CN107815434A - 一种趋磁细菌的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种趋磁细菌的培养方法，该方法包括以下步骤：活化：将冷冻的趋磁细菌在水浴中化冻为液态后接种于无菌的液体活化培养基中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养5～8d，得到活化后的菌液；扩大培养：将活化菌液离心，将沉淀部分转接入无菌的液体扩大培养基中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养20～22h，得到扩大培养菌液；发酵培养：将培养菌液加入到发酵培养基中，在磁场震荡、温度为30～32℃、搅拌速度为40～50rpm的环境中密封发酵培养40～50h，得到发酵菌液；将发酵菌体超声波破碎洗涤、纯化和冷冻干燥获得磁小体。本发明操作更为简单，并且趋磁细菌能实现规模化培养，磁小体收率更高。

Description

一种趋磁细菌的培养方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种趋磁细菌的培养方法。
背景技术
趋磁细菌(Magnetotactic bacterium)是一类在外磁场的作用下能作定向运动的细菌，这些细菌之所以有这种举动主要是因为它们产生微小的、含铁的、具有磁性的小颗粒——磁小体(Magnetosome)。每颗磁小体都具有北极和南极，这些细菌将这些磁小体排成一直线形成一长的磁铁。
趋磁细菌的磁小体可以做为一种新的生物资源得到应用，小尺寸的磁小体与大块材料具有显著不同，大块的纯铁矫顽力约为80安/米，而当颗粒尺寸减小到2×10-2微米以下时，其矫顽力可增加1千倍，若进一步减小其尺寸，大约小于6×10-3微米时，其矫顽力反而降低到零，呈现出超顺磁性。磁小体所具有的高矫顽力特性，可作成高贮存密度的磁记录磁粉，大量应用于磁带、磁盘、磁卡以及磁性钥匙等；此外，利用超顺磁性可将磁小体制成用途广泛的磁性液体。同样在医疗领域，目前也普遍认为趋磁菌有一定的实用前景，包括生产磁性定向药物或抗体，以及制造生物传感器等。
目前，作为一株兼性厌氧菌，趋磁细菌生长缓慢，生长量低，环境要求苛刻，固态培养难度大，特别是经过常规固态平板培养后产磁能力的减弱或丧失，人工培养水平较低，磁小体分离纯化的量和水平均较低，无法大规模进行培养，离产业化水平还有较大差距。
发明内容
本发明的目的在于提供一种趋磁细菌的培养方法，旨在解决现有趋磁细菌培养困难、磁小体分离纯化的量和水平均较低的问题。
本发明是这样实现的，一种趋磁细菌的培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)活化：将冷冻的趋磁细菌在水浴中化冻为液态后接种于无菌的液体活化培养基中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养5～8d，得到活化后的菌液；
(2)扩大培养：将步骤(1)中得到的活化菌液离心，将沉淀部分转接入无菌的液体扩大培养基中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养20～22h，得到扩大培养菌液；
(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的培养菌液加入到发酵培养基中，在磁场震荡、温度为30～32℃、搅拌速度为40～50rpm的环境中密封发酵培养40～50h，得到发酵菌液；
(4)将步骤(3)中得到的发酵菌体超声波破碎洗涤、纯化和冷冻干燥获得磁小体。
优选地，所述趋磁细菌为趋磁细菌AMB-1；在步骤(1)中，所述活化培养基为液体培养基1653MSGM，接种的趋磁细菌与活化培养基的质量体积比为1g：(5～6)mL。
优选地，在步骤(2)中，所述扩大培养基的pH为6.7～6.8；所述扩大培养基的组成为：营养琼脂6.5g、Fe3+(硫酸铁)80μM、MgSO4.7H2O 0.1g、盐酸吡多辛0.1mg、氨三乙酸1.5g、NH4Cl 1.0g、硼酸0.01g、盐酸硫胺素0.05mg、核黄素0.05mg、生物素0.002mg、柠檬酸0.03mg、叶酸0.02mg、泛酸钙0.05mg、β-内酰胺类抗生素0.01mg、矿物质素混合液5mL，蒸馏水加至1000mL；
所述活化菌液与扩大培养基的体积比为(5～8)mL：(50～100)mL。
优选地，所述矿物质素混合液的组成为：硫酸钴(CoSO4.7H2O)0.18g、氯化钙(CaCl2.2H2O)0.1g、硫酸锌(ZnSO4.7H2O)0.18g、硫酸铜(CuSO4.5H2O)0.01g、硫酸铝钾(KAl(SO4)2.12H2O)0.02g、氯化镍(NiCl2.6H2O)0.025g、亚硒酸钠(Na2SeO3.5H2O)0.3mg，加蒸馏水至1000mL。
优选地，在步骤(3)中，所述发酵培养基的pH为6.3～6.5；
所述发酵培养基的组成为：液体培养基1653MSGM 400～500ml、乳酸钠8～10g、Fe3+(硫酸铁)200～250μM，蒸馏水加至1000mL；
所述培养菌液与发酵培养基的体积比为1：(5～10)。
优选地，在步骤(3)中，所述磁场震荡为：以(500～800)mT强度磁场绕培养菌液的发酵主体以20～30rpm/min的速度转动。
优选地，在步骤(4)中，所述超声波破碎功率为60％～70％，超声波处理时间为30min～45min。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明操作更为简单，并且趋磁细菌能实现规模化培养，磁小体收率更高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在以下实施例中，趋磁细菌AMB-1购于美国标准菌种保藏中心(ATCC)，液体培养基1653MSGM根据ATCC官网提供配制。
液体扩大培养基的配制：营养琼脂6.5g、Fe3+(硫酸铁)80μM、MgSO4.7H2O 0.1g、盐酸吡多辛0.1mg、氨三乙酸1.5g、NH4Cl 1.0g、硼酸0.01g、盐酸硫胺素0.05mg、核黄素0.05mg、生物素0.002mg、柠檬酸0.03mg、叶酸0.02mg、泛酸钙0.05mg、β-内酰胺类抗生素0.01mg、矿物质素混合液5mL，蒸馏水加至1000mL；其中，矿物质素混合液的组成为：硫酸钴(CoSO4.7H2O)0.18g、氯化钙(CaCl2.2H2O)0.1g、硫酸锌(ZnSO4.7H2O)0.18g、硫酸铜(CuSO4.5H2O)0.01g、硫酸铝钾(KAl(SO4)2.12H2O)0.02g、氯化镍(NiCl2.6H2O)0.025g、亚硒酸钠(Na2SeO3.5H2O)0.3mg，加蒸馏水至1000mL。
发酵培养基的配制为：液体培养基1653MSGM 400～500ml、乳酸钠8～10g、Fe3+(硫酸铁)200～250μM，蒸馏水加至1000mL；
实施例1
(1)活化：将1g冷冻的趋磁细菌AMB-1在50～60℃水浴中化冻为液态后接种于(5～6)mL无菌的液体培养基1653MSGM中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养5～8d，得到活化后的菌液；
(2)扩大培养：将5mL步骤(1)中得到的活化菌液离心，将褐色沉淀部分转接入100mL、pH为6.7～6.8的无菌的液体扩大培养基中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养20～22h，得到扩大培养菌液；
(3)发酵培养：将100mL步骤(2)中得到的培养菌液加入到1000mL、pH为6.3～6.5发酵培养基中，在800mT强度磁场绕培养菌液的发酵主体以30rpm/min的速度转动、温度为30～32℃、搅拌速度为50rpm的环境中密封发酵培养40～50h，得到发酵菌液；
(4)将步骤(3)中得到的发酵菌体以破碎功率为70％的超声波破碎30min～45min，常规洗涤、纯化和冷冻干燥获得磁小体。
对所获得的干燥磁小体进行称重为1.8mg，产率为1.8mg/L。
实施例2
(1)活化：将1g冷冻的趋磁细菌AMB-1在50～60℃水浴中化冻为液态后接种于(5～6)mL无菌的液体培养基1653MSGM中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养5～8d，得到活化后的菌液；
(2)扩大培养：将8mL步骤(1)中得到的活化菌液离心，将褐色沉淀部分转接入50mL、pH为6.7～6.8的无菌的液体扩大培养基中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养20～22h，得到扩大培养菌液；
(3)发酵培养：将100mL步骤(2)中得到的培养菌液加入到500mL、pH为6.3～6.5发酵培养基中，在500mT强度磁场绕培养菌液的发酵主体以20rpm/min的速度转动、温度为30～32℃、搅拌速度为40rpm的环境中密封发酵培养40～50h，得到发酵菌液；
(4)将步骤(3)中得到的发酵菌体以破碎功率为60％的超声波破碎30min～45min，常规洗涤、纯化和冷冻干燥获得磁小体。
对所获得的干燥磁小体进行称重为1.2mg，产率为2.4mg/L。
实施例3
(1)活化：将1g冷冻的趋磁细菌AMB-1在50～60℃水浴中化冻为液态后接种于(5～6)mL无菌的液体培养基1653MSGM中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养5～8d，得到活化后的菌液；
(2)扩大培养：将6mL步骤(1)中得到的活化菌液离心，将褐色沉淀部分转接入80mL、pH为6.7～6.8的无菌的液体扩大培养基中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养20～22h，得到扩大培养菌液；
(3)发酵培养：将100mL步骤(2)中得到的培养菌液加入到800mL、pH为6.3～6.5发酵培养基中，在600mT强度磁场绕培养菌液的发酵主体以25rpm/min的速度转动、温度为30～32℃、搅拌速度为45rpm的环境中密封发酵培养45h，得到发酵菌液；
(4)将步骤(3)中得到的发酵菌体以破碎功率为65％的超声波破碎30min～45min，常规洗涤、纯化和冷冻干燥获得磁小体。
对所获得的干燥磁小体进行称重为1.6mg，产率为2.0mg/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种趋磁细菌的培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)活化：将冷冻的趋磁细菌在水浴中化冻为液态后接种于无菌的液体活化培养基中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养5～8d，得到活化后的菌液；
(2)扩大培养：将步骤(1)中得到的活化菌液离心，将沉淀部分转接入无菌的液体扩大培养基中，在30℃温度下、密封无外菌环境中培养20～22h，得到扩大培养菌液；
(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的培养菌液加入到发酵培养基中，在磁场震荡、温度为30～32℃、搅拌速度为40～50rpm的环境中密封发酵培养40～50h，得到发酵菌液；
(4)将步骤(3)中得到的发酵菌体超声波破碎洗涤、纯化和冷冻干燥获得磁小体。
2.如权利要求1所述的趋磁细菌的培养方法，其特征在于，所述趋磁细菌为趋磁细菌AMB-1；在步骤(1)中，所述活化培养基为液体培养基1653MSGM，接种的趋磁细菌与活化培养基的质量体积比为1g：(5～6)mL。
3.如权利要求1所述的趋磁细菌的培养方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述扩大培养基的pH为6.7～6.8；所述扩大培养基的组成为：营养琼脂6.5g、Fe3+(硫酸铁)80μM、MgSO4.7H2O 0.1g、盐酸吡多辛0.1mg、氨三乙酸1.5g、NH4Cl 1.0g、硼酸0.01g、盐酸硫胺素0.05mg、核黄素0.05mg、生物素0.002mg、柠檬酸0.03mg、叶酸0.02mg、泛酸钙0.05mg、β-内酰胺类抗生素0.01mg、矿物质素混合液5mL，蒸馏水加至1000mL；
所述活化菌液与扩大培养基的体积比为(5～8)mL：(50～100)mL。
4.如权利要求3所述的趋磁细菌的培养方法，其特征在于，所述矿物质素混合液的组成为：硫酸钴(CoSO4.7H2O)0.18g、氯化钙(CaCl2.2H2O)0.1g、硫酸锌(ZnSO4.7H2O)0.18g、硫酸铜(CuSO4.5H2O)0.01g、硫酸铝钾(KAl(SO4)2.12H2O)0.02g、氯化镍(NiCl2.6H2O)0.025g、亚硒酸钠(Na2SeO3.5H2O)0.3mg，加蒸馏水至1000mL。
5.如权利要求1所述的趋磁细菌的培养方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述发酵培养基的pH为6.3～6.5；
所述发酵培养基的组成为：液体培养基1653MSGM 400～500ml、乳酸钠8～10g、Fe3+(硫酸铁)200～250μM，蒸馏水加至1000mL；
所述培养菌液与发酵培养基的体积比为1：(5～10)。
6.如权利要求5所述的趋磁细菌的培养方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述磁场震荡为：以(500～800)mT强度磁场绕培养菌液的发酵主体以20～30rpm/min的速度转动。
7.如权利要求1所述的趋磁细菌的培养方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述超声波破碎功率为60％～70％，超声波处理时间为30min～45min。
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