CN107847610A - 基于piv5的扩增病毒样颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基于PIV5的扩增VLP(AVLP)的组合物、使用方法和制备方法，该基于PIV5的扩增VLP(AVLP)可以在靶细胞中递送可表达的异源核苷酸序列而不产生后代，并且其在多种动物和人类健康应用，如疫苗接种、基因治疗和癌症治疗中表现出有用的安全性和治疗功效。

Description

基于PIV5的扩增病毒样颗粒

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年4月28日提交的美国临时专利申请第62/153,598号的优先权和权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

在实验室中已经修改了几种类型的病毒，包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和单纯疱疹病毒，用于治疗应用。然而，每个最适合的应用都具有应用上的有限。例如，逆转录病毒载体永久整合到感染细胞的基因组中导致安全问题，且在用于转导时需要有丝细胞分裂。腺病毒载体可以将基因递送到各种分裂和非分裂细胞类型，但感染细胞的免疫消除通常限制体内的基因表达。单纯疱疹病毒可以递送大量的外源DNA；然而，细胞毒性和转基因表达维持仍然是一个障碍。AAV感染许多非分裂和分裂的细胞类型，但是具有有限的DNA能力。显然需要一种更灵活和通用的方法。

发明内容

本公开内容涉及安全且有效地将感兴趣的可表达异源核苷酸递送至靶细胞而不产生病毒后代的副流感5(PIV5)病毒样颗粒(VLP)(本文中简称“扩增病毒样颗粒”或“AVLP”)的组合物、使用方法和制备方法。

在一个实施方式中，本公开包括分离的多核苷酸，其包含(i)PIV5NP、V/P和L基因中每一种的至少一部分，以及(ii)异源非PIV5核苷酸序列，其中所述多核苷酸缺少一种或多种选自由M、F、SH和HN的所组成的组PIV5基因，或不能表达选自由M、F、SH和HN所组成的组的一种或多种PIV5蛋白。

在该实施方式的一个方面，分离的多核苷酸可以包含PIV5NP、V/P和L基因。

在该实施方式的另一方面，分离的多核苷酸可以缺少PIV5M基因或不能表达PIV5M蛋白。

在该实施方式的另一方面，所述异源非PIV5核苷酸序列可以插入在V/P和L基因之间。

在该实施方式的另一方面，M、F、SH和HNPIV5基因中的一个或全部被异源核苷酸序列替代。

在任何上述实施方式的另一方面，所述异源核苷酸序列包含选择标记。在一些实施方式中，所述选择标记可以是Hyg或Hyg-TK。

在任何上述实施方式的另一方面，所述异源核苷酸序列编码选自由RNAi、shRNA、siRNA、反义寡核苷酸和核酶的分子所组成的组。

在任何上述实施方式的另一方面，所述异源核苷酸序列源自除PIV5之外的病毒。在一些实施方式中，所述异源核苷酸序列源自选自由流感病毒、RSV和HIV所组成的组的病毒。在一个实施方式中，所述异源核苷酸序列编码流感病毒HA。在另一个实施方式中，所述异源核苷酸序列编码RSV F。在另一个实施方式中，所述异源核苷酸序列编码HIV Gag、Env或两者。

在任何上述实施方式的另一方面，所述异源核苷酸序列是哺乳动物序列。在一个实施方式中，所述异源核苷酸序列是人序列。

在任何上述实施方式的另一方面，所述异源核苷酸序列编码CFTR或NeuroD1或BMP-2蛋白。

在任何上述实施方式的另一方面，所述异源核苷酸序列编码Cas9和引导RNA。

在任何上述实施方式的另一方面，所述异源核苷酸序列编码分泌蛋白。

在任何上述实施方式的另一方面，所述异源多核苷酸还包含报道基因。在一些实施方式中，所述报道基因编码荧光素酶或绿色荧光蛋白。

在本公开的另一个实施方式中，本公开提供了包含上述实施方式中任一项所述的多核苷酸的载体。

在本公开的另一个实施方式中，本公开提供了包含上述实施方式中任一项所述的多核苷酸或所述载体的宿主细胞。

在本公开的另一个实施方式中，本公开提供了由所述宿主细胞产生的扩增病毒样颗粒(AVLP)。

在本公开的另一个实施方式中，本公开提供了包含上述实施方式中任一项所述的多核苷酸的扩增病毒样颗粒(AVLP)。

在本公开的另一个实施方式中，本公开提供了经所述AVLP感染的细胞。

在本公开的另一个实施方式中，本公开提供了治疗有需要的受试者的疾病的方法，包括向所述受试者施用所述AVLP。在该实施方式的另一方面，所述受试者是人。

附图说明

参考以下描述结合伴随附图，可以更容易地理解本公开的各种特征和优点。以下列出的数字并非必须按比例绘制：

图1示出了根据本公开的示例性实施方式的表达EGFP和H5蛋白的AVLP(AVLP-EGFP、AVLP-H5)和稳定细胞系的发育。

图2示出了根据本公开的示例性实施方式的带有AVLP-EGFP感染的HeLa和Vero细胞。

图3示出了根据本公开的示例性实施方式的Vero(AVLP-H5)细胞系的表征。

图4示出了根据本公开的示例性实施方式的经AVLP-H5或PIV5-H5/SH-HN系统感染的Vero细胞中H5表达的表征。

图5示出了根据本公开的示例性实施方式的AVLP-H5颗粒的鉴别。

图6示出了根据本公开的示例性实施方式的小鼠中抗H5抗体的滴度。

图7示出了根据本公开的示例性实施方式的IFNγ的ELISPOT测定。

图8示出了根据本公开的示例性实施方式的AVLP-H5对H5N1病毒挑战的保护。

图9示出了根据本公开的示例性实施方式在原代人和猪气道上皮细胞中测试的AVLP-EGFP。

图10示出了根据本公开的示例性实施方式在人和犬间充质干细胞(MSC)中测试的AVLP-EGFP。

图11示出了根据本公开的示例性实施方式的BHK细胞中的AVLP-BMP2。

图12示出了根据本公开的示例性实施方式例的人MSC中的AVLP-BMP2。

图13示出了根据本公开的示例性实施方式的犬MSC中的AVLP-BMP2。

图14示出了根据本公开的示例性实施方式的犬、人和绵羊MSC中的AVLP-BMP2的定量。

图15示出了根据本公开的示例性实施方式的BHK细胞中表达NueoD1的AVLP。

图16示出了表达Cas9的和引导RNA的AVLP(AVLP-Cas9-gRNA)。根据本公开的示例性实施方式，也已经产生含有AVLP-Cas9-gRNA的细胞。

图17示出了根据本公开的示例性实施方式的通过蛋白质印迹检测含有AVLP-Cas9-gRNA的细胞中的Cas9。

图18示出了根据本公开的示例性实施方式的用RSV-F肽、GFP(不相关)肽或PMA/离子霉素模拟刺激或刺激的脾细胞。

图19示出了根据本公开的示例性实施方式的通过添加“自杀”蛋白质而破坏的含有AVLP的细胞。

图20示出了根据本公开的示例性实施方式的表达HT和纳米萤光素酶的AVLP，其具有与Hyg-TK融合的nL。

图21示出了根据本公开的示例性实施方式的感染性嵌合病毒的AVLP产生。

图22示出了根据本公开的示例性实施方式的用于表达基因治疗的AVLP系统。

图23示出了根据本公开的示例性实施方式的体内AVLP荧光素酶表达动力学。

图24示出了根据本公开的示例性实施方式，用不同浓度的更昔洛韦处理的表达AVLP(TK)-EGFP的BHK稳定细胞系。

图25示出了根据本公开的示例性实施方式的PIV5与基于腮腺炎病毒(MuV)AVLP的比较。

图26示出了根据本公开的示例性实施方式的HIV嵌合体的产生。

图27示出了根据本公开的示例性实施方式的HIV Env的表达。

具体实施方式

为了便于理解本公开的各种实施方式的原理和特征，这里解释了各种说明性实施方式。尽管详细说明了本公开的示例性实施方式，但是应当理解能设想到其他实施方式。因此，本公开并不意图将本发明的范围限于说明书或示例中阐述的部件的构造和布置的细节。本公开能够具有其他实施方式并且能够以各种方式实践或执行。

在描述示例性实施方式时，为了清楚起见，将采用具体术语。如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。例如，对组件的引用也旨在包括多个组件的组合。提及含有“a”成分的组合物旨在包括除了所命名的组分之外的其他成分。

范围可以在本文中表示为从“大约”或“大致”或“基本上”一个特定值和/或到“大约”或“大致”或“基本上”另一个特定值。当表示这样的范围时，其他示例性实施方式包括从一个特定值和/或到另一特定值。

类似地，如本文所使用的，“基本上不含有”某物或“基本上纯的”和类似的特征可以包括“至少基本上不含有”某物，或者“至少基本上纯的”，以及“完全不含有由”某物，或者“完全纯的”。

术语“患者”、“个体”、“受试者”和“动物”在本文中可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于人类和兽医动物(例如猫、狗、牛、马、绵羊、猪等)和实验动物模型。在优选的实施方式中，所述受试者是人。

如本文所用，术语本文所述的基于PIV5的AVLP组合物和至少第二药物活性成分的“组合”是指可以同时或顺序递送(例如，在24小时内)的至少两种，但任何所需化合物的组合。预期当用于治疗各种疾病时，本公开的组合物和方法可以与适用于相同或相似疾病的其它治疗方法/药剂一起使用。这样的其它治疗方法/试剂可以共同施用(同时或顺序地，以任何顺序)以产生加和或协同效应。由于加和作用或协同作用，每种试剂的合适治疗有效剂量可能会减少。此外，本公开的两个或多个实施方式也可以共同施用以产生加和或协同效应。

“治疗有效量”是指当向受试者施用治疗病况、障碍或病症时，化合物(例如，本文所述的基于PIV5的AVLP组合物)足以进行该治疗的量。“治疗有效量”将根据所施用的化合物或细菌以及所治疗的哺乳动物的疾病及其严重程度以及年龄、体重、身体状况和反应性而变化。

与本公开的组合物一起使用的术语“药学上可接受的”是指这样的组合物的分子实体和其它成分，其在生理上是可耐受的，并且当施用于哺乳动物(例如人)时通常不产生不良反应。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的可在哺乳动物中使用，更特别是可以在人中使用。

术语“载体”是指化合物与其一同施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选使用水或水溶液盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液作为载体，特别是用于可注射溶液。或者，载体可以是固体剂型载体，包括但不限于粘合剂(用于压缩丸剂)、助流剂、包封剂、调味剂和着色剂中的一种或多种。合适的药物载体描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。

术语状态、障碍或病况的“进行治疗”或“治疗”的包括：

(1)预防或延迟在可能患有或易患于状态、障碍或病况但尚未经历或显示该状态、障碍或病况的临床或亚临床症状的受试者中发展的状态、障碍或病况的至少一种临床或亚临床症状的出现；或者

(2)抑制状态、障碍或病况，即阻止、减少或延缓疾病的发展或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床或临床症状；或者

(3)减轻疾病，即导致状态、障碍或病况或其临床或亚临床症状中的至少一种症状消退。

受治疗受试者的获益或者是在统计学上显著的，或者至少对患者或医师来说是可察觉的。

如本文所用，术语“副流感病毒5”(PIV5)包括例如但不限于菌株KNU-11、CC-14、D277、1168-1和08-1990。PIV5基因组的非限制性实例列于GenBank登录号NC_006430.1、AF052755.1、KC852177.1、KP893891.1、KC237065.1、KC237064.1和KC237063.1中。

“包含”或“含有”或“包括”是指至少标明的化合物、元件、颗粒或方法步骤存在于组合物或制品或方法中，但不排除其它化合物、材料、颗粒、方法步骤的存在，即使其他这样的化合物、材料、颗粒、方法步骤具有与标明的那些相同的功能。

提及一个或多个方法步骤不排除在明确标明的那些步骤之间存在额外的方法步骤或中间方法步骤。类似地，还应当理解，在组合物中提及一种或多种组分不排除除了明确鉴定的那些以外的其它组分的存在。

描述为构成本公开的各种要素的材料旨在是说明性的而不是限制性的。将执行与本文所描述的材料相同或类似功能的许多合适的材料旨在包含在本公开的范围内。本文未描述的这些其它材料可以包括但不限于例如在本公开开发之后开发的材料。

副流感病毒5(PIV5)是负链RNA病毒，是副粘病毒科的腮腺炎病毒(Rubulavirus)属的成员，副粘病毒科包括许多重要的人和动物病原体，例如腮腺炎病毒、人类副流感病毒2型和4型、新城疫病毒、仙台病毒、HPIV3、麻疹病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒和呼吸道合胞病毒，PIV5以前被称为猿猴病毒-5(SV5)(Chatziandreou等人，2004，J Gen Virol；85：3007-3016)。虽然PIV5最初是从培养的原代猴细胞中分离的，但其天然宿主是引起狗窝咳嗽的狗(McCandlish等人，1978，Vet Rec；102：293-301)。虽然PIV5可以感染人类(Cohn等人，1996，Pathobiology；64：131-135)，未有把人类中已知的症状或疾病与PIV5相关联。与大多数副粘病毒不同，PIV5可以感染正常细胞，而引起很小的细胞病变效应。

本公开的PIV5包括各种野生型PIV5菌株、突变体PIV5或重组PIV5(rPIV5)中的任一种。野生型菌株包括但不限于PIV5菌株W3A、WR(编号VR-288^TM)、犬副流感病毒株78-238(ATCC编号VR-1573)(Evermann等人，1980，JAm Vet Med Assoc；177：132-1114；和Evermann等人，1981，Arch Virol；68：165-172)、犬副流感病毒株D008(ATCC编号VR-399)(Binn等人，1967，Proc Soc Exp Biol Med；126：140-145)、MIL、DEN、LN、MEL、密码子病毒、CPI+、CPI-、H221、78524、Tl和SER。参见，例如，Chatziandreou等人，2004，J Gen Virol；85(Pt 10)：3007-16；Choppin，1964，Virology：23：224-233；和Baumgartner等人，1987，Intervirology；27：218-223。此外，可以使用用于商业狗窝咳嗽疫苗的PIV5菌株，例如BI、FD、Merck和Merial疫苗。

可以使用各种方法中的任何一种来构建PIV5遗传物质，包括但不限于在He等人(Virology；237(2)：249-60，1197)中更详细地描述的反向遗传学系统。

PIV5编码8种病毒蛋白。核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)和大RNA聚合酶(L)蛋白对于病毒RNA基因组的转录和复制是重要的。V蛋白在病毒发病机理以及病毒RNA合成中起重要作用。融合蛋白(F)蛋白是一种糖蛋白，以不依赖于pH的方式介导细胞与细胞和病毒与细胞的融合，这对病毒进入细胞是至关重要的。已经确定了F蛋白的结构，并确定了用于有效融合的关键氨基酸残基。血凝素-神经氨酸酶(HN)，其是另一种病毒糖蛋白，且参与病毒进入和从宿主细胞释放。基质(M)蛋白在病毒组装和发芽中起重要作用。疏水性(SH)蛋白是一种44-残基的疏水整合膜蛋白，并且在膜中取向为其N末端处于细胞质中。对于副粘病毒的分子生物学的综述，参见例如Whelan等人，2004，Curr Top Microbiol Immunol；283：61-119；和Lamb&Parks，(2006)。Paramyxoviridae:the viruses and their replication.InFields Virology，第5版，pp.1449-1496,D.M.Knipe和P.M.Howley编辑。Philadelphia，PA：Lippincott Williams&Wilkms。溶瘤剂可能在这8种蛋白质中的一种或多种中具有突变。

PIV5可以感染人(Hsiung等人，1965，J Immunol；94：67-73)，但并不与任何已知的疾病有关。PIV5感染小鼠和仓鼠，但不会在动物中引起任何症状。PIV5可以在细胞中生长并以高达8×10⁸pfu/ml的滴度释放到培养基中，表明其作为安全基因递送载体的潜力以及一种可能用于大量生产病毒的成本有效的方法。

PIV5可以在许多细胞类型中有效地感染细胞并引起很少细胞病变效应(CPE)。在一些细胞类型中，PIV5感染引起合胞体的形成，即许多细胞融合在一起，导致细胞死亡。突变可以包括促进合胞体形成的一种或多种突变(参见例如Paterson等人，2000，Virology；270：17-30)。

PIV5感染并不诱导凋亡(He等人，2001，JVirol；75：4068-4079)。然而，缺乏SH(rPIV5ASH)的重组PIV5通过肿瘤坏死因子(TNF)-a介导的外源性凋亡途径诱导L929细胞的凋亡(He等人，2001，J Virol；75：4068-4079；He等人，Virology；250：30-40；和Lin等人，2003，JVirol；77：3371-3383)。

PIV5的V蛋白在阻断病毒诱导的凋亡中发挥关键作用。缺乏V蛋白的保守的富含半胱氨酸的C-端的重组PIV5(rPIV5VAC)通过可能是通过内质网(ER)-应力(stress)引发的内源性凋亡途径诱导多种细胞凋亡(Sun等人，2004，JVirol；78：5068-5078)。在V/P基因产物(例如rPIV5-CPI-)的N-端中具有突变的突变重组PIV5也诱导细胞凋亡(Wansley和Parks，2002，JVirol；76：10109-10121)。

本公开提供了基于PIV5的AVLP组合物、系统和方法，用于多种应用包括功能基因组学、药物发现、靶标验证、蛋白质生产(例如治疗性蛋白质、疫苗、单克隆抗体)、基因治疗和治疗性治疗，例如癌症治疗。

本公开涉及基于PIV5的AVLP组合物及其制备的构建体，其可用于将可感染的可表达的多核苷酸序列引入宿主细胞。在一些实施方式中，基于PIV5的AVLP组合物是分离的多核苷酸序列，其转录编码负链PIV5基因组的一部分的单链RNA，其中所述多核苷酸序列转录编码负链NP、V/P和L基因的至少一部分的单链RNA，并且其中所述多核苷酸序列缺少或不能转录M、F、SH和HN基因中的一个或多个，并且其中所述多核苷酸序列含有插入在V/P和L基因之间的异源非PIV5核苷酸序列(例如，图1A)。在一些实施方式中，M、F、SH和HN基因中的一个或全部被完全去除，并用可表达的异源核苷酸序列替换。在一些实施方式中，所述分离的多核苷酸包含NP、V/P和L基因的全部。在一些实施方式中，所述分离的多核苷酸包含NP、V/P和L基因中至少一个的全部。

在一些实施方式中，基于PIV5的AVLP组合物包含至少一种包含如本文所述的分离的多核苷酸的AVLP颗粒。在其它实施方式中，基于PIV5的AVLP组合物包含多个包含如本文所述的分离的多核苷酸的AVLP颗粒。

在一些实施方式中，本公开提供包含本文所述的基于PIV5的AVLP组合物的药物组合物。这样的药物组合物可以包括本文讨论的药学上可接受的载体和/或其它治疗剂。在一些实施方式中，所述药物组合物包含治疗有效量的基于PIV5的AVLP组合物和/或如本文所述的其它治疗剂。

在另外的实施方式中，为了增加、改善、增强等、复制、转录和/或表达，另外的调控序列被置于3'引导序列和5'尾部序列的上游、下游或内部。在其它实施方式中，所述AVLP组合物还包含转录终止信号，例如有效终止转录的polyA信号。在一些实施方式中，所述AVLP组合物还包含其它附加元件：5'LTR、PBS、包装序列、剪接供体(SD)、复制起点、任选的中枢多巴胺(PPT)、RRE、MCS、剪接受体(SA)和修饰的最小功能3'LTR。可以在所述AVLP系统中提供的其它元件包括例如用于稳定mRNA的合成内含子或其他序列、以便于从单个mRNA翻译两个开放阅读框的内部核糖体进入位点(IRES)、选择性标记和转录终止信号(例如聚腺苷酸化位点)。可用其他元件以促进两个开放阅读框架的表达。一个实例是促进多肽在预定位点切割的2A/2B肽序列(Szymczak等人Nature Biotechnology 22：589594，2004)。以这种方式，通过自切割2A序列分离的两个多肽序列可以从AVLP系统由单个开放阅读框产生。另一个实例是使用内部核糖体起始序列或IRES元件，例如来自微小RNA病毒或口蹄疫病毒的元件是两个非限制性实例(Donnelly等人，J.Gen.Virol，82：1013-1025，2001)。

感兴趣的可表达的异源核苷酸序列本质上是AVLP有效载荷。此处，术语“异源”是指序列不是源自PIV5的。术语“可表达”表示多核苷酸序列能够在细胞中转录，但是不需要—也不排除—多核苷酸序列此后翻译。可表达的异源核苷酸可编码一种或多种产物，其可以具有相同或不同的表达机制，并且当在细胞中表达时可具有相同或不同的预期功能。

任何可表达的异源核苷酸序列可以插入到转移载体中而不受限制，包括编码治疗性蛋白质、酶和抗体的序列等；siRNA；反义；微小RNA、适体；核酶、任何基因抑制或沉默序列；以及通过AVLP系统传递给宿主细胞的任何序列。

可用于可表达的异源核苷酸的序列是本领域已知的，可以在GenBank中鉴定和/或可以由本领域公知的方法确定，包括从感兴趣的生物样品直接测序。

本公开可用于基因治疗和/或用于治疗涉及在宿主细胞中增加或减少感兴趣的核苷酸序列的疾病的治疗方法。在这些实施方式中，可表达的异源核苷酸序列可以源自哺乳动物基因组。在一些实施方式中可能特别有用的是源自人类基因组的可表达异源核苷酸序列，其中野生型RNA和/或蛋白质的表达可以在患者体内产生治疗效果。例如，可表达的异源核苷酸序列可以编码CFTR、NeuroD1、Cas9和引导RNA，或任何其他此类序列。在其它实施方式中，异源核苷酸序列编码分泌蛋白。例如，异源核苷酸序列可以编码BMP-2或任何其它这样的序列。

在其它实施方式中，可表达的异源核苷酸序列对阳性选择刺激作出反应。例如，异源核苷酸序列可以包含Hyg，阳性选择刺激是潮霉素B。在其他实施方式中，可表达的异源核苷酸序列也对阴性选择刺激作出反应。例如，异源核苷酸序列可以包含Hyg-TK，而阴性选择刺激可以是阿昔洛韦或更昔洛韦。在另外的实施方式中，可能有用的是多核苷酸序列进一步包含报道基因。例如，报道基因可以是荧光素酶或绿色荧光蛋白。

在一些实施方式中，AVLP表达一个或多个修饰宿主细胞内感兴趣的宿主细胞核苷酸序列的翻译和/或转录的核苷酸序列(例如siRNA)。在一些实施方式中，可表达的异源核苷酸序列的转录和/或翻译经修饰以使得其核苷酸序列相对于细胞中的内源基因是密码子变性的。此外，可表达的异源核苷酸序列可以被修饰，使得它共表达能够抑制或沉默宿主细胞内的宿主细胞核苷酸序列的抑制或沉默序列。

例如，AVLP可以表达靶向β-血红蛋白的siRNA，其可以抑制或沉默镰状细胞性贫血患者的镰状血红蛋白。同样的AVLP也可以表达正常血红蛋白分子，其在siRNA靶向的位点已被密码子变性。以这种方式表达镰状球蛋白的红细胞可以抑制镰状球蛋白的表达，同时表达天然血红蛋白并纠正遗传异常。AVLP系统将被递送到干细胞群体中，这将导致表达血红蛋白的类红细胞最终变成红细胞。该方法可以被定制以用AVLP组合物治疗各种疾病，包括癌症、遗传疾病和感染性疾病。

在其它实施方式中，感兴趣的可表达的异源核苷酸产生稳定宿主细胞RNA核苷酸序列的产物。这种产品可以诱导或持续表达。例如，3'RhoB非翻译区(UTR)可以稳定表达毒素蛋白或其他感兴趣的蛋白质的靶RNA以响应血清。另一个例子是将嗜酸性粒细胞趋化因子3'非翻译区连接到感兴趣的基因，其通常具有低半衰期，但是通过向细胞中加入TNF-α和IL-4来稳定。或者，CYP2E 1和CYP2B 1mRNA的5'编码区域中的16聚体序列中包含的序列在胰岛素存在下使靶RNA不稳定。在去除胰岛素时，靶RNA被稳定并且可以表达蛋白质(Trong等人，Biochem J.，2004年12月23日)。

可用于本发明组合物和方法的可表达的异源序列的其它非限制性实例包括可产生蛋白质的序列，包括例如干扰素(α、β、γ、ε)、促红细胞生成素、因子VIII、凝血因子、抗体及其片段(例如包括单链、Fab和人源化)、胰岛素、趋化因子、细胞因子、生长因子、血管发生调节因子、凋亡调节因子、例如生长因子、包括例如Amphiregulin、B淋巴细胞刺激物、白介素16(IL16)、Thymopoietin、TRAIL、Apo-2、Pre B细胞集落增强因子、内皮分化相关因子1(EDF1)、内皮单核细胞激活多肽II、巨噬细胞迁移抑制因子MIF、自然杀伤细胞增强因子(NKEFA)、骨形态发生蛋白8(成骨蛋白2)、骨形态发生蛋白6、结缔组织生长因子(CTGF)、CGI-149蛋白(神经内分泌分化因子)、细胞因子A3(巨噬细胞炎症蛋白1-α)、胶质母细胞瘤细胞分化相关蛋白(GBDR1)、肝细胞源性生长因子、神经介肽U-25前体、任何肿瘤基因、致癌基因、原癌基因或细胞调节基因(可以在condor.bcm.tmc.edu/oncogene找到)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、T细胞特异性RANTES前体、胸腺树突状细胞衍生因子1；受体如激活素A受体、II型(ACVR2)、β信号序列受体(SSR2)、CD14单核细胞LPS受体、CD36(1型胶原蛋白受体)样2、CD44R(Hermes抗原gp90归巢受体)、G蛋白偶联受体9、趋化因子C×C受体4、集落刺激因子2受体P(CSF2RB)、FLT-3受体酪氨酸激酶、类似于瞬时受体电位C前体、杀伤细胞凝集素样受体亚家族B、低密度脂蛋白受体基因、低亲和力Fc-γ受体IIC、MCP-1受体、单核细胞趋化蛋白1受体(CCR2)、核受体亚家族4、A组成员1、孤儿G蛋白偶联受体GPRC5D、过氧化物酶体增殖激活受体γ、Pheromore相关受体(大鼠)、血管升压素激活的钙动员假定受体、视黄酸受体、Toll样受体6、跨膜激活剂和CAML相互作用剂(TACI)、B细胞成熟肽(BCMA)、CSF-1受体、干扰素(α、β和γ)受体1(IFNAR1)。可以调节以增加抗体产生的途径包括例如泛素/蛋白体；端粒酶；FGFR3；和Mcl-1等。

在本公开的某些实施方式中，所述AVLP组合物可用于制备用作疫苗的抗原制剂。任何合适的抗原可根据本公开内容制备，包括从朊病毒、病毒、分枝杆菌、原生动物(例如恶性疟原虫(疟疾))、锥虫、细菌(例如，链球菌、奈瑟球菌等)获得的抗原，等等

可以用含有一个或多个异源多核苷酸序列或多个AVLP颗粒的单个AVLP颗粒转染宿主细胞，其中每个含有相同或不同的异源多核苷酸序列。例如，多亚单位抗原(包括细胞内和细胞表面多亚基组分)可以通过在单独的载体上表达单独的亚基，但是用所有载体感染相同的宿主细胞来制备，使得在宿主细胞内进行组装。

疫苗通常含有多种抗原组分，例如衍生自不同蛋白质和/或来自同一蛋白质的不同表位区域的抗原成分。例如，针对病毒性疾病的疫苗可以包含从病毒获得的一种或多种多肽序列，当向宿主施用时，引发对病毒挑战的免疫原性或保护性应答。

如上所述，本公开也可用于制备多肽多聚体，例如其中产生由多于一种多肽组成的抗原制剂。例如，病毒衣壳可以由多于一个的多肽亚基组成。通过用携带不同病毒包膜序列的载体转导宿主细胞，当在细胞中表达时，蛋白质可以自组装成含有多于一个蛋白质亚基(例如以其天然构型)的三维结构。

在进一步的实施方式中，可表达的异源核苷酸序列源自除PIV5之外的另一种病毒。例如，异源核苷酸序列可以编码(来自任何菌株)流感HA、RSV F、HIV Gag和/或Env等。这样的实施方式可用于开发疫苗和/或疫苗接种方法。这里给出的实施例是非限制性的，因为本领域技术人员将理解，来自各种致病剂(包括细菌、寄生虫等)的核苷酸序列可能是期望用于AVLP疫苗组合物和/或接种方法。

根据本公开可以产生疫苗的病毒的实例包括例如正粘病毒、流感病毒A(包括在其HA和NA蛋白质中变化的所有菌株，例如(非限制性实例)H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H7N7和H3N8)；乙型流感、C型流感病毒、thogoto病毒(包括Dhori、Batken病毒、SiAR 126病毒)和异源病毒(例如感染性鲑鱼贫血病毒)、冠状病毒等。这些包括从所有物种类型分离或传播的流感，包括来自无脊椎动物、脊椎动物、哺乳动物、人类、非人灵长类动物、猴子、猪、牛和其他家畜、鸟类、家禽如火鸡、鸡、鹌鹑和鸭、野鸟(包括水生鸟类和陆生鸟类)、爬行动物等。这些还包括例如通过突变、抗原漂移、抗原性转移、重组等改变的现有菌株，特别是具有增加的毒力和/或种间传播(例如人传人)的菌株。

特别令人感兴趣的是流感病毒，其是动物共患病和/或交叉物种，由于它们具有广泛的宿主范围或由于在感染的宿主中的重组和/或由于天然存在的或定向的突变。例如，H5N1(涉及病毒存在的表面抗原亚型、5型血凝素和1型神经氨酸酶)是亚洲禽流感亚型，导致亚洲禽鸟流感爆发。在一个实施方式中，本发明的组合物包含基于PIV5的AVLP组合物，其包含本文所述的分离的多核苷酸，其还包含H5N1的HA序列。

流感抗原制剂(例如疫苗)可以包含在流感病毒粒子中天然存在的一种或多种多肽。然而，其优选不包含将导致天然致病性病毒的所有多肽基因。这些包括例如血细胞凝集素(由HA基因编码)、神经氨酸酶(由NA基因编码)、核蛋白(由NA基因编码)、基质(M1)蛋白(由M基因编码)、M2(由M基因编码)结构蛋白(由NS基因编码)和聚合酶。天然存在的病毒粒子被包裹在脂质双层中，该双层膜与蛋白质H和N(“衣壳层”)“镶嵌”。基质蛋白(M1)在病毒膜下方形成蛋白质层(“基质层”)，并参与病毒组装、稳定性和完整性。参见，例如，Harris等人，Virol.289：34-44，2001。M2蛋白是膜蛋白离子通道。本公开的AVLP可以包含H、N和任选的M1和M2蛋白。所述蛋白质的序列是本领域已知的和/或可以在GenBank中鉴定。例如，M1和M2序列参见Widjaja等人J.Virol，78：8771-8779，2004。已经确定了H5的至少九种亚型。目前在亚洲和欧洲流行的H5感染，如HPAI H5N1病毒已在人类中被记录到，可能导致严重的疾病或死亡。已确定H7的至少九种亚型。人类H7感染是罕见的，但可能发生在与感染禽鸟直接接触的人群中。症状可能包括结膜炎和/或上呼吸道症状。H7病毒包括例如H7N2、H7N7和H7N3)，并且在人体中引起轻度至严重和致命的疾病。H亚型在流行病学中最重要，因为它们控制病毒结合并进入细胞的能力，然后发生病毒的繁殖。N亚型控制细胞中新形成的病毒的释放。已经确定了至少九种H9亚型。很少有报道流感AH9感染人类。然而，有报道感染H9株时出现流感样综合征的儿童。

本公开提供针对所有禽流感亚型(例如H和N亚型)的疫苗，包括现有的亚型，其衍生物及其重组体，例如具有人传人能力的亚型和重组体。已经对各种分离物进行了表征，特别是对于H5亚型。参见例如Sturm-Ramirez，J.Virol，2004，78，4892-4901；Guan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，2004，101，8156-8161。

本公开还提供了用于产生AVLP组合物的方法。可用于产生AVLP组合物的宿主细胞的实例包括任何哺乳动物或人细胞系或原代细胞。非限制性实例包括例如293、HT1080、Jurkat和SupT1细胞。其他实例是CHO、293、Hela、Vero、L929、BHK、NIH 3T3、MRC-5、BAE-1、HEP-G2、NSO、U937、Namalwa、HL60、WEHI 231、YAC 1、U 266B1、SH-SY5Y、CHO，例如CHO-K1(CCL-61)、293(例如，CRL-1573)。细胞在有效产生转染和表达的条件下培养。这些条件包括例如实现蛋白质生产所需的特定环境。这种环境包括例如适当的缓冲剂、氧化剂、还原剂、pH、辅因子、温度、离子浓度、适合的年龄和/或细胞阶段(例如特别是细胞周期的一部分，或在特定基因正在被表达的特定阶段)、培养条件(包括细胞培养基、底物、氧气、二氧化碳、葡萄糖和其它糖底物、血清、生长因子等)。

本公开还提供了涉及在体内将AVLP递送至宿主细胞的各种治疗方法。在一些实施方式中，将AVLP递送至受试者以治疗或预防癌症或癌前病症。在其它实施方式中，将AVLP递送至受试者以治疗或预防糖尿病。在另外的实施方式中，将AVLP递送至受试者以治疗或预防炎性病症。在其它实施方式中，将AVLP递送至受试者以治疗或预防自身免疫病症。在一些实施方式中，将AVLP递送至受试者以治疗或预防移植相关病症。在其他实施方式中，将AVLP递送至受试者以治疗或预防感染(例如，疫苗接种，如以上和在以下实施例中进一步论述)。

在包括治疗用途的一些实施方式中，受体受试者具有选自由癌症、癌前病症、自身免疫疾病、炎性病症、移植排斥、移植后淋巴组织增生性疾病、过敏性疾病和感染的疾病所组成的组。

可通过本公开的方法治疗的癌症的非限制性实例包括例如癌、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤和白血病。非限制性的具体实例包括例如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、所有组织病理类型的脑癌、血管肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、睾丸癌、子宫癌、子宫颈癌、胃肠癌、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、尤文氏肉瘤、横纹肌肉瘤、未知原发癌(CUP)、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、Waldenstroom氏巨球蛋白血症、乳头状腺癌、囊腺癌、支气管癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilms肿瘤、肺癌、上皮癌、宫颈癌、睾丸肿瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、成神经细胞瘤、小细胞肺癌、膀胱癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样癌、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、大粒细胞淋巴细胞淋巴瘤或白血病、γ-δT细胞淋巴瘤或γ-δT细胞白血病、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、造血肿瘤、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)诱导各种类型的恶性肿瘤、包括但不限于EBV相关霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、所有形式的移植淋巴瘤、包括移植后淋巴增生性疾病(PTLD)、子宫癌、肾细胞癌、肝癌、肝母细胞瘤等。

可通过本公开的方法治疗的炎性和自身免疫疾病的非限制性实例包括例如炎症性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病、糖尿病(例如、1型糖尿病)、多发性硬化症、关节炎(例如类风湿性关节炎)、格雷夫斯病、红斑狼疮、强直性脊柱炎、牛皮癣、贝切特氏病、自闭症小肠结肠炎、吉兰巴利综合症、重症肌无力、寻常型天疱疮、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、横纹性脊髓炎自身免疫性心肌病、腹腔疾病、皮肌炎、韦格纳肉芽肿病、变态反应、哮喘、接触性皮炎、动脉粥样硬化(或影响心脏或血管系统的任何其他炎性病症)、自身免疫性葡萄膜炎以及其他自身免疫性皮肤病、自身免疫性肾脏、肺、或肝脏疾病、自身免疫性神经病变等

在一些实施方式中，AVLP可被修饰或工程化以含有允许转导载体靶向并感染宿超出其正常范围的主细胞的多肽序列，或更具体地限制细胞或组织类型的转导。例如，受体配体、抗体(使用抗体的抗原结合部分或重组抗体型分子，例如单链抗体)和多肽部分或其修饰(例如，其中在靶向序列中存在糖基化位点)可以促进AVLP系统的定向递送到感兴趣的靶细胞。例如，除了F和HN之外，还可以使用其他糖蛋白从AVLP感染的细胞产生颗粒。如果需要靶向特异性细胞类型，则AVLP可以被其它蛋白质伪装，例如(VSV-G假型AVLP-EGFP)。

在其它实施方式中，将AVLP递送至受试者以治疗或预防感染。通过本公开的方法可治疗的感染包括但不限于可由例如细菌、寄生虫、病毒、真菌或原生动物引起的那些。

预期当用于治疗各种疾病时，本公开的组合物和方法可以与适合于相同或相似疾病的其它治疗剂组合。此外，本公开的两个或多个实施方式也可以共同施用以产生加和或协同效应。当与第二治疗剂共同施用时，本公开的实施方式和第二治疗剂可以同时或顺序(以任何顺序)。由于加和作用或协同作用，每种试剂的合适治疗有效剂量可能会减少。

作为非限制性实例，本公开可与通过(例如通过抑制、还原和/或阻断IL1、INFα/β、IL6、TNF、IL13、IL23等)阻断炎症的其它治疗组合。在一些实施方式中，本文公开的AVLP组合物和方法可用于增强针对肿瘤或感染的疫苗的功效。本公开的组合物和方法可以在用于引发免疫应答(例如，治疗癌症或感染)的试剂(包括但不限于小分子、抗体或细胞试剂)的同时或之前(例如，1-30天之前)施用于受试者。本公开的组合物和方法还可以与抗肿瘤抗体或针对致病性抗原或过敏原的抗体组合施用。

本公开的组合物和方法可以与其他免疫调节治疗组合，例如治疗性疫苗(包括但不限于GVAX、基于DC的疫苗等)、检查点抑制剂(包括但不限于阻断CTLA4的试剂、PD1、LAG3、TIM3等)或活化剂(包括但不限于增强41BB、OX40等的试剂)。本公开的抑制性治疗也可以与具有调节基因表达能力的其他治疗组合。

本公开的治疗方法可以与额外的疗法相结合。例如，当用于治疗癌症时，AVLP可以与传统的癌症疗法结合使用，例如手术、放射疗法、化疗或其组合，这取决于肿瘤的类型、患者状况、其他健康问题和各种因素。

可用于与AVLP组合癌症治疗的其它治疗剂包括抗血管生成剂。许多抗血管生成剂已经被鉴定并且是本领域已知的，包括例如TNP-470、血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白酶组织抑制剂(TIΜP1和TIMP2)、催乳素(16-Kd片段)、血管抑素(纤溶酶原的38-Kd片段)、内皮抑素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR和FLT-1受体、胎盘增生素相关蛋白以及Carmeliet和Jain(2000)列出的那些。在一个实施方式中，本公开的抑制剂可以与VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂组合使用，例如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的抑制剂及其任何组合(例如，抗hVEGF抗体A4.6.1、贝伐珠单抗或雷珠单抗)。

可用于本公开的组合治疗的化学治疗化合物的非限制性实例包括例如氨基羟乙基酰胺、安丫啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、卡介苗、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、雌烯雌酚、己烯雌酚、多西他赛、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌激素、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、染料木素、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、ironotecan、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、甲氧氯丙嗪、甲羟孕酮、甲孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁替胺、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、喷司他丁、普卡霉素、卟吩、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链球菌素、苏拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、噻替派、二十碳烯、二氯化物、托泊替康、曲妥珠单抗、维A酸、长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

这些化疗化合物可以通过其作用机制分类为例如以下组：抗代谢物/抗癌剂、如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂、包括天然产物如长春花生物碱(长春花碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管破坏剂如紫杉醇(紫杉醇、多西紫杉醇)、长春新碱、长春花碱、诺考达唑、埃坡霉素和诺维本、表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)、DNA损伤剂(放线菌素、安丫啶、蒽环类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲基腺嘌呤、磷酸酰胺、美法仑、美甲胺、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、丙卡巴肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素如放线菌素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(丝霉素)和丝裂霉素；酶(系统地代谢L-天冬酰胺、并剥夺不具有合成本身天冬酰胺能力的细胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板药；抗增殖/抗有丝分裂的烷基化剂如氮芥(氮芥、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲佐菌素)(DTIC)；抗增生/抗有丝分布的抗代谢药如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨基丁二酰亚胺；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁替胺)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐等凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗微生物剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如TNP-470、染料木素素、贝伐珠单抗)和生长因子抑制剂(例如成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂))；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维A酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安丫啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、恩哌糖苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、托泊替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和胱天蛋白酶激活剂；和染色质破坏剂。

为了治疗感染，与AVLP的联合治疗可以包括本公开的组合物和方法与例如抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物、抗寄生虫药物、抗原生动物药物或它们的组合的共同施用。

有用的抗生素的非限制性实例包括林可酰胺(克林霉素)；氯霉素；四环素(如四环素、金霉素、地塞米松、甲基环霉素、多西环素、米诺环素)；氨基糖苷类(如庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、阿米卡星、卡那霉素、链霉素、新霉素)；β-内酰胺类(如青霉素、头孢菌素、亚胺培南、氨曲南)；万古霉素；杆菌肽；大环内酯类(红霉素)、两性霉素；磺酰胺(如磺胺、磺胺甲恶唑、磺胺乙酰胺、磺胺嘧啶、磺胺异恶唑、硫氰菊酯、磺胺多辛、马凡尼、对氨基苯甲酸、甲氧苄啶磺胺甲恶唑)；乌洛托品；呋喃妥因；那吡啶；甲氧苄啶；利福平；灭滴灵；头孢唑林；林可霉素；大观霉素；莫匹罗星；喹诺酮类(如萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、氟沙星、左氧氟沙星)；新生霉素；多粘菌素；短杆菌；和抗假单胞菌(如羧苄青霉素、羧苄青霉素茚满、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林)或其任何盐或变体。参见Physician's Desk Reference(2005)，Thomson P D R，Montvale N.J.；Gennaro等人编撰，Remington's The Science and Practice of Pharmacy(2000)，LippincottWilliams and Wilkins，Baltimore Md.Braunwald等人编撰，Harrison's Principles ofInternal Medicine,(2001)，McGraw Hill,NY；Berkow等人编撰，The Merck ManualofDiagnosis and Therapy(1992)，Merck Research Laboratories，Rahway N.J.。抗生素可以商业获得，例如，来自Daiichi Sankyo，Inc.(Parsippany，N.J.)、Merck(WhitehouseStation，N.J.)、Pfizer(New York，N.Y.)、Glaxo Smith Kline(Research Triangle Park，N.C.)、Johnson&Johnson(New Brunswick，N.J.)、AstraZeneca(Wilmington，Del.)，Novartis(East Hanover，N.J.)和Sanofi-Aventis(Bridgewater，N.J.)。使用的抗生素将取决于感染的类型。

有用的抗真菌剂的非限制性实例包括例如咪唑类(如灰黄霉素、咪康唑、特比萘芬、氟康唑、酮康唑、伏立康唑和伊曲康唑)；多烯(如两性霉素B和制霉菌素)；氟胞嘧啶；和啶菌素或其任何盐或变体。参见Physician's Desk Reference(2005)，Thomson P D R，Montvale N.J.；Gennaro等人编撰，Remington's The Science and Practice ofPharmacy(2000)，Lippincott Williams and Wilkins，Baltimore Md.Braunwald等人编撰，Harrison's Principles of Internal Medicine(2001)，McGraw Hill,NY；Berkow等人编撰，The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy(1992)，Merck ResearchLaboratories，RahwayN.J.。

有用的抗病毒药物的非限制性实例包括例如干扰素α、β或γ、去羟肌苷、拉米夫定、扎那他韦、罗帕尼维尔、奈非那韦、依法韦仑、茚地那韦、伐昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、金刚烷乙胺、利巴韦林、更昔洛韦、膦甲酸和阿昔洛韦或其任何盐或变体。参见Physician'sDesk Reference(2005)，Thomson P D R，Montvale N.J.；Gennaro等人编撰，Remington'sThe Science and Practice of Pharmacy(2000)，Lippincott Williams and Wilkins，Baltimore Md.Braunwald等人编撰，Harrison's Principles ofInternal Medicine,(2001)，McGraw Hill,NY；Berkow等人编撰，The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy(1992)，Merck Research Laboratories，Rahway N.J.。

有用的抗寄生虫剂的非限制性实例包括例如氯喹、美氟喹、奎宁、伯氨喹、阿托伐醌、柳氮菌胺和乙胺嘧啶或其任何盐或变体。参见Physician's Desk Reference(2005)，Thomson PD R，Montvale N.J.；Gennaro等人编撰，Remington's The Science andPractice ofPharmacy(2000)，Lippincott Williams and Wilkins，BaltimoreMd.Braunwald等人编撰，Harrison's Principles of Internal Medicine(2001)，McGrawHill,NY；Berkow等人编撰，The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy(1992)，MerckResearch Laboratories，RahwayN.J.。

有用的抗原生动物药物的非限制性实例包括例如甲硝唑、二氧嘧啶、碘喹啉、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、戊脒、克林霉素、伯氨喹、乙胺嘧啶和磺胺嘧啶或其任何盐或变体。参见Physician's Desk Reference，第59版，(2005)，Thomson PD R，Montvale N.J.；Gennaro等人编撰，Remington's The Science and Practice of Pharmacy，第20版，(2000)，Lippincott Williams and Wilkins，Baltimore Md.Braunwald等人编撰，Harrison'sPrinciples ofInternal Medicine，第15版，(2001)，McGraw Hill,NY；Berkow等人编撰，The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy(1992)，Merck Research Laboratories，Rahway N.J.。

实施例

还通过以下实施例描述和展示了本公开。在本说明书中的任何地方使用这些和其他示例仅是说明性的，并且绝不限制本公开或任何示例性术语的范围和含义。同样地，本公开不限于这里描述的任何特定优选实施例。

在阅读本说明书之后，本公开的许多修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且在不偏离本公开的精神或范围的情况下可以进行这种变化。因此，本公开内容仅受所附权利要求书的条款以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。

实施例1

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施例进一步理解本公开：

对于细胞培养物，将BHK21、Vero和HeLa细胞保持在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。MDBK细胞在具有10％FBS的DMEM中生长。将潮霉素加入到BHK21和Vero细胞系的培养基中，使终浓度为50至500μg/mL。对于PIV5病毒感染，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤单层，然后用DMEM加1％牛血清白蛋白接种病毒。用PBS再次洗涤单层，并在37℃，5％CO₂下与含有2％FBS的DMEM一起温育。

对于PIV5起始物质，使用了PIV5-H5/SH-HN(ZL46)(由Li，Z.等人，RecombinantParainfluenza Virus 5Expressing Hemagglutinin of Influenza A VirusH5N1Protected Mice Against Lethal High-Pathogenic Avian Influenza Virus H5N1Challenge 2013J.Virol.所述)。也考虑其他PIV5菌株。

为了浓缩PIV5或AVLP-H5病毒颗粒，将含有病毒的上清液装载在20％蔗糖上，并在3700rpm的Thermo Scientific超速离心机F40L-8×100转子中沉淀1小时。将得到的沉淀物重新悬浮于含有1％BSA的PBS中，并储存在-80℃。

高致病性A/越南/1203/2004(H5N1；由Richard Webby，St.Jude Children'sResearch Hospital，Memphis，TN提供)在37℃下在含胚鸡蛋的尿囊腔中繁殖24小时，然后等份分装并储存于-80℃。根据CDC批准的选择性药物使用指南，所有使用活、高致病性的A/越南/1203/2004的实验应至少在增强的生物安全等级3(BSL3+)密闭中进行。

为了产生含有PIV5AVLP(pAVLP)的质粒，使用含有PIV5全长基因组的感染性克隆质粒pPIV5(由Cornwell HJ，McCandlish IA，Thompson H，Laird HM，WrightNG.1976.Isolation of parainfluenza virus SV5from dogs with respiratorydisease.SV5，Vet Rec 98：301-302描述的病毒)。删除PIV5F、HN和SH基因，并在V/P和L基因之间引入选择标记基因潮霉素。如本文进一步描述的，将可表达的感兴趣的异源核苷酸序列(例如EGFP或H5N1HA)插入到V/P和潮霉素基因之间的pAVLP中，以获得pAVLP-EGFP或pAVLP-H5。PIV5 AVLP基因组的长度应保持为6的倍数。

为了建立携带PIV5 AVLP基因组的稳定细胞系，并启动细胞中PIV5病毒AVLP基因组的转录和复制，质粒pAVLP-EGFP或H5(3μg)以及质粒pCAGGS-PIV5-L(1.5μg)、pCAGGS-PIV5-NP(1μg)、pCAGGS-PIV5-P(200ng)和pBH437(表达T7聚合酶，500ng)转染到6孔板中的BHK21细胞中。转染后4至6小时，取出培养基并用新鲜培养基替换。在转染后2至4天加入潮霉素。通过潮霉素选择2至5周，将存活的细胞发育成携带PIV5AVLP基因组的BHK21细胞系。

为了获得单循环感染性PIV5 AVLP颗粒(AVLP)，将以2:1:1的比例表达PIV5F、HN和M的质粒转染到携带PIV5 AVLP基因组的稳定细胞系中。在转染后2至3天收集上清液。通过低速离心或0.44μm过滤器除去细胞碎片。含有AVLP的经清除的上清液可用于感染新鲜细胞以测定蛋白质表达水平或发展额外的细胞系。

为了研究PIV5AVLP基因组在细胞中的稳定性，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)从细胞中提取AVLP基因组RNA，并用PIV5基因特异性引物进行逆转录(RT)。使用覆盖整个PIV5AVLP基因组的特异性引物通过PCR进一步扩增逆转录产物，然后通过任何标准方法对PCR产物进行测序。

为了检测PIV5或H5蛋白的表达，通过间接免疫荧光测定(IFA)检查AVLP感染的细胞或携带PIV5AVLP基因组的细胞系，(如LinY，Horvath F，Aligo JA，Wilson R，HeB.2005.The role of simian virus 5V protein on viral RNA synthesis，Virology338：270-280所述)。为此，将细胞用PBS(pH 7.4)中的3.7％甲醛固定10分钟，然后在室温下用0.1％Triton X-100加1％BSA或PBS中的1％BSA处理30分钟。将固定的细胞与37℃的初级抗体温育1小时，然后与FITC偶联的二抗温育。将细胞进一步洗涤并置于载玻片上。Gold Antifade Mountant(Life Technologies)直接应用于荧光标记细胞，并加入盖玻片。使用Nikon FXA荧光显微镜和Zeiss 410共聚焦显微镜检查荧光并拍照。

通过蛋白质印迹进一步检测。为此，携带PIV5AVLP基因组的细胞用全细胞提取缓冲液(WCEB)(50mM Tris-HCl[pH 8]、280mM NaCl、0.5％NP-40、0.2mM EDTA、2mM EGTA和10％甘油)裂解。通过以4000rpm离心15分钟使裂解物清除，并将上清液与相同体积的2×SDS加载缓冲液(100mM Tris-HCl[pH 6.8]、20％甘油、4％SDS、200mM二硫苏糖醇[DTT]和0.1％溴酚蓝)相混合，在95℃加热5分钟，用10％SDS-PAGE分离。使用iBlot干印迹系统(Invitrogen)将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜与小鼠抗H5抗体(1:2000稀释)、小鼠抗PIV5-V/P或小鼠抗PIV5-NP抗体(1:2000稀释)一起温育，随后与经1:2000稀释的用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠二级抗体温育。洗涤后，将PVDF膜与ECL高级基质(GE Healthcare)温育并使用柯达图像站440进行扫描。

为了检查AVLP颗粒，将颗粒装载在经清除的上清液中并至20％蔗糖上，并以37,000rpm在Thermo Scientific超速离心机F40L-8×100转子中沉淀1小时。然后将沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.4)中。纯化的PIV5或AVLP颗粒被吸收到铺满了Parlodion的镍网上30秒。将网格漂浮在一滴pH 7.4的Tris缓冲盐水(TBS)上5分钟，随后漂浮在TBS中1％卵白蛋白的液滴上1小时，伴有在TBS中1％卵白蛋白中1:300稀释的PIV5HN特异性小鼠单克隆抗体。用TBS洗涤三次后，将样品与TBS中1％卵白蛋白1:10稀释的10-nm金颗粒偶联的山羊抗小鼠IgG温育1小时。用TBS再次洗涤网格，然后用2％磷钨酸(pH 6.6)染色。使用JEOL 1230透射电子显微镜(JEOL，Tokyo，Japan)检查网格。

在动物研究中使用6至8周龄的雌性BALB/c小鼠。所有动物实验均按照机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。通过鼻内(i.n.)途径进行小鼠免疫。对于鼻内免疫，通过腹膜内注射三溴乙醇(Avertin；180至250μL/kg体重)麻醉6周龄的BALB/c小鼠，然后通过以2×10⁴PFU的剂量滴加100μL的AVLP或PIV5-H5/SH-HN进行鼻内接种。PBS处理的小鼠作为对照。19天后，AVLP-H5接种组中的小鼠以与第一次接种相同的剂量加强。在挑战前6天通过颌下出血收集小鼠血液样本进行血清学评估。

对于具有一个剂量的PBS或PIV5-H5/SH-HN的组或具有两个剂量的AVLP-H5的组，在初次免疫后42天进行小鼠挑战。麻醉的小鼠用稀释于50μL PBS中的1050％致死感染剂量(LD50)A/越南/1203/04进行鼻内接种。每天监测小鼠的发病率和死亡率。每隔一天测量体重。

通过ELISA测定H5抗原特异性IgG抗体滴度。2HB 96孔微量滴定板用100μL以1μg/mL在PBS中的纯化的H5蛋白进行包被，并在4℃温育过夜。在封闭缓冲液(洗涤缓冲液中的1％BSA；KPL，Inc.，Gaithersburg，MD，USA)中制备血清的两倍系列稀释液。将100μL每种稀释液转移到平板中并在室温下温育2小时。吸出样品后，将板用洗涤缓冲液洗涤三次。在封闭缓冲液中将第二抗体以1:2000【辣根过氧化物酶标记的山羊抗IgG(SouthernBiotech，Birmingham，AL，USA)】稀释。向每个孔中加入100μL稀释的二抗，将板在室温下温育1小时。抽吸后，将板洗涤并用100μL SureBlue Reserve TMB substrate(KPL,Inc.)在室温显影。使用BioTek Epoch酶标仪读取450nm处的OD。端点抗体滴度定义为OD高于初次血清平均OD的两个标准偏差的最高血清稀释度。

根据WHO“动物流感诊断和监测手册”进行血细胞凝集抑制(HAI)测定。洗涤鸡红血细胞(cRBC)并在PBS中悬浮至0.5％的终浓度。将灭活的甲型流感病毒(A/越南/1203/04)在PBS中调节至每25μL中4个血细胞凝集单位(HAU)。在96孔圆底板中，将25μL单独的RDE处理的血清样品以两倍的方式连续稀释。在制备连续稀释的血清之后，加入25μL(4HAU)稀释的病毒。将板轻轻混合并在室温下温育1小时。然后向每个孔中加入50μl的0.5％cRBC，轻轻混合，并在室温下温育30至45分钟。通过以45度角倾斜板来评分血细胞凝集。HAI滴度是完全抑制血细胞凝集的最后稀释抗血清的倒数。

进行酶联免疫吸附点(ELISpot)测定以检测淋巴细胞中流感病毒H5N1 HA抗原的T细胞应答。用0.1μg流感病毒H5N1 HA抗原、用0.1μg结核分枝杆菌E6蛋白作为无关抗原或用在50μL完全肿瘤培养基(CTM)中肉豆蔻酸乙酸酯离子霉素刺激细胞。使用AID ViruSpotReader(Cell Technology，Inc.)对斑点进行计数。结果表示为从每10⁶个脾细胞的模拟刺激细胞总数中减去的细胞因子分泌细胞的平均数。

使用GraphPad Prism 5.0程序(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)中的Student t测试进行差异比较(即数据分析)。当P<0.05时差异有统计学意义，P<0.01时差异最显著。

实施例2

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施方式进一步理解本公开：

为了产生AVLP-EGFP，提供了含有PIV5基因NP、V/P和L(其分别编码NP、P和L)和调控序列(前导序列，尾标和适当的基因连接序列)的质粒，(图1A)。PIV5的全长基因组中缺失了PIV5的M、F、SH和HN。选择EGFP作为跟踪活细胞的记录，并将VFP基因下游的EGFP基因插入。为了选择含有AVLP的细胞，将选择标记物，潮霉素抗性基因(Hyg)插入AVLP(图1A)。

用质粒pCAGGS-PIV5-L、pCAGGS-PIV5-NP、pCAGGS-PIV5-P和pBH437(表达T7RNA聚合酶)将质粒pAVLP-EGFP转染到BHK21细胞中。转染细胞在潮霉素中2至3周进行传代并选择。所选细胞的单个菌落进行扩展(图1B)。早在两周内，细胞中发现绿色荧光信号(图1C)。

类似地，产生含有AVLP-EGFP的Vero细胞(图1C)。使用对PIV5NP和P特异性抗体的免疫印迹检查PIV5蛋白的表达(图1D)。在这些细胞中检测到PIV5的NP和P。此外，从细胞中纯化RNA，并使用RT-PCR测序对这些细胞中的AVLP基因组进行测序。AVLP RNA序列通常与质粒pAVLP-EGFP中的输入cDNA序列匹配。

为了从含有AVLP-EGFP基因组的细胞获得颗粒，用表达PIV5F、HN和M的质粒转染细胞(图1B)。过滤含有单周期感染性PIV5颗粒(AVLP-EGFP)的上清液。将经过清洗的上清液用于“感染”新鲜的HeLa细胞(即，这些细胞之前没有接触AVLP-EGFP)。

作为参考，图1A示出了PIV5、AVLP-EGFP和AVLP-H5的示意图。NP，核蛋白；P，磷蛋白；V，V蛋白；M，基质蛋白；SH，小疏水蛋白；F，融合蛋白；HN，血凝素-神经氨酸酶蛋白；L，RNA依赖性RNA聚合酶；Hyg，潮霉素；EGFP，增强型绿色荧光蛋白；H5，流感病毒A H5N1 HA。

为了进一步参考，图1B示出了AVLP生成的示意图。用表达PIV5 P、NP、L和T7聚合酶的质粒与表达EGFP的PIV5 AVLP质粒转染细胞。用潮霉素选择转染的细胞。含有PIV5 AVLP基因组并表达潮霉素的BHK21(AVLP-EGFP)细胞克隆在潮霉素选择下扩增。用表达PIV5 F、HN和M的质粒转染BHK21(AVLP-EGFP)细胞。在转染细胞的上清液中产生携带由PIV5 HN、F和M包装的PIV5 AVLP基因组的颗粒。将该颗粒命名为AVLP-EGFP并用于感染Vero细胞。感染的Vero细胞在潮霉素选择下发育成携带PIV5 AVLP基因组(Vero(AVLP-EGFP))的细胞系。用表达PIV5 F、HN和M的质粒转染Vero(AVLP-EGFP)细胞，然后在转染细胞的上清液中产生AVLP-EGFP颗粒。

为进一步参考，图1C显示使用荧光显微镜检测EGFP表达。通过荧光显微镜鉴定稳定的BHK21和Vero细胞系中的EGFP表达。此外，图1D显示使用蛋白质印迹(WB)检测PIV5 V/P和NP表达。使用小鼠抗PIV5 V/P和NP抗体以及BHK21和Vero细胞的作为阴性对照，通过WB检测在BHK21(AVLP-EGFP)和Vero(AVLP-EGFP)中PIV5 V/P和NP表达。

如图2A所示，在含有AVLP-EGFP基因组的细胞的培养基中接种7天后，在HeLa细胞中观察到EGFP的表达，表明感染性AVLP-EGFP。类似地，在培养基接种后11天，在Vero细胞中检测到EGFP的表达(图2B)。

为了参考，图2显示了由含有AVLP-EGFP的过滤上清液感染的HeLa(图2A)和Vero(图2B)细胞。使用荧光显微镜在感染后2、7和11天拍摄图像。

通过在接种后1天计数显示GFP的细胞数量确定培养基中感染性颗粒的数量，并发现AVLP的滴度超过10⁶感染性颗粒/毫升(IP/mL)。在没有选择压力的情况下(即培养基中没有潮霉素)，细胞应该能够传代至少三代，而在后代细胞中AVLP-EGFP没有明显的损失。

实施例3

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施方式进一步理解本公开：

来自实施例2的AVLP-EGFP可以用作起始材料以产生变体(例如，AVLP-H5)。然而，也可以根据需要使用新的PIV5起始物质，按照上述给出的公开内容，并用另一个可表达的感兴趣的异源核苷酸序列(例如，流感H5N1 HA)代替EGFP。

例如，为了产生表达H5N1(AVLP-H5)的HA的AVLP，AVLP-EGFP质粒中的EGFP被H5N1(H5)的HA替代。如此处所示，H5与全长PIV5基因组(ZL46)中描述的相同，其中除去H5的多碱基切割位点。

如AVLP-EGFP(图1A和图3)所述，获得AVLP-H5。例如，从用编码PIV5 F、HN和M的质粒转染的Vero(AVLP-H5)细胞的上清液获得AVLP-H5颗粒。AVLP-H5感染性颗粒的滴度约为4×10⁶IP/mL。在AVLP-H5和PIV5-H5/SH-HN感染的Vero细胞中检测到H5蛋白，主要定位在细胞膜上(图4)。

作为参考，图3A显示IFA在Vero(AVLP-H5)细胞中鉴定H5和PIV5V/P表达。将Vero(AVLP-H5)细胞固定并用抗H5或抗PIV5 V/P抗体染色，然后用FITC缀合的第二抗体染色。在将GoldAntifade Mountant应用于细胞样品后进行DAPI染色。图3B显示通过蛋白质印迹鉴定Vero(AVLP-H5)细胞中的H5、PIV5 V/P和NP表达。Vero(AVLP-H5)细胞样品用抗H5、抗PIV5 V/P或抗PIV5NP抗体染色，Vero细胞样品用作阴性对照。

为了进一步参考，图4显示感染AVLP-H5或PIV5-H5/SH-HN的Vero细胞。两天后，将Vero细胞固定并用triton或PBS处理。细胞用抗H5抗体染色，然后用FITC-缀合的二抗染色。将Gold Antifade Mountant应用于细胞样品后进行DAPI染色。

使用EM分析，AVLP-H5颗粒被抗PIV5 HN抗体染色。AVLP-H5的大小和形状应与野生型PIV5颗粒相似，而使用抗H5抗体在AVLP-H5中不应检测到H5(图5)。

为了参考，图5显示用抗PIV5 HN抗体以及随后然后用金颗粒标记的二抗处理的纯化AVLP-H5和PIV5颗粒。使用电子显微镜检查样品。

为了研究体内HA抗体的产生，用PBS，表达H5的PIV5(PIV5-H5/SH-HN；如Li Z，MooneyAJ，Gabbard JD，Gao X，Xu P，Place RJ，Hogan RJ，Tompkins SM，HeB.2013Recombinant Parainfluenza Virus 5Expressing Hemagglutinin of InfluenzaA Virus H5N1 Protected Mice against Lethal Highly Pathogenic AvianInfluenzaVirus H5N1 Challenge.Journal ofvirology 87：354-362中所述)，和鼻内AVLP-H5接种小鼠。对于AVLP-H5，在初次免疫后19天进行加强。在初次免疫后26天，收集血液样品并制备血清。两个剂量的AVLP-H5和一个剂量的PIV5-H5/SH-HN接种诱导特异性抗H5-HA抗体。AVLP-H5疫苗接种的小鼠比PIV5-H5接种小鼠诱导更高水平的ELISA抗体。

用血清样品进行HAI滴度测定。此处，八个AVLP-H5免疫的小鼠中的六个显示在10至40范围内的可检测的HAI滴度，而七个PIV5-H5/SH-HN接种的小鼠中的六个具有从0至40的HAI滴度。在PBS组小鼠中未检测到HAI。

使用IFN-γELISPOT测定法检测由PIV5-H5和AVLP-H5诱导的细胞免疫应答。在初次免疫后26天，将小鼠安乐死，获得用于IFN-γELISPOT测定的脾细胞。与PBS对照小鼠相比，PIV5-H5和AVLP-H5-接种的小鼠诱导特异性和可比较水平的H5特异性细胞免疫应答。

作为参考，图6A显示小鼠中抗H5抗体的ELISA滴度。BALB/c小鼠用AVLP-H5或PIV5-H5/SH-HN进行鼻内免疫，并在初次免疫后第26天进行采血。收集小鼠血液样品进行分析。使用IgG特异性ELISA在血清样品中测量HA(H5)特异性抗体滴度。差异由Student's t检验进行评估(**，P<0.01)。图6B显示小鼠中抗H5抗体的HAI滴度。将甲型流感病毒(A/越南/1203/04)的4HAU与连续稀释的小鼠血清在96孔圆底板中混合。将血凝抑制(HAI)滴度评分为完全抑制血细胞凝集的最高稀释抗血清的倒数。该图显示了每只小鼠的重复孔的平均值。HAI滴定度检测限(10)用虚线表示。

然后确定AVLP-H5颗粒疫苗是否能够提供针对H5N1挑战的保护。免疫小鼠在初次免疫后32天用10LD₅₀ H5N1进行挑战。所有PBS免疫小鼠体重减轻而死于感染。相比之下，接种了PIV5-H5/SH-HN(这里是10/10小鼠)和AVLP-H5(这里是15/15小鼠)的小鼠的100％在挑战中存活，表明AVLP-H5免疫提供了强大的可比性保护。

作为参考，图7中的小鼠用单剂量的PBS或PIV5-H5/SH-HN或两次剂量的AVLP-H5鼻内(每组n＝5)接种疫苗。在第26天进行免疫后，处死小鼠，收集脾脏。脾细胞用H5刺激。结果表示为每10⁶个脾细胞的IFN-γ产生细胞的平均数。差异由Student's t检验进行评估。(*，P<0.05；ns，不显著)。

为了进一步的参考，图8中的小鼠用单剂量的PBS或PIV5-H5/SH-HN(每组n＝10)或两次剂量的AVLP-H5鼻内(每组n＝15)接种疫苗。在初次接种后的第32天，用10LD₅₀的H5N1甲型流感病毒(A/越南/1203/04)挑战小鼠。在流感病毒挑战后，以两天间隔监测减重(图8A所示)和存活(图8B所示)进行14天。减肥量作为原始体重(挑战之日)的平均百分比绘制。

该示例性实施方式表明AVLP变体可以被产生并用作递送目的可表达的异源核苷酸序列的平台，其可以具有治疗应用，例如在这里例如针对流感H5N1的疫苗接种。本领域技术人员将认识到可以使用上述方法的变化产生附加的AVLP变体，并且用于治疗和/或预防某些人和动物疾病。

实施例4

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施方式进一步理解本公开：

含有潮霉素(Hyg)-胸苷激酶(TK)融合蛋白代替Hyg(图19)的AVLP响应施用阳性选择刺激物(例如潮霉素)或阴性选择刺激物(例如阿昔洛韦(ATC：J05AB01)或更昔洛韦(ATC：J05AB06))

AVLP-Hyg-TK允许通过潮霉素选择的阳性选择进行感兴趣的序列表达，或者与阿昔洛韦(ATC：J05AB01)或更昔洛韦(ATC：J05AB06)感兴趣的序列的细胞的杀伤(图25)。该AVLP变体能够在多种应用中使用—例如基因治疗，癌症治疗和/或疫苗开发—并可以随意关闭。也可以自己表达TK，或者与AVLP系统内的其他病毒蛋白如NP、V/P或L融合。也可以使用其他所谓的“自杀基因”系统(例如番茄胸苷激酶和AZT)。

实施例5

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施方式进一步理解本公开：

在某些情况下，需要跟踪AVLP系统。为了实现这一点，将Hyg-TK与纳米萤光素酶(L)融合以产生AVLP-HTL(Hyg-TK-荧光素酶)(图20)。所有三种蛋白质都是功能性的，允许用潮霉素阳性选择AVLP-HTL，用TK基因进行阴性选择，并通过标准方法用荧光素酶跟踪AVLP系统(图23)。也可以使用其他荧光素酶基因和其他报道基因。

实施例6

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施方式进一步理解本公开：

开发AVLP-CFTR变体作为用于在CF(囊性纤维化)患者的原代人上皮细胞中表达功能性CFTR的治疗剂(图22)。为了证实AVLP系统在该靶组织中的功能，将AVLP-EGFP系统施用于原代人和猪上皮细胞并进行追踪。在引入AVLP-EGFP后细胞是健康的，并且在42天都继续表达EGFP(图9)。

作为参考，图9显示了在原代人和猪气道上皮细胞中测试的AVLP-EGFP。AVLP-EGFP对细胞造成最小/不可检测的损伤并在用AVLP-EGFP接种细胞后42天检测到GFP的表达。此外，AVLP-EGFP可以从细胞的顶端和底侧表面进入细胞。这表明AVLP系统可以用于表达在气道上皮细胞中的基因，其可用于表达用于治疗某些疾病例如囊性纤维化治疗的异源核苷酸序列。

实施例7

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施方式进一步理解本公开：

构建了AVLP-BMP-2系统(图11)。含有AVLP-BMP-2的细胞的表达水平高于慢病毒载体转导细胞的表达水平(图12、图13和图14)。值得注意的是，AVLP-BMP-2系统比慢病毒载体系统的成本要低(比慢病毒系统便宜90％以上)并且更安全，因为它们在其生命周期中没有DNA相，因此不融合到宿主基因组中。

实施例8

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施方式进一步理解本公开：

在人和犬间充质干细胞(MSC)中测试AVLP-EGFP。作为参考，图10显示AVLP-EGFP对细胞产生最小/不可检测的损伤，并且在用AVLP-EGFP接种细胞后5天检测到GFP的表达。这进一步表明AVLP可用于基于MSC的疗法。

实施例9

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施方式进一步理解本公开：

证明AVLP-Cas9和引导RNA系统表达Cas9和引导RNA(图16和图17)。

实施例10

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施方式进一步理解本公开：

利用PIV5-AVLP系统(其不融合到宿主细胞基因组中，例如活HIV)，构建了包含HIV的Env和Gag，但内部蛋白来自于PIV5的嵌合体PIV5-HIV(图21、图26和图27)。

感兴趣的可表达异源核苷酸序列可以并入AVLP嵌合病毒系统中，以允许用阳性选择刺激(例如潮霉素)选择PIV5-HIV生长，并用具有阴性选择刺激的PIV5-HIV破坏细胞(例如阿昔洛韦或更昔洛韦)。

除了PIV5-HIV外，还可能产生其他嵌合体病毒。非限制性实例包括PIV5-RSV和PIV5-流感H1N1(图18、图20和图21)。为了证明这些AVLP系统的优越功能，PIV5-RSV被证明可以产生比具有相同RSV F的非扩增病毒颗粒更强大的免疫应答(图18)。

为了参考，图18中的脾细胞用RSV-F肽、GFP(不相关)肽或PMA/离子霉素进行模拟刺激或刺激。AVLP免疫刺激比PIV5-RSV-F更好的细胞介导的应答，表明AVLP-RSV-F产生强大的细胞免疫应答。

实施例11

本领域技术人员将通过参考以下示例性非限制性实施方式进一步理解本公开：

AVLP-CART系统被构建用于潜在的用作癌症治疗中的治疗剂(图22)。也可以使用用于癌基因疗法的感兴趣的其他基因和/或序列。

本公开不受本文描述的具体实施例的限制。实际上，除了本文所述的那些之外，本公开的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述中变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。

本文引用的所有专利、申请、公开、测试方法、文献和其他材料的全部内容通过引用并入本文，如同在本说明书中实际存在的那样。

Claims (27)

1.一种分离的多核苷酸，其包含：

(i)PIV5 NP、V/P和L基因中每一种的至少一部分，以及

(ii)异源非PIV5核苷酸序列，

其中所述多核苷酸缺少一种或多种选自由M、F、SH和HN所组成的组的PIV5基因，或不能表达选自由M、F、SH和HN所组成的组的一种或多种PIV5蛋白。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其包含PIV5 NP、V/P和L基因。

3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其缺少PIV5 M基因或不能表达PIV5 M蛋白。

4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的多核苷酸，其中所述异源非PIV5核苷酸序列插入在V/P和L基因之间。

5.如权利要求1-4中任一权利要求所述的多核苷酸，其中M、F、SH和HN PIV5基因中的一个或全部被异源核苷酸序列替代。

6.如权利要求1-5中任一权利要求所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列包含选择标记。

7.如权利要求6所述的多核苷酸，其中所述选择标记是Hyg或Hyg-TK。

8.如权利要求1-5中任一权利要求所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列编码选自RNAi、shRNA、siRNA、反义寡核苷酸和核酶的分子。

9.如权利要求1-5中任一权利要求所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列源自除PIV5之外的病毒。

10.如权利要求9所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列源自选自由流感病毒、RSV和HIV所组成的组的病毒。

11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列编码流感病毒HA。

12.如权利要求10所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列编码RSV F。

13.如权利要求10所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列编码HIV Gag、Env或两者。

14.如权利要求1-5中任一权利要求所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列是哺乳动物序列。

15.如权利要求14所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列是人序列。

16.如权利要求1-5中任一权利要求所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列编码CFTR或NeuroD1或BMP-2蛋白。

17.如权利要求1-5中任一权利要求所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列编码Cas9和引导RNA。

18.如权利要求1-5中任一权利要求所述的多核苷酸，其中所述异源核苷酸序列编码分泌蛋白。

19.如权利要求1-18中任一权利要求所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含报道基因。

20.如权利要求20所述的多核苷酸，其中所述报道基因编码荧光素酶或绿色荧光蛋白。

21.一种载体，其包含权利要求1-20中任一权利要求所述的多核苷酸。

22.一种宿主细胞，其包含如权利要求1-20中任一权利要求所述的多核苷酸或如权利要求21所述的载体。

23.一种由如权利要求22所述的宿主细胞产生的扩增病毒样颗粒(AVLP)。

24.一种扩增病毒样颗粒(AVLP)，其包含如权利要求1-20中任一项所述的多核苷酸。

25.一种经如权利要求23或24所述的AVLP感染的细胞。

26.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，包括：

向所述受试者施用权利要求23或权利要求24的AVLP。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者是人。