CN107810278B - 用于海马体功能下降的药学组合物及抑制剂的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用微RNA(micro RNA；miRNA)与N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体(N‑methyl‑D‑aspartate receptor；NMDAR)的相关关系的海马体的功能下降的判断方法、功能下降的抑制方法及功能下降抑制剂的筛选方法，在本说明书中，在老化的海马体中被上调的微RNA中miR‑204，正确地以作为重要的调节受体的EphB2为目标，使EphB2表达下降，由此确认，导致海马体神经的N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体的NR1亚基的神经元表面表达下降、树突密度下降，因此具有利用微RNA与N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体的相关关系判断海马体的功能是否下降，进一步地提供海马体的功能下降的抑制方法及功能下降抑制剂的筛选方法的效果。

Description

用于海马体功能下降的药学组合物及抑制剂的筛选方法
技术领域
本申请要求2015年06月18日申请的韩国专利申请第10-2015-0086823号的优先权，上述说明书全文为本申请的参考文献。本发明涉及利用微RNA(micro RNA；miRNA)与N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor；NMDAR)受体的相关关系的海马体的功能下降的判断方法、功能下降的抑制方法及功能下降抑制剂的筛选方法，更详细地，在老化的海马体(Hippocampus)中，随着miRNA-204的表达的增加，eph/ephrin介导轴突导向信号路径(Eph/ephrin mediated axon guidance signaling pathway)下调，由此，海马体的N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达下降，因此利用它们的相关关系判断海马体的功能是否下降，进一步地提供海马体的功能下降的抑制方法及功能下降抑制剂的筛选方法。
背景技术
海马体作为大脑系统的核心构成要素，是突出在大脑的侧脑室下角(侧脑室下角)底面的大脑皮质的一部分。海马体调节学习、记忆及认识新事物或情感行为或一些运动，并且具有调节下丘脑功能的作用。这种海马体随着年龄经历生物学性及结构性变化，与年龄相关性地影响认知衰退(C.A.Erickson and C.A.Barnes，Experimental Gerontology，38：61，2003)。由老化引起的神经调节缺陷可影响老化的海马体的记忆功能及学习能力，由此还引发阿尔茨海默氏痴呆症、癫痫、克撸尔-布西综合征等。
Ryann M.Fame et al.,Trends Neurosci.34(1)：41，2011；Federico W.Grilloet al.，PNAS，110(16)：E1514，2013)。
尤其，大脑由神经元(神经细胞)向突触连接的网络形成，我们的记忆信息就是以在作为神经元间连接结构的突触产生变化的方式发生。若与记忆有关的基因通过表达制成蛋白质，则记忆内容会被巩固，由此维持长期储存的状态，但是在老化过程中突触的可塑性(Synaptic plasticity)发生变化。上述突触可塑性是指改变对突触后神经元产生影响的突触的结构性或生化性变化，对海马体内的回路的电刺激可诱导视为与学习有关的长期性的突触变化。其中，据悉在海马体中发现据悉为调节细胞的凋亡和正常细胞间的信号传递的作为神经受体的N-甲基-D-天冬氨酸受体尤其在CA1中被发现，控制钙离子路径，并且参与长期增强。
并且，N-甲基-D-天冬氨酸受体与多巴胺D1受体直接相互作用，并根据相互作用的结果调节细胞凋亡，或者诱导正常细胞间的通信的功能，因此，作为用于治疗脑卒中、精神病(精神分裂症)、骨质疏松症、癫痫、痴呆等各种疾病的环节，对N-甲基-D-天冬氨酸受体进行了多种研究。例如，在喝酒后没有记忆的现象，即‘断片’现象也是因酒精阻止N-甲基-D-天冬氨酸受体的活动而引起的，这是学界的定论。即，这是因为若N-甲基-D-天冬氨酸活动被阻止，则在大脑的神经细胞之间传递信号的作为媒介作用的谷氨酸也停止活动。
另一方面，微RNA作为21核苷酸(nt)至25核苷酸(nt)的单链RNA分子，与mRNA的3'-UTR相结合成为抑制真核生物的基因表达的新型物质。微RNA的生成借助Drosha(核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢtype酶))来被制成茎环(stemloop)结构的前体微RNA(pre-miRNA)，并向细胞质移动，被Dicer切断而被制成微RNA。由此制成的微RNA通过调节目标蛋白质的表达来参与产生、细胞增殖及凋亡、脂肪代谢肿瘤形成等。具有这种功能的微RNA，最近除了组蛋白去乙酰化酶(histone decaetylases.HDACs)或DNA甲基转移酶(DNA methyl transferases，DNMTs)之外，作为另一表观遗传调节(epigenetic regulators)而备受瞩目(Miranda KCet al.，Cell，126(6)：1203，2006；Nicole Noren Hooten et al.，PLoS ONE，5(5)：e10724，2010)。
所有哺乳动物的微RNA的约50％丰富地存在于大脑中，据悉，其中多数对神经及神经发育起重要作用(Sempere，L.F.et al.，Genome Biol.，5：R13，2004；Giraldez，A.J.etal.，Science，308：833，2005)。
在现有技术中，据报道小鼠的整个大脑中的微RNA通过胰岛素信号传递路径潜在性地参与老化过程(Sachi Inukai et al.，PLoS ONE，7(7)：e40028，2012)，并且据悉对神经活动的调节，在海马体的微RNA及特定生物学路径中，基于它们的下游(down stream)目标的相互作用来进行(Stephen M.Eacker et al.，PLoS ONE，6(10)：e25068，2011)，但是实际上，还缺乏对微RNA的动态表达以老化依赖性地对正常的海马体功能有何影响的综合研究。
为此，本发明人致力于研究在海马体的正常老化过程中微RNA的作用的结果，确认在老化的海马体中，被上调的微RNA中miR-204正确地靶向作为重要的调节受体的EphB2来下降EphB2表达，由此，确认出了海马体神经的N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR1亚基的神经元表面表达下降且树突密度下降的情况。
并且，利用微RNA与N-甲基-D-天冬氨酸受体的相关关系判断海马体的功能是否下降，进一步地确认可提供海马体的功能下降的抑制方法及功能下降抑制剂的筛选方法，从而完成了本发明。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明的目的在于，提供利用微RNA与N-甲基-D-天冬氨酸受体的相关关系的海马体的功能下降的判断方法。
本发明的再一目的在于，提供利用微RNA与N-甲基-D-天冬氨酸受体的相关关系的海马体的功能下降的抑制方法及包含微RNA抑制剂的海马体功能下降抑制用组合物。
本发明的另一目的在于，提供将抑制由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂用于预防或治疗海马体功能下降的用途。
本发明的还一目的在于，提供海马体功能下降的预防方法，包括对所需个体给予药学有效量的抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂的步骤。
本发明的又一目的在于，提供海马体功能下降的治疗方法，包括对所需个体给予药学有效量的抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂的步骤。
本发明的又一目的在于，提供利用微RNA与N-甲基-D-天冬氨酸受体的相关关系的海马体的功能下降抑制剂的筛选方法。
解决问题的方案
为了实现上述第一目的，本发明提供用于判断海马体的功能是否下降的方法，其特征在于，包括：步骤(a)，在从患者中取样的基因样本中分析由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p的表达程度；步骤(b)，将从正常人取样的基因样本作为对照组，确认患者的miR-204-5p表达是否增加；进一步确认随着上述miR-204-5p基因的表达增加，海马体神经元表面的N-甲基-D-天冬氨酸受体表达是否下降。
根据本发明的优选一实施例，随着上述miR-204-5p表达的增加EphB2蛋白质表达下降，因此海马体神经元的N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达可下降。
根据本发明的优选的还一实施例，随着上述miR-204-5p基因的表达增加，在N-甲基-D-天冬氨酸受体中，NR1亚基的表达可下降。
根据本发明的优选的另一实施例，随着上述miR-204-5p基因的表达增加，海马体神经元的树突棘密度(dendritic spine density)可下降。
为了实现上述第二目的，本发明提供海马体功能下降的抑制方法，包括通过对抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂进行处理来使N-甲基-D-天冬氨酸受体表达增加的步骤。
根据本发明的优选一实施例，抑制上述miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂可以为反义寡核苷酸或siRNA。
根据本发明的优选的还一实施例，上述制剂可以为选自作为反义RNA的由5'AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA 3'构成的组中的一种以上。
根据本发明的优选的再一实施例，基于抑制上述miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂EphB2蛋白质表达增加，因此海马体神经元的N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达可增加。
根据本发明的优选的另一实施例，在上述N-甲基-D-天冬氨酸受体中，NR1亚基(subunit)的表达可增加。
根据本发明的优选的还一实施例，基于抑制上述miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂海马体神经元的树突棘密度可增加。
为了实现上述第三目的，本发明提供海马体功能下降抑制剂的筛选方法，包括：步骤(a)，在来源于人类的海马体神经元中对抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的候补物质进行处理；以及步骤(b)，在上述神经元表面中确认N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达是否增加。
根据本发明的优选一实施例，在上述步骤(b)中，可筛选使N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达增加的候补物质。
根据本发明的优选的再一实施例，在上述步骤(b)中，可通过进一步确认EphB2蛋白质的表达是否增加，来筛选使EphB2及N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白质的表达增加的候补物质。
根据本发明的优选的另一实施例，在上述步骤(b)中，可确认NR1亚基的的表达是否增加。
进一步地，本发明提供包含抑制由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂的用于预防或治疗海马体功能下降的药学组合物。
并且，本发明提供将抑制由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂用于预防或治疗海马体功能下降的用途。
并且，本发明提供海马体功能下降的预防方法，包括对所需个体给予药学有效量的抑制由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂的步骤。
同时，本发明提供海马体功能下降的治疗方法，包括对所需个体给予药学有效量的抑制由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂的步骤。
发明的效果
在本说明书中，老化的海马体中被上调的微RNA中miR-204，正确地以作为重要的调节受体的EphB2为目标，使EphB2表达下降，由此确认了导致海马体神经的N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR1亚基的神经元表面表达下降、树突密度下降的情况，因此具有利用微RNA与N-甲基-D-天冬氨酸受体的相关关系判断海马体的功能是否下降，进一步地提供海马体的功能下降的抑制方法及功能下降抑制剂的筛选方法的效果。
附图说明
图1a为确认海马体mRNA的老化依赖性表达模式，以热点图(heat map)示出2个月、6个月及18个月后小鼠的海马体中微RNA的表达变化，表达值倍数变化(fold change)值为2.0以上的微RNA约80个。
图1b为以分散体积图(Scattered volume plot)示出在2个月小鼠及18个月小鼠之间具有2.0以上的表达值倍数变化值的微RNA，通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测筛选的代表性的微RNA用红色表示。X轴表示体积变化，Y轴用表达值倍数变化值表示微RNA的表达水平。
图1c为利用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time Quantitative PolymeraseChain Reaction；qPCR)进行分析时，表示在2个月小鼠及18个月小鼠之间具有2.0以上的表达值倍数变化值的微RNA的种类的数据。
图2a为海马体老化的期间Eph/ephrin介导的轴突诱导的预测路径模式化的数据，利用实时荧光定量聚合酶链反应检测的目标用#表示。
图2b为利用实时荧光定量聚合酶链反应表示包含在轴突诱导路径的代表性的目标mRNA的表达值倍数变化值的数据。
图2c为利用实时荧光定量聚合酶链反应表示在海马体组织中参与Eph-ephrin信号的目标mRNA的表达值倍数变化值的数据。
图2d为通过蛋白质印迹分析确认在年轻海马体及老年海马体组织中参与ephrin信号传递的目标分子的蛋白质表达水平的数据。利用image J软件分析蛋白质带定量及相对密度。
图3为筛选参与EphB2的微RNA的数据。
图4为示出微RNA204-5p及EphB2的相对RNA表达量的数据。
图5a为示出在神经元中作为miR-204-5p的目标的EphB2，将miR-204-5p处理在野生型及变异的EphB2-3'UTR时，示出相对荧光素酶活性。
图5b为在培养的海马体来源神经元中示出miR-204-5p浓度依赖性的EphB2-3'UTR的荧光素酶活性的数据。
图5c为在神经元中处理miR-204mimic及miR-204抑制剂时，利用蛋白质印迹法确认EphB2蛋白质表达变化的数据。
图6为确认基于miR-204的树突密度是否调节的数据。
图7a为示出基于miR-204的N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR1亚基的表面表达调节程度的数据。在培养第7天利用scramble(scr)、miR-204mimic及miR-204抑制剂转化的海马体神经元中被生物素化(表面)的NR1及总NR1蛋白质，利用特定抗体通过免疫染色进行视觉化。微管蛋白(tubulin)用作总蛋白质的载入对照组，微管蛋白的缺乏表示表面标签的对照组。条形图示出培养第7天的表面NR1及总NR1的表达比例(*P＜0.05，误差条：标准平均误差)。
图7b为从年轻海马体及老年海马体组织利用蛋白质印迹法分析对N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚基的蛋白质表达程度进行定量的数据。蛋白质带定量及相对密度利用imageJ软件进行分析。
具体实施方式
以下，更详细地说明本发明。
如上所述，据悉存在于大脑中的微RNA(micro RNA；miRNA，以下标记为微RNA)对神经及神经发育具有关键的作用，但是实际上缺乏根据微RNA的表达调节，以老化依赖性地对正常的海马体功能有何影响的研究。
在本发明中提供利用微RNA与N-甲基-D-天冬氨酸受体的相关关系的海马体的功能下降的判断方法、功能下降的抑制方法及功能下降抑制剂的筛选方法，进而试图解决所述的问题。由此，在老化的海马体中上调的微RNA中miR-204通过正确靶向作为关键调节受体的EphB2来降低EphB2表达，从而确认，在海马体神经元细胞的表面中，N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR1亚基的表达降低且降低树突密度。
因此，本发明涉及如下的海马体的功能下降的判断方法，即，包括：步骤(a)，在从患者中取样的基因样本中分析由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p的表达程度；
步骤(b)，将从正常人取样的基因样本作为对照组，确认患者的miR-204-5p表达是否增加，
进一步确认随着上述miR-204-5p基因的表达增加，海马体神经元表面的N-甲基-D-天冬氨酸受体表达是否下降。
并且，本发明可提供利用上述海马体的功能下降的判断方法记忆力衰退诊断方法及认知功能诊断方法，进一步地，可提供痴呆诊断方法。
在本发明中，其特征在于，若随着上述miR-204-5p表达的增加EphB2蛋白质降低，则eph/ephrin介导轴突导向信号路径(Eph/ephrin mediated axon guidance signalingpathway)被上调，因此海马体神经元的N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达降低，其特征在于，优选地，神经元(神经细胞)细胞表面的N-甲基-D-天冬氨酸受体中，NR1亚基的表达降低。
并且，本发明的特征在于，随着上述miR-204-5p基因的表达增加，海马体神经元的树突棘密度降低。
最初由本发明人鉴定，据悉由上述序列号1的碱基序列(5'-uucccuuugucauccuaugccu-3')表示的miR-204-5p主要抑制癌细胞的生长(Binbin Zhanget al.，Medical Oncology，32(1)：1，2014)，但是miR-204-5p通过正确靶向EphB2来降低EphB2表达，从而表达于海马体神经元细胞的表面的N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR1亚基的表达下降，且降低树突密度。
本发明的miR-204或miR-204-5p核酸分子可来源于包括人类的动物，例如猴子(monkeys)、猪(pigs)、马(horses)、牛(cows)，、羊(sheep)、狗(dogs)、猫(cats)、鼠(mice)、兔子(rabbits)等，但并不限定于此。并且，本发明的miR-204或miR-204-5p核酸分子可以以单链或双链形态存在。成熟型微RNA分子主要以单链存在，但是前体微RNA(pre-miRNA)分子主要位可形成双链部分的部分性的自我互补的(例如，茎-结构及环-结构)结构。
本发明的上述核酸分子为公知的序列信息数据库，例如，可通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)的基因库(GenBank)等获得信息，利用其分离或制备标准分子生物学技术，例如利用化学合成法或重组方法，或者可使用市售的。
在本发明的一实施例中，为了理解介导海马体的老化过程调节的微RNA，在2个月、6个月及18个月的雄性小鼠中进行小型RNA(small RNA；smRNA或sRNA，以下标记为sRNA)分析。据悉，上述小型RNA为大概由200以下的碱基构成的RNA，主要为真核细胞，是指除了tRNA及核糖体RNA之外的。
如图1a所示，为了确认随着老化的进行而表达不同的微RNA，进行了热点图分析，确认海马体的总269个微RNA中80个在3个不同时期中对某2个时期表达值倍数变化值显示为2.0以上。确认到了在老化期间微RNA是不显著的表达增加或表达减少，尤其在18个月的小鼠中存在表达显著增加的微RNA。
如图1b所示，在进行正常老化的期间(2个月及18个月之间)表达的海马体的269个微RNA的分散体积结构的情况下，确认19个微RNA表达降低2倍以上，与此相反，36个微RNA表达增加2倍以上。并且，为了确认小型RNA数据显著性，在2个月小鼠及18个月小鼠之间随机筛选12个2.0以上的表达值倍数变化值的微RNA(表达增加：5个，表达减少：7个)，利用实时荧光定量聚合酶链反应分析的结果，如图1c所示，确认与小型RNA分析数据相一致，并确认小型RNA分析可反映在海马体组织中的微RNA整体表达模式。
在本发明中，为了确认在海马体老化中微RNA表达调节导致的生物学效果是什么，导出了多个微RNA的预期目标基因路径。如表2所示，导出了多种生物学效果，预期主要有与癌相关的路径相当显著，但在老化方面，针对相对研究较少的轴突导向路径(p＝4.5E-18)进行了后期研究。如图2a所示的树突诱导路径(axon guidance pathway)示意图，在本发明中试图确认Eph/ephrin的活性与微RNA的关联性。
如图2b所示，在本发明中，利用实时荧光定量聚合酶链反应确认，在Eph/ephrin子家族(subfamily)内目标分子中9个在进行老化过程中表达降低，13个分子未观察到显著变化，只有Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family，member A，RhoA)表达增加。这整体表示根据老化介导于Eph/ephrin的轴突导向路径的下调。尤其，确认据悉为调节突触可塑性的两种作为ephrin受体的EphA1及EphB2分别约为30％及25％，mRNA表达有所降低。
为了确认根据老化的ephrin消耗路径的下调，如图2c所示，在2个月小鼠及18个月小鼠海马体组织中，利用实时荧光定量聚合酶链反应分析参与Eph-ephrin信号的目标mRNA的表达值倍数变化值。分析结果确认，与本发明的小型RNA资料分析结果相一致，作为单一ephrin亚基的ephrinB3和作为4种ephrin受体亚基的EphA1、EphA2、EphA4及EphB2是mRNA表达降低25％至60％左右，与此相反，Ras同源基因家族成员A mRNA是表达约增加50％左右。
并且，为了确认上述多个分子的蛋白质是表达水平是否也根据老化发生变化，确认了对Ras同源基因家族成员A、EphA4及EphB2的蛋白质表达程度，其结果，如图2d所示，确认EphA4及EphB2时蛋白质表达水平约降低60％及30％，Ras同源基因家族成员A是蛋白质表达增加至150％。
在本发明中，将据悉为在上述ephrin信号路径中是调节突触可塑性的阳性调节者之一、对神经可塑性很重要，在阿尔茨海默氏症中成为认知衰退的要素的EphB2选定为在老化器件表达显著被调节的微RNA的目标。
如图3所示，在本发明中，确认具有对EphB2的3'UTR(序列号2)的结合点，并在2个月小鼠及18个月小鼠之间表达降低2倍以上的作为8种候补微RNA的miR-24-3p、miR-34C-5p、miR-204-5p、miR-346-5p、miR-495-3p、miR149-5p、miR-485-5p、miR-383-5p(MIMAT0000219、MIMAT0000381、MIMAT0000237、MIMAT0000597、MIMAT0003456、MIMAT0000159、MIMAT0003128、MIMAT0000748)，并确认，其中，只有由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p抑制EphB2活性。并且，如图4所示，确认随着老化的进行，miR-204-5p及EphB2的mRNA表达水平呈逆相关关系。
在本发明的一实施例中，为了确认上述miR-204-5p是否对EphB2具有特异性，比较了野生型EphB2-3'UTR-WT(AGGATTCTCATAAGGGAA)及miR-204结合点点突变的EphB2-3'UTR-MT(AGGATTCTCATGGAGAGA的活性。如图5a所示，反应EphB2-3'UTR-WT与miR-204-5p的结果，确认EphB2的活性急剧降低，与此相反，确认在EphB2-3'UTR-MT的情况下，没有活性变化。并且，如图5b所示，确认miR-204-5p浓度依赖性的EphB2的活性降低。
图5c为在神经元中处理miR-204mimic及miR-204抑制剂(5'AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA 3')时，利用蛋白质印迹法确认EphB2蛋白质表达变化的数据，因确认miR-204，EphB2蛋白质表达量显著降低至50％，在处理miR-204抑制剂的情况下，EphB2蛋白质表达量恢复至130％。即，确认在本发明中EphB2为miR-204-5p的直接目标。
以上述结果为基础，在本发明的一实施例中，试图了解在突触可塑性中miR-204-5p及EphB2的关系。如图6所示，确认基于miR-204-5p的树突棘密度调节程度的结果，与作为对照组的无关序列(scramble mimic，包括3.4棘/10um的长度、5.2棘的突出部，p＜0.001)相比，miR-204-5p的过表达降低40％左右的棘密度。在同时转化EphB2-3'UTR-WT及miR-204mimic的情况下(3.9棘/10um的长度，p＞0.5)，与仅感染miR-204mimic(3.6棘/10um的长度，p＜0.001)的神经元相比较，没有与棘密度具有显著增加，与此相反，在同时转化EphB2-3'UTR-MT及miR-204mimic的情况下(5.4棘/10nm长度，p＜0.001)，具有正常水平的棘密度。即，上述结果是指miR-204-5p通过抑制EphB2来调节树突棘密度。
并且，据悉EphB2使介导表达于神经元的细胞表面的N-甲基-D-天冬氨酸受体，因此想了解在本发明中是否基于miR-204-5p在海马体神经元中影响N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基的输送及位置变化。
图7a为示出基于miR-204的N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR1亚基的表面表达调节程度的数据确认细胞表面NR1蛋白质/总NR1蛋白质的比率的结果，确认基于miR-204在神经元细胞表面NR1蛋白质的表达比率显著降低，与此相反，确认基于miR-204抑制剂NR1蛋白质的表达利率显著增加。
并且，如图7b所示，从年轻(2个月小鼠)及老年(18个月小鼠)海马体组织确认N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚基的蛋白质表达程度的结果，确认在老化过程期间总NR1蛋白质的表达降低约50％左右。这是指根据基于miR-204神经元的EphB2表达降低，神经元的细胞表面积所有NR1表达降低。
即，在本发明中，确认在老化的海马体中上调的微RNA中miR-204通过正确靶向EphB2来降低EphB2，由此海马体神经的N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR1亚基的神经元表面表达降低，并降低树突密度，从而确认可利用miR-204-5p及EphB2的相关关系或miR-204-5p及N-甲基-D-天冬氨酸受体的相关关系判断海马体的功能是否降低。
进一步地，上述miR-204-5p及EphB2的相关关系或miR-204-5p及N-甲基-D-天冬氨酸受体的相关关系可使用在海马体的功能下降的抑制方法及功能下降抑制剂的筛选方法。
即，本发明还涉及如下的海马体功能下降的抑制方法，即，包括通过对抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂进行处理使N-甲基-D-天冬氨酸受体表达增加。
上述方法可适用于因N-甲基-D-天冬氨酸受体表达降低而海马体的功能降低的情况或因一般的老化过程发生的海马体功能降低。
并且，本发明可通过抑制海马体功能降低适用于认知功能改善、抑制/改善记忆损伤及海马体功能降低来源的多种疾病的治疗。
上述抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂可以为反义寡核苷酸或siRNA。在本发明中，优选地，将由序列号4的碱基序列表示的miR-204-5p用作抑制剂，但一般可无限适用对由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p具有互补序列的寡核苷酸，可选择性地仅与特异性识别EphB2的3'UTR的miR-204-5p的特定部位相结合的寡核苷酸也可无限使用。
海马体功能下降的抑制方法的特征在于，基于上述抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂EphB2蛋白质表达增加，从而海马体神经元的N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达增加，优选地，海马体功能下降的抑制方法的特征在于，在神经元(神经细胞)细胞表面的N-甲基-D-天冬氨酸受体中，NR1亚基的表达增加。并且，海马体功能下降的抑制方法的特征在于，基于抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂海马体神经元的树突棘密度增加。
如上所述，在图5c及图7a中，确认基于miR-204-5p抑制剂EphB2蛋白质表达增加，NR1亚基的表达增加，从而确认通过对抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂进行处理来抑制海马体的功能下降。
本发明还涉及如下的海马体功能下降抑制剂的筛选方法，即，包括：步骤(a)，在来源于人类的海马体神经元中对抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的候补物质进行处理；以及
步骤(b)，在上述神经元表面中确认N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达是否增加。
海马体功能下降抑制剂的筛选方法的特征在于，在上述候补物质中，筛选使N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达增加的物质，尤其，在N-甲基-D-天冬氨酸受体中，可确认NR1亚基的表达是否增加。
并且，在上述步骤(b)中，通过进一步确认EphB2蛋白质表达是否增加，来筛选使EphB2蛋白质的表达增加的候补物质。
进一步地，本发明涉及包含由序列号1的碱基序列表示的抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂的用于预防或治疗海马体功能下降的药学组合物。
并且，本发明提供将抑制由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂用于预防或治疗海马体功能下降的用途。
并且，本发明提供海马体功能下降的预防方法，包括对所需个体给予药学有效量的抑制由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂的步骤。
同时，本发明提供海马体功能下降的治疗方法，包括对所需个体给予药学有效量的抑制由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂的步骤。
本发明的组合物不仅预防及治疗海马体功能下降，而且还可预防及治疗基于认知障碍改善及痴呆治疗等老化的与海马体功能异常有关的多种疾病。并且，本发明的组合物通过抑制miR-204-5p活性来使作为海马体神经元表面蛋白质的N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达增加，从而可适用于因N-甲基-D-天冬氨酸受体表达下降或功能异常产生的脑卒中、精神病(精神分裂症)等各种疾病的预防或治疗。
包含本发明的抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂的用于预防及治疗海马体功能下降的药学组合物还可进一步包含可提高海马体功能的其他制剂。
以下参考本发明的优选实施例进行详细说明，使本发明所属技术领域的普通技术人员可容易地实施。但是本发明能够以各种形态实现，而并不限定于在此说明的实施例。
实施例1.与海马体老化过程有关的小型RNA(small RNA)剖面分析
在本发明中为了了解介导海马体的老化过程调节的微RNA，对2个月、6个月及18个月的雄性小鼠进行小型RNA(small RNA；smRNA或sRNA，以下标记为sRNA)分析。
1-1：准备动物及收集组织
从韩国生命工学研究院-机关动物管理及使用委员会(Korea ResearchInstitute of Bioscience&Biotechnology-Institutional animal care and usecommittee；KRIBB-IACUC)获取2个月、6个月及18个月的3种不同月龄的普通野生型雄性C57BL/6J小鼠。
通过牺牲没有肿瘤或疾病痕迹的正常的小鼠，从中立即解剖海马体组织并利用液体氮冷冻保管。它们的健康状态通过一系列血清测试进行确认，按照各步骤从4只小鼠获取8个海马体组织。所有动物保持在“无特异病原体(specific pathogen free；SPF)”条件下，所有动物实验按照工学研究院-机关动物管理及使用委员会(KRIBB-IACUC)所提供的批准指南进行。
1-2：准备RNA
RNA提取及品质管理方法通过使用标准协议进行。
首先，均质化(homogenized)冷冻的组织后，利用苯酚进行提取。将获得的RNA颗粒溶解于无核酸分解酶的水(nuclease free water)，直到使用之前保管在-80℃温度。
利用NanoDrop 2000分光光度计(赛默飞世尔科技(Thermo Scientific)，美国)分析RNA纯度及浓度。所有样品在无核酸分解酶的水中A260/A280比率显示为2以上，A260/A230比率显示为1.9以上。
为了确认RNA的品质，RNA完整性(integrity)利用Bio-analyzer Nano 6000chip(安捷伦科技(Agilent Technologies)，美国)进行分析。具有高于正确的18S/28S及8的RNA的完整数(RNAIntegrity Number，RIN)值的RNA样品用于后期实验。
1-3：小型RNA提取及cDNA库构建
小型RNA(small RNA，以下标记为sRNA)利用纯链微孢子总RNA纯化系统试剂盒(Pure Link Micro-to-Midi total RNA Purification System kit)(英杰(Invitrogen)，美国)及miRNeasy mini kit(Qiagen，美国)进行提取。按照小鼠海马体组织的所有步骤对小型RNA进行纯化，并按照制造商的建议事项准备了Illumina碱基序列分析(Illuminasequencing)。
在各步骤中，利用15％的TBE-urea PAGE凝胶对从4只小鼠海马体组织分离的10μg的小型RNA进行电泳。然后，从凝胶切割包含小型RNA的长度为18核苷酸至30核苷酸之间的RNA分子的线后，从凝胶块分离RNA并沉淀于乙醇。将分离的小型RNA按照制造商的协议附着5'及3'衔接子(illumina truseq kit，cat No：FC-121-3001)并通过逆转录来合成cDNA。获得的cDNA利用Illumina引物(illumina truseq kit，cat No：FC-121-3001)进行PCR扩增后，对PCR扩增产物进行电泳，从聚丙烯酰胺凝胶切割后，利用乙醇使其沉淀并分离。各cDNA库利用Illumina序列分析技术分析碱基序列。
1-4：深度测序(Deep sequencing)-下一代碱基序列分析
在本发明中，通过使用Illumina深度测序Hi-seq2000对小鼠海马体组织的3个步骤的微RNA谱进行特性化。
在所有年龄组别中，小型RNA样品库利用50nt(nucleotied)的读取长度(readlength；可一次性读取的长度)进行单一末端测序(single end sequencing)。读取去除了指数碱基序列及3'衔接子碱基序列，且废弃了包含衔接子二聚体(adaptor dimers)、线粒体或核糖体序列的序列。并且，读取去除了包含均聚物(homopolymers)或小于14nt的。
读取的结果使用cufflink(Johns Hopkins University)及Top-Hat(JohnsHopkins University)软件程序进行排列原序列(align raw sequences)，参考小鼠基因组(Mus_musculus.NCBIM37.55)映射后，为了掌握成熟的微RNA的种类，与公知的微RNA相对应的序列读取的编号由与公知的微RNA的数据库完全一致的序列来决定(miR Base releaseversion 16，http://www.mirbase.org/)。
1-5：分析微RNA表达谱分析
原始数据(Raw data；对各微RNA读取)利用每百万读取(reads per million；RPM，miRNA counts/total counts of each sample x 1million)进行标准化，对各样品排除了小于读取数10的微RNA。并且，为了易于Log2转换，在RPM值加上了1。
过滤的数据由对数所转变，表达不同的微RNA将与作为不同于对照时期的2个月的6个月及18个月组之间的差异调节至表达值倍数变化为＞|2.0|。
其结果，如图1a所示，海马体的共269个微RNA中80个在3种其他时期中对某2个时期表达值倍数变化值显示为2.0以上。
如图1b所示，在正常性的老化进行过程中(2个月及18个月之间)所表达的海马体的269个微RNA的分散体积结构的情况下，确认19个的微RNA表达降低2倍以上，与此相反，36个的微RNA表达增加2倍以上。
1-6：实时定量PCR检测
为了确认小型RNA数据显著性，在2个月小鼠及18个月小鼠之间随机筛选12个具有2.0以上的表达值倍数变化值的微RNA利用(表达增加：5个、表达降低：7个)实时荧光定量聚合酶链反应进行分析。
所筛选的微RNA为mmu-miR-191-5p、mmu-miR-342-3p、mmu-miR-99b-5p、mmu-miR-139-5p、mmu-miR-433-3p、mmu-miR-1839-5p、mmu-miR-144-5p、mmu-miR-125b-1-3p、mmu-miR-125b-2-3p、mmu-miR-298-5p及mmu-miR-411-5p。(MIMAT0000221、MIMAT0000590、MIMAT0000132、MIMAT0000656、MIMAT0001420、MIMAT0009456、MIMAT0016988、MIMAT0004669、MIMAT0004529、MIMAT0000376、MIMAT0004747)。
首先，在上述分离的总RNA中，通过逆转录微RNA来合成cDNA，使用了InvitrogenNCodeTM miRNA First strand cDNA模块。
为了按照制造商的指示生成cDNA而使用了总RNA及微RNA(各1μg)。总反应液体积为20μl在Bio-Rad热循环仪(Bio-Rad Thermal Cycler)(伯乐生命医学(Bio-Rad)，美国)进行了反应。
实时荧光定量聚合酶链反应是利用Bio-Rad实时PCR系统(Bio-Rad real timePCR system)(CFX-96)进行，对微RNA的各引物设计是使用Primer Blast界面(PrimerBlast interface)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)及PrimerBank(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)进行。所有反应与
Figure GDA0002882133880000191
Green Mix及各引物集(微RNA的情况下使用普遍的逆方向引物)一同分注于96-孔板2组来进行。
表1
Figure GDA0002882133880000192
Figure GDA0002882133880000201
其结果，如图1c所示，确认与小型RNA分析数据一致，确认小型RNA分析可反映在海马体组织中的微RNA整个表达模式。
实施例2.分析目标基因的路径
对根据老化过程表达不同的微RNA的所预期的目标基因的所有目录与限于小鼠种的结果的基本参数一同输入于DAVID、KEGG(Kyoto Encyclopedia of a Genes andGenomes)的基因功能分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)及Ingenuity路径分析(Ingenuity Pathway Analysis)(
Figure GDA0002882133880000202
Systems，http://www.ingenuity.com)。
表2
Figure GDA0002882133880000203
Figure GDA0002882133880000211
其结果，如上述表2所示，导出了多种生物学效果，主要预期为相当显著存在与癌有关的路径，但是针对在老化方面研究相对较少的轴突导向路径(p＝4.5E-18)进行了进一步研究。如图2a所示，与轴突导向路径(axon guidance pathway)示意图一样，在本发明中，试图掌握Eph/ephrin的活性与微RNA的相关性。
实施例3.确认根据老化的Eph/ephrin路径调节
3-1：确认mRNA表达水平
在本发明中，为了了解Eph/ephrin子家族(subfamily)的表达随着老化如何发生变化，进行了实时荧光定量聚合酶链反应分析。
首先，为了通过逆转录在实施例1中分离的按各步骤的小鼠海马体组织的RNA来合成cDNA，使用了PrimeScriptTM RT reagent Kit(Promega ImPromm-II ReverseTranscription system)。根据制造商的指示为了生成cDNA模板而使用了总RNA(各1μg)，将总反应液体积为20μl并在Bio-Rad的热循环仪(Bio-Rad Thermal Cycler)(Bio-Rad，美国)下进行反应。
实时荧光定量聚合酶链反应利用Bio-Rad实时PCR系统(Bio-Rad real time PCRsystem)(CFX-96)进行，对微RNA的各引物设计通过使用Primer Blast界面(Primer Blastinterface)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)及PrimerBank(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)来进行。所有反应与
Figure GDA0002882133880000221
Green Mix及个引物集一同分注于96-孔板2组来进行。
表3
Figure GDA0002882133880000222
Figure GDA0002882133880000231
Figure GDA0002882133880000241
其结果，如图2b所示，在老化进行过程中，Eph/ephrin子家族(subfamily)内目标分子中9个表达降低，13个分子未观察到显著变化，确认只有Ras同源基因家族成员A表达增加。尤其，确认据悉为调节突触可塑性的2种作为ephrin受体的EphA1及EphB2的mRNA表达分别降低约30％及25％。
并且，如图2c所示，在2个月小鼠及18个月小鼠海马体组织中，分析参与Eph-ephrin信号的目标mRNA得到表达值倍数变化值的结果，确认作为单一ephrin亚基的ephrinB3和作为4种ephrin受体亚基的EphA1、EphA2、EphA4及EphB2的mRNA表达降低25％至60％左右(p＜0.05)，与此相反，Ras同源基因家族成员A mRNA表达增加约50％左右(p＜0.05)。
3-2：确认蛋白质表达水平
为了确认上述多个分子的蛋白质表达水平是否也根据老化发生变化，确认了对Ras同源基因家族成员A、EphA4及EphB2的蛋白质表达程度。
蛋白质印迹法根据
Figure GDA0002882133880000242
蛋白质印迹法科学实验报告对各个海马体组织样品进行。首先，样品组织用RIPA缓冲液(赛默飞世尔(Life Technologies))溶解后，将所有溶解物取20μg至30μg，5％的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)/5～20％的梯度聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate/5～20％gradient polyacrylamide凝胶)(SDS-PAGE)中进行电泳后，电转(electrotransfer)至硝化纤维膜。
印迹用第一抗体杂交后，处理第二抗体，将各抗体稀释于包含5％的干奶(drymilk)的三羟甲基氨基甲烷缓冲食盐水(Tris-buffered saline solution)并进行处理。杂交的带使用增强化学发光(enhance chemiluminescence，ECL)检测系统(记载使用的增强化学发光溶液及测定设备信息)进行确认。
第一抗体使用了α微管蛋白(α-Tubulin)(AbClon；AbC-2001)、Ras同源基因家族成员A(abcam；ab68826)、EphB2(R&D systems；H00002048-M03)及EphA4(Abnova；H00002043-M02)，peroxidase-conjugated第二抗体使用了(Jackson ImmunoResearchLaboratories)。
蛋白质印迹法的蛋白质带表达通过使用image-J软件(image-J software)(ImageJ 1.46)进行定量化。
其结果，如图2d所示，确认EphA4(p＜0.005，n＝4)及EphB2(p＜0.005，n＝4)蛋白质表达水平分别降低60％及30％，并确认Ras同源基因家族成员A(P＝0.005，n＝4)蛋白质表达增加至150％。
实施例4.筛选以EphB2为目标的微RNA
在本发明中，试图筛选在老化进行过程中表达显著被调节的EphB2为目标的微RNA。
首先，在2个月小鼠及18个月小鼠之间，筛选作为表达降低2倍以上的8种候补微RNA的miR-24-3p、miR-34C-5p、miR-204-5p、miR-346-5p、miR-495-3p、miR149-5p、miR-485-5p、miR-383-5p(MIMAT0000219、MIMAT0000381、MIMAT0000237、MIMAT0000597、MIMAT0003456、MIMAT0000159、MIMAT0003128、MIMAT0000748)。
为了测试用于抑制EphB2的微RNA的能力使用了荧光素酶测定(luciferaseassay)分析法，首先，利用HEK293细胞(ATCC)同时转化由序列号2的碱基序列表示的luciferase-EphB2-3'UTR报道分子结构物(Promega)和上述候补miRNAmimic。
通过接种于24孔以使20000个细胞/孔，培养24小时后，与2μl的脂质体进行混合转化4小时以使luciferase-EphB2-3'UTR报道分子及miRNA mimic量分别为0.5μg后，在各孔添加50μl的某种荧光素酶反应溶液后，利用Promega设备测定荧光素酶活性。
如图3所示，确认只有由序列号1的碱基序列表示的miR-204-5p抑制EphB2活性。
并且，为了更具体地掌握miR-204-5p及EphB2关系，在实施例1的小型RNA文件结果中确认miR-204-5p及EphB2的mRNA表达水平的结果，如图4所示，随着老化的进行miR-204-5p及EphB2的mRNA表达水平具有逆相关关系。
实施例5.确认对miR-204-5p的EphB2的特异性
在本发明中，为了确认miR-204-5p对EphB2是否有特异性，比较了野生型EphB2-3'UTR-WT(序列号2)及miR-204结合点点突变的EphB2-3'UTR-MT(序列号3)的活性。
与实施例4相同的方法进行荧光素酶测定，作为对照组使用了无关序列(5'GGUUCGUACGUACACUGUUCA3')。
如图5a所示，反应EphB2-3'UTR-WT于miR-204-5p的结果，确认EphB2的活性急剧下降，与此相反，在EphB2-3'UTR-MT的情况下，确认没有活性变化。
为了确认根据miR-204-5p的EphB2活性变化，与上述相同的方法以0nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM及50nM浓高度通过转化来测定荧光素酶活性，将作为对照组的scramble处理为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM及0nM，以使将转化的物质的量相同。
其结果，如图5b所示，确认miR-204-5p浓度依赖性地EphB2的活性下降。
实施例6.确认根据miR-204-5p的EphB2蛋白质表达变化
在本发明中，利用蛋白质印迹法确认了根据miR-204-5p的EphB2蛋白质表达变化。
首先，从野生型小鼠分离了解离的海马体神经元(步骤P0)。在12-孔板中涂敷有聚赖氨酸(poly-lysine)的盖玻片(glass coverslips，18mm；Bellco Glass，美国)上接种神经元后，保持在包含B27(Invitrogen，美国)，谷氨酰胺(glutamine，Sigma-Aldrich，美国)及青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin，西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，美国)的Neurobasal培养基，并在各孔中接种70000个细胞后，在5％的CO2、37℃的湿度条件下培养。
在培养第14天转化miR-204mimic及miR-204抑制剂(AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA)，神经元的转化使用了磷酸钙方法。
在转化后7天时间内5％的CO2，37℃的湿度条件下培养后，获取细胞，为了溶解细胞使用包含有蛋白质分解酶抑制剂(protease inhibitor)的RIPA缓冲液，并在4℃下搅拌60分钟。随后，简单地处超声波理细胞2次后，在4℃下通过以13000rpm进行了15分钟的离心分离来分离了蛋白质。与实施例3-2相同的方法对分离的蛋白质进行了蛋白质印迹法。
其结果，如图5c所示，确认根据miR-204的EphB2蛋白质表达量显著降低至50％，在处理miR-204抑制剂的情况下，EphB2蛋白质表达量恢复至130％。即，在本发明中，确认EphB2为miR-204-5p的直接性的目标。
实施例7.通过miR-204-5p的EphB2抑制的树突棘密度调节
在本发明中，试图掌握在突触可塑性中的miR-204-5p及EphB2的关系。
首先，在与实施例6相同的方法进行分离培养14天的海马体神经元中分别转化1)无关序列、2)miR-204mimic、3)EphB2-3'UTR-WT及miR-204mimic、4)EphB2-3'UTR-MT及miR-204mimic后，利用免疫细胞化学法观察了树突棘密度。
处理4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)/4％的蔗糖(sucrose)磷酸盐缓冲液(PBS)在室温下固定神经元10分钟。利用磷酸盐缓冲液清洗3次后，处理包含有0.1％的triton X-100的磷酸盐缓冲液在室温下渗透化(permeabilized)10分钟后，处理包含有5％的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液来进行阻止(blocked)。然后，处理兔抗GFP(Rabbitanti-GFP)(艾碧康(Abcam)：1：1000)第一抗体并在4℃下过夜反应后，利用包含有1％的BSA的磷酸盐缓冲液清洗3次，处理结合有Alexa-488的第二抗体(1：1000，Life technologies)在室温下反应1小时。
为了定量分析，在多层分析中从各盖玻片中随机筛选了转化的神经元，图像利用63x物镜剪切为LSM 760。由50-200μM的细胞体(cell body)定量分析树突(Dendrites)。在定量分析中仅使用了第二树突及第三树突。所有形态学实验至少反复实验了3次以上(n＝10-20individual experiments)。由棘头测定了包含宽于基本的球茎头(bulbous head)的突出部(Protrusion)。
如图6所示，确认与作为对照组的无关序列(包含3.4棘/10um的长度、5.2棘突出部，p＜0.001)相比，miR-204-5p的过表达诱导降低棘密度40％左右。
在同时转化EphB2-3'UTR-WT及miR-204mimic的情况下，与仅感染(3.9棘/10um的长度，p＞0.5)、miR-204mimic(3.6棘/10um长度，p＜0.001)的神经元相比，棘密度没有显著增加，与此相反，在同时转化EphB2-3'UTR-MT及miR-204mimic的情况下(5.4棘/10nm长度，p＜0.001)，确认具有正常水平的棘密度。
实施例8.通过miR-204-5p的EphB2抑制的N-甲基-D-天冬氨酸受体的细胞表面表达调节
据悉EphB2介导表达在神经元的细胞表面的N-甲基-D-天冬氨酸受体，因此，在本发明中试图了解根据miR-204-5p是否影响在海马体神经元中N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基的输送及位置变化。
首先，在与实施例6相同的方法进行分离培养14天的海马体神经元中分别转化1)无关序列，2)miR-204mimic，3)miR-204抑制剂后，在5％的CO2、37的湿度条件下培养7天并进行准备。
为了分析表达在细胞表面的蛋白质需要进行物素化分析(Biotinylationassay)。为此，在冰块上用冰凉的磷酸盐缓冲液溶液清洗2次转化的小鼠第一海马体神经元后，在包含有1mg/ml的sulfo-NHS-SS-Biotin(皮尔斯蛋白研究产品(Pierce ProteinResearch Products))的磷酸盐缓冲液溶液中，使细胞在冰块上反应30分钟。然后，为了去除未附着的生物素，用包含100mM的甘氨酸(glycine)的磷酸盐缓冲液溶液清洗细胞后，再用磷酸盐缓冲液溶液清洗，然后为了溶解细胞通过使用包含有分解酶抑制剂(proteaseinhibitor)的RIPA裂解液并在4℃下搅拌60分钟。然后，对细胞简单进行2次超声波处理后，在4℃下以13000rpm进行了15分钟的离心分离。
取细胞溶解物的10％测定总蛋白质浓度，剩下细胞溶解物(约200μg)与抗生物素蛋白琼脂糖珠(avidin agarose beads，皮尔斯公司(Pierce)，美国)一同在25℃下反应60分钟。
分离的蛋白质用磷酸盐缓冲液清洗3次后，用2x样品缓冲液煮沸，用20μg表面蛋白质及总溶解蛋白质进行蛋白质印迹法。
用第一抗体杂交印迹后，处理了第二抗体，各抗体稀释于包含有5％的干奶(drymilk)的三羟甲基氨基甲烷缓冲食盐水(Tris-buffered saline solution)中。杂交的带增强化学发光检测系统(记载使用的增强化学发光溶液及测定设备信息)进行确认。
第一抗体使用了α微管蛋白(α-Tubulin)(AbClon；AbC-2001)及N-甲基-D-天冬氨酸亚基NR1(NMDAreceptor subunit NR1)(美国赛默飞世尔科技；32-0500)，过氧化物酶结合的(peroxidase-conjugated)第二抗体使用了(杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmunoResearch Laboratories))。
数据定量分析使用NIH ImageJ软件以对照组(control culture)进行正规化，比较标签为总蛋白质及生物素的蛋白质的表达比率。
其结果，如图7a所示，确认根据miR-204在神经元细胞表面NR1蛋白质的比率显著降低(P＜0.05，n＝3)，与此相反，确认根据miR-204抑制剂NR1蛋白质的表达比率显著增加(P＜0.05，n＝3)。
并且，为了确认老化是否影响N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚基的蛋白质表达，利用实施例3-2的蛋白质样品与上述相同的方法进行蛋白质印迹法。
其结果，如图7b所示，从年轻(2个月小鼠)及老年(18个月小鼠)海马体组织确认N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚基的蛋白质表达程度的结果显示，在老化过程中总NR1蛋白质的表达降低约50％左右。这表明随着根据miR-204神经元的EphB2表达降低，神经元的细胞表面积整个NR1表达降低。
以上，详细说明了本发明内容的特定部分，就本技术领域的普通技术人员而言，这些具体技术只是优选实施方式而已，本发明的范围并不限定于此是显而易见的。因此，本发明的实质性的范畴由所附的发明要求保护范围和同等技术方案而决定。
序列表
<110> 大邱庆北科学技术院（Daegu Gyeongbuk Institute of Science andTechnology）
基础科学研究院（INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE）
<120> 利用微RNA与N-甲基-D-天冬氨酸受体的相关关系的海马体的功能下降的判断方法、功能下降的抑制方法及功能下降抑制剂的筛选方法
<130> SOP113348CN
<150> KR 10-2015-0086823
<151> 2015-06-18
<150> PCT/KR2016/006465
<151> 2016-06-17
<160> 62
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
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gcggatagga ttcatggctt ca 22
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ggtagtcgtt gatgctcacc t 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> EphrinA3-F
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cgtgcaggtg aacgtgaac 19
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<212> DNA
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tgctgctgtt aggttttgcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EphrinB3-R
<400> 42
ctgaggataa agcacgtaac cg 22
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<220>
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<220>
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<220>
<223> Rock2-R
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> cdk5-R
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> Rasa1-F
<400> 53
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<210> 54
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<212> DNA
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<400> 54
cgccttctat cttctactgg ctc 23
<210> 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pak2-F
<400> 55
aacggagagc tagaagacaa gc 22
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pak2-R
<400> 56
tggaacagaa ggcaaaggtt t 21
<210> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fyn-F
<400> 57
acctccatcc cgaactacaa c 21
<210> 58
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<213> 人工序列
<220>
<223> Fyn-R
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cgccacaaac agtgtcactc 20
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<220>
<223> Met-F
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gtgaacatga agtatcagct ccc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-R
<400> 60
tgtagtttgt ggctccgaga t 21
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Actin-F
<400> 61
ggctgtattc ccctccatcg 20
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Actin-R
<400> 62
ccagttggta acaatgccat gt 22

Claims (5)

1.一种用于海马体功能下降的药学组合物，该药学组合物能预防或治疗海马体功能下降，其特征在于，包括能抑制由序列号1的碱基序列表达的miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂。
2.根据权利要求1所述的用于海马体功能下降的药学组合物，其特征在于，抑制上述miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的制剂为反义寡核苷酸或siRNA。
3.一种抑制剂的筛选方法，该抑制剂用于抑制海马体功能下降，其特征在于，包括：
步骤(a)，在来源于人类的海马体神经元中对抑制miR-204-5p的基因表达或抑制miR-204-5p活性的候补物质进行处理；以及
步骤(b)，在上述神经元表面中确认N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达是否增加。
4.根据权利要求3所述的抑制剂的筛选方法，其特征在于，在上述步骤(b)中，筛选使N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达增加的候补物质。
5.根据权利要求3所述的抑制剂的筛选方法，其特征在于，在上述步骤(b)中，通过进一步确认EphB2蛋白质的表达是否增加，来筛选使EphB2及N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白质的表达增加的候补物质。
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