CN107827991A

CN107827991A - 靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞及其应用

Info

Publication number: CN107827991A
Application number: CN201711157376.3A
Authority: CN
Inventors: 史燕东; 武宁
Original assignee: IMPROVING LIFE BIOTECHNOLOGY (SHANGHAI) Co Ltd
Current assignee: IMPROVING LIFE BIOTECHNOLOGY (SHANGHAI) Co Ltd
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2037-11-20
Also published as: CN107827991B

Abstract

本发明公开了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及其应用，用于制备嵌合抗原受体T细胞的嵌合抗原受体包含顺序串联的白介素2信号肽，抗CD19单链抗体，CD8蛋白分子的绞链区，跨膜区，胞内信号结构域及CD3ζ蛋白分子的胞内信号传导结构域；其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。该嵌合抗原受体T细胞应用于制备治疗血液恶性肿瘤的药物或制剂；其中，血液恶性肿瘤包括CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病，弥漫性大B细胞淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。

Description

靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及其应用

技术领域

本发明属于免疫学和分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及其应用。

背景技术

传统的放、化疗、手术、造血干细胞移植等治疗方法延长了部分血液系统恶性肿瘤患者的生存时间，但是复发、难治甚至耐药现象，仍是目前面临的巨大挑战。

近年来，细胞免疫治疗因在肿瘤的肿瘤中取得了突破性进展，成为血液系统等多种肿瘤治疗的重要手段，被Science杂志列为2013年十大科学突破的首位。其中嵌合抗原受体T细胞免疫治疗进展尤为突出。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫治疗技术是在体外通过基因工程技术修饰患者自体或异体T细胞成为表达嵌合抗原受体的嵌合抗原受体T细胞。嵌合抗原受体分子中包括一个能特异地识别癌细胞表面抗原蛋白的单链抗体(scFv)，嵌合抗原受体中的scFv赋予了嵌合抗原受体T细胞特异地识别癌细胞的能力，当回输到病人体内后嵌合抗原受体T细胞就能特异性地杀死肿瘤细胞。嵌合抗原受体T细胞免疫治疗具有特异性强，安全性高，能长期有效控制甚至完全治愈肿瘤，是肿瘤治疗技术的重大突破。CD19特异性表达于恶性和正常B细胞以及B细胞前体细胞，而造血干细胞及非造血细胞则不存在CD19表达，因此针对CD19的嵌合抗原蛋白T细胞能特异地杀伤表达CD19恶性B细胞肿瘤。

过继性免疫细胞治疗(adoptive T-cell therapy，ACT)通过回输自体或经肿瘤特异性诱导的T细胞，在治疗一些到目前为止用其它手段几乎难以治愈的转移性恶性肿瘤如黑色素瘤方面取得重大成功；但由于回输T细胞在体内活性持续较短、缺乏肿瘤特异性及疗效不确切等诸多问题，在临床应用上受到限制。

针对过继性细胞治疗中回输T细胞的这些不足，本发明旨在设计一种人工的嵌合抗原受体蛋白，并利用基因工程技术在体外对患者自体的T细胞进行修饰，使设计的嵌合抗原受体蛋白表达在细胞膜上，使之成为嵌合抗原受体T细胞；当嵌合抗原受体T细胞回输到患者体内后，嵌合抗原受体利用其位于细胞表面的单链抗体部分识别并结合位于肿瘤细胞表面的特异抗原，这种特异性地结合改变嵌合抗原受体位于T细胞内的信号释放区的构象，信号释放区就会发出刺激信号来激活T细胞对肿瘤细胞的杀伤机制，从而杀死肿瘤细胞；同时嵌合抗原受体信号释放区发出的刺激信号还会刺激T细胞生长，产生更多的嵌合抗原受体T细胞，直至杀死所有的肿瘤细胞。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明提供了一种能够特异性地抑制、杀伤CD19恶性B细胞肿瘤的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及其应用。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种用于制备靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的嵌合抗原受体，具体采用了以下技术方案：

一种靶向CD19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的白介素2信号肽，抗CD19单链抗体，CD8蛋白分子的绞链区，跨膜区，胞内信号结构域及CD3ζ蛋白分子的胞内信号传导结构域；其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

优选的，在嵌合抗原受体T细胞外表面、能识别肿瘤细胞表面CD19抗原的是鼠源的抗CD19单链抗体(克隆号FMC63)，所述抗CD19单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻重链之间的连接区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述嵌合抗原受体在其N-端以白介素2的信号肽跟抗CD19的单链抗体的重链可变区连接，其中白介素2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述嵌合抗原受体中的抗CD19单链抗体通过CD8蛋白分子的铰链区与跨膜区相连接；该铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

优选的，所述胞内信号传导结构域(或者信号共刺激区)与跨膜区来自同一信号蛋白分子，所述的信号蛋白分子选自CD27、CD28、人肿瘤坏死因子受体9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或者与CD83特异性结合的配体。

进一步的，所述嵌合抗原受体的跨膜区跟胞内信号结构域选自人肿瘤坏死因子受体9；该人肿瘤坏死因子受体9蛋白分子的跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；该人肿瘤坏死因子受体9蛋白分子的胞内信号传导结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

优选的，所述CD3ζ蛋白分子的胞内信号传导结构域或者(刺激信号释放区)其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

本发明还提供了一种核酸分子，其编码上述的嵌合抗原受体，且其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

本发明还提供了一种载体，其包括上述的核酸分子；所述载体是利用所述核酸分子对慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中的GFP基因进行取代，并且以人延长因子1α基因的启动子取代其中的PGK启动子；其核苷酸如SEQ ID NO:11所示。

本发明还提供了一种T细胞，其表达权利要求1至6任一项所述的嵌合抗原受体。

本发明还提供了上述T细胞的用途，具体应用于制备治疗血液恶性肿瘤的药物或制剂；其中，所述的血液恶性肿瘤包括CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病，弥漫性大B细胞淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。

优选的，所述治疗血液恶性肿瘤的药物或制剂包括表达所述嵌合抗原受体的患者自体免疫细胞。

进一步地，所述治疗血液恶性肿瘤的药物或制剂包括表达所述嵌合抗原受体的患者自体NK细胞和CD3阳性T细胞。

本发明的有益效果在于：

CD19特异性表达于恶性和正常B细胞以及B细胞前体细胞，而造血干细胞及非造血细胞则不存在CD19表达，因此针对CD19的嵌合抗原受体T细胞能特异地杀伤表达CD19恶性B细胞肿瘤。本发明依据该思路，利用基因工程技术在体外对患者自体的T细胞进行修饰，使设计的嵌合抗原受体蛋白表达在细胞膜上，使之成为嵌合抗原受体T细胞；并且经过试验证明，本发明提供的嵌合抗原受体T细胞具有抑制肿瘤细胞增殖、调节机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长、特异性杀伤CD19阳性肿瘤细胞的优势，可应用于肿瘤的治疗。

附图说明

图1为本发明嵌合抗原受体T细胞与对照T-细胞的流式细胞检测结果对比图。

图2为本发明嵌合抗原受体T细胞与正常T细胞的体外试验结果对照图。

图3为本发明嵌合抗原受体T细胞与正常T细胞受刺激分泌INF-γ的试验结果对照图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

【实施例1】表达针对CD19的嵌合抗原受体基因的嵌合抗原受体慢病毒载体的构建

(1)全部人工合成的编码嵌合抗原受体的人工CAR基因(包括人伸长因子1α基因的启动子，并在5’-端加EcoRV内切酶位点，在3’-端加SalI内切酶位点)。

(2)用EcoRV和SalI(NEB公司)双酶切从慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中切除GFP基因和PGK启动子，将包含人伸长因子1α基因的启动子的人工合成的编码嵌合抗原受体的人工CAR基因取代GFP基因和PGK启动子，从而得到能表达针对CD19的嵌合抗原受体基因的嵌合抗原受体慢病毒载体。

【实施例2】使用三载体系统在293T细胞中包装包含编码嵌合抗原受体的人工基因的重组载体的假慢病毒颗粒

293T在含10vol％FBS的DMEM培养基中培养，耗材包括DMEM(Gibco，C11995500BT)，FBS(Gibco，10099-141)，胰酶(Gibco，25200-056)，Dulbecco’s PBS(Hyclone，cat#SH30256.01)，PEI(1mg/ml，Life Sciences，23966-2)，Opti-MEM(Gibco，51985-034)和10厘米细胞培养皿(Fisher Scientific，310109011)。

包装包含编码嵌合抗原受体的人工基因的重组载体的假慢病毒颗粒制备流程如下：

第0天：铺板

转染前24小时，用胰酶消化对数生长期的293FT细胞，以种子培养基(DMEM+10％FBS+500μg/ml G418)调整细胞密度，重新接种于10cm细胞培养皿中，37℃，5％CO₂恒温培养箱培养，保证24h后细胞汇合度达到90％-95％，以便用于转染。

第1天：转染

换液：转染前2小时更换新鲜DMEM；每个10cm培养皿中加入6ml预热至37℃的新鲜DMEM。

转染混合液准备：在15ml无菌离心管中按下表准备转染混合液：

转染：每个10cm培养皿中加入1ml转染混合液，需要缓慢、均匀加入；前后左右轻轻摇匀，37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。

第2天：换液

弃去培养上清，用10ml预热至37℃的PBS清洗一次。加入6ml预热至37℃的新鲜包装培养基(DMEM+500μg/ml G418)，37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。

第3天：收集第一批病毒上清

收集细胞培养皿中的培养基，即第一批病毒上清，4℃保存。向培养皿中添加6ml预热至37℃的新鲜包装培养基，37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。

第4天：收集第二批病毒上清

收获第二批培养上清。剩余的包装细胞及细胞培养皿按照生物垃圾进行处理。

收集到的病毒上清中就是包含编码嵌合抗原受体的人工基因的重组载体的假慢病毒颗粒，即可用于嵌合抗原受体T细胞制备。

【实施例3】使用包含编码针对CD19嵌合抗原受体的人工基因的重组载体的假慢病毒颗粒制备表达嵌合抗原受体的T细胞(简称嵌合抗原受体T细胞)

(1)单核淋巴细胞(PBMC)的制备

所用试剂耗材包括无血清培养基，无血清冻存液，PBS，Ficoll淋巴细胞分离液(GEHealthcare#17-5442-03)，5ml、10ml和25ml一次性无菌移液管(Thermo)，无菌枪头(QSP)，离心管(Thermo，339652)，细胞冷冻管(Thermo，375418)。

将采集的患者自体外周血加入到50ml无菌离心管中，置水平离心机中，450g，20℃，离心8分钟；将离心管中外周血会分层，上层是血浆，下层为全血细胞；取下层全血细胞加等体积PBS进行稀释；然后在50ml离心管中，每管按1:2比例混合室温的淋巴细胞分离液和全血细胞混合液：用25ml移液管吸取稀释的全血细胞缓缓加入于淋巴细胞分离液上层；将加样后的离心管置于水平离心机内，500g，4℃，离心25分钟；轻轻吸取白细胞层，合并于50ml离心管内，补充预温PBS至总体积为45ml，旋紧管盖，将离心管上下颠倒混匀4-5次，500g，4℃，离25分钟；观察细胞沉淀后，倾去上清，补充预温生理盐水至总体积40ml，轻轻悬浮细胞沉淀，旋紧管盖，将离心管上下颠倒混匀4-5次，然后，450g，20℃，离心8分钟；倾去上清，再用PBS洗白细胞两次，每次都400g，20℃，离心8分钟；最后白细胞重悬在PBS中，并计数，即得到制备好的单核淋巴细胞(PBMC)。

(2)CD3阳性(CD3+)T淋巴细胞的分选纯化

选用试剂和耗材包括Dulbecco’s PBS(Hyclone，cat#SH30256.01)，BSA(Sigma,cat#V900933)，EDTA，0.5M(VWR,cat#45001-122)，Pan T-Cell Isolation Kit(Miltenyi，cat#130-096-535)，AO/PI染料(Nexcelom，CS2-0105)，细胞计数板(Nexcelom，#SD100)及LScolumn(Miltenyi，cat#130-042-401)。准备15ml缓冲液(15ml PBS+75mg BSA+60μl 0.5MEDTA)，4℃预冷备用；取1.0E+07的PBMC重悬在PBS缓冲液中，300g，4℃，离心10分钟，弃上清；用40μl预冷缓冲液重悬细胞，加入10μl Pan T Cell Biotin-Antibody Cocktail，human，混匀后在4℃放置10分钟；再加入30μl缓冲液和20μl Pan T Cell MicroBeadCocktail，human，混匀后在4℃放置15分钟；将LS柱置于MidiMACS磁珠分离器上，用3ml缓冲液润洗LS柱(注意避免气泡阻塞柱子)；将细胞悬液从4℃取出，加入LS柱，收集流出液(为CD3+T细胞)；在柱子中加3ml缓冲液，收集流出液(含CD3+细胞)；合并含CD3+T细胞的流出液，按照细胞计数的标准操作规程进行细胞计数，即得到纯化的CD3+T细胞。

(3)T细胞的体外活化和嵌合抗原受体假慢病毒病毒转染

选用试剂和耗材包括无血清培养基，白介素2(IL-2)，PBS(Hyclone，#SH30256.01)，Human T-Activated CD3/CD28(GIBCO，11131D)，AO/PI染料(Nexcelom，CS2-0105)。

第一天

取不含IL-2的无血清培养基放入37℃培养箱中预热30分钟；取分离好的T细胞用预热的不含IL-2的无血清培养基洗涤1次，300g，室温离心10分钟，进行细胞计数，然后用预热的培养基稀释T细胞至浓度为0.5E+06细胞/ml；在6孔细胞培养板每个培养孔中心区域轻缓将T细胞加入，每孔加入2ml含T细胞的培养基，共加入1.0E+06个细胞，每孔加入20μlHuman T-Activited CD3/CD28放入培养箱中，37℃，5％CO₂，培养；

第二天

已培养24小时的T-细胞中加入IL-2至IL-2终浓度为200U/ml，37℃，5％CO₂，进行刺激扩增培养；

第三天

将嵌合抗原受体假慢病毒加入到活化的T细胞中，然后放37℃，5％CO₂培养箱中培养；

第四天

换新鲜培养基(IL-2终浓度为200U/ml)。

根据所要求的细胞量在第六天后即可收集嵌合抗原受体T细胞。

【实施例4】用流式细胞检测方法检测嵌合抗原受体T细胞表面的嵌合抗原受体

嵌合抗原受体检测所用第一抗体是兔抗鼠IgG(H+L)F(ab')₂(Jackson公司)。操作步骤如下：收集1.0E+6制备好的嵌合抗原受体T细胞，加入到1.5ml EP管中，300g，离心5min，弃上清；加入200μl PBS重悬细胞在1.5ml EP管中，按照产品说明的要求加入第一抗体，4℃孵育30分钟后，500g离心4分钟，弃掉上清；用200μl Staining Buffer重悬，500g离心4分钟，弃掉上清；加入200μl PBS重悬细胞，再按照产品说明加入第二抗体，4℃避光孵育30分钟；再500g离心4分钟，弃上清，再加入400μl Staining Buffer重悬；上机检测。

检测结果如图1所示，表明：跟没有处理过的正常对照T细胞相比，本发明制备所得的嵌合抗原受体T细胞中嵌合抗原受体表达率达到29％，较对照组高出6倍。

【实施例5】检测嵌合抗原受体-T细胞特异针对靶细胞的细胞毒性

5.1检测嵌合抗原受体-T细胞特异针对靶细胞的杀伤能力

检测用LDH-Cytotoxicity Colorimetric Assay Kit II试剂盒(Biovision)和RPMI-1640培养基(Hyclone，cat#SH30809.01B)。收集所需细胞，用新鲜培养基1640洗涤一次；先将靶细胞(比如CD19阳性Raji细胞)以每孔5.0E+04加入96孔U型板中，同时用CD19阴性K562细胞做对照；再将效应细胞(嵌合抗原受体-T细胞和T细胞)分别加入对应的靶细胞孔中，保证每孔最终体积在100微升；每孔设3个复孔，同时加入高限对照(靶细胞+10％细胞裂解液+1640培养基)和低限对照(靶细胞+1640培养基)以及低限样品对照(嵌合抗原受体-T细胞或T细胞+培养基)；将混合后的细胞(96孔板中)放入37℃，5％CO₂培养箱中孵育4个小时；将细胞混合液96孔板中取出，放入离心机中600g，4℃，离心10分钟，取上清10微升，放入新的96孔平底板中进行LDH检测(另外，再取5微升，放入另一96孔板中进行γ-干扰素检测)；再加入预先配制好的LDH反应混合液100μl，混合后室温避光放置30分钟；加入10％终止液终止反应，放入酶标仪中读取OD450nm(reference 650nm)；用excel分析所得结果。

检测结果如图2所示，表明：通过本发明制备的嵌合抗原受体-T细胞跟普通T-细胞相比，虽然对CD19阴性K562细胞的杀伤没有差别，但对CD19阳性肿瘤靶细胞Raji细胞的杀伤力提高超过一倍，同时也证明了本发明制备的嵌合抗原受体-T细胞具有特异性地针对CD19阳性肿瘤细胞的杀伤力。

5.2检测嵌合抗原受体T细胞受靶细胞特异诱导分泌的γ-干扰素(IFN-γ)

嵌合抗原受体T细胞受靶细胞刺激诱导分泌的IFN-γ量可以间接反映嵌合抗原受体T细胞对肿瘤靶细胞的特异杀伤能力。检测用ELISA检测试剂盒(RAYBIO)。Raji细胞是CD19阳性的B细胞白血病细胞，K562细胞是CD19阴性的B细胞淋巴瘤细胞。取按特定比例效应细胞和靶细胞混合孵育后离心分离得上清各5μl加入96孔板中；用PBS稀释第一抗体，在96孔板中每孔加50μl抗体，4℃过夜；每孔用250μl PBST洗板，共洗3遍；5％脱脂奶粉(PBST)封闭，每孔用250μl PBST洗板，共洗3遍；加标准品和样品(标准品配制：取10μl于640μl含1％BSA的PBS中，浓度为1000pg/ml，以此为母液进行2倍稀释，分别为500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml)，样品分布按照自己习惯排布；每孔用250μlPBST洗板，共洗3遍；每孔加入50μl稀释好的第二抗体，37度孵育1小时；每孔用250μl PBST洗板，共洗3遍；每孔加入50μl streptavidin-HRP(取375μl于15ml Reagent diluent中)，室温30分钟；每孔用250μl PBST洗板，共洗3遍；每孔加入50μl TMB(天根#PA107-01)，室温30分钟；每孔加入50μl 1M浓硫酸，终止反应；酶标仪读取OD 450nm，Reference 620nm，计算样品中γ-干扰素含量。

γ-干扰素是一种细胞因子，具有抑制肿瘤细胞增殖、调节机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长等多种作用。检测结果如图3所示表明：CD19阴性肿瘤K562细胞对本发明制备的嵌合抗原受体-T细胞和普通T-细胞的γ-干扰素分泌量没有明显影响，但CD19阳性肿瘤Raji细胞却能特异性地诱导本发明制备的嵌合抗原受体-T细胞大量分泌抑制肿瘤细胞生长的γ-干扰素，跟CD19阴性肿瘤K562细胞相比，CD19阳性肿瘤Raji细胞诱导嵌合抗原受体-T细胞分泌γ-干扰素的量提高了至少八倍。

经过上述试验证明，本发明提供的嵌合抗原受体T细胞具有抑制肿瘤细胞增殖、调节机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长、特异性杀伤CD19阳性肿瘤细胞的优势，可应用于肿瘤的治疗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 英普乐孚生物技术（上海）有限公司

<120> 靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞和应用

<130> 2017

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Ala Met Gly Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Ala Ser Ala

20

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Val Leu Leu Gly Gly Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Ala Thr

20 25 30

Gly Val Ser Thr Ile Ala Gly Pro Pro Ala Leu Gly Leu Gly Thr Leu

35 40 45

Gly Val Ile Thr Gly Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ala Leu Leu

50 55 60

Ser Ala Leu Thr Ile Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ser Gly Val Pro Leu

65 70 75 80

Leu Met Ala Ser Leu Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ile Thr Thr Cys Ala

85 90 95

Leu His Thr Thr Thr Gly Gly Ser Thr Ala Met Ala Thr Thr Gly Gly

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Ile Gly Met Thr Gly Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Ala Ala Val Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Ile Ser Leu Thr

20 25 30

Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu Ile

35 40 45

Thr His Thr Ser Ala Leu His Ser Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ala Thr Ser Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ala Ile Ala Thr Thr Pro Cys Gly Gly Gly Ala Thr Leu Pro Thr

85 90 95

Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile

100 105

<210> 5

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala Pro Gly Ala Cys Ala Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Ala Gly Leu Ala Pro Ala Cys Ala Ile Thr

35 40 45

<210> 6

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ile Ile Ser Pro Pro Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Pro Leu

1 5 10 15

Leu Pro Pro Leu Thr Leu Ala Pro Ser Val Val

20 25

<210> 7

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met

1 5 10 15

Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro

20 25 30

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu

35 40

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Leu Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr

20 25 30

Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu

35 40 45

Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu

50 55 60

Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala

100 105 110

<210> 9

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Thr Ala Met Gly Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Ala Ser Ala Gly Val Leu Leu Gly Gly Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Ala Pro Ser Gly Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val

35 40 45

Ser Leu Pro Ala Thr Gly Val Ser Thr Ile Ala Gly Pro Pro Ala Leu

50 55 60

Gly Leu Gly Thr Leu Gly Val Ile Thr Gly Ser Gly Thr Thr Thr Thr

65 70 75 80

Ala Ser Ala Leu Leu Ser Ala Leu Thr Ile Ile Leu Ala Ala Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Val Pro Leu Leu Met Ala Ser Leu Gly Thr Ala Ala Thr Ala

100 105 110

Ile Thr Thr Cys Ala Leu His Thr Thr Thr Gly Gly Ser Thr Ala Met

115 120 125

Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ile Gly Met

145 150 155 160

Thr Gly Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ala Val Thr

165 170 175

Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Ile Ser Leu Thr Leu Ala Thr Thr

180 185 190

Gly Gly Leu Pro Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu Ile Thr His Thr Ser

195 200 205

Ala Leu His Ser Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Ala Thr Ser Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gly Gly Gly Ala Ile Ala

225 230 235 240

Thr Thr Pro Cys Gly Gly Gly Ala Thr Leu Pro Thr Thr Pro Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Leu Leu Gly Ile Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala Pro Gly Ala

275 280 285

Cys Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Ala Gly Leu Ala Pro

290 295 300

Ala Cys Ala Ile Thr Ile Ile Ser Pro Pro Leu Ala Leu Thr Ser Thr

305 310 315 320

Ala Leu Leu Pro Leu Leu Pro Pro Leu Thr Leu Ala Pro Ser Val Val

325 330 335

Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met

340 345 350

Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro

355 360 365

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala

370 375 380

Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Leu Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala

385 390 395 400

Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala

405 410 415

Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro

420 425 430

Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala

435 440 445

Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His

450 455 460

Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala

485 490

<210> 10

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgtatcgca tgcagctgct gagctgcatc gccctgtccc tggccctggt gaccaacagc 60

gccgaggtga agctgcagga gtccggacca ggactggtgg caccttccca gtctctgagc 120

gtgacatgta ccgtgtccgg cgtgtctctg cctgactacg gcgtgtcctg gatcaggcag 180

ccacctagga agggactgga gtggctgggc gtgatctggg gctctgagac cacatactat 240

aatagcgccc tgaagtcccg gctgacaatc atcaaggata actccaagtc tcaggtgttc 300

ctgaagatga atagcctgca gacagacgat accgccatct actattgcgc caagcactac 360

tattacggcg gctcttatgc catggactac tggggccagg gcacaagcgt gaccgtgagc 420

tccaccggcg gcggcggctc tggaggagga ggaagcggag gaggaggcga tatccagatg 480

acacagacca catctagcct gagcgcctcc ctgggcgaca gagtgaccat ctcttgtagg 540

gccagccagg atatctccaa gtatctgaac tggtaccagc agaagcctga cggcacagtg 600

aagctgctga tctatcacac ctctcgcctg cacagcggag tgccatcccg gttctctgga 660

agcggatccg gaacagacta ctctctgacc atcagcaacc tggagcagga ggatatcgcc 720

acatatttct gccagcaggg caatacactg ccatacacct ttggcggcgg caccaagctg 780

gagatcacca caaccccagc acctaggcca ccaacaccag caccaaccat cgcatcccag 840

ccactgtctc tgagaccaga ggcatgcagg cctgcagcag gaggagccgt gcacacacgg 900

ggcctggact ttgcctgtga tatctatatc atctccttct ttctggccct gacatctacc 960

gccctgctgt tcctgctgtt ctttctgacc ctgaggttta gcgtggtgaa gagaggcagg 1020

aagaagctgc tgtacatctt caagcagcct tttatgagac cagtgcagac aacccaggag 1080

gaggacggct gctcctgtag gttcccagaa gaggaggagg gaggatgtga gctgcgcgtg 1140

aagttttctc ggagcgccga tgcccctgcc tataagcagg gccagaatca gctgtacaac 1200

gagctgaatc tgggccggag agaggagtac gacgtgctgg ataagaggag gggaagagat 1260

ccagagatgg gaggcaagcc acggagaaag aacccccagg agggcctgta taatgagctg 1320

cagaaggaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggaga gaggcgccgg 1380

ggcaagggac acgatggcct gtatcagggc ctgtccacag ccaccaagga cacctacgat 1440

gccctgcaca tgcaggccct gcctccaagg tga 1473

<210> 11

<211> 2695

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgatatcgt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 60

gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 120

tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 180

agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc 240

cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat 300

tacttccacc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg 360

ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg 420

gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc 480

tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg 540

gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc 600

cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg 660

agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc 720

tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc 780

agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag 840

gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc 900

gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga 960

ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat 1020

ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta 1080

attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac 1140

agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga ggaatttcga catttaaatt 1200

taattaagcc accatgtacc gcatgcagct gctgagctgc atcgccctga gcctggccct 1260

ggtgaccaac agcgccgagg tgaagctgca ggagagcggc cccggcctgg tggcccccag 1320

ccagagcctg agcgtgacct gcaccgtgag cggcgtgagc ctgcccgact acggcgtgag 1380

ctggatccgc cagccccccc gcaagggcct ggagtggctg ggcgtgatct ggggcagcga 1440

gaccacctac tacaacagcg ccctgaagag ccgcctgacc atcatcaagg acaacagcaa 1500

gagccaggtg ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac gacaccgcca tctactactg 1560

cgccaagcac tactactacg gcggcagcta cgccatggac tactggggcc agggcaccag 1620

cgtgaccgtg agcagcaccg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg 1680

cgacatccag atgacccaga ccaccagcag cctgagcgcc agcctgggcg accgcgtgac 1740

catcagctgc cgcgccagcc aggacatcag caagtacctg aactggtacc agcagaagcc 1800

cgacggcacc gtgaagctgc tgatctacca caccagccgc ctgcacagcg gcgtgcccag 1860

ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccga ctacagcctg accatcagca acctggagca 1920

ggaggacatc gccacctact tctgccagca gggcaacacc ctgccctaca ccttcggcgg 1980

cggcaccaag ctggagatca ccaccacccc cgccccccgc ccccccaccc ccgcccccac 2040

catcgccagc cagcccctga gcctgcgccc cgaggcctgc cgccccgccg ccggcggcgc 2100

cgtgcacacc cgcggcctgg acttcgcctg cgacatctac atcatcagct tcttcctggc 2160

cctgaccagc accgccctgc tgttcctgct gttcttcctg accctgcgct tcagcgtggt 2220

gaagcgcggc cgcaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cccttcatgc gccccgtgca 2280

gaccacccag gaggaggacg gctgcagctg ccgcttcccc gaggaggagg agggcggctg 2340

cgagctgcgc gtgaagttca gccgcagcgc cgacgccccc gcctacaagc agggccagaa 2400

ccagctgtac aacgagctga acctgggccg ccgcgaggag tacgacgtgc tggacaagcg 2460

ccgcggccgc gaccccgaga tgggcggcaa gccccgccgc aagaaccccc aggagggcct 2520

gtacaacgag ctgcagaagg acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg 2580

cgagcgccgc cgcggcaagg gccacgacgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa 2640

ggacacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc cgctgagtcg acaat 2695

Claims

1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包含顺序串联的白介素2信号肽，抗CD19单链抗体，CD8蛋白分子的绞链区，跨膜区，胞内信号结构域和CD3ζ蛋白分子的胞内信号传导结构域；其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗CD19单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻重链之间的连接区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述嵌合抗原受体在其N-端以白介素2的信号肽跟抗CD19单链抗体的重链可变区连接，白介素2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8蛋白分子铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述胞内信号结构域与跨膜区来自同一信号蛋白分子，所述的信号蛋白分子选自CD27、CD28、人肿瘤坏死因子受体9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或者与CD83特异性结合的配体。

5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的跨膜区跟胞内信号结构域选自人肿瘤坏死因子受体9；该人肿瘤坏死因子受体9蛋白分子的跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；该人肿瘤坏死因子受体9蛋白分子的胞内信号传导结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD3ζ蛋白分子胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

7.核酸分子，其编码权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体，且其核苷酸序列如SEQID NO:10所示。

8.载体，其包括权利要求7所述的核酸分子；所述载体是利用所述核酸分子对慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中的GFP基因进行取代，并且以人延长因子1α基因的启动子取代其中的PGK启动子；其核苷酸如SEQ ID NO:11所示。

9.T细胞，其表达权利要求1至6任一项所述的嵌合抗原受体。

10.如权利要求9所述的T细胞应用于制备治疗血液恶性肿瘤的药物或制剂；其中，所述的血液恶性肿瘤包括CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病，弥漫性大B细胞淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。