CN107847761B - 具有抗病毒活性的类胡萝卜素组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含类胡萝卜素的组合物，该类胡萝卜素具体地为八氢番茄红素和六氢番茄红素，该组合物可用于延缓病毒感染，具体地为通过调节针对细胞或组织内病毒感染的至少一种反应。该细胞或组织可以是受试者的从而延缓该受试者中的病毒感染；或者可以是分离的，特别是以细胞或组织培养物的形式，特别用于在筛选抗病毒剂的方法中使用。

Description

具有抗病毒活性的类胡萝卜素组合物及其用途

技术领域

本发明涉及包含类胡萝卜素的组合物，该类胡萝卜素具体地为八氢番茄红素和六氢番茄红素，该组合物可用于延缓受试者中的病毒感染并可在筛选抗病毒剂的方法中使用。

背景技术

病毒是仅在其他生物的活细胞内复制的一种小的感染剂。病毒可感染从动物和植物到微生物(包括细菌和古生菌)的各种生命形式。病毒感染通常在受累及的受试者中引起疾病症状，这些疾病症状可以从导致发病和死亡的轻度至重度症状变化。

与病毒感染相关联的最恣意的症状之一是人类呼吸系统疾病。由病毒引起的人类呼吸道疾病的例子包括由各种流感病毒引起的流感、由冠状病毒(SARS-CoV)引起的严重急性呼吸综合征(SARS)、由腺病毒引起的呼吸系统疾病，以及由呼吸道合胞病毒(RSV)引起的支气管炎和儿童肺炎。

许多其他严重疾病例如埃博拉病毒病、艾滋病和单纯疱疹病毒1型 (HSV-1)是由病毒引起的。HSV-1是一种攻击神经细胞的病毒，在其他条件下引起感冒疮(cold sore，唇疱疹)。

流行性感冒，俗称“流感”，是由流感病毒引起的传染病。流感在每年爆发中在世界各地传播，导致大约三百万至五百万例严重疾病以及约 250,000至500,000人死亡。死亡多数发生在幼儿、老年人和其他有健康问题的人群中。流感的并发症可包括病毒性肺炎、继发性细菌性肺炎、鼻窦感染以及先前健康问题例如哮喘或心力衰竭的恶化。

通常，流感病毒通过咳嗽或打喷嚏在空气中传播。认为它主要发生在相对较短的距离。也可以通过触摸被病毒污染的表面，然后触摸口腔或眼睛来传播。经常洗手和戴外科口罩是常见的预防方法。

三种主要的流感亚型引起该疾病：甲型、乙型和丙型流感，这是根据他们的抗原决定簇进行分类。该流感病毒体由单链RNA基因组组成，该单链RNA基因组与核蛋白(NP)密切相关联并被脂蛋白包膜封闭，该脂蛋白包膜以基质蛋白(M1)为衬里(line)并携带两种主要的表面糖蛋白抗原——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA和NA糖蛋白最易改变；例如，存在16个免疫型(class)的HA和9种不同NA型，这为不同的流感病毒亚型如H1N1或H3N2提供了基础。甲型流感病毒具有另外的跨膜糖蛋白M2，M2在不同的HN亚型之间高度保守。M2 基因编码在病毒体细胞表面上以四聚体表达的具有96至97个氨基酸的蛋白质。它由约24个胞外氨基酸、约19个跨膜氨基酸和约54个细胞质残基构成。

常用于对抗流感的两类抗病毒药物是神经氨酸酶抑制剂(例如以商品名“Tamiflu”售卖的奥司他韦，以及扎那米韦)和M2蛋白抑制剂(金刚烷衍生物)。对神经氨酸酶抑制剂的研究表明，对于那些在其他方面健康的患者，其益处可能不会大于服用药物所涉及的风险，而对于那些有其他健康问题的患者，其益处可能是完全缺乏的。抗病毒药物金刚烷胺和金刚乙胺抑制病毒离子通道(M2蛋白)，由此抑制甲型流感病毒的复制。如果在感染早期施用，这些药物有时对甲型流感有效，但对缺乏 M2药物靶标的乙型流感病毒无效。测得的H3N2的美国分离株对金刚烷胺和金刚乙胺的抗药性在2005年已上升到91％。据了解疾病控制中心(CDC)由于高度抗药性已不推荐使用M2抑制剂。世界卫生组织建议对高危人群每年接种一次流感疫苗。然而，因为该病毒迅速地进化，针对一年的废弃病毒制备的疫苗在下一年可能没有用处。一种治疗流感疾病安全有效的药剂目前是医疗界和普通人群尚未满足的需求。

类胡萝卜素是由植物、藻类和光合成细菌合成的超过600种天然存在的有机色素成员的家族。类胡萝卜素可以由所有这些生物的脂肪和其他基本的有机代谢砌块(building block)产生。人类不能产生类胡萝卜素，但他们能够从其饮食中积累类胡萝卜素。

类胡萝卜素分为两类，叶黄素(含氧)和胡萝卜素(纯烃类，且不含氧)。所有的类胡萝卜素都是四萜类，意味着它们是由8个异戊二烯分子产生，并含有40个碳原子。含有未取代的β-紫罗酮环的类胡萝卜素(包括β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-隐黄质和γ-胡萝卜素)具有维生素A活性(意味着它们可以转化为视黄醛(retinal))。

非维生素A原类胡萝卜素(包括八氢番茄红素和六氢番茄红素)——来自胡萝卜素类的类胡萝卜素——是有可见色的类胡萝卜素(例如番茄红素)的生物合成途径中的前体类胡萝卜素。八氢番茄红素和六氢番茄红素分子在可见光范围内是无色的，意味着它们只吸收UV范围内的光。八氢番茄红素和六氢番茄红素作为抗氧化剂、抗炎剂、UV防护剂和皮肤增白剂对人类健康的益处已经在先前由本发明的一些发明人及同事披露。

类胡萝卜素长期以来被认为具有促进健康的特性，通常归因于其抗氧化和抗炎作用。因此，基于抗氧化和抗炎活性对免疫系统的功能和身体总体强度的间接贡献，类胡萝卜素也已被建议作为抗病毒剂。

美国专利申请公开号2007/0031356和US 2011/0082218披露了UV 介导的β-胡萝卜素对促炎基因表达的影响。Lin H-W等人(2012.Food Chem[食品化学]134:2169-2175)描述了β-胡萝卜素的抗炎作用及其作为DNA病毒感染的抗炎剂的潜在用途。Wertz K等人(2005.J Invest Dermatol[皮肤病学研究杂志]124:428-434)和Torma H等人(2014.ArchDermatol Res[皮肤病研究文献]306:739-747)，Balmer J E和Blomhoff R. (2002.JLipid Res.[脂质研究杂志]43:1773-1808)，Bertram J H和 Bortkiewicz H.(1995.Am JClin Nutr 62(suppl)[美国临床营养学杂志62 (增刊)]:1327S-36S)并描述了视黄酸介导的细胞基因表达。然而，这些出版物都没有提出这些表达的基因对防止病毒感染的潜在作用。

美国专利No.5,514,667披露了局部制剂用于局部治疗皮肤和粘膜的疱疹病毒感染的用途，该局部制剂包含抗病毒药物和作为抗炎或抗氧化药物的增效药物的组合。类胡萝卜素被提及作为增强药物活性的可能的抗氧化剂。披露的优选制剂包括多硫戊聚糖锌与丁苯羟酸的组合。

德国专利申请公开No.DE202005007462披露了用于对抗慢性病毒感染的药剂或营养补充剂组合物，其包含维生素C、维生素E、辅酶Q10、类胡萝卜素、硒、锌和铜。

美国专利申请公开No.2009/0169586披露了一种制备稳定的包装剂型的方法，其包含氧化敏感性材料，例如杜氏藻属的整体干燥的藻，其富含被认为对人类健康有价值的类胡萝卜素的混合物(包括β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、植物黄体素(lutein，叶黄素)、玉米黄质和隐黄质)以及各种矿物质和其他营养成分。该申请披露了使用包含干燥杜氏藻的剂型来治疗或预防各种病症(包括真菌和病毒感染)的方法。还披露了用于补充受试者的饮食的方法、维持或改善受试者的总体健康的方法、以及促进受试者的美黑的方法。

美国专利申请公开No.20110217244披露了氧化转化的类胡萝卜素或其组分用以增强受试者的免疫反应以治疗感染，或用以增强被免疫的受试者对抗原的免疫反应的用途。还披露了含有氧化转化的类胡萝卜素的药物组合物和试剂盒。

对于具有抗病毒作用，特别是针对流感病毒的、有效且安全使用的组合物存在未满足的需要，并且具有该组合物将是非常有利的。

发明内容

本发明披露了八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合和包含该组合的组合物用于延缓病毒感染的用途。

本发明部分是基于意外的发现，即八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合在降低病毒粒子(更特别地是流感病毒粒子)、体外孵育后的病毒粒子的数量以及降低体内病毒粒子负载方面是非常有效的。还显示该组合对细胞和身体对抗病毒攻击的防御机制所涉及的基因的表达具有直接影响，从而提供了针对感染的保护机制。该组合在诱导减少病毒RNA 合成、RNA翻译和蛋白质合成所涉及的基因的表达方面非常有效，从而延缓病毒的复制。

还显示该组合减少编码促进病毒在细胞内运动的马达蛋白的基因的表达，从而减少维持病毒复制和感染所需的病毒运动。

还显示该组合减少病毒进入宿主细胞所必需的基因的表达，从而减少病毒的进一步传播和感染。

还显示该组合影响操纵(hijack)宿主细胞功能所涉及的基因的表达，特别是降低DNA复制和转录所必需的基因的表达。

不希望受任何具体理论或作用机制的束缚，本发明的组合物的抗病毒作用可归因于多种细胞抗病毒机制的诱导，这些细胞抗病毒机制导致病毒结合并进入宿主细胞减少；DNA/RNA复制、翻译和合成减少；以及病毒到邻近的宿主细胞的传播减少。所提出的作用模式均没有在先期归因于维生素A原化合物或其他类胡萝卜素。

意外发现八氢番茄红素和六氢番茄红素独立于中枢免疫系统反应的激活、经由先天细胞防御机制有效地延缓病毒感染，这为长期以来具有受损或未充分发育的免疫系统的个体对于抗病毒治疗的需要提供了解决方案，这些个体包括与疾病相关联的免疫受损个体、孕妇、儿童和老年人。这些对病毒感染及其并发症高度易感的人群最需要抗病毒疗法，但这受到完全通过中枢免疫系统发挥作用的药物的不利的和/或不充分的影响。

此外，意外发现八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合独立于中枢免疫系统反应、经由先天细胞防御机制有效地延缓病毒感染，这允许将该组合用作分析剂，特别是在体外测试中作为阳性对照筛选有效的抗病毒化合物。

根据一个方面，本发明提供了一种延缓有需要的受试者的细胞或组织的病毒感染的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合，由此延缓病毒感染。

根据某些实施例，延缓病毒感染包括调节针对在该受试者的细胞或组织内的病毒感染的至少一种反应。

根据某些实施例，其中针对病毒感染的反应选自由以下各项组成的组：防止和/或延缓病毒粘附和/或渗透进入受试者细胞或组织；抑制在包含该病毒的受试者细胞内的病毒复制；延缓在包含该病毒的细胞中由病毒对至少一种细胞功能的操纵；延缓该病毒从包含该病毒的细胞传播到至少一个另外的细胞中；诱导与遏制该病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达；以及抑制与诱导该病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。

如本文所用，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的“有效量”这一术语是指在如本文所述的，调节针对细胞或组织内的病毒感染的至少一种反应中有效的量。

根据某些实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的有效量为至少0.05μM。根据其他实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的有效量为至少0.1μM、至少0.2μM、至少0.3μM、至少0.4μM、至少0.5μM、至少1.0μM、至少2.0μM、至少4.0μM、至少6.0μM、至少8.0μM或至少10.0μM。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。根据某些示例性实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的有效量为约0.05μM至约100μM。根据另外的某些示例性实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的有效量为约0.2μM至约100μM。

根据某些实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合是在组合物内施用。

根据某些当前的示例性实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素是处于其天然形式。八氢番茄红素、六氢番茄红素或其组合可以从天然来源分离，化学产生或使用重组方法产生。

根据某些实施例，包含八氢番茄红素和六氢番茄红素组合的组合物还包含至少一种选自由以下各项组成的组的另外的成分：氨基酸、肽、多肽、脂肪酸、脂肪、糖化合物、除八氢番茄红素和六氢番茄红素之外的类胡萝卜素，或其组合。根据这些实施例可以存在于组合物中的除八氢番茄红素和六氢番茄红素以外的类胡萝卜素选自由以下各项组成的组：ζ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、玉米黄质、虾青素、植物黄体素、角黄素、链孢红素等，包括它们的所有立体异构体、衍生物及其任何组合。

根据又其他实施例，除八氢番茄红素和六氢番茄红素外的类胡萝卜素属于叶黄素类。根据另外的实施例，除八氢番茄红素和六氢番茄红素外的类胡萝卜素是非维生素A原类胡萝卜素。

根据一些实施例，该组合物基本上不含原维生素A类胡萝卜素化合物。根据这些实施例，该组合物包含占该组合物的总类胡萝卜素含量的少于20％的原维生素A类胡萝卜素化合物，占该组合物的总类胡萝卜素含量的小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％或更少的原维生素A类胡萝卜素化合物。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。根据一些实施例，该组合物包含占该组合物的总类胡萝卜素含量的不可检测的量到10％的原维生素A类胡萝卜素化合物。

根据一些实施例，该组合物本质上不含β-胡萝卜素。根据这些实施例，该组合物包含占该组合物的总类胡萝卜素含量的少于20％的β-胡萝卜素，占该组合物的总类胡萝卜素含量的小于15％、小于10％、小于5％、小于1％或更少的β-胡萝卜素。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。根据一些实施例，该组合物包含占该组合物的总类胡萝卜素含量的不可检测的量到10％的β-胡萝卜素。

根据某些实施例，受试者感染了该病毒。

根据一些实施例，延缓受试者的细胞或组织的病毒感染导致延缓病毒感染的发作。

根据实施例，延缓受试者的细胞或组织的病毒感染导致与病毒感染相关或由该病毒感染引起的至少一种症状的严重程度的预防、改善、延缓、抑制、减轻中的至少一者及其任何组合。

根据这些实施例，本发明提供了用于治疗受试者的病毒感染的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物。

根据某些实施例，该受试者选自由人类和动物组成的组。根据某些示例性实施例，该受试者是人类。

不希望受任何理论或作用机制的束缚，在无需激活或适度激活该受试者的全身免疫系统的情况下，如本文所披露的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合对靶向于对抗病毒感染的细胞机制的直接作用可以提供足够的保护，使得该组合非常适合施用至免疫系统受抑制或患有免疫抑制相关疾病的受试者。

因此，根据一些实施例，该受试者是具有受损的免疫系统的受试者。根据其他实施例，该受试者受免疫抑制相关疾病的累及。根据另外的实施例，该受试者正在接受或已经正在接受免疫抑制治疗。根据某些示例性实施例，该免疫受损的受试者选自由儿童、老人和孕妇组成的组。

根据某些实施例，该病毒感染是流感病毒或其亚型的感染。根据一些实施例，该病毒感染是甲型流感病毒的亚型的感染。根据其他实施例，该病毒感染是乙型流感病毒的亚型的感染。根据另外的实施例，该病毒感染是丙型流感病毒的亚型的感染。

根据某些示例性实施例，该流感病毒株选自由N1H1PR8和H3N2 组成的组。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。

根据某些实施例，本发明的方法适用于延缓该流感病毒的多种变体的感染。

根据其他当前的示例性实施例，该病毒是单纯疱疹病毒1型 (HSV-1)。

根据又另外的实施例，该方法适用于延缓多种病毒类型的感染。

根据本发明的教导，可以使用本领域已知的用于施用根据本发明的教导的包含八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合物的任何方法。

根据某些实施例，该组合物是还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物。

根据其他实施例，该组合物是还包含可食用赋形剂、稀释剂或载体的可食用组合物。根据一些实施例，该可食用组合物是营养食品 (nutraceutical)组合物或营养补充剂。

根据一些实施例，该药物组合物是经口服、鼻内、经颊、舌下、局部、皮下和/或静脉内途径来施用。根据其他实施例，该组合物是经吸入和/或雾化来施用。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。

根据又其他实施例，本发明的方法还包括向该受试者施用选自由以下各项组成的组的另外的药剂：抗病毒剂、疫苗、抗体、抗氧化剂、传统草药药剂、顺势疗法药物(homeopathic remedy)、包含它们的组合物、以及其任何组合。

根据某些实施例，包含根据本发明的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合物和另外的药剂是以单一组合物来施用。

根据其他实施例，该八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合和该至少一种另外的药剂是以分开的组合物来施用。根据这些实施例，可以同时地、相伴地、顺序地和/或交替地施用这些组合物。

八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物的给药频率、用量和持续时间取决于受试者的一般健康状况、年龄、性别、体重和病毒感染的发生等。根据一些实施例，将八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物每天施用一至八次。根据一些实施例，将八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物预防性地施用。

根据另外的方面，本发明提供了有效量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物，以在延缓受试者的细胞或组织的病毒感染中使用。该组合物和待处理的病毒如上文所述。

根据另外的方面，本发明提供了用于延缓分离的细胞或组织的病毒感染的方法，该方法包括向该细胞或组织施用有效量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物。根据某些实施例，该分离的细胞或组织形成细胞培养物或组织培养物的一部分。

根据一些实施例，延缓培养物的细胞或组织的病毒感染导致延缓病毒感染的发作。根据一些实施例，延缓细胞或组织的病毒感染导致调节针对在该细胞或该组织内的病毒感染的至少一种反应。

根据某些实施例，该细胞反应选自由以下各项组成的组：防止和/ 或延缓病毒粘附和/或渗透进入细胞或组织；延缓在包含该病毒的受试者细胞内的病毒复制；延缓在包含该病毒的细胞中由病毒对至少一种细胞功能的操纵；延缓该病毒从包含该病毒的细胞传播到至少一种另外的细胞中；诱导与遏制该病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达；以及抑制与诱导该病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。

根据一些实施例，在确定测试化合物的抗病毒活性中，施用用于延缓分离的细胞或组织的病毒感染的该八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物提供了阳性对照，其中该测试化合物是在相同的实验条件下被施用至相同类型的细胞或组织。根据一些实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物是以被认为在延缓病毒感染中具有治疗效果的量施用。根据其他实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物是以针对所使用的细胞或组织类型进行过调整(calibrate)的量施用。

从下面的描述和附图中，本发明的其他目的、特征和优点将变得清晰。根据下文给出的详细描述，本发明的另外的实施例和全部适用范围将变得清楚。然而，应理解的是，尽管指出了本发明的优选实施例，但是详细描述和具体实例仅仅是以说明的方式给出的，因为根据此详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得清楚。

附图说明

图1证明八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合(COMP1)对MDCK 细胞没有细胞毒性作用。

图2显示八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合(COMP1)对MDCK 细胞中流感病毒(H1N1PR8)的密度(density，浓度)的抑制作用。

图3显示用COMP1处理或未处理的HSV-1感染的人肾细胞的龙胆紫染色。被称为有效的HSV1药物的阿昔洛韦充当阳性对照。

图4显示八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合(COMP1)对流感病毒粒子数量的体内抑制作用。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“八氢番茄红素”是指7,7',8,8',11,11',12,12'-八氢 -psi-psi-胡萝卜素，包括其所有立体异构体。八氢番茄红素的合成是植物中类胡萝卜素合成的第一关键步骤。八氢番茄红素是由两分子牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯(geranylgeranylpyrophosphate，GGPP)通过八氢番茄红素合酶的作用产生的。八氢番茄红素是非维生素A原胡萝卜素。

术语“六氢番茄红素”是指15-顺式,7,8,11,12,7',8'-六氢-psi-psi-胡萝卜素，包括其所有立体异构体和衍生物。六氢番茄红素是由八氢番茄红素在导致形成五个共轭双键的去饱和反应中形成。六氢番茄红素是非维生素A原胡萝卜素。

使用以下等式用分光光度法测量如本文所披露的八氢番茄红素和六氢番茄红素的摩尔量：

O.D*稀释因子(＝浓度mg/ml)/八氢番茄红素/六氢番茄红素系数，其中

八氢番茄红素在己烷和乙醇中的消光系数为915且在乙酸乙酯中的消光系数为870；并且

六氢番茄红素在己烷和乙醇中的消光系数为1557，且在乙酸乙酯中的消光系数为1480；并且其中八氢番茄红素的O.D是在284-288nm处获得的，以及六氢番茄红素的O.D是在345-248nm处获得的。

如本文所用，关于病毒感染的术语“延缓”或“延缓的”是指在其最广泛的范围内使用以延迟、中止、中断或完全抑制被病毒采用以便生存、复制和传播以致引起细胞感染的所有活性和机制。

如本文所用，术语“有效量”是指足以延缓在受试者体内或在体外细胞或组织培养物中的细胞或组织的病毒感染的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的量。根据本发明的某些实施例，延缓细胞或组织的病毒感染包括调节针对病毒的至少一种细胞反应，导致该病毒入侵、复制和传播减少中的至少一种。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指进一步可有效治疗被病毒累及或疑似被病毒累及或容易被病毒累及的受试者的、如上文所述的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的有效量。如本文所用，术语“治疗”是指延缓病毒感染的发作和/或预防、改善、延缓、减轻与病毒感染相关联的或由病毒感染引起的至少一种症状的严重程度，及其任何组合。

根据一个方面，本发明提供了一种延缓有需要的受试者的细胞或组织的病毒感染的方法，该方法包括向该受试者施用包含有效量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合物，由此延缓或抑制该病毒感染。

根据另一个方面，本发明提供了一种抑制有需要的受试者的细胞或组织的病毒感染的方法，该方法包括向该受试者施用包含有效量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合物，由此延缓或抑制该病毒感染。

根据某些实施例，延缓病毒感染包括调节针对在该受试者的细胞或组织内的病毒感染的至少一种反应。

根据一些实施例，延缓病毒感染包括防止和/或抑制病毒粘附和/或穿透进入到该细胞或组织中。

根据一些实施例，延缓病毒感染包括抑制包含该病毒的受试者的细胞内的病毒复制。

根据一些实施例，延缓病毒感染包括抑制病毒从包含该病毒的细胞传播到至少一个另外的细胞中。

根据一些实施例，延缓病毒感染包括抑制在包含该病毒的细胞中由该病毒对至少一种细胞功能的操纵。

根据一些实施例，延缓病毒感染包括诱导与遏制该病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达。根据这些实施例，与遏制病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因选自由以下各项组成的组：RSAD2 (NM_080657)；IFIT1(NM_001548)和IFIT3(NM_001549)及其任何组合。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。

根据一些实施例，延缓病毒感染包括抑制与促进该病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达。根据这些实施例，与促进病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因选自由以下各项组成的组：DDX17 (NM_006386)；ATF6(NM_007348)；TOP1(NM_003286)；USP47 (NM_017944)；KIF5B(NM_004521)；HTATSF1(NM_001163280)； SRPK1(NM_003137)；PCBP2(NM_005016)；ACBD3(NM_022735) 及其任何组合。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。

在本发明的方法和组合物中使用的八氢番茄红素和六氢番茄红素可以从任何可用的来源获得。它们可以从天然来源提取，可以化学合成或可以通过分子遗传学方法获得。根据某些示例性实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素可以从产生类胡萝卜素的生物体获得，这些生物体包括各种植物、各种藻类和某些微生物，包括经基因修饰的生物体。非限制性实例包括番茄果实、柑橘类水果、胡萝卜、藻类、真菌和食用花卉。八氢番茄红素和六氢番茄红素中的每一种可以从不同的来源提取，或者可以从相同的来源获得。

根据某些实施例，八氢番茄红素、六氢番茄红素或其任何组合来源于番茄果实。根据其他实施例，八氢番茄红素、六氢番茄红素或其任何组合来源于藻类，优选杜氏藻属物种的藻类。

根据其他实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素不是提取自和/或可替代地分离或纯化自生物体。因此，根据某些实施例，本发明的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合为粉末形式，是通过以下方式获得：干燥完整的生物体或其一部分，以获得富含八氢番茄红素和六氢番茄红素的粉末。可以经干燥以提供本发明的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的生物体或其部分包括例如藻类、真菌、微生物、植物和植物部分(如叶、果实、茎、根和花)。

根据某些实施例，将富含八氢番茄红素和六氢番茄红素的粉末进一步纯化。根据一些实施例，通过柱色谱或经超临界二氧化碳(SCCO₂) 萃取杂质进行纯化。

除了从天然来源获得八氢番茄红素、六氢番茄红素或其组合之外，这些类胡萝卜素还可以通过任何已知的化学或生物化学方法，或者通过从经基因修饰的来源回收这些类胡萝卜素来合成。以化学方法，八氢番茄红素可以由例如两个牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯(C-20)在可以由八氢番茄红素合酶介导的反应中合成。该牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯可以通过甲羟戊酸的转化或通过丙酮酸酯和甘油醛-3-磷酸酯的缩合直接获得。六氢番茄红素可以通过八氢番茄红素的去饱和来合成，这个反应可以由八氢番茄红素去饱和酶介导。

经基因修饰的来源也可以是八氢番茄红素和六氢番茄红素的来源。经基因修饰的表面可以例如通过在产生类胡萝卜素的生物体中诱变具有在下游产生六氢番茄红素活性的酶获得。这样合成的八氢番茄红素、六氢番茄红素和其他类胡萝卜素将具有与从上述生产类胡萝卜素的生物体获得的这些类胡萝卜素的活性实质上相似的活性。

组合物中的类胡萝卜素浓度可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量。通常通过高效液相色谱法(HPLC)或通过分光光度计测量类胡萝卜素浓度。

类胡萝卜素的吸收光谱明显地依赖于溶剂，并且用于计算某种类胡萝卜素浓度的类胡萝卜素的吸光系数(在具有1cm光程的分光光度计比色皿中1％溶液的给定波长处的吸光度)在不同溶剂中显著变化。这必须在分析某些组合物中的类胡萝卜素时记住，特别是当通过在分离程序的过程中可以使用不同溶剂的HPLC进行分析时。

如上所述测量本发明披露的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的摩尔量。

从生物体或其任何部分提取类胡萝卜素，特别是提取八氢番茄红素和六氢番茄红素可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。根据某些实施例，将生物体或其部分浸入溶剂中，以从该生物体中将油溶性成分萃取到溶剂中。萃取可以在实施预处理之后进行。例如，当来源是番茄果实时，预处理包括对果实进行研磨和/或均质化。该萃取过程可以通过加热和/或搅拌来源-溶剂混合物(source-solvent mixture)来加速。除去未萃取的碎片后，可以将溶剂去除。萃取溶剂的实例包括低级一元醇例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇和2-丁醇；低级烷基酯例如乙酸乙酯；烃例如苯、己烷和戊烷；酮例如丙酮和甲基乙基酮；油例如角鲨烷、液体石蜡、聚癸烯；醚例如乙醚、四氢呋喃和二丙醚；和乙腈。如本领域技术人员已知的，可以使用一种溶剂以及不同溶剂的组合。根据某些实施例，该溶剂是己烷、乙醇、乙酸乙酯或其任何组合。

然后可以将萃取物例如通过分子量分提、溶剂分提、通过用任何介质(例如离子交换树脂或吸收介质、超临界CO₂等)纯化油溶性萃取物来进一步纯化。根据某些实施例，去除萃取溶剂，并且将油溶性类胡萝卜素制剂与适用于化妆品或口服消耗品的载体混合。这种载体可以是液体以获得液体配制品，或是固体以获得固体配制品。在本发明的一些发明人和同事的美国专利No.6,383,474中描述了八氢番茄红素和六氢番茄红素提取的实例。

根据某些实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合是在组合物内施用。

根据一些实施例，包含八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合物被配制成水溶性的。

包含八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合物可以进一步包含选自由以下各项组成的组的另外的化合物：至少一种脂肪酸、至少一种氨基酸、至少一种肽、至少一种多肽、至少一种糖化合物、至少一种除八氢番茄红素和六氢番茄红素以外的类胡萝卜素、至少一种脂质化合物 (包括磷脂和脂肪)、至少一种糖蛋白、至少一种糖苷、至少一种生物碱、至少一种萜烯化合物、至少一种酚化合物、至少一种聚酮化合物或以上任何项的组合。根据另外的实施例，相伴地和/或交替地提供该组合物和至少一种脂肪酸、至少一种氨基酸、至少一种肽、至少一种多肽、至少一种糖化合物、至少一种除八氢番茄红素和六氢番茄红素以外的类胡萝卜素、至少一种脂质化合物(包括磷脂和脂肪)、至少一种糖蛋白、至少一种糖苷、至少一种生物碱、至少一种萜烯化合物、至少一种酚化合物、至少一种聚酮化合物或以上任何项的组合。

可以存在于根据这个实施例的组合物中的脂肪酸、氨基酸和糖化合物可以从天然或GMO来源获得，或者可替代地通过化学合成获得。

根据又其他实施例，除八氢番茄红素和六氢番茄红素外的类胡萝卜素属于叶黄素类。根据另外的实施例，除八氢番茄红素和六氢番茄红素外的类胡萝卜素是非维生素A原类胡萝卜素。

根据一些实施例，该组合物基本上不含原维生素A类胡萝卜素化合物。根据这些实施例，该组合物包含占该组合物的总类胡萝卜素含量的少于20％的原维生素A类胡萝卜素化合物，占该组合物的总类胡萝卜素含量的小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％或更少的原维生素A类胡萝卜素化合物。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。根据一些实施例，该组合物包含占该组合物的总类胡萝卜素含量的不可检测的量到10％的原维生素A类胡萝卜素化合物。

根据一些实施例，该组合物本质上不含β-胡萝卜素。根据这些实施例，该组合物包含占该组合物的总类胡萝卜素含量的少于20％的β-胡萝卜素，占该组合物的总类胡萝卜素含量的小于15％、小于10％、小于5％、小于1％或更少的β-胡萝卜素。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。根据一些实施例，该组合物包含占该组合物的总类胡萝卜素含量的不可检测的量到10％的β-胡萝卜素。

根据一些实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的含量为占该组合物的总类胡萝卜素含量的至少50％、至少55％、至少60％、至少 70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。根据一些实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的含量为该组合物中总类胡萝卜素含量的约80％至100％。根据其他实施例，该组合物中存在的仅有的类胡萝卜素是八氢番茄红素和六氢番茄红素(总类胡萝卜素含量的100％)。

根据某些实施例，包含八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合物不含白藜芦醇。另外或可替代地，包含八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合物不含非类固醇抗炎药(NSAD)。

根据某些实施例，如本发明实施例中所述的包含八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合物是还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体或添加剂的药物组合物。根据这些实施例，该药物组合物包含治疗有效量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合。

本领域普通技术人员将认识到，治疗有效量将随待治疗的感染或病症、其严重程度、待采用的治疗方案、所用药剂的药代动力学以及所治疗的患者(动物或人)而变化。

包含八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的药物组合物可以配制成用于口服、鼻腔、肠胃外、静脉内、肌内、透皮、经颊、皮下、栓剂和局部给药的各种剂型。通常，优选以口服可给药、鼻腔可给药或局部可给药的形式施用药物组合物。根据一些实施例，该组合物经吸入来施用。在不使得本发明的组合物不稳定或损害其治疗活性的情况下，本领域技术人员可以在说明书的教导内修改配制品以提供用于特定给药途径的众多配制品。

为了制备根据本发明的药物组合物，根据常规药物配混技术，优选地将根据本发明的有效量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合与药学上可接受的载体紧密混合来产生一剂。根据给药(例如口服或肠胃外) 所需的制剂形式，载体可以采取多种多样的形式。在制备口服剂型的药物组合物时，可以使用任何常用的药物介质。因此，对于液体口服制剂例如悬浮液、酏剂和溶液，可以使用合适的载体和添加剂，包括水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂(例如粉剂、片剂、胶囊)和固体制剂(例如栓剂)，可以使用合适的载体和添加剂，包括淀粉、糖载体(例如右旋糖、甘露醇、乳糖和相关载体)、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。如果需要，片剂或胶囊可以是包有肠溶衣的或通过标准技术持续释放的。这些剂型的使用可显著提高患者对八氢番茄红素和六氢番茄红素的生物利用度。

对于肠胃外配制品，该载体通常包含无菌水或氯化钠水溶液，但也可以包含其他成分(包括有助于分散的那些)。当然，在使用无菌水并保持无菌的情况下，组合物和载体也必须灭菌。还可以制备可注射悬浮液，在这种情况下可以使用适当的液体载体、助悬剂等。脂质体悬浮液还可以通过常规方法制备以产生药学上可接受的载体。

还可以将药物组合物配制成改良的缓释剂型(包括延迟释放、延时释放、延长释药、持续释放、脉冲释放、控制释放、加速释放和快速释放、靶向释放、程序释放)和胃滞留剂型。这些剂型可以根据本领域技术人员已知的常规方法和技术制备(参见，例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy[药学的科学与实践],第21版；Lippincott Williams and Wilkins[利平科特威廉姆斯和威尔金斯]:Philadelphia[费城], Pa.[宾夕法尼亚州],2005；Modified-Release Drug Delivery Technology[改良的缓释药物递送技术],Rathbone等人编,Drugs and the Pharmaceutical Science[药物和药物科学],Marcel Dekker,公司:New York[纽约],N.Y.[纽约州],2003；第126卷)。

根据某些实施例，将药物组合物以用于口服给药的剂型提供。根据其他实施例，将药物组合物以用于肠胃外给药的剂型提供。根据又其他实施例，将药物组合物以用于局部给药的剂型提供。根据另外的实施例，将药物组合物以用于鼻内给药的剂型提供。根据又另外的实施例，将药物组合物以作为吸入剂的剂型提供。

根据某些实施例，可以将本文提供的药物组合物以单位剂量形式 (unit-dosageform)或多重剂量形式(multiple-dosage form)提供。如本文所用，单位剂量形式是指适合施用于人类和动物受试者的并且如本领域已知的进行单独包装的物理离散单位。每个单位剂量(unit-dose) 包含足以产生所需治疗效果的预定量的(一种或多种)活性成分——根据本发明的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合——以及所需的药物载体或赋形剂。单位剂量形式的例子包括安瓿、注射器以及独立包装的片剂和胶囊。单位剂量形式可以以其部分或其多倍施用。多重剂量形式是包装在单个容器中、以分离的单位剂量形式给药的多个相同的单位剂量形式。多重剂量形式的例子包括小瓶(vial)，瓶(bottle)装片剂或胶囊，或瓶装预定量的液体。

在根据本发明的治疗活性配制品中包含的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的量是用于延缓感染和/或影响与受试者细胞或组织中的病毒感染相关联的至少一种细胞机制和/或反应的有效量。根据某些示例性实施例，该有效量延缓由流感病毒引起的感染，或者在其他实施例中，该有效量延缓单纯疱疹病毒1型(HSV-1)引起的感染。根据又另外的实施例，该有效量治疗、预防或延缓受试者中流感或HDV-1感染的发作。

根据某些实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的有效量为至少0.05μM。根据其他实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的有效量为至少0.1μM、至少0.2μM、至少0.3μM、至少0.4μM、至少0.5μM、至少1.0μM、至少2.0μM、至少4.0μM、至少6.0μM、至少8.0μM或至少10.0μM。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。根据某些示例性实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的有效量为约0.05μM至约100μM。根据另外的某些示例性实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的有效量为约0.2μM至约100μM。

活性八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物的施用范围可以为连续(静脉内滴注)到每天几次口服给药(例如一天多次)，并且可以包括口服、局部、肠胃外、肌内、静脉内、皮下、透皮 (其可以包括渗透促进剂)、经颊和栓剂给药以及其他给药途径。肠溶包衣口服片剂也可用于增强来自口服给药途径的化合物的生物利用度。最有效的剂型将取决于患者疾病的严重程度和患者的一般健康状况、年龄性别和体重。口服剂型是特别优选的，因为易于给药和预期的有利患者依从性。

本发明的组合物由于其对宿主细胞非常低的毒性，可以有利地预防性地用于防止病毒感染或防止与病毒感染相关联的临床症状的发生，或者可以连续施用持续延长的时间以延缓病毒感染的发作。因此，本发明还包括用于预防性治疗病毒感染，特别是流感和HSV-1感染的方法。在根据本发明的这个方面中，本发明的组合物用于防止或延缓患者的病毒感染或相关疾病的发作，这些患者包括免疫缺陷或免疫受损的那些患者 (例如，艾滋病患者和移植患者等)以及孕妇、老人和孩子。

另外，本发明的组合物可以单独施用，或者可以与另外的活性剂一起施用。根据某些实施例，这些另外的活性剂是已知具有抗病毒作用的那些。本发明的组合物可以以单一组合物或分开的组合物施用。分开的组合物的施用可以同时地、相伴地、顺序地和/或交替地进行。

八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物还可用于研究目的的方法中，特别是在筛选有效的抗病毒化合物的方法中。这种用途是基于八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的特征活性，该组合调节先天细胞防御机制，但不影响中枢免疫系统或对中枢免疫系统有微小的影响。因此，根据另外的方面，本发明提供了用于延缓分离的细胞或组织的病毒感染的方法，该方法包括向该细胞或组织施用有效量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物。根据某些实施例，该分离的细胞或组织形成细胞培养物或组织培养物的一部分。根据本发明的这种方法，可以使用本领域技术人员已知的适合与八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合一起使用的任何组合物。

根据一些实施例，延缓这些培养物的细胞或组织的病毒感染导致延缓病毒感染的发作。根据一些实施例，延缓细胞或组织的病毒感染导致调节针对在该细胞或该组织内的病毒感染的至少一种反应。

根据某些实施例，该细胞反应选自由以下各项组成的组：防止和/ 或抑制病毒粘附和/或渗透进入细胞或组织；抑制在包含该病毒的受试者细胞内的病毒复制；抑制在包含该病毒的细胞中由病毒对至少一种细胞功能的操纵；抑制该病毒从包含该病毒的细胞传播到至少一个另外的细胞中；诱导与遏制该病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达；以及抑制与诱导该病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达。每种可能性代表了本发明的一个单独的实施例。

根据一些实施例，在确定测试化合物的抗病毒活性中，施用用于延缓分离的细胞或组织的病毒感染的该八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物提供了阳性对照，其中该测试化合物是在相同的实验条件下被施用至相同类型的细胞或组织。根据一些实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物是以认为在延缓病毒感染中具有治疗效果的量施用。根据其他实施例，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含该组合的组合物是以针对所使用的细胞或组织类型进行过调整的量来施用。

呈现以下实例以更充分地说明本发明的一些实施例。但是，它们绝不应被解读为限制本发明的广泛范围。本领域的技术人员可以在不偏离本发明的范围的情况下容易地设想在此披露的这些原理的许多变化和修改。

实例

实例1：制备包含八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合物

使用富含八氢番茄红素和六氢番茄红素并且本质上不含番茄红素和ζ-胡萝卜素的专用番茄植物果实制备番茄油性树脂。通过用有机溶剂 (己烷)萃取番茄果实然后蒸发有机溶剂来制备油性树脂。

示例性所得油性树脂包含组合浓度为107mg P&P/ml的八氢番茄红素和六氢番茄红素(P&P)和3.04mgβ-胡萝卜素/ml油性树脂，其他类胡萝卜素以可忽略的或未检出的量存在。

将该油性树脂溶解于DMSO中，使最终的八氢番茄红素和六氢番茄红素浓度为1mM-2mM(0.75mg-1.0mg P&P/ml)。称为COMP1的组合物被等分成0.1ml样品并储存在-20℃直至使用。丢弃使用后的剩余物，以避免反复冻融。

实例2：包含八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合物(COMP1)对基因表达的影响

将角质细胞接种在24孔中，并在培养基(角质细胞SFM，补充有 EGF 0.25ng/ml、垂体提取物(PE)25μg/ml、庆大霉素25μg/ml)中培养48小时。然后将培养基用测定培养基(补充有庆大霉素25μg/ml的角质细胞SFM)替代；将细胞孵育24h。孵育后，将细胞用如上所述制备的含八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合物(COMP1)处理或不处理 (对照)。将组合物稀释至最终浓度为0.05μM-1μM的八氢番茄红素和六氢番茄红素并添加到细胞培养基中。然后将这些细胞再孵育24h。该对照包含0.005％的DMSO。

在孵育结束时，从经处理的细胞和对照细胞中提取RNA。根据供应商的说明，使用TriPure分离试剂提取来自每个样品的总RNA。然后将提取的RNA置于Affymetrix U219基因阵列芯片上以用于分析。在30000 个测试基因中，发现在施用COMP1后384个基因的表达被显著调节。在被调节的基因中，表1中列出的12种基因与细胞的抗病毒活性有关。

表1：基因列表，这些基因的表达受到向培养的人角质细胞施用COMP1的影响

在施用八氢番茄红素和六氢番茄红素后，基因RSAD2、IFIT1和 IFIT3的表达升高。这些基因涉及先天免疫反应的INF-γ通路以及其他通路。已知这个通路在病毒感染期间被激活，作为该被感染细胞的防御机制的一部分。不希望受到任何具体理论或作用机制的束缚，预期在施用八氢番茄红素和六氢番茄红素之后这些基因的表达升高增强了针对病毒感染的防御机制。

表1中列出的其余基因的表达减弱。这些基因涉及通常被病毒利用以便其在宿主细胞中渗透、复制和繁殖的细胞通路。不希望受到任何具体理论或作用机制的束缚，通过减弱这些基因的表达水平，八氢番茄红素和六氢番茄红素可以干扰病毒的繁殖和传播。这种效应的一个可能结果可以是疾病后果的减少。另外，此类细胞基因表达的降低提供了由八氢番茄红素和六氢番茄红素进行抗病毒保护的第二条线，这是通过与逃避细胞先天免疫反应的病毒株对抗，负面地影响病毒的繁殖和传播机制。

实例3：COMP1的连续稀释

检查具有细胞毒活性的阈值COMP1稀释度以确定用于检查该组合物的抗病毒作用的适用范围。进行COMP1的连续稀释，针对八氢番茄红素和六氢番茄红素的浓度进行归一化。对于使用HSV1的实验， COMP1的第一稀释度为1:50，导致终浓度为1％-2％DMSO。使用含有10％灭活胎牛血清(FCS)的培养基制备该稀释物。然后，使用含有 2％FCS的感染培养基制备连续两倍稀释物，产生混配物稀释度为1:100 直至1:25,600(表2)。

对于流感病毒，使用含有10％灭活胎牛血清(FCS)的培养基将源材料以1:100稀释导致终浓度为1％-2％DMSO。将这种源材料以1:4 稀释，并且该初始稀释物继续进行另外9次连续两倍稀释，产生最终混配物稀释度为1:200直至1:25,600(表2)。

表2：COMP1的稀释度以及八氢番茄红素和六氢番茄红素的最终合并浓度

实例4：COMP1的细胞毒性

将Madin-Darby犬肾上皮细胞(MDCK细胞)在96孔板中培养。将COMP1的连续两倍稀释物(对于流感病毒在1:400至1:25,600范围内以及对于HSV-1在1:100至1:25,600范围内)(表2)一式三份地施加至培养的细胞。用类似的DMSO稀释物处理的细胞以及未处理的细胞用作阴性对照。在三天的孵育期后，将细胞固定，并用1％龙胆紫染色。使用分光光度计在595nm的波长下，将染料强度以O.D(光密度) 检测。与COMP1的不同稀释物相比，在未处理的对照中观察到类似的 O.D值，指示缺乏细胞毒性。在以上所述的连续稀释度下测试时，COMP1 对培养的细胞没有细胞毒性作用(图1)。1:400的混配物稀释度是针对抗病毒活性要测试的第一稀释度(1:100，17.7μM或10μg/ml八氢番茄红素和六氢番茄红素)。

实例5：在培养的细胞中COMP1对流感病毒繁殖的影响

将MDCK细胞接种在96孔板(10,000个细胞/孔)的含有2％FCS 的100μM DMEM培养基中。将细胞在37℃的温度、5％CO₂下孵育至少5小时。在第一个孵育时间之后，添加如上文实例3和表2中所述制备和稀释的COMP1，并将细胞孵育24h(稀释度1:400直至1: 25,600)。然后将细胞用1:2,000稀释的流感病毒PR8N1H1株(每孔最终浓度为50空斑形成单位(PFU))感染，并在COMP1的存在下与该病毒一起再孵育3天。平行地，进行单独的病毒感染以评价感染效率和最大病毒繁殖以进行比较。使用针对病毒的包膜蛋白的ELISA测定来测定病毒粒子，给出在该实验结束时对病毒的量的定量表示。

图2是显示通过COMP1(表2的稀释度1:400直至1:25,600)抑制NDCK细胞内的流感病毒(N1H1PR8)的粒子数目的图表。如图1 所示，包含如上文实例1中所述制备的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合物(COMP1)以剂量响应的方式抑制流感病毒的繁殖，在八氢番茄红素和六氢番茄红素浓度为4.4μM(稀释度1:400)下达到超过 60％的抑制。对八氢番茄红素和六氢番茄红素的任何检查的稀释物都没有观察到针对MDCK细胞的细胞毒性活性(图2)。当用另外的流感毒株(H3N2)感染MDCK细胞时也获得类似的结果(数据未显示)。

实例6：在培养的细胞中COMP1对HSV1繁殖的影响

将人肾(HuKi)细胞接种在含有10％FCS的MEM HAA培养基中。将处于1:200、1:400和1:800的几种稀释度的COMP1(获得如表2 所指示的最终八氢番茄红素和六氢番茄红素浓度)添加到细胞中。接下来，将细胞在COMP1的存在下用0.1MOI(感染复数)的HSV1(vr-3-p8)感染1h的时间，通过洗掉病毒来终止。然后将受感染的细胞在COMP1 的存在下再孵育72h。然后收集感染细胞的上清液，十倍连续稀释以获得几种病毒滴度并用于第二次感染实验。第二次感染进行72h，以形成空斑结束，在空斑中病毒离去后细胞裂解。然后应用半定量方法以便在存在或不存在COMP1的情况下确定空斑数目。将细胞用20％乙醇固定，用1％龙胆紫染色并拍照证明。在实验期间将已知为有效的HSV1药物的阿昔洛韦用作阳性对照。

图3是感染细胞的龙胆紫染色，证明COMP对HSV1繁殖具有抑制作用。如图中所指示，当与单独感染病毒的细胞相比时，在所有测试的稀释物(1:200、1:400和1:800)中可以观察到更少的空斑(白点)。在所有测量的病毒滴度中确定这种空斑减少。为了进一步量化这种病毒的效果，收集在每种混配物稀释度下获得的负载量并用于空斑测定。感染前一天，将HK细胞(在24孔板中3*105个细胞/孔)接种于补充有 10％热灭活FBS的M199培养基中。用MOI为0.1(原病毒滴度：10⁸*5.5 PFU/ml)的HSV1感染细胞。不断摇动使这些病毒被吸附1h，然后除去。将细胞用M199培养基洗涤两次，然后用仅补充有2％FBS的或补充有下列COMP1储备稀释物的M199培养基覆盖：1:200、1:400和1: 800。在感染后48小时通过使用空斑测定在Vero细胞上滴定上清液来确定病毒产量。然后计数形成的空斑，然后将计数值用于定量COMP1的抑制作用。如图3所指示，不管使用的稀释度如何，用COMP1处理导致病毒产量降低约50％。最有可能的是将八氢番茄红素和六氢番茄红素浓度提高到4.4μM之上将增加它们对HSV1繁殖的抑制作用。对于所指示的任何稀释度，未观察到针对HuKi细胞的细胞毒性活性(数据未显示)。

实例7：在小鼠中COMP1对流感病毒体内繁殖的作用

在该实验中使用如上文实例1中所述制备的COMP1。使用雌性 BALV/c小鼠(5周龄，重14-16g)。在用流感病毒PR8 N1H1感染之前 8小时通过逐滴鼻腔给药，以1:50稀释度(如上表2中的35.4μM) 给予每只小鼠50μl的COMP1。8小时后，使用异氟烷麻醉小鼠，并将 50μl病毒(每只小鼠40PFU)逐滴施用到小鼠鼻中。

该测定包括三组：

1.小鼠感染流感病毒，没有额外处理(“病态小鼠”)。

2.如上所述用COMP1处理小鼠。

3.以与用COMP1处理小鼠相同的方案用磷酸奥司他韦(“Tamiflu”) 处理小鼠。

感染5天后，再次麻醉这些小鼠，收获每只小鼠的肺并储存于-80 ℃直至使用。为了确定肺内的病毒浓度，使用1ml不含FCS的DMEM 中的SPEX球将来自每只小鼠的肺均质化。将100μl得到的悬浮液裂解，并且根据制造商方案使用Easy Mag分离多核苷酸。使用TaqMan，使用用于流感病毒血凝素编码基因的特异性引物，用分离的多核苷酸进行实时(RT)PCR。使用预设的校准曲线将获得的阈值循环(Ct)值转化为病毒浓度(拷贝/ml)。

如在图4中清楚地证明的，包含浓度为35.4μM(约20μg/ml)的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的COMP1的抑制作用以与磷酸奥司他韦相同的程度抑制了流感病毒PR8的体内复制，该磷酸奥司他韦已知在预防和治疗流感症状方面非常有效。这是第一次证明八氢番茄红素和六氢番茄红素的这种作用。

这些具体实施例的上述描述将如此充分地揭示本发明的总体性质， 使得其他人可以通过应用当前知识，在无需过度试验并且不偏离一般概 念的情况下容易地修改和/或改编此类具体实施例的各种应用，因此，这 样的改编和修改应该并且旨在被理解为在所披露的实施例的等同物的 含义和范围内。应该理解，这里使用的措辞或术语是为了说明而不是限 制的目的。用于进行各种所披露的功能的手段、材料和步骤可以在不偏离本发明的情况下采取多种替代形式。

Claims (28)

1.八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合在制备用于延缓细胞或组织的由流感病毒或单纯疱疹病毒1型(HSV-1)引起的病毒感染的药物组合物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其中该细胞或组织是受试者的。

3.如权利要求2所述的用途，其中延缓该病毒感染包括调节所述受试者的所述细胞或组织内针对所述病毒感染的至少一种反应。

4.如权利要求3所述的用途，其中针对所述病毒感染的所述反应包括防止和/或延缓病毒粘附到所述细胞或组织上。

5.如权利要求3至4中任一项所述的用途，其中针对所述病毒感染的所述反应包括防止和/或延缓病毒穿透进入所述细胞或组织。

6.如权利要求3至4中任一项所述的用途，其中针对所述病毒感染的所述反应包括延缓在包含所述病毒的所述受试者细胞内的病毒复制。

7.如权利要求3至4中任一项所述的用途，其中针对所述病毒感染的所述反应包括延缓在包含所述病毒的受试者细胞中由所述病毒对至少一种细胞功能的操纵。

8.如权利要求3至4中任一项所述的用途，其中针对所述病毒感染的所述反应包括延缓所述病毒从包含所述病毒的细胞传播到至少一个另外的细胞中。

9.如权利要求3至4中任一项所述的用途，其中针对所述病毒感染的所述反应包括诱导与遏制所述病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达。

10.如权利要求3至4中任一项所述的用途，其中针对所述病毒感染的所述反应包括抑制与诱导所述病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达。

11.如权利要求1所述的用途，其中所述八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的所述有效量为至少0.05μM。

12.如权利要求2所述的用途，其中延缓所述受试者的细胞或组织的病毒感染导致延缓所述病毒感染的发作。

13.如权利要求2所述的用途，其中所述受试者选自由人类和动物组成的组。

14.如权利要求13所述的用途，其中所述受试者的免疫系统受损。

15.如权利要求1所述的用途，其中所述八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合是在组合物内施用。

16.如权利要求15所述的用途，其中所述组合物还包含至少一种选自下组的另外的成分，所述组由以下各项组成：氨基酸、肽、脂肪酸、脂肪、糖化合物、除八氢番茄红素和六氢番茄红素之外的类胡萝卜素，或其组合。

17.如权利要求16所述的用途，其中除八氢番茄红素和六氢番茄红素外的所述类胡萝卜素属于叶黄素类。

18.如权利要求16所述的用途，其中除八氢番茄红素和六氢番茄红素外的所述类胡萝卜素是非维生素A原类胡萝卜素。

19.如权利要求15-18中任一项所述的用途，其中所述组合物是还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物。

20.如权利要求19所述的用途，其中所述组合物是经口服、局部、经颊、鼻内、舌下、皮下、静脉内或通过吸入来施用。

21.如权利要求15-18中任一项所述的用途，其中所述组合物是还包含可食用赋形剂、稀释剂或载体的可食用组合物。

22.如权利要求20所述的用途，其中将所述组合物与至少一种另外的抗病毒疗法组合施用。

23.如权利要求1所述的用途，其中所述细胞或组织是形成细胞培养物或组织培养物的一部分的分离的细胞或组织。

24.如权利要求23所述的用途，其中所述八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合是在组合物内施用。

25.如权利要求23至24中任一项所述的用途，其中延缓所述细胞或组织的所述病毒感染导致调节针对在所述细胞或所述组织内的所述病毒感染的至少一种反应。

26.如权利要求23至24中任一项所述的用途，其中所述细胞反应选自由以下各项组成的组：防止和/或延缓病毒粘附和/或渗透进入所述细胞或组织；延缓在包含所述病毒的所述受试者细胞内的病毒复制；延缓在包含所述病毒的细胞中由病毒对至少一种细胞功能的操纵；延缓所述病毒从包含所述病毒的细胞传播到至少一个另外的细胞中；诱导与遏制所述病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达；以及抑制与诱导所述病毒感染的细胞机制相关联的至少一种基因的表达。

27.如权利要求23所述的用途，其中在确定测试化合物的抗病毒活性中，施用用于延缓所述分离的细胞或组织的病毒感染的所述八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合或包含所述组合的组合物提供了阳性对照，其中所述测试化合物是在相同的实验条件下被施用至相同类型的细胞或组织。

28.如权利要求15所述的用途，其中所述组合物还包含多肽。

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