CN107723094A - 一种超临界co2提取神秘果种子精油的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药化工产品领域，公开了一种超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法及精油，所述超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法萃取温度41.52℃，萃取压力28.88Mpa，萃取时间122.19min，提取率4.98611％；所述超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法首先采用超临界萃取法提取种子精油；其次，进行单因素试验探究萃取条件；最后，通过响应面法优化提取工艺。本发明对乙醇夹带提取的精油主要成分和含量做了对比分析，还初步探究了乙醇夹带提取的精油的降糖作用，结果表明其降糖作用比较明显，为进步研究精油的降糖效果提供了实际的依据。

Description

一种超临界CO2提取神秘果种子精油的方法

技术领域

本发明属于日用化工产品领域，尤其涉及一种超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法及精油的降糖作用。

背景技术

神秘果为杜鹃花目山榄科神秘属，常绿灌木植物，原产于西非热带地区。海南由于得天独厚的亚热带气候成为主要的研究培育中心。神秘果种子由果肉包覆，种子约占果实的二分之一，头尾略尖，如小橄榄状，果肉可供食用，果肉去除后之种子一半为深褐色之光滑表面有如释迦果种子，另一半为由果肉留下的一层薄膜包覆，难以去除，遂有“阴阳子”之称。对于神秘果果肉已经做了很多药理方面的研究，但在种子方面的研究却甚少。为了了解其种子的功效，经综合查阅文献资料确定其中某些成分可能会起到降糖效果。初试验通过测试种子精油对两种(正常的和STZ模型的)小白鼠的降血糖作用，揭示神秘果种子的药理作用，为综合开发利用神秘果提供科学依据。自德国的Zosel博士成功利用超临界二氧化碳脱除咖啡豆的咖啡因后，超临界技术开始在很多领域得到重视。超临界流体是介于气态和液态之间的一种物质，既有接近于气体的黏度和传递性又有接近于液体的密度。流体在其临界点附近压力与温度的微小的变化都会使流体密度相当大的改变，从而使溶质溶解度也产生大的变化。超临界提取天然产物越来越成为天然化学药物提取的首选方式。其优点是样品用量小，操作方便，产率高，无污染，无溶剂残留是一种绿色的现代化提取方法。采用气相色谱-质谱联用仪分析其成分。一般来说，影响超临界提取率的因素有：温度，压力，萃取时间和二氧化碳流量等。响应面分析法是一个有效的和强大的统计方法的优化提取工艺，减少了一些试验性的试验要求。该方法包括三个步骤：(1)中心复合旋转设计，(2)响应表面模型进行回归分析，(3)利用响应面模型进行工艺因素优化。响应面分析法在优化超临界提取工艺条件的很多方面都取得成功，如：超临界萃取桂皮精油工艺条件的优化。本发明采用三因素三水平的响应面分析法设计试验，来确定最佳的提取条件。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有提取神秘果种子精油工艺的方法中目标杂质较多，步骤繁琐，成本高，且不能较好的确定最佳提取率。本发明利用乙醇夹带获得精油在提取降糖成分上有较多的富集主要提取了大量的不饱和脂肪酸和VE,这是优于常规的方法所在。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法。

本发明是这样实现的，一种超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法。所述超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法的萃取温度41.52℃，萃取压力 28.88Mpa，萃取时间122.19min，此时提取率4.98611％。首先采用超临界萃取法提取种子精油；其次，进行单因素试验探究萃取条件；最后，通过响应面法优化提取工艺。具体方法如下：

步骤一，种子精油的超临界萃取

称取种子粉末50g于超临界萃取釜中，CO₂来源于温度保持在2℃的缸中并在高压下注入萃取釜。二氧化碳流量测量用流量计。在提取过程中，通过调节阀控制提取温度和压力。萃取完后，将萃取容器减压并收集器中挥发油。溶剂用旋转真空蒸发器蒸发而提取物用氮气处理以除去残留溶剂。测量收集精油的重量，再计算提取率。

精油提取率(％)＝(提取的精油质量/神秘果种子粉的质量)×100％

步骤二，萃取条件的单因素试验

分别以萃取温度、萃取压力、萃取时间、二氧化碳流量等为变量，以萃取率为评价指标，确定影响神秘果种子精油提取率的主要因素。

萃取压力的影响：固定萃取时间为2h，温度为40℃，二氧化碳流量20L/h。考察萃取压力(15,25,45Mpa)对提取率的影响。

萃取温度的影响：固定萃取压力25Mpa，时间2h，二氧化碳流量20L/h。考察萃取温度(30,40,50℃)对提取率的影响。

萃取时间的影响：固定萃取压力25Mpa，温度为40℃，二氧化碳流量20L/h。考察萃取时间(1.5，2.0,2.5h)对提取率的影响。

二氧化碳流量的影响：固定萃取压力25Mpa，温度为40℃，时间2h。考察二氧化碳流量(15,20,25L/h)对提取率的影响。

步骤三，响应面法优化提取工艺

超临界提取神秘果种子精油过程中的工艺参数用响应面分析法优化。根据单因素实验结果，以神秘果种子精油萃取率为指标进行RSM实验设计，选取对神秘果种子精油萃取率影响最大的3个因素(萃取温度，压力，时间)为自变量，分别以X1，X2，X3表示，并以+l、0、一1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi＝(Xi-X0)/△X对自变量进行编码，其中xi为自变量的编码值， Xi置为自变量的真实值，X0为实验中心点处自变量的真实值，△X为自变量的变化步长。利用统计软件Design Expert对实验数据进行回归分析，预测神秘果种子精油萃取的最佳工艺参数。

步骤四，精油的GC/MS条件

GC条件：色谱柱：石英毛细管柱HP-FFAP 30m×0.25mm，0.25um；进样口温度：260℃；程序升温：初始40℃(保持3min)，以8℃/min升温速率升至200℃(保持5min)，再以6℃/min升至260℃(保持5min)；进样量1.0μL，分流比为50:1；载气为高纯He，流速为1.0mL/min。

MS条件：离子源：EI电子轰击源；离子源温度：200℃；电离电压：70eV；接口温度：250℃；扫描范围(m/z)：10～500aum。

本发明的优点及积极效果为：本发明以神秘果种子精油萃取率为指标，选取对神秘果种子精油萃取率影响最大的3个因素(萃取温度，压力，时间)为自变量，采用响应面分析法对神秘果种子精油提取过程中的工艺参数进行优化，再通过Design Exper软件对优化后的模型回归分析，确定神秘果种子精油萃取的最佳工艺参数。结果表明：压力对提取率的影响极显著。最终确定最佳工艺条件：萃取温度41.52℃，萃取压力28.88Mpa，萃取时间122.19min，此时提取率 4.98611％。本发明相对于传统的水蒸气蒸馏法和溶剂萃取法，可以提高精油的产量。本发明还初步探究了精油的降糖作用，结果表明其降糖作用比较明显，为进步研究精油的降糖效果提供了实际的依据。

附图说明

图1是本发明实施提供的超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法流程图。

图2本发明实施提供的压力对提取率的影响图。

图3本发明实施提供的温度对提取率的影响图。

图4本发明实施提供的萃取时间对提取率的影响图。

图5本发明实施提供的二氧化碳流量对提取率的影响图。

图6本发明实施提供的Y＝(X1，X2，0)的响应面和等高线图(X3＝60min)。

图7本发明实施提供的Y＝(0，X2，X3)的响应面和等高线图(X1＝40℃)。

图8本发明实施提供的Y＝(X1，0，X3)的响应面和等高线图(X2＝30Mpa)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法包括以下步骤：

S101：样品准备；

S102：种子精油的超临界萃取；

S103：萃取条件的单因素试验；

S104：响应面法优化提取工艺；

S105：精油的GC/MS条件；

S106：乙醇夹带与不夹带的超临界提取精油的GC-ms分析。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

一、试验方法：

步骤一：样品制备。

将神秘果种子放在冷冻干燥箱干燥干燥3-4小时，经粉碎机粉碎，过60目筛备用。

步骤二：种子精油的超临界萃取。

流程：二氧化碳钢瓶→冷冻系统→贮罐→高压泵→萃取釜→解析釜→冷冻系统(循环)

操作：称取种子粉末50g于超临界萃取釜中，CO₂来源于温度保持在2℃的缸中并在高压下注入萃取釜。二氧化碳流量测量用流量计。在提取过程中，通过调节阀控制提取温度和压力。萃取完后，将萃取容器减压并收集器中挥发油。溶剂用旋转真空蒸发器蒸发而提取物用氮气处理以除去残留溶剂。测量收集精油的重量，再计算提取率。

精油提取率(％)＝(提取的精油质量/神秘果种子粉的质量)×100％

步骤三：萃取条件的单因素试验。

分别以萃取温度、萃取压力、萃取时间、二氧化碳流量等为变量，以萃取率为评价指标，确定影响神秘果种子精油提取率的主要因素。

萃取压力的影响：固定萃取时间为2h，温度为40℃，二氧化碳流量20L/h。考察萃取压力(15,25,45Mpa)对提取率的影响。

萃取温度的影响：固定萃取压力25Mpa，时间2h，二氧化碳流量20L/h。考察萃取温度(30,40,50℃)对提取率的影响。

萃取时间的影响：固定萃取压力25Mpa，温度为40℃，二氧化碳流量20L/h。考察萃取时间(1.5，2.0,2.5h)对提取率的影响。

二氧化碳流量的影响：固定萃取压力25Mpa，温度为40℃，时间2h。考察二氧化碳流量(15,20,25L/h)对提取率的影响。

步骤四：响应面法优化提取工艺。

超临界提取神秘果种子精油过程中的工艺参数用响应面分析法优化。根据单因素试验结果，以神秘果种子精油萃取率为指标进行RSM试验设计，选取对神秘果种子精油萃取率影响最大的3个因素(萃取温度，压力，时间)为自变量，分别以X1，X2，X3表示，并以+l、0、一1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi＝(Xi-X0)/△X对自变量进行编码，其中xi为自变量的编码值， Xi置为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，△X为自变量的变化步长。利用统计软件Design Expert对试验数据进行回归分析，预测神秘果种子精油萃取的最佳工艺参数。

步骤五：精油的GC/MS条。

GC条件：色谱柱：石英毛细管柱HP-FFAP 30m×0.25mm，0.25um；进样口温度：260℃；程序升温：初始40℃(保持3min)，以8℃/min升温速率升至 200℃(保持5min)，再以6℃/min升至260℃(保持5min)；进样量1.0μL，分流比为50:1；载气为高纯He，流速为1.0mL/min。

MS条件：离子源：EI电子轰击源；离子源温度：200℃；电离电压：70eV；接口温度：250℃；扫描范围(m/z)：10～500aum。

进一步，所述材料，试剂与仪器为：神秘果采集于海口，种子粉碎60目备用；GC/MS-QP2010气相色谱质谱联用仪日本岛津公司；HA121-50-02超临界萃取装置.江苏，南通华安超临界萃取有限公司；FD-1冷冻干燥箱.西安常仪仪器设备有限公司；9周大昆明鼠15只，广州动物试验中心；三诺安稳血糖仪.湖南长沙；中号灌胃针；无水乙醇.天津福晨有限公司。

二、结果与分析

1、单因素试验

单因素试验结果见图2～5。图形表明，影响神秘果种子精油提取率的主要因素是萃取温度、萃取压力和萃取时间，二氧化碳流量对神秘果种子精油提取率影响不大。单因素试验获得的最佳条件为：C02流量20L/h，萃取温度40℃，萃取压力25MPa，萃取时间2h，在该条件下神秘果种子精油提取率较高。因此，选取萃取温度30-50℃，萃取压力15-45MPa，萃取时间1.5-2.5h进行后续的响应面法设计，优化神秘果种子精油萃取工艺参数。

2、响应面分析因素水平的选取

依据单因素试验结果，进行响应面法中心复合旋转模型试验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法设计试验，分析因素与水平见表1，响应面试验设计与数据处理见表2。

表1响应面分析因素与水平

表2响应面试验设计与数据处理

利用Design Expert软件对表2试验数据进行回归分析，得二次多元回归模型为：

Y＝4.9100+0.13625X1+0.64875X2+0.07750X3+0.07250X1X3-0.02000X1X2-0.12250X2X3-0.45500X12-1.6400X22-0.44250X32

对模型进行方差分析，结果见表3。由表3可以看出：模型的 F＝239.11,P<0.000l，表明模型高度显著，不同处理间的差异极显著.P＜0.05，表明差异显著。P＞0.1000，表明该模型条件差异不显著。对模型进行回归方程系数显著性检验：一次项X2(P＜0.0001)极显著，X1(P＝0.0037)和X3(P＝0.0455) 显著；二次项X12、X22和X32(P＜0.0001)极显著；交互项X2X3(P＝0.03) 显著。表明压力对提取率有极显著的影响，温度和时间对提取率的影响显著；压力的二次方、温度的二次方和时间的二次方对提取率有极显著影响；压力和时间的交互项对提取率的影响显著。

表3提取回归模型方差分析结果

**.P＜0.0001,差异极显著；*.P＜0.05,差异显著

3、响应面分析及条件优化

(1)、压力与温度的影响及交互作用分析

在固定萃取时间为2h条件下(X3＝0)，萃取温度和萃取压力及两者的交互作用对神秘果种子精油提取率影响的响应面及对应等高线见图6。从图6可以看出，萃取温度和萃取压力对神秘果种子精油提取率的交互作用不显著(P＝0.6710)。萃取率大小的变化主要受萃取压力的影响，随着萃取压力的增加得率逐步增加，在萃取压力达到30Mpa左右时，提取率达到最大值；从其响应面及对应等高线也可以看出，在温度为40℃左右时，在较低的压力条件下就可以得到较高的提取率。

(2)、压力与时间的影响及交互作用分析

在固定萃取温度为40℃条件下(X1＝0)，萃取时间和萃取压力及两者交互作用对神秘果种子精油提取率影响的响应面及对应等高线见图7。从图7可以看出，萃取时间和压力对提取率的交互作用显著(P＝0.0300)。萃取率主要受萃取压力影响，压力在萃取率的提高中起到了关键性的作用，提取率随着萃取压力的增加而迅速增加，在萃取压力达30Mpa左右，提取率达到最大值。

(3)、温度与时间的影响及交互作用分析

在固定萃取压力为25MPa条件下(X2＝0)，萃取温度和萃取时间及两者的交互作用对神秘果种子精油提取率影响的响应面及对应等高线见图8。从图8可以看出，萃取时间和萃取温度对提取率的交互作用不显著(P＝0.1522)。从整体上看，时间和温度对提取率的影响都相对较小。

综合图5-图7的响应面图可以看出，萃取压力是影响神秘果种子精油提取率最显著的因素，温度，时间次之，其中温度和时间对提取率的影响都显著。通过对回归模型求解方程，得出最大萃取得率为4.98611％；最佳工艺条件为：萃取温度41.52℃，压力28.88Mpa，时间122.19min。

(4)、种子精油成分的分析

GC-MS分析测定神秘果种子精油中组分的种类和相对含量，用峰面积归一法确定了各主要成分的相对百分含量。确定后的已知组分名称和相对含量分别列于表4和表5。已鉴定成分的总含量占精油成分的90.98％。通过表4可以看出神秘果种子精油(加乙醇)的主要成分和含量为：十六烷酸，2-羟基-1-羟甲基乙酯(6.999％)、油酸(12.306％)、棕榈酸(17.105％)、9,12-十八碳二烯酸(Z,Z)(18.207％)、十八烷酸(6.728％)、及α-烷基-12-齐墩果烯乙酸酯(3.512％) 等。由表5可以看出精油(不加乙醇)的主要组分和含量为：油酸(37.734％)、棕榈树(30.774％)和十八烷酸(9.421％)等。通过图和表明显看出夹带剂对精油成分和含量得影响很显著，加了夹带剂乙醇的精油主要成分增多，含量相对减少，提取的化合物范围增大；不加乙醇的主要成分相对集中，含量很高，化合物种类少。

表4神秘果种子精油的主要组成(加乙醇)

表5神秘果精油的主要组成(不加乙醇)

(5)、精油对小白鼠降糖作用的试验

取3只正常的9周大的小白鼠，分别测血糖值，以此为0点，分别灌胃等量的神秘果种子精油。在60min，90min和120min时，分别记录小白鼠血糖值，其结果见表6。

表6精油对正常小白鼠血糖(mmol/L)的影响

取5只STZ模型糖尿病9周大的小白鼠，分别测血糖值，以此为0点，再分别灌胃等量的神秘果种子精油。在15min，30min，60min，90min和120min 时，分别记录小白鼠血糖值，其结果见表7。为了研究长期灌胃精油对STZ模型糖尿病小白鼠血糖的影响，连续灌胃精油15天，并在0天、第4天、第7天、第10天和第14天各测量小白鼠血糖值一次。其结果见表8。

表7精油对STZ模型糖尿病小白鼠血糖(mmol/L)的影响

表8长期灌胃精油对STZ模型糖尿病小白鼠血糖mmol/L的影响

取正常小鼠2只，STZ模型小鼠2只，灌胃精油的糖尿病小鼠5只。分别测其血清的胰岛素值，结果见表9。

表9精油对糖尿病模型小鼠血清血糖值和胰岛素值的影响

综合表6、表7和表8和可以看出精油在降血糖方面效果比较明显，起效也较快，能在15min内就有降糖效果，且作用时间长，在120min测量时，血糖值还处在一个低水平。长期灌胃精油对STZ模型小鼠的血糖值影响非常明显，几乎能使血糖值达到正常水平，而对正常小鼠的血糖值影响就不是很明显。从平均值来看，存在很明显的个体差异。此试验还需进一步的研究通过有力的数据加以证明其降糖效果如何。此次试验紧紧只是初步证明了其可起到降糖作用。

在单试验基础上，通过Design-Expert软件，用中心复合旋转设计对超临界萃取神秘果种子精油的工艺条件进行优化。结果表明：压力对提取率的影响极显著。最终确定最佳工艺条件：萃取温度41.52℃，萃取压力28.88Mpa，萃取时间122.19min，此时提取率4.98611％。本发明对精油主要成分和含量做了分析，还初步探究了精油的降糖作用，结果表明其降糖作用比较明显，为进步研究精油的降糖效果提供了实际的依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法，其特征在于，所述超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法萃取温度41.52℃，萃取压力28.88Mpa，萃取时间122.19min，提取率4.98611％；

所述超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法采用超临界萃取法提取种子精油；进行单因素试验探究萃取条件；通过响应面法优化提取工艺。

2.如权利要求1所述的超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法，其特征在于，所述超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法包括：

步骤一，种子精油的超临界萃取；

步骤二，萃取条件的单因素试验；

步骤三，响应面法优化提取工艺；

步骤四，精油的GC/MS条件。

3.如权利要求2所述的超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法，其特征在于，所述步骤一种子精油的超临界萃取包括：

称取种子粉末50g于超临界萃取釜中，CO₂来源于温度保持在2℃的缸中并在高压下注入萃取釜；二氧化碳流量测量用流量计；在提取过程中，通过调节阀控制提取温度和压力；萃取完后，将萃取容器减压并收集器中挥发油；溶剂用旋转真空蒸发器蒸发而提取物用氮气处理以除去残留溶剂；测量收集精油的重量，再计算提取率；

精油提取率(％)＝(提取的精油质量/神秘果种子粉的质量)×100％。

4.如权利要求1所述的超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法，其特征在于，所述步骤二，萃取条件的单因素试验包括：

分别以萃取温度、萃取压力、萃取时间、二氧化碳流量等为变量，以萃取率为评价指标，确定影响神秘果种子精油提取率的主要因素；

萃取压力的影响：固定萃取时间为2h，温度为40℃，二氧化碳流量20L/h；

萃取温度的影响：固定萃取压力25Mpa，时间2h，二氧化碳流量20L/h；

萃取时间的影响：固定萃取压力25Mpa，温度为40℃，二氧化碳流量20L/h；

二氧化碳流量的影响：固定萃取压力25Mpa，温度为40℃，时间2h。

5.如权利要求1所述的超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法，其特征在于，所述步骤三，响应面法优化提取工艺包括：

超临界提取神秘果种子精油过程中的工艺参数用响应面分析法优化；根据单因素实验结果，以神秘果种子精油萃取率为指标进行RSM实验设计，选取对神秘果种子精油萃取率影响最大的因素萃取温度，压力，时间为自变量，分别以X1，X2，X3表示，并以+l、0、一1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi＝(Xi-X0)/△X对自变量进行编码，其中xi为自变量的编码值，Xi置为自变量的真实值，X0为实验中心点处自变量的真实值，△X为自变量的变化步长；利用统计软件Design Expert对实验数据进行回归分析，预测神秘果种子精油萃取的最佳工艺参数。

6.如权利要求1所述的超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法，其特征在于，所述步骤四，精油的GC/MS条件包括：

GC条件：色谱柱：石英毛细管柱HP-FFAP 30m×0.25mm，0.25um；进样口温度：260℃；程序升温：初始40℃，保持3min，以8℃/min升温速率升至200℃，保持5min，再以6℃/min升至260℃，保持5min；进样量1.0μL，分流比为50:1；载气为高纯He，流速为1.0mL/min；

MS条件：离子源：EI电子轰击源；离子源温度：200℃；电离电压：70eV；接口温度：250℃；扫描范围(m/z)：10～500aum。

7.一种如权利要求1-6任意一项所述的超临界CO₂提取神秘果种子精油的方法制备的精油。