用于鉴定在样品中人表皮生长因子受体2(HER2)的量和WW结构域结合蛋白质2(WBP2)的量的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)至少一个第一探针，其适于检测和测量样品中人表皮生长因子受体2(HER2)的水平，以确定样品是HER2阳性还是HER2阴性；和(b)至少一个第二探针，其适于检测和测量样品中的WW结构域结合蛋白质2(WBP2)水平。

本发明的另一方面提供了用于确定预后总体生存期，癌症复发或治疗应答的体外方法，所述方法包括：(a)测量样品中人表皮生长因子受体2(HER2)的水平；(b)测量样品中WW结构域结合蛋白2(WBP2)的水平，和(c)确定HER2和WBP2的水平是高于还是低于预定水平，其中步骤(c)的结果提供了总体癌症生存期、癌症复发或癌症治疗应答的预后。

通过结合附图回顾以下描述的本发明的具体实施方案，本发明的其它方面对于本领域的普通技术人员将变得明显。

附图说明

现在将参照附图仅以举例的方式描述本发明，其中：

图1提供涉及超过200个临床样本分析的Kaplan-Meier存活曲线。(A)总体存活年数依赖于WBP2和HER2状态(n＝221)；(B)无病生存年数依赖于WBP2和HER2状态。(N＝221)；(C)对总体生存期的Kaplan-Meier存活分析依赖于HER2状态；(D)和无病生存期依赖于HER2状态；(E)细胞核中HER2的表达量与WBP2的量的相关性；(F)细胞质中HER2的表达量与WBP2的量的相关性。

图2提供免疫印迹分析(A)显示了WBP2介导EGF/HER2信号传导并支持WBP2作为应答靶向EGFR/HER2的药物的潜在预测物。Her2通过WBP2发信号，因此，当WBP2活性异常时阻断Her2将不能有效杀死癌细胞，因为WBP2的异常活性将驱使癌症生长。这意味着异常水平的WBP2可能预测对赫赛汀的应答。通过在人乳腺癌SK-BR-3细胞转染靶向HER2的siRNA敲低HER2。使用萤光素酶的siRNA作为阴性对照。细胞血清饥饿24小时后，用50ng/ml的EGF处理10分钟。细胞裂解物用抗WBP2的抗体免疫沉淀(IP)，并使用抗磷酸酪氨酸(PY20)通过Western印迹(IB)分析内源WBP2的磷酸化。用指定的抗体通过Western印迹(IB)分析HER2和EGFR的磷酸化。使用β-微管蛋白作为蛋白质上样对照。通过转染HER2的siRNA敲低人乳腺癌细胞SK-BR-3(B)和ZR-751(C)中的HER2。使用萤光素酶的siRNA作为阴性对照。细胞血清饥饿24小时后，用50ng/ml EGF处理10分钟。细胞裂解物用抗WBP2的抗体免疫沉淀(IP)，并使用抗磷酸酪氨酸(PY20)和抗WBP2的抗体通过Western印迹(IB)分析内源WBP2的磷酸化。用指定的抗体通过Western印迹(IB)分析HER2的磷酸化。使用β-微管蛋白作为蛋白质上样对照。

图3曲妥珠单抗(Trastuzumab)剂量应答与WBP2表达水平对细胞增殖的影响。使用表达WBP2的慢病毒在BT-474中过表达WBP2(A和B)，以及使用靶向WPB2的两种不同的shRNA在SK-BR-3中敲低WBP2(C和D)，和靶向WBP2的两种不同的siRNA在ZR-75-30中敲低WBP2(E和F)。将每孔10,000个细胞铺在96孔板上用于2D培养(A和C)或铺在96孔超低附着板上用于3D培养(B和D)。曲妥珠单抗孵育3天(SK-BR-3)或5天(BT-474)后，通过使用Cell Titer96aqueous非放射性细胞增殖测定法来测量细胞的生存力。细胞生存力通过曲妥珠单抗与未处理的对照细胞相比的倍数变化计算。数据表示为平均值±SD。Student t检验确定统计学显著性(*或+P<0.05；**或++P<0.01；***或+++P<0.001，相对于载体或对照)。

图4曲妥珠单抗剂量应答与WBP2表达对HER2水平和下游信号通路的影响。使用表达WBP2的慢病毒在BT-474中过表达WBP2(A)，并且使用靶向WPB2的两种不同的shRNA在SK-BR-3中敲低WBP2(B)，以及使用靶向WBP2的两种不同的siRNA在ZR-75-30中敲低WBP2(C)。用不同浓度的曲妥珠单抗(0、1、10、100μg/ml)处理细胞3天(SK-BR-3)或5天(BT-474和ZR-75-30)。通过Western印迹分析Her2、WBP2和β-微管蛋白的表达。

图5在体内实验中，WBP2表达对曲妥珠单抗治疗的影响。所有的动物房和处理程序都符合新加坡国立大学的机构指南。对于异种移植模型，向5周龄雌性无胸腺裸鼠(n＝6-7，In Vivos，Singapore)植入0.72mg 60天释放的17β-雌二醇微丸(Innovative Research，Sarasota，FL，USA)，并在2天后，将BT-474对照(载体)或WBP2过表达细胞(1×10⁷个，在200μl DPBS和基质胶1:1混合物中)皮下注射到小鼠乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到150-200mm³时，将小鼠分组，保持组与组之间平均肿瘤大小相似，并用曲妥珠单抗(10mg/kg，Roche)或PBS(对照)通过腹膜内给药(IP)每周两次处理3周。用游标卡尺每周测量肿瘤大小两次，并且肿瘤体积的计算如下：体积＝(宽度×宽度×长度)/2。数据表示为平均值±SEM。统计显著性由Mann-Whitney检验确定。

附图不应被理解为取代了本发明上述描述的一般性。

发明详述

现在将参考附图描述本发明的具体实施方案。在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，而不是为了限制本发明的范围。此外，除非另有定义，否则，在此使用的所有技术和科技术语与本发明所属的普通技术人员通常理解的含义相同。

本技术涉及人表皮生长因子受体2(HER2)阳性或阴性的测定和WW结构域结合蛋白质2(WBP2)水平与癌症患者(特别是乳腺癌患者)的总生存期、癌症复发或癌症治疗应答的相关性。

因此，本发明的一方面提供了用于预后癌症患者的总生存期、癌症复发或癌症治疗应答的方法，所述方法包括：(a)通过检查来自患者的样品，以确定基于人表皮生长因子2(HER2)的预定水平，鉴定患者是HER2阳性还是阴性；和(b)检测患者样品中的WW结构域结合蛋白质2(WBP2)水平，其中步骤(a)中的结果和步骤(b)中的结果为患者的总生存期、癌症复发或对患者的治疗应答提供了预后。

本文所用的术语“总生存期的预后”是指基于来自患者样品中HER2和WBP2的量大致确定患者可能生存多长时间。在各种实施方案中，可在1年、或2年、或3年、或4年、或5年、或6年、或7年、或8年、或9年、或10年、或11年、或12年或者更长的过程中测量患者的状态是存活还是死亡。

本文所用的术语“癌症复发的预后”是指基于来自患者的样品中HER2和WABP2的量在观察到或认为癌症已经从患者中消失一段时间后患者是否有可能再次患癌症。在各种实施方案中，癌症的发展和患者是否再次患癌可被分层成亚组，例如：无癌症、局部癌症(其可根据肿瘤的大小进行亚分类)、转移、或死亡以及在各种类别中随着时间的推移这些亚组中的一个或多个的发展速率。在各种实施方案中，可在1年，或2年、或3年、或4年、或5年、或6年、或7年、或8年、或9年、或10年、或11年、或12年或者更长的过程中测量患者是否有癌症复发。

本文所用的术语“癌症治疗应答的预后”是指基于来自患者样品中HER2和WBP2的量来确定患者是否有可能对癌症治疗有积极应答。其中，随着时间的推移，癌症治愈、抑制或减缓(减少)是患者对癌症治疗的积极应答。在各种实施方案中，可在3周、或25周、或1年、或2年、或3年、或4年、或5年、或6年、或7年、或8年、或9年、或10年、或11年、或12年或者更长的过程中测量患者是否对癌症治疗有积极响应的状态。

本文所用的术语“样品”是指从个体获得的任何组织或流体，比如通过活组织检查。“样品”包括但不限于例如血浆、血清、脑脊液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部切片、眼泪、唾液、血细胞、器官、组织，包括乳房组织和体外细胞培养成分的样品。样品可存在于组织芯片或可包含整个组织切片。

本文所用的术语“患者”是指被怀疑有或患有癌症的动物，例如哺乳动物。在各种实施方案中，这可包括有患癌症风险的动物，患有癌症的动物或者过去患有癌症的动物。在各种实施方案中，患者包括人。

在各种实施方案中，通过乳房X光来识别患者。因此，任何观察到的肿块都足以怀疑患者有或患有癌症。在各种的实施方案中，通过进行组织活检鉴定患者，其中所述样品被分类为非典型的、新生物形成、癌或发育异常(dysplasia)都足以怀疑患者有或患有癌症。身体中的任何器官都可以使用各种技术进行活检，其中一些技术需要大的手术(例如霍奇金病(Hodgkin’sdisease)的脾切除术)，而另一些甚至不需要局部麻醉(例如甲状腺，乳房，肺，肝，胃等的细针穿刺活检)。

HER2是一种癌症生物标志物，HER2的过度表达发生在约30％的乳腺癌中。本领域已知用于确定患者是人表皮生长因子受体2(HER2)阳性还是HER2阴性的任何方法将适用于本文所述的方法中。HER2是治疗的靶标，治疗包括但不限于曲妥珠单抗，帕妥珠单抗和拉帕替尼。检测患者是HER2阳性还是阴性的方法包括但不限于荧光原位杂交(FISH)以检测存在于患者样品中HER2基因的数目，以及免疫组织化学(IHC)以检测患者样品中HER2蛋白质的量。IHC使用抗体来评估HER2蛋白的表达。用于确定患者是HER2阳性还是阴性的方法及其相关技术，例如FISH和IHC，在本领域是已知的。IHC有一个评分系统，用于确定患者是HER2阳性还是HER2阴性。这是基于HER2基因表达的预定设置水平。患者样品具有约1-2或更高的预定水平的IHC评分将指示患者是HER2阳性的，而IHC评分低于约1-2的预定水平将指示患者是HER2正常的或HER2阴性的。这些患者仍然有HER2的表达，但被认为是在正常范围内。对于IHC技术，参见例如Dabbs D.J.，2006(第二版)：“诊断免疫组织化学”。可以理解的是，这取决于所采用的方法，评分系统可不同，并且预定设置水平可针对评分系统进行调整。

另一种检查来自患者的样品以确定基于HER2的预定水平患者是人表皮生长因子受体2(HER2)阳性还是阴性的方式是原位杂交(ISH)。ISH使用与荧光、显色或银检测系统(即FISH、CISH或SISH)偶联的或与CISH和SISH系统(亮场双ISH(BDISH)或双重半抗原、双色ISH(DDISH))组合的DNA探针来确定HER2拷贝的数量。ISH是仅使用单个探针计算每个核的HER2拷贝数，或作为双探针技术，其中17号染色体着丝粒探针(染色体计数探针17，CEP17)的杂交允许确定HER2:CEP17的比率。双探针方法可作为双色技术进行，两个探针在同一张载玻片上共杂交，或者作为单色测定法，其中每个探针在连续载玻片上使用。相比于平均HER2拷贝数，HER2:CEP17比率有时被认为是一种更好的HER2扩增状态的反映，因为HER2拷贝数也依赖于肿瘤的有丝分裂指数、切片厚度、核截断效应和异常的染色体拷贝数。

美国食品和药物管理局(FDA)或美国临床肿瘤学会/美国病理学家学院(ASCO/CAP)发布的最被接受的确定HER2阴性或HER2阳性的预定水平。表1总结了这两者。

表1：美国食品和药物管理局或美国临床肿瘤学会/美国病理学家学院通过IHC或FISH确定HER2状态的预定水平。

并非所有HER2阳性乳腺癌患者对治疗有应答，并且一些HER2阳性乳腺癌即使没有治疗也是自限性的。这表明HER2阳性乳腺癌中有一些亚群更具侵袭性和/或对治疗有内在抵抗。

在乳腺癌细胞中，WBP2是EGFR(表皮生长因子受体)、ER(雌激素受体)和Wnt信号传导(Lim SK等(2011))的介质。WBP2和调节其表达的蛋白质可用于预测对药物的应答。样品中的WBP2水平可通过使用抗体或适配体(aptamer)检测核和/或细胞质/非核WBP2蛋白的量或使用DNA探针检测基因组扩增来测量。FISH和IHC可用于确定患者具有高还是低的WBP2水平。WBP2蛋白的序列呈现于氨基酸序列SEQ ID NO.1：

WBP2是一种生物标志物可用于将HER2阳性乳腺癌分层为低度和高度侵袭性病例以用于治疗和监视。

本文所用的术语“低度侵袭性癌症”是指在一段时间内不太可能死亡或出现癌症复发的癌症患者。在各种实施方案中，可在1年、或2年、或3年、或4年、或5年、或6年、或7年、或8年、或9年、或10年、或11年、或12年或更长的过程中测量患者的癌症状态。

本文所用的术语“高度侵袭性癌症”是指在一段时间内更可能死亡或出现癌症复发的癌症患者。在各种实施方案中，可在1年、或2年、或3年、或4年、或5年、或6年、或7年、或8年、或9年、或10年、或11年、或12年或更长的过程中测量患者的癌症状态。

在各种实施方案中，将步骤(a)和(b)中的结果与来自对照群体的一组预定表达水平的结果进行比较。

本文所使用的术语“对照群体”是指测量HER2和WBP2以确定存在或从一个群体中的多个个体获得的样品中的量。在各种实施方案中，所述多个个体包括至少五个个体，但是任何个体的数量可以是合适的，包括少于或多于5个个体，条件是所述个体是具有患癌症风险的，患有癌症的或过去患有癌症的。测量值形成一个参考。在各种实施方案中，每个个体的癌症随时间的发展可于1年、或2年、或3年、或4年、或5年、或6年、或7年、或8年、或9年、或10年、或11年、或12年或更长的过程中被测量。在各种实施方案中，癌症的发展可分层为亚组，例如：无癌症、局部癌症(其可根据肿瘤大小进行亚分类)、转移、死亡以及在各种类别中这些亚组中的一个或多个的发展速率。可使用一系列方法来推导出参考群体的值，所述参考群体的值是本领域技术人员基于HER2和WBP2的测量和癌症的发展来确定的。

在各种实施方案中，对照群体被分层为确定癌症侵袭性的多个亚组。

在各种实施方案中，每个亚组均参考自包含低于预定水平的WBP2表达的HER2阴性患者的参照组。

在各种实施方案中，WBP2的表达低于包含IHC得分为1和更低的预定水平，而高WBP2是IHC得分大于1。

本文所用的术语“预定水平”是指测定截止值，其通过将测定结果与预定水平/截止值相比较用于评估预后或治疗效果结果，其中预定水平/截止值已经与多种临床参数相关联或联系在一起，所述临床参数为例如疾病/病症的亚划分、疾病/病症的严重程度、进展、非进展或治疗对疾病/病症的改善。本文公开的内容提供了示例性的预定水平/截止值。但应理解的是，截止值可根据测定的性质(例如，采用的抗体、反应条件、样品纯度等)而变化。此外，应该理解的是，本文公开的内容可适用于其他测定法，例如基于本文提供的描述以免疫测定法获得可用于那些其他测定法的免疫测定特异性截止值。尽管预定限度/截止值的准确值可在不同测定法之间变化，但本文所描述的相关性应当是普遍适用的。

在各种实施方案中，高于预定水平的WBP2表达水平和HER2阳性患者的样品提供与参照组相比，患者具有总体生存几率降低约4至5倍的预后。

在各种实施方案中，具有低于预定水平的WBP2表达水平和HER2阳性患者的样品提供与参照组相比，患者具有总体生存几率降低约1至2倍的预后。

在各种实施方案中，具有高于预定水平的WBP2表达水平和HER2阴性患者的样品提供与参照组相比，患者具有总体生存几率降低约2至3倍的预后。

优选每个亚组参考HER2阴性患者参照组，并且其中从HER2阴性患者参照组获得的样品具有低WBP2水平。优选地，具有高WBP2水平的HER2阳性患者的样品提供与参照组相比，患者具有总体生存几率降低约4.5倍的预后；具有低WBP2水平的HER2阳性患者的样品提供与参照组相比，患者具有总体生存几率降低约1.7倍的预后。

在各种实施方案中，具有高于预定水平的WBP2表达水平和HER2阳性患者的样品提供与参照组相比，患者具有癌症复发几率高约2至3倍的预后。

在各种实施方案中，具有低于预定水平的WBP2表达水平和HER2阳性患者的样品提供与参照组相比，患者具有癌症复发几率高约1倍的预后。

在各种实施方案中，具有高于预定水平的WBP2表达水平和HER2阴性患者的样品提供与参照组相比，患者具有癌症复发几率高约1至2倍的预后。

具有高WBP2水平的HER2阳性患者的样品提供与参照组相比，患者具有癌症复发几率高约2.6倍的预后；具有低WBP2水平的HER2阳性患者的样品提供与对照组相比，患者具有癌症复发几率高约1.1倍的预后。

在各种实施方案中，具有高于预定水平的WBP2表达水平和HER2阳性结果的样品预测患者可能对治疗有应答。

在各种实施方案中，具有低于预定水平的WBP2表达水平和HER2阳性结果的样品预测患者治疗应答的可能性较小。

WBP2是生物标志物，其可进一步将HER2阳性乳腺癌分层为对HER2拮抗剂治疗应答不良者和应答良好者的亚组。因此，高于预定水平的WBP2表达水平和HER2阳性结果表明患者将对HER2拮抗剂治疗应答良好。相反，低于预定水平的WBP2表达水平和HER2阳性结果表明患者将对HER2拮抗剂治疗应答不良或差。

本文所用的术语“治疗”及其同义词是指治疗性治疗和预防性或预防措施，其中目标是治愈、预防或减缓(减轻)癌症病症。在各种实施方案中，治疗减少患者细胞中HER2表达的量。优选地，所述治疗使得从HER2阳性患者获取的样品中的细胞所表达HER2的量降低至HER2阴性预定水平。

在各种实施方案中，治疗包括HER2拮抗剂。

在各种实施方案中，HER2拮抗剂包含赫赛汀(曲妥珠单抗)、帕妥珠单抗、拉帕替尼、拉帕替尼与卡培他滨结合、曲妥珠单抗emtansin、阿托珠单抗(Ado-trastuzumab)、奈拉替尼(Neratinib)、氨柔比星、瓦利替尼(varlitinib)或达沙替尼(Dasatinib)。

在各种实施方案中，HER2阳性胃癌治疗包括但不限于瓦利替尼、赫赛汀(曲妥珠单抗)、帕妥珠单抗和拉帕替尼治疗。HER2阳性乳腺癌治疗包括但不限于：瓦利替尼、赫赛汀(曲妥珠单抗)、帕妥珠单抗和拉帕替尼治疗。在各种实施方案中，HER2阳性胆管上皮癌(cholangiocarcinoma)治疗包括但不限于：瓦利替尼、赫赛汀(曲妥珠单抗)、帕妥珠单抗和拉帕替尼治疗。

在各种实施方案中，患者样品中的WBP2水平用适用于靶向WBP2蛋白的至少一种探针进行测量。

在各种实施方案中，探针是一种抗体。在各种实施方案中，抗体结合或接合SEQ IDNO.1所示的WBP2蛋白和/或化合物结合或接合到SEQ IDNO.1所示的WBP2蛋白。示例性抗体包括多克隆、单克隆、人源化的、双特异性的和异源缀合抗体。制备抗体的方法是本领域已知的。在各种实施方案中，根据包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的表位生成抗体。SEQIDNO.2：NH2-NDMKNVPEAFKGTKKGT-COOH。

在各种实施方案中，探针是适配体。在各种实施方案中，适配体包含寡核苷酸，其结合或接合SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白和/或结合或接合SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白的部分和/或结合或接合SEQ ID NO.2所示的WBP2肽的部分。

在各种实施方案中，探针是肽。在各种实施方案中，所述肽包含氨基酸，其结合或接合SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白和/或结合或接合SEQ IDNO.1所示的WBP2蛋白的部分和/或结合或接合SEQ ID NO.2所示的WBP2肽的部分。在各种实施方案中，所述肽的实例包括：SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列：PPGYPPPYPPPY或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列：YVQPPPPPYPGPMEPPVSGPDVPSTPAAEAKAAEAAASAY。

本文所用的术语“癌症”是指涉及异常细胞增殖的任何癌症。在各种实施方案中，所述癌症是HER2过度表达的癌症。在各种实施方案中，所述癌症是乳腺癌、或卵巢癌、或胃癌(stomach cancer)、或胃癌(gastric cancer)或子宫癌或胆管上皮癌。在各种实施方案中，所述癌症是乳腺癌。

在各种实施方案中，所述方法是体外方法。

在各种其他实施方案中，所述方法是体内方法。

本发明的另一个方面提供了用于在样品中鉴定人表皮生长因子受体2(HER2)的量和WW结构域结合蛋白质2(WBP2)的量的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)至少一个第一探针适合于检测和测量在样品中人表皮生长因子受体2(HER2)水平，以确定所述样品是HER2阳性还是HER2阴性；和(b)至少一个第二探针适合于检测和测量在样品中WW结构域结合蛋白质2(WBP2)水平。

在各种实施方案中，所述第一探针适合靶向HER2基因。本领域已知的任何HER2基因探针将是合适的。

在各种实施方案中，所述第二探针适合靶向WBP2基因。其中所述WBP2基因包含如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列：aatgacatgaagaacgtgccagaagccttcaaagggaccaagaaaggcactgtctaccttaccccttaccgggtcatctttctgtccaagggcaaggatgccatgcagtcc或者其任何片段或其互补序列。

在各种实施方案中，第一探针适合于靶向HER2蛋白质。在各种实施方案中，所述HER2蛋白包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列：

MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV。

本领域已知的或者能够结合到HER2蛋白上的任何HER2蛋白探针将是合适的。在各种实施方案中，所述HER2蛋白探针包含抗体。表2列出了目前USFDA批准的HER2检测试剂盒。

表2：FDA批准的所示HER2检测试剂盒被用来帮助评估正在考虑HER2靶向治疗的患者们。

CISH，显色原位杂交；FDA，美国食品和药物管理局；FISH，荧光原位杂交；HER2，人表皮生长因子受体2；IHC，免疫组织化学；ISH，原位杂交。

在各种实施方案中，所述第二探针适合于靶向WBP2蛋白。其中WBP2蛋白包含如SEQID NO.1所示的蛋白质序列。

在各种实施方案中，所述第一和第二探针是抗体。在各种实施方案中，所述抗体结合或接合如SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白和/或结合或接合如SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白的部分和/或结合或接合如SEQ ID NO.2所示的WBP2肽的部分。

在各种实施方案中，所述第一和第二探针是适配体。在各种实施方案中，所述适配体结合或接合如SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白和/或结合或接合如SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白的部分和/或结合或接合如SEQ IDNO.2所示的WBP2肽的部分。

在各种实施方案中，所述第一和第二探针是肽。在各种实施方案中，所述肽结合或接合如SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白和/或结合或接合如SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白的部分和/或结合或接合如SEQ ID NO.2所示的WBP2肽的部分。在各种实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO.4或SEQID NO.5所示的任何一种肽中所列的序列，或者其片段、同源物、变体或衍生物；或者包含编码任何合适的多肽探针的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽探针结合或接合如SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白和/或结合或接合如SEQ ID NO.1所示的WBP2蛋白的部分和/或结合或接合如SEQ ID NO.2所示的WBP2肽的部分或其补体。

试剂盒中提及的术语用与上述提及到的同类术语相似的方式定义。

在各种实施方案中，所述试剂盒还包括用于检查样品以确定患者的总体生存期、癌症复发或癌症治疗应答的预后的书面说明书。

在各种实施方案中，所述试剂盒还包括用于计算HER2和WBP2预定水平的书面说明书。在各种实施方案中，所述试剂盒还包括用基于本文公开的方法计算患者的总体生存期、癌症复发或对癌症治疗应答的预后的装置。在各种实施方案中，所述装置包括处理器、存储器、计算机、数据库、后端服务器、通信网络、智能电话、平板电脑、手持装置，在这样的装置或任何相似的装置上的应用，可包括或输入试剂盒测量的如细节、HER2和WBP2的水平数据和参数，同时，还可以用基于本文公开的方法计算以确定患者的总体生存期、癌症复发或癌症治疗应答的预后。

在各种实施方案中，试剂盒进一步包含组件，例如针刺活检工具、小瓶、适于获得样品的其他设备和/或用于适当检测的试剂。

本发明的另一方面提供一种体外方法用于确定总体生存期、癌症复发或治疗应答的预后，所述方法包括：(a)测量人表皮生长因子受体2(HER2)样品；(b)测量样品中WW结构域结合蛋白2(WBP2)的水平，和(c)确定HER2和WBP2的水平是高于还是低于预定水平，其中步骤(c)中的结果提供总体癌症生存期、癌症复发或癌症治疗应答的预后。

本发明的另一方面提供一种在患有癌症的患者中对于靶向EGFR或HER2治疗存活或应答的预后的方法，其包括测量患者样品中WBP2水平的步骤。

体外方法中提及的术语与用于上述提及的同类术语相似的方式定义。类似地，上述提到和描述的所有步骤可用于体外方法。

在整个本文件中，除非另有相反指示，否则术语“含有”、“由......组成”、“具有”等应被解释为非穷尽性的，或者换句话说，意指“包括但不限于”。

此外，在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”或如“包括”或“包含”的变体将被理解为暗示包含所述技术特征(integer)或技术特征的组，但不排除任何其他技术特征或技术特征的组。

如说明书中所使用的，单数形式“一(a、an)”、“该”和“所述”包括复数形式，除非上下文另有明确说明。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属的技术人员通常理解的相同含义。

本领域技术人员应当进一步认识到，上述特征的变化和组合，不是替代或替换，可被组合以形成落入本发明意图保护的范围内进一步的实施方案。

实施例

在涉及超过200个临床样本(n＝221)的分析中，发现WBP2与HER2组合在预测更差的总体生存期和无病生存期中比单独的WBP2或HER2更强大(参见下面表3和图1)。参考仅测量HER2阳性和HER2阴性(图1C和1D)的分层并测量具有低WBP2水平的HER2阴性患者、具有高WBP2水平的HER2阴性患者、具有低WBP2水平的HER2阳性患者和具有高WBP2水平的HER2阳性患者的分层，所见差异更大。例如，参考具有低WBP2水平的HER2阴性患者，具有高WBP2水平的HER2阳性患者的总体存活几率低约4.5倍，而在具有低WBP2水平的HER2阳性患者中低约1.7倍；并且高WBP2水平的HER2阳性患者的复发几率高约2.6倍，而低WBP 2水平的HER2阳性患者高约1.1倍(图1A和1B)。HER2和WBP2过表达以及HER2和WBP2正常表达水平之间存在相关性(图1E和1F)。

价值主张：1)WBP2可用于将HER2阳性乳腺癌分层为低度和高度侵袭性的病例以进行治疗和监测；2)WBP2赋予HER2+病例侵袭性并预测对HER2拮抗剂治疗有应答，治疗包括但不限于赫赛汀(曲妥珠单抗)、帕妥珠单抗和拉帕替尼治疗。大于1的IHC评分表明高WBP2水平，而IHC评分为1或更低表明低WBP2水平。

表3

抗体

通过NeoMPS公司(NeoMPS,Inc)，我们基于SEQ ID NO.2(N′-NDMKNVPEAFKGTKKGT-C′)肽序列中所示的17个氨基酸产生针对WBP2的内部(in-house)多克隆抗体，所述抗体通过亲和纯化并且在WBP2特异性和对照肽的存在下，通过用免疫前血清的比较免疫沉淀、外源表达的带标签的WBP2蛋白的相互免疫以及用抗标签和抗WBP2抗体的免疫印迹进行严格验证(数据--未显示)。抗PY20-HRP，获自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BD生物科学公司(BD-Biosciences，San Diego，California，USA)。抗HER2抗体是本领域已知的并且可从任何市售登记的诊断试剂盒获得。对于本研究，HER2诊断试剂盒从美国罗氏分子系统公司(Roche MolecularSystems Inc.USA)的HER2诊断试剂盒获得。

样品

在原始切除后的时间点的221个临床样品包括原始切除和随访活检是从新加坡的几个医院征得同意后在大量时间范围内收集的。

在免疫印迹分析(图2A)中，显示WBP2介导了EGF/HER2信号传导，且显示WBP2是靶向EGFR/HER2的药物的响应的潜在预测物。通过转染HER2的siRNA在人乳腺癌SK-BR-3细胞中敲低HER2。使用萤光素酶的siRNA作为阴性对照。细胞血清饥饿24小时后用50ng/ml EGF处理10分钟。细胞裂解物用抗WBP2抗体免疫沉淀(IP)，并利用抗磷酸酪氨酸(PY20)的抗体通过Western印迹(IB)分析内源WBP2的磷酸化。用所述的抗体通过Western印迹(IB)分析HER2和EGFR的磷酸化。使用β-微管蛋白作为蛋白质上样对照。

WBP2的磷酸化似乎取决于HER2的表达。通过使用萤光素酶的siRNA作为阴性对照，当通过转染HER2的siRNA在人乳腺癌细胞SK-BR-3(图2B)和ZR-751(图2C)中敲低HER2时，WBP2的磷酸化增加。在细胞血清饥饿24小时后，用50ng/ml EGF处理10分钟。细胞裂解物用抗WBP2抗体免疫沉淀(IP)，并利用抗磷酸酪氨酸(PY20)的抗体和抗WBP2的抗体通过Western印迹(IB)分析内源WBP2的磷酸化。用所述的抗体通过Western印迹(IB)分析HER2的磷酸化。使用β-微管蛋白作为蛋白质上样对照。

体外模型

检查了三种不同的乳腺癌细胞系，以HER2过表达为特征的BT-474人乳腺癌细胞、SK-BR-3乳腺癌细胞和ZR-75-30乳腺癌细胞系。用不同浓度的曲妥珠单抗(0,1,10,100μg/ml)处理细胞3天(SK-BR-3)或5天(BT-474和ZR-75-30)。

过表达WBP2和HER2的细胞对HER2拮抗剂如曲妥珠单抗更敏感。曲妥珠单抗的剂量应答与WBP2的表达水平影响细胞增殖。当用曲妥珠单抗处理时，与以过表达HER2为特征但没有增强表达的WBP2的BT-474人乳腺癌细胞相比，使用表达WBP2的慢病毒在以过表达HER2为特征的BT-474人乳腺癌细胞中过表达WBP2会导致细胞增殖更大程度的减少(图3A和3B)。类似地，在SK-BR-3乳腺癌细胞中使用靶向WPB2的两种不同的shRNA敲低WBP2时，曲妥珠单抗治疗在减少细胞增殖方面不太成功(图3C和3D)。同样当在乳腺癌细胞系ZR-75-30中使用靶向WBP2的两种不同siRNA时，曲妥珠单抗治疗在降低细胞增殖方面不太成功(图3E和3F)。以每孔10,000个细胞将细胞铺在96孔板上用于2D培养(A和C)或铺在96孔超低附着板以用于3D培养(B和D)。在用曲妥珠单抗孵育3天(SK-BR-3)或5天(BT-474)后，通过使用CellTitre 96aqueous非放射性细胞增殖测定来测量细胞的生存力。通过与曲妥珠单抗未处理的对照细胞相比的倍数变化计算细胞生存力。数据代表平均值±SD。通过Student t检验(*或+P<0.05；**或++P<0.01；***或+++P<0.001，相对于载体或对照)确定统计显著性。

上文列出的曲妥珠单抗剂量应答实验期间的蛋白质表达谱和图3证明了类似的模式。当WBP2过表达时，与WBP2表达被敲低时相比，HER2的表达水平对HER2拮抗剂更敏感。当使用表达WBP2的慢病毒(图4A)在以HER2过表达为特征的BT-474人乳腺癌细胞中过表达WBP2时，磷酸化的HER2、HER2、磷酸化的EGFR、EGFR和磷酸化的AKT全部在较高剂量的曲妥珠单抗治疗下降低。相反，当使用靶向WPB2的两种不同的shRNA在SK-BR-3乳腺癌细胞中敲低WBP2时，HER2表达几乎没有变化(图4B)。当使用靶向WBP2的两种不同的siRNA在ZR-75-30乳腺癌细胞中敲低WBP2时，在较高剂量的曲妥珠单抗治疗中仅观察到磷酸化AKT的减少(图4C)。

体内模型

所有的动物房和处理程序都符合新加坡国立大学的机构指南。对于异种移植模型，向5周龄雌性无胸腺裸鼠(n＝6-7，In Vivos，Singapore)植入0.72mg 60天释放的17β-雌二醇微丸(Innovative Research，Sarasota，FL，USA)，2天后，将BT-474对照(载体)或WBP2过表达细胞(1×10⁷个在200μl(磷酸盐缓冲液)DPBS和(基质胶)Matrigel 1:1混合物中)皮下注射到小鼠乳腺脂肪垫中。BT-474人乳腺癌的特征在于人表皮生长因子受体2(HER-2)和雌激素受体(ER)的过度表达。BT-474细胞响应雌二醇而生长。需要补充雌二醇来建立无胸腺裸鼠的异种移植模型。

当肿瘤达到150-200mm³时，将小鼠分成组，保持组间平均肿瘤大小相似，并用曲妥珠单抗(10mg/kg，Roche)或PBS(对照)通过腹膜内给药(IP)每周两次处理3周。用游标卡尺每周测量肿瘤大小两次，肿瘤体积的计算如下：体积＝(宽度×宽度×长度)/2。数据表示为平均值±SEM。统计显著性由Mann-Whitney检验确定。

在35天治疗中绘制肿瘤体积中的应答(图5A)。可看出，当用PBS或曲妥珠单抗分别处理时，用BT-474人乳腺癌诱导的肿瘤大小相应地增加或减小。在用WBP2过表达细胞诱导的肿瘤中观察到类似的趋势。在图5B中绘制每个时间点，其中计算每个治疗的平均肿瘤体积大小和SEM统计学显著性。表4总结了结束点数据分析。

表4：肿瘤体积的结束点数据分析

相似结果可从患者来源的异种移植模型(PDX)中获得，其中所述PDX模型包括：组1WBP2低、HER2阴性PDX模型；组2WBP2低、HER2阳性PDX模型；组3WBP2高、HER2阴性；和组4WBP2高、HER2阳性。每组用曲妥珠单抗(10mg/kg，Roche)或PBS(对照)进行腹膜内给药处理，并且每周用游标卡尺对肿瘤大小进行测量两次，且肿瘤体积计算如下：体积＝(宽度²×长度)/2。组2具有的平均肿瘤体积大于组4(数据未显示)。

本领域技术人员将会意识到，除了具体描述的那些以外，本文所描述的本发明易于进行变化和修改。本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中提到或指出的所有的步骤、特征、配方和化合物，单独或共同以及任何和所有组合或任何两个或更多的步骤或特征。

本文所引用的每个文件、文献、专利申请或专利通过引用明确地全文合并入本文，这意味着读者应当将其作为本文的一部分来阅读和考虑。本文所引用的文件、参考文献、专利申请或专利不再在本文中重复，这仅仅是出于简洁的原因。

本文提及任何产品的任何制造商的介绍、说明书、产品规格和产品说明书或通过引用合并入本文的任何文件，通过引用本文特此合并，并且可被用来实践本发明。

本发明在范围上不被本文描述的任何特定的实施方案所限制。这些实施方案仅仅用于达到范例的目的。功能上等同的产品、制剂和方法显然在如本文描述的本发明的范围内。

本文所描述的本发明可包括一个或多个范围值(例如：大小、浓度等)。范围值将会被理解为包括该范围内的所有值，包括定义该范围的值，以及与该范围相邻的值，紧邻的值导致与定义该范围边界的值相同的或基本相同的结果。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，单词“包括”或如“含有”或“包含”的变体，将会被理解为暗示包含指定的技术特征(integer)或技术特征组，但不排除任何其他技术特征或技术特征组。还要注意的是，在本公开内容中，且特别是在权利要求书中和/或段落中，诸如“包括”、“含有”、“包含”等类似的术语具有美国专利法中赋予它们的含义；例如，他们可表示“包含”、“含有、”“包括”等；并且诸如“基本上由……组成”、“基本上由……构成”这类术语具有美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许未明确列举的元素，但是排除现有领域中发现的或者影响本发明的基本或新颖性特征的元素。

本文所用到的选定术语的其他定义可在本发明的详细描述内找到并且贯穿始终。除非另外的定义，否则本文使用的所有其他科学和技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

序列表

<110> 新加坡国立大学

林允斌

<120> WBP2与HER2作为共预后因子对患者分层以进行治疗

<130> 2016.P00286

<150> SG 10201505756X

<151> 2015-07-23

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Leu Asn Lys Asn His Ser Glu Gly Gly Gly Val Ile Val Asn

1 5 10 15

Asn Thr Glu Ser Ile Leu Met Ser Tyr Asp His Val Glu Leu Thr Phe

20 25 30

Asn Asp Met Lys Asn Val Pro Glu Ala Phe Lys Gly Thr Lys Lys Gly

35 40 45

Thr Val Tyr Leu Thr Pro Tyr Arg Val Ile Phe Leu Ser Lys Gly Lys

50 55 60

Asp Ala Met Gln Ser Phe Met Met Pro Phe Tyr Leu Met Lys Asp Cys

65 70 75 80

Glu Ile Lys Gln Pro Val Phe Gly Ala Asn Tyr Ile Lys Gly Thr Val

85 90 95

Lys Ala Glu Ala Gly Gly Gly Trp Glu Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Leu

100 105 110

Thr Phe Thr Ala Gly Gly Ala Ile Glu Phe Gly Gln Arg Met Leu Gln

115 120 125

Val Ala Ser Gln Ala Ser Arg Gly Glu Val Pro Ser Gly Ala Tyr Gly

130 135 140

Tyr Ser Tyr Met Pro Ser Gly Ala Tyr Val Tyr Pro Pro Pro Val Ala

145 150 155 160

Asn Gly Met Tyr Pro Cys Pro Pro Gly Tyr Pro Tyr Pro Pro Pro Pro

165 170 175

Pro Glu Phe Tyr Pro Gly Pro Pro Met Met Asp Gly Ala Met Gly Tyr

180 185 190

Val Gln Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Gly Pro Met Glu Pro Pro Val

195 200 205

Ser Gly Pro Asp Val Pro Ser Thr Pro Ala Ala Glu Ala Lys Ala Ala

210 215 220

Glu Ala Ala Ala Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Gly Asn Pro His Asn Val

225 230 235 240

Tyr Met Pro Thr Ser Gln Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Tyr Pro Pro Glu

245 250 255

Asp Lys Lys Thr Gln

260

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asn Asp Met Lys Asn Val Pro Glu Ala Phe Lys Gly Thr Lys Lys Gly

1 5 10 15

Thr

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Pro Pro Gly Tyr Pro Pro Pro Tyr Pro Pro Pro Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Tyr Val Gln Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Gly Pro Met Glu Pro Pro

1 5 10 15

Val Ser Gly Pro Asp Val Pro Ser Thr Pro Ala Ala Glu Ala Lys Ala

20 25 30

Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Tyr

35 40

<210> 5

<211> 111

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

aatgacatga agaacgtgcc agaagccttc aaagggacca agaaaggcac tgtctacctt 60

accccttacc gggtcatctt tctgtccaag ggcaaggatg ccatgcagtc c 111

<210> 6

<211> 1255

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

35 40 45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

50 55 60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

65 70 75 80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

85 90 95

Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

100 105 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

115 120 125

Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

130 135 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

145 150 155 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

165 170 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

180 185 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

195 200 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210 215 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

225 230 235 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

245 250 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

260 265 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

340 345 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

355 360 365

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

370 375 380

Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

385 390 395 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

405 410 415

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

420 425 430

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu

435 440 445

Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

450 455 460

Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

465 470 475 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

485 490 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

500 505 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

515 520 525

Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

530 535 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

545 550 555 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

565 570 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

580 585 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

595 600 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

610 615 620

Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

625 630 635 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser

645 650 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

660 665 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

675 680 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

690 695 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

705 710 715 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

725 730 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

740 745 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

755 760 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

770 775 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

785 790 795 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

805 810 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

820 825 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

835 840 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

850 855 860

Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

865 870 875 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

885 890 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

900 905 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

915 920 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

930 935 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

945 950 955 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

965 970 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

980 985 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu

995 1000 1005

Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr

1010 1015 1020

Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly

1025 1030 1035

Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg

1040 1045 1050

Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu

1055 1060 1065

Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser

1070 1075 1080

Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu

1085 1090 1095

Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser

1100 1105 1110

Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val

1115 1120 1125

Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro

1130 1135 1140

Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro

1145 1150 1155

Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu

1160 1165 1170

Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly

1175 1180 1185

Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala

1190 1195 1200

Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp

1205 1210 1215

Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro

1220 1225 1230

Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr

1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

1250 1255

1

Claims

1.探针在制备用于预后患有乳腺癌的患者对于用HER2拮抗剂的治疗的应答的试剂盒中的用途，其中所述探针包括：

(a)至少一种第一探针，其适于检测和测量样品中的人表皮生长因子受体2(HER2)水平以基于HER2的预定水平确定所述患者是HER2阳性还是阴性；

(b)至少一种第二探针，其适于检测和测量所述患者的样品中的WW结构域结合蛋白质2(WBP2)的水平，其中所述试剂盒包含用于进行比较的来自对照群体的一组预定表达水平结果，并且其中所述对照群体被分层为确定癌症侵袭性的多个亚组；和

其中具有高于预定水平的WBP2表达水平和HER2阳性结果的样品预测所述患者可能对治疗有应答以及具有低于预定水平的WBP2表达水平和HER2阳性结果的样品预测所述患者对治疗有应答的可能性较小。

2.根据权利要求1所述的用途，其中每个亚组均参考自包含低于所述预定水平的WBP2表达的HER2阴性结果的参照组。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述HER2拮抗剂包括赫赛汀(曲妥珠单抗)、帕妥珠单抗、拉帕替尼、拉帕替尼与卡培他滨、曲妥珠单抗emtansin、阿托珠单抗、奈拉替尼、或达沙替尼。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述第一和第二探针是抗体。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述第二探针是适配体。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述第二探针是肽。