CN107709572A - 促进从动物饲料中提取酶的方法及酶活性的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了促进从动物饲料中提取酶的方法及酶活性的测定方法。

Description

促进从动物饲料中提取酶的方法及酶活性的测定方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以2015年5月20日提交的美国临时申请62/164,007作为优先权基础，通过引用并入文本，如同完整叙述。
技术领域
本发明公开的内容涉及一种从饲料样品中提取植酸酶(phytase)的方法及其活性测定。该活性测定检测无机磷酸盐的存在与否，其中无机磷酸盐通过植酸酶的水解酶作用由植酸钠底物释放。
背景技术
以谷物为基础的动物饲料中的磷以植酸(phytic acid)的形式存在。植酸中的磷酸盐可以被反刍动物消化，因为其内脏中定殖的细菌可以产生植酸酶，将不可消化形式的磷酸盐转化成无机的游离形式进而能够很容易被吸收。然而单胃动物由于不携带这种类型的细菌，因此无法利用植酸作为磷的来源。因此外源植酸酶通常被添加到饲料配方中喂养单胃动物以提高磷酸盐的利用率。
植酸酶(肌醇六磷酸酶，EC 3.1.3.8)催化水解难消化的、有机态磷—植酸(肌醇六磷酸)，并释放可以利用的无机态磷。传统上，通过发酵生产得到的微生物植酸酶被用于饲料生产，要么将酶喷涂在颗粒状饲料的表面，或以浓缩干燥制剂形式添加到饲料中。微生物植酸酶通过植物提炼生产具有成本优势，可以直接在饲料中混合地面植物组织。以低的包合率在饲料中添加干燥制剂或粉碎的植物组织，为饲料样品中酶活性的可靠测量创造了新的挑战。一种准确测定饲料制品中植酸酶活性的方法是极其迫切的需求。
发明内容
一方面，本发明涉及一种测定动物饲料中植酸酶活性的方法。该方法包括将一定量的动物饲料与碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液混合以获得混合物。动物饲料包含植酸酶。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包含浓度范围从10mM到500mM的碳酸钠和浓度范围从10mM到500mM的碳酸氢钠。该方法包括从混合物中提取植酸酶。该方法还包括测定所提取的植酸酶的活性。
一方面，本发明涉及一种提取饲料酶(feed enzyme)的方法。该方法包括将一定量的动物饲料与碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液混合以获得混合物。动物饲料包含饲料酶。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包含浓度范围从10mM到500mM的碳酸钠和浓度范围从10mM到500mM的碳酸氢钠。该方法还包括从混合物中提取饲料酶。
附图说明
结合附图将会更好地理解下述对本发明的优选实施方式的具体说明。为了更好的阐明本发明，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应该理解的是本发明并不局限于所显示的准确的设置和手段。附图中：
图1显示了分别使用pH5.5、含0.01％吐温的醋酸钠缓冲液(斜线条纹柱状图)，pH10、含0.01％吐温的硼酸钠缓冲液(灰色柱状图)或pH10.8的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(横条纹柱状图)从饲料中提取的植酸酶在37℃和65℃的条件下的活性。每种缓冲液都显示为稀释5倍、10倍和20倍且分别在37℃和65℃下的结果。
图2是分别使用pH10.8的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH10的硼酸钠缓冲液以及pH5.5的醋酸钠缓冲液从饲料中提取的植酸酶的蛋白质印迹图。
图3为显示使用碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液分别在22℃、55℃、65℃、75℃和85℃下从饲料样品中提取的植酸酶的活性图。左侧的柱状图为每个设置的温度点稀释50倍的结果。右侧的柱状图为每个设置的温度点稀释100倍的结果。
图4显示了分别使用pH10、含0.01％吐温的硼酸钠缓冲液(柱状图1和2)和pH10.8的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(柱状图3)提取后回收的植酸酶的活性结果图。
图5A和图5B显示了使用不同体积的碳酸钠/碳酸氢钠提取缓冲液从配制有1000FTU/kg(图5A)和3000FTU/kg(图5B)植酸酶的10g饲料中回收的最大活性的百分比结果图。
图6显示了使用两种提取方式：(1)醋酸钠缓冲液和(2)碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，从研磨成三种不同颗粒尺寸的转基因粉状物中回收的植酸酶活性结果图。
图7显示了使用(1)碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，(2)含有吐温的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液和(3)含有吐温的硼酸钠缓冲液从配制有1000FTU/kg和3000FTU/kg植酸酶的饲料中回收植酸酶的活性结果图。
图8显示了在(1)碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，(2)含有吐温的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液和(3)含有吐温的硼酸钠缓冲液中保存的植酸酶活性的稳定性结果图。
具体实施方式
下述说明书中使用了特定的术语，但这仅是为了方便而并非为了限制。词语“右”、“左”、“顶部”及“底部”指定了附图中所涉及的方向。除非特别说明，否则权利要求书和说明书的相应部分中使用的词语“一”和“一个”被定义为包括一个或多个所引用的元素。这些术语包括上述具体提到的词语、派生词和相似的外来词语。短语“至少一个”后面的一系列两个或多个元素，如“A、B或C”，指的是A、B、或C中的任何单独的个体，以及它们任意的组合。
在一种实施方式中，提供了一种测定动物饲料中植酸酶活性的方法。该方法可以包括将一定量的动物饲料与碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液混合以获得混合物。动物饲料可以含有植酸酶。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液可以包含碳酸钠和碳酸氢钠。该方法可以包括从混合物中提取植酸酶。该方法还可以包括测定提取的植酸酶的活性。
本发明所述的“植酸酶”是一种能够催化植酸水解的酶。在被添加到动物饲料之前，植酸酶可以是由基因工程宿主产生的。所述宿主可以但不局限于是植物细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞或酵母细胞。所述宿主可以是细菌细胞。所述细菌细胞可以是大肠杆菌细胞。
在一种实施方式中，碳酸钠的浓度范围可以从10mM到500mM。碳酸氢钠的浓度范围可以从10mM到500mM。上述的每一个浓度范围都是可以被细分的。各个碳酸钠与碳酸氢钠的浓度都可以在所述范围(包括端点)内以10mM为增量选择的任意两个值之间进行细分。任意一种反应物的浓度都可以是其各自范围内的一个特定值。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中碳酸钠的浓度可以与碳酸氢钠的浓度相同。碳酸钠的浓度可以是30mM。碳酸氢钠的浓度可以是30mM。缓冲液中碳酸钠的浓度可以与碳酸氢钠的浓度不同。
在一种实施方式中，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的pH可以是10.00或者更高。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的pH范围可以是10.00到14.00，包括端点。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的pH可以是10.00、10.5、11.00、11.5、12.00、12.5、13.00、13.5或14.00。pH的范围可以是10.0到11.0，11.0到12.0，12.0到13.0，13.0到14.0之间，并包括端点。pH可以是10.0到14.0之间，并包括端点中选择的任意整数pH值。pH可以是11.0到13.0之间，并包括端点中的任意pH值。pH值可以是10.00。
在一种实施方式中，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液还可以包括非离子去垢剂(nonionicdetergent)。本发明所述的非离子去垢剂是指在水溶液中不产生离子的去垢剂。非离子去垢剂可以是在添加月桂酸之前由脱水山梨醇(sorbitan)乙氧基化形成的聚山梨酯型非离子去垢剂。聚山梨酯型非离子去垢剂可以是聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯。聚山梨酯型非离子去垢剂可以是吐温吐温在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中的浓度范围可以是0.001％(v/v)到1.0％(v/v)。吐温的浓度可以在所述范围(包括端点)内以0.001％为增量选择的任意两个值之间进行细分。吐温任意浓度可以是所述范围内的一个特定值。
在一种实施方式中，所述方法使用的饲料的量的范围可以从100g到500g，包括端点。饲料的量可以是100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g或500g。饲料的量可以是100g到150g，150g到200g，200g到250g，250g到300g，300g到350g，350g到400g，400g到450g，或450g到500g之间中的任意量，包括端点。本发明中任意一个范围内的饲料的量可以是该范围中的任意两点之间的任何值。饲料的量可以大于500g。本发明所述的“动物饲料”指的是任何适用于动物摄取营养、生存或生长的食物、饲料、饲料组分、饮食、制剂、添加剂、补充剂或混合物。
在一种实施方式中，该方法还可以包括在进行混合之前将动物饲料研磨成粉状物(flour)。其中粉状物含有尺寸范围在250μm到6,000μm之间(包括端点)的颗粒。粉状物含有尺寸范围从250μm到300μm、从300μm到400μm、从400μm到500μm、从500μm到600μm、从600μm到700μm、从700μm到800μm、从800μm到900μm、从900μm到1,000μm、从1,000μm到1,100μm、从1,100μm到1,200μm、从1,200μm到1,300μm、从1,300μm到1,400μm、从1,400μm到1,500μm、从1,500μm到1,600μm、从1,600μm到1,700μm、从1,700μm到1,800μm、从1,800μm到1,900μm、从1,900μm到2,000μm、从2,000μm到2,100μm、从2,100μm到2,200μm、从2,200μm到2,300μm、从2,300μm到2,400μm、从2,400μm到2,500μm、从2,500μm到2,600μm、从2,600μm到2,700μm、从2,700μm到2,800μm、从2,800μm到2,900μm、从2,900μm到3,000μm、从3,000μm到3,100μm、从3,100μm到3,200μm、从3,200μm到3,300μm、从3,300μm到3,400μm、从3,400μm到3,500μm、从3,500μm到3,600μm、从3,600μm到3,700μm、从3,700μm到3,800μm、从3,800μm到3,900μm、从3,900μm到4,000μm、从4,000μm到4,100μm、从4,100μm到4,200μm、从4,200μm到4,300μm、从4,300μm到4,400μm、从4,400μm到4,500μm、从4,500μm到4,600μm、从4,600μm到4,700μm、从4,700μm到4,800μm、从4,800μm到4,900μm、从4,900μm到5,000μm、从5,000μm到5,100μm、从5,100μm到5,200μm、从5,200μm到5,300μm、从5,300μm到5,400μm、从5,400μm到5,500μm、从5,500μm到5,600μm、从5,600μm到5,700μm、从5,700μm到5,800μm、从5,800μm到5,900μm、从5,900μm到6,000μm之间(包括端点)的颗粒。此处任何一个范围内的颗粒的尺寸可以是包括在该范围内的任意两个点之间的任何值。颗粒尺寸可以从250μm到1000μm，包括端点。颗粒尺寸至少为250μm。
在一种实施方式中，动物饲料的量可以是动物饲料研磨后得到的粉状物的量。所述方法中所使用的粉状物的量的范围可以在1g到500g之间，包括端点。粉状物的量可以是1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g或500g。粉状物的量可以是从1g到10g、从10g到20g、从20g到30g、从30g到40g、从40g到50g、从50g到60g、从60g到70g、从70g到80g、从80g到90g、从90g到100g、100g到150g、从150g到200g、从200g到250g、从250g到300g、从300g到350g、从350g到400g、从400到450g、或从450g到500g之间(包括端点)的任意量。此处任何一个范围内的粉状物的量可以是包括在该范围内的任意两个点之间的任何值。粉状物的量至少为500g。
在一种实施方式中，从混合物中提取植酸酶可以由本领域任何已知的提取方法来完成。提取的步骤可以是如本文中实施例2所描述的步骤。
在一种实施方式中，混合物在提取过程中的温度可以在20℃到80℃范围内，包括端点。混合物的温度可以是20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、65℃、70℃、75℃或80℃，包括端点。混合物的温度范围可以是20℃到25℃、20℃到30℃、20℃到35℃、20℃到40℃、20℃到45℃、20℃到50℃、20℃到55℃、20℃到60℃、20℃到65℃、20℃到70℃、20℃到75℃、或者低于80℃。此处任何一个范围内的温度可以是包括在该范围内的任意两个点之间的任何值。混合物的温度可以是55℃。
在一种实施方式中，在37℃下使用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液从饲料中提取的植酸酶的量可大于在相同温度下使用硼酸钠缓冲液提取的植酸酶的量。在37℃下使用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液从饲料中提取的植酸酶的量可大于在相同温度下使用醋酸钠缓冲液提取的植酸酶的量。
在一种实施方式中，提取的植酸酶可以在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中储存一段时间。提取的植酸酶的储存时间范围可以从一个小时到三十天，包含端点。储存时间可以是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、15小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、10天、15天、20天、25天，或者30天。储存时间可以是包含端点在内的各点值与点值之间的任何一个整数值。储存时间可以少于30天。储存时间可以少于20天。储存时间可以少于10天。储存时间可以少于1天。
在一种实施方式中，测定植酸酶活性的步骤可以在20℃到80℃的温度范围内进行，包含端点。混合物的温度可以是20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、65℃、70℃、75℃或80℃，包括端点。混合物的温度范围可以是20℃到25℃、20℃到30℃、20℃到35℃、20℃到37℃、20℃到40℃、20℃到42℃、20℃到45℃、20℃到50℃、20℃到55℃、20℃到60℃、20℃到65℃、20℃到70℃、20℃到75℃、或者低于80℃。此处任何一个范围内的温度可以是包括在该范围内的任意两个点之间的任何值。所述温度可以是37℃。
在一种实施方式中，提供了一种提取饲料酶的方法。所述方法可以包括将一定量的动物饲料与碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液混合以获得混合物。所述动物饲料可以包含饲料酶。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液可以包含碳酸钠和碳酸氢钠。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中碳酸钠的浓度可以是本文所描述的任何浓度。碳酸钠的浓度可以是30mM。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中碳酸氢钠的浓度可以是本文所描述的任何浓度。碳酸氢钠的浓度可以是30mM。所述方法可以包括从混合物中提取饲料酶。
在一种实施方式中，饲料酶可以是动物饲料中包含的任意酶。所述饲料酶可以为但不局限于植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、淀粉酶、蛋白酶、甘露糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、木糖苷酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、酯酶或纤维素酶。所述植酸酶可以是本文所描述的任何植酸酶。所述植酸酶可以是大肠杆菌植酸酶。
在一种实施方式中，饲料酶可以是由基因工程宿主产生的。所述宿主可以是但不局限于植物细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞和酵母细胞。
在提取过程中，混合物的温度可以是本文中所描述方法中的任何温度。该温度可以是55℃。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的pH可以是本文所描述的方法中的任何pH。pH可以是10.00或者更大。
其中动物饲料的量可以是本文所描述的方法中的任何量。动物饲料的量可以至少是100g。在一种实施方式中，所述方法还包括在混合步骤前将动物饲料研磨成粉状物。粉状物可以含有本文所描述的方法中具有任何尺寸的颗粒。颗粒的尺寸可以至少是250μm。动物饲料的量可以是研磨后产生的粉状物的量。粉状物的量可以是本文所描述的方法中任何粉状物的量。粉状物的量可以至少是1g。碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液还可以包含非离子去垢剂。所述非离子去垢剂可以是本文所描述的任何非离子去垢剂。该非离子去垢剂可以是吐温碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中吐温的浓度范围可以从0.001％(v/v)到1.0％(v/v)，包含端点，或者是本文所描述的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中吐温的任何浓度。
在一种实施方式中，所述混合物可以含有以小于或等于选自由以下组成的组中的一个比例存在的饲料和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液：1:5(w/v)、1:10(w/v)、1:20(w/v)、1:50(w/v)、1:60(w/v)、1:70(w/v)、1:80(w/v)、1:90(w/v)、1:100(w/v)、1:200(w/v)、1:300(w/v)、1:400(w/v)、1:500(w/v)、1:600(w/v)、1:700(w/v)、1:800(w/v)、1:900(w/v)以及1:1000(w/v)，或者任意两个值之间的任何值。
下面的清单包含本发明的特定实施方式。但是该清单并不限制也没有排除本领域技术人员所能够想到的其他替代的实施方式。
实施方式
1.一种测定动物饲料中植酸酶活性的方法，该方法包括：
将一定量的动物饲料与碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液混合以获得混合物，其中，所述动物饲料包含植酸酶，并且碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包含浓度范围从10mM到500mM的碳酸钠和浓度范围从10mM到500mM的碳酸氢钠；
从混合物中提取植酸酶，以及
测定提取的植酸酶的活性。
2.如实施方式1所述的方法还包括在混合步骤前将动物饲料研磨成粉状物。
3.如实施方式2所述的方法，其中，粉状物含有尺寸范围在250μm到6000μm之间的颗粒。
4.如实施方式3所述的方法，其中，尺寸至少是250μm。
5.如前述实施方式中的任何一个或多个所述的方法，其中，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的pH是10.00，或者更大。
6.如前述实施方式中的任何一个或多个所述的方法，其中，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液还包括非离子去垢剂。
7.如前述实施方式中的任何一个或多个所述的方法，其中，动物饲料的量在100g到500g之间的范围内。
8.如前述实施方式中的任何一个或多个所述的方法，其中，混合物的温度范围在20℃到80℃之间。
9.如前述实施方式中的任何一个或多个所述的方法，其中，植酸酶是由基因工程宿主产生的。
10.如实施方式9所述的方法，其中，宿主选自植物细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞及酵母细胞。
11.如前述实施方式中的任何一个或多个所述的方法，其中，植酸酶是大肠杆菌植酸酶。
12.如前述实施方式中的任何一个或多个所述的方法，其中，植酸酶活性的测定是在20℃到80℃之间的温度范围内进行的。
13.如前述实施方式中的任何一个或多个所述的方法，其中，温度是37℃。
14.一种提取饲料酶的方法包括：将一定量的动物饲料与碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液混合以获得混合物，其中，所述动物饲料包含饲料酶，并且碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包含浓度范围从10mM到500mM的碳酸钠和浓度范围从10mM到500mM的碳酸氢钠；以及
从混合物中提取饲料酶。
15.如实施方式14所述的方法，其中，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的pH是10.00或者更大。
16.如实施方式14-15中任何一个或两个所述的方法，其中，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液还含有非离子去垢剂。
17.如实施方式16所述的方法，其中，非离子去垢剂是聚山梨酯(polysorbate)。
18.如实施方式17所述的方法，其中，聚山梨酯的浓度在0.001％(v/v)到1.0％(v/v)的范围内。
19.如实施方式14-18中任何一个或多个所述的方法，其中，混合物含有以小于或等于选自由以下组成的组中的一个比例存在的饲料和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液：1:5(w/v)、1:10(w/v)、1:20(w/v)、1:50(w/v)、1:60(w/v)、1:70(w/v)、1:80(w/v)、1:90(w/v)、1:100(w/v)、1:200(w/v)、1:300(w/v)、1:400(w/v)、1:500(w/v)、1:600(w/v)、1:700(w/v)、1:800(w/v)、1:900(w/v)及1:1000(w/v)。
20.如实施方式14-19中任何一个或多个所述的方法，其中，动物饲料的量在100g到500g之间的范围内。
21.如实施方式14-20中任何一个或多个所述的方法，还包括将动物饲料研磨成粉状物，其中，粉状物含有尺寸范围在250μm到6000μm之间的颗粒。
22.如实施方式21所述的方法，其中，尺寸至少是250μm。
23.如实施方式14-22中任何一个或多个所述的方法，其中，混合物的温度在20℃到80℃范围内。
24.如实施方式23所述的方法，其中，温度是50℃。
25.如实施方式14-24中任何一个或多个所述的方法，还包括测定饲料酶的活性。
26.如实施方式14-25中任何一个或多个所述的方法，其中，饲料酶是由基因工程宿主产生的。
27.如实施方式26所述的方法，其中，宿主选自植物细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞及酵母细胞。
28.如实施方式14-27中任何一个或多个所述的方法，其中，饲料酶选自由植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、淀粉酶、蛋白酶、甘露糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、木糖苷酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、酯酶或纤维素酶组成的组中。
29.如实施方式28所述的方法，其中，植酸酶是大肠杆菌植酸酶。
30.如实施方式25所述的方法，其中，测定步骤是在30℃到80℃之间的温度范围内进行的。
31.如实施方式30所述的方法，其中，温度是37℃。
本文中更多的实施方式可以由一个或多个其它实施方式中的一个或多个元素来补充而获得，和/或，将一种实施方式中的一个或多个元素替换为其它实施方式中的一个或多个元素而获得。
实施例
下文中提供了一些非限定性的实施例来说明具体的实施方式。在整个实施方式中，可以从下面的一个或多个实施例中补充一个或多个细节，和/或一种实施方式中的一个或多个元素可以被以下一个或多个实施例的一个或多个细节替换。
实施例1.植酸酶提取及活性测定
该方法包括从活性测定试验所使用的饲料样品中提取植酸酶的步骤。提取步骤通过使用pH10.8的30mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液在23℃到75℃的温度范围内提取植酸酶蛋白，并且在最低限制的背景条件(由饲料中高浓度的磷酸盐、内源性磷酸盐和/或其它酶所引起)下最大限度的从饲料中提取植酸酶。该测定特别适用于补充有高水平磷酸盐的饲料中植酸酶的检测和饲料中非植酸酶蛋白的检测。结果表明，提高提取体积和调整饲料重量与提取体积的比例，例如1/15(w/v)调整为1/30(w/v)，可以提高植酸酶提取的效率。同时还注意到，延长提取时间或重复提取，例如经过1小时初次提取后，混合新鲜提取缓冲液并再继续提取1小时，可以最大限度地提取植酸酶。在碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中加入吐温可以进一步提高植酸酶提取效率。
植酸酶活性测定检测了植酸钠底物释放的无机磷酸盐的存在。该活性测定在升高的温度下进行，即65℃，可以最大限度地提高检测灵敏度，并且能精确测定饲料中通常被稀释数千倍的植酸酶活性。
仪器与耗材
表1.仪器与耗材
*所有的玻璃器皿都用硝酸进行清洗，然后用dH2O洗涤以去除任何残留的磷酸盐。
表2.试剂和化学品
实验准备
所有缓冲液和试剂都是在仅用于植酸酶制备的实验器具中配制的。
稀释的硝酸：通过在盛有130mL的dH2O的玻璃瓶中加入70mL的浓硝酸而制得。
10％吐温 ：在45mL的dH2O中溶解5mL吐温而制得。
钼酸铵储存液：400mL的dH2O中溶解50g四水合钼酸铵，加入5mL氢氧化铵，然后转移至500mL的玻璃瓶中而制得。玻璃瓶用铝箔纸包裹以避光，可在室温下避光保存90天。
作为显色终止液(Color Stop Solution)的钒酸铵储存液：400mL的dH2O中溶解1.175g钒酸铵，使用60℃水浴加热促进溶解而制得。溶解完全后溶液开始变为黄色。钒酸铵完全溶解之后立马在搅拌条件下向其中缓慢加入10mL稀释的硝酸。溶液冷却至室温后转移至玻璃瓶中，用dH2O将溶液定容至500mL。玻璃瓶用铝箔纸包裹以避光，可在室温下避光保存90天。
pH5.5的含有1mM氯化钙和0.01％吐温 的醋酸钠缓冲液250mM：通过用600mL去离子水溶解18.096g醋酸钠而制得。采用1.676mL醋酸调节样品的pH到5.5。再加入0.147g氯化钙溶解，同时与1.0mL 10％吐温混合，维持pH在5.5。用dH2O将溶液定容至1000mL，在4℃下可以保存90天。
pH5.5的7.2mM磷酸钾标准品：称取0.049g磷酸二氢钾，并在50mL的Falcon离心管中用50mL醋酸钠缓冲液溶解而制得。确定pH为5.5。该标准品可在4℃下保存90天。
pH5.5的9.1mM植酸钠底物：每天需要新鲜配制，通过在25mL醋酸钠缓冲液中溶解0.2102g的植酸而制得，pH5.5，可以满足一个完整的96孔板测定外加磷酸盐标准曲线的测定。
pH10.8的30mM碳酸钠/碳酸氢钠提取缓冲液：
(1)100mM碳酸钠的制备：称取5.30g碳酸钠，用蒸馏水溶解后定容至500mL。
(2)100mM碳酸氢钠的制备：称取4.2g碳酸氢钠，用蒸馏水溶解后定容至500mL。
(3)450mL的100mM碳酸钠预先与50mL的100mM的碳酸氢钠混合以使在100mM下pH为10.8。300mL预混合液用水稀释至终体积为1000mL。如果需要，用1M的氢氧化钠调节pH为10.8。
pH10.8、含有0.01％吐温 的30mM的碳酸钠/碳酸氢钠提取缓冲液：如上所述地配制1000mL的碳酸钠/碳酸氢钠提取缓冲液。1000mL的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中加入1mL10％吐温该碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液在4℃下可以保存90天。
pH10.0、含有0.01％吐温 的25mM的硼酸钠提取缓冲液：9.534g硼酸钠溶解于玻璃瓶的600mL去离子水中，加入1.0mL 10％吐温采用3.8mL的10N氢氧化钠调节pH到10。用去离子水定容至1000mL。
显色终止液：在酶孵育的1小时期间于37℃下进行制备，且在使用前避光保存。下面列出的成分一起加入到50mL的Falcon离心管中以制备总计25mL的显色终止液。
表3.显色终止液的成分
成分 体积(mL)
dH2O 8.375
钼酸铵储存液 6.25
钒酸铵储存液 6.25
35％硝酸 4.125
显色终止液呈浅黄色。
实施例2.实验步骤
(1)研磨谷物或饲料样品：
混合饲料样品。饲料汇集在5加仑的桶中。在研磨前，用塑料匙搅拌饲料使其混匀。从汇集在5加仑的桶中的饲料中取出100g到500g的饲料样品。最常用的饲料样品量是250g。
饲料样品用配有0.5mm筛的Udy研磨机，或者配有1.0mm筛的Retsch SM100切割碎机，或者Roskamp Champion公司的TP650-9滚压机进行研磨，并筛出所需要的颗粒尺寸。粉状物储存在有标签的袋子中，并放在干燥阴凉处。
每个样品研磨前都用刷子和真空器清洗研磨机，然后用空气吹扫。
(2)从饲料样品中提取蛋白质：5g、10g、20g或100g研磨好的饲料样品被称取在250mL、500mL、1000mL或2800mL的烧瓶中。
粉状物中加入提取缓冲液，然后剧烈的涡旋振荡以重悬粉状物。在测定中，20g粉状物用于植酸酶蛋白提取。烧瓶置于振荡器上，以250rpm在23℃或55℃下震荡1小时。1小时后，样品从振荡器取下，取1.5mL悬液至2mL离心管中，在台式离心机中16000×g离心10分钟。包含蛋白的上清收集至2mL离心管中用于进一步分析。如果饲料样品需要进一步提取以得到最大的回收率，饲料悬液中以w/v比例加入新鲜的提取缓冲液。例如，如果w/v比例是5，往烧瓶中加入100mL提取缓冲液；如果w/v比例是10，往烧瓶中加入200mL缓冲液。与新鲜的提取缓冲液混合后，烧瓶在选定的温度下置于振荡器上更长的时间。
饲料样品中蛋白提取物的稀释：来自饲料的植酸酶蛋白提取物用250mM的醋酸钠缓冲液(pH5.5，1mM氯化钙和0.01％吐温)稀释。经典的稀释方式是基于饲料中包含的植酸酶含量，从5倍开始直到40倍。进行测定的来自饲料的蛋白提取物的稀释倍数是5、10、20和40。结果表明，植酸酶蛋白提取物必须被充分稀释才可以检测到由植酸酶释放的无机磷酸盐，即在磷酸盐标准曲线的线性检测范围内。
植酸酶活性的测定
植酸酶活性测定的底物，9.1mM植酸钠，如前所述制备得到。96孔深孔板检测模块用于测定，包含12列以及标记为A、B、C、D、E、F、G和H的8行。75微升稀释的植酸酶提取物加入到检测模块A到D行(反应组)，每个孔的样品信息同时被记录。5倍、10倍、20倍和40倍稀释的样品被测定。植酸钠底物被加入到样品板中，并用锡箔纸包裹。包含样品的检测模块被密封。植酸盐底物与检测模块一起在37℃或65℃下孵育10分钟。150微升预热的9.1mM植酸底物首先加入到没有植酸酶蛋白提取物的E-H行(空白对照)。然后，150微升预热的9.1mM植酸底物加入到A行并充分混匀。最后，150微升预热的9.1mM植酸底物加到剩下的B、C和D行。96孔检测模块密封后在37℃或65℃下孵育60分钟。
显色终止液的配制如实施例1所述。孵育60分钟后，在通风橱中，150微升的显色终止液加入到96孔检测模块中，从A行开始，充分混匀后，剩下的B、C、D、E、F、G和H行同样加入150微升的显色终止液终止反应。空白对照组E-H行，在加入显色终止液后加入75μL相应稀释度的植酸酶样品提取物，因此植酸酶不会产生磷。由于空白对照组含有相同量的底物、植酸酶样品提取物和显色终止液，因此空白对照组可以用作获取磷酸盐背景读数。检测模块置于通风橱中10分钟，然后3000×g离心10分钟。取检测模块每个孔的上清100微升到平底微孔板中。在415nm处读取微孔板中样品的光密度值。
磷酸盐标准曲线
每进行一次测定都要制备磷酸盐标准曲线，由此，通过植酸酶的活性由植酸底物释放的无机磷可以用标准曲线进行量化。如本文所述，每个磷酸盐标准品都是通过将250mM醋酸钠缓冲液和7.2mM磷酸钾混合而制备的。用于制备各个标准品的磷酸钾和醋酸钠的体积如表4所示，作为磷酸盐标准品1到12被分装在96孔圆底板的1到12列。
100微升的植酸底物加入到每个磷酸盐标准品中，混合均匀。然后加入100μL的显色终止液，充分混匀。混合物在室温下孵育10分钟，使显色反应完全，然后3000×g离心10分钟，收集上清。
取每个标准品混合物100微升上清置于新的平底微孔板，在415nm处测定其吸光值(OD415)。
表4.磷酸盐/缓冲液的体积分装
标准品(Std) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
醋酸钠缓冲液(μL) 50 45 42.5 40 37.5 35 25 20 15 10 5 0
7.2mM磷酸钾(μL) 0 5 7.5 10 12.5 15 25 30 35 40 45 50
磷酸钾浓度(μM) 0 144 216 288 360 432 720 864 1008 1152 1296 1440
磷酸酶活性的表征
植酸酶活性测定方法如美国分析化学家协会正式方法2000.12(AOAC OfficialMethod 2000.12)，饲料的植酸酶活性(Phytase Activity in Feed)，比色酶法(Colorimetric Enzymatic Method)，2000第一版；及2009年12月8日授权的美国专利7,629,139所述，通过引用并入文本，如同完整叙述。
磷酸盐标准曲线：每个415nm读数(ΔOD415)都要扣除标准品1(0μM植酸盐)的OD415值，通过减去试剂空白校正磷酸盐标准曲线的读数。
校正后的415nm吸光度(ΔOD415)被绘制在Y轴作为X轴上磷酸盐浓度(μM)的函数，然后用线性回归法计算“最佳拟合”直线及其对应方程：
X＝(Y-R)/Z
其中，X＝磷酸盐标准品的μM(图中的X轴)
Y＝ΔOD415(图中的Y轴)
R＝磷酸盐标准曲线的截距
Z＝磷酸盐标准曲线的斜率
植酸酶活性的计算
根据植酸酶反应所释放无机磷的浓度，计算蛋白提取样品中植酸酶的活性。
一个植酸酶单位(FTU)被定义为：在测定条件下每分钟释放1μmol无机磷所需要的酶量。该测定中，在37℃或65℃下植酸酶与植酸底物在pH5.5的醋酸钠缓冲液中共同孵育60分钟。
蛋白提取样品的空白对照组(E到H行)的测定值被同一稀释度的植酸酶蛋白提取物其相应的反应组(A到D行)测定值(ΔOD415’)减去。经过背景校正的吸光度值(ΔOD415’，如前述方程的Y)利用磷酸盐标准曲线回归参数以确定磷酸盐值。该值计算结果以μM计(X’，如前述方程的X)。
用以下方程确定由样品中植酸酶所释放的有机磷酸盐浓度：
X’＝(Q–R)/Z
其中，X’＝由植酸酶活性所产生的磷酸盐浓度(μM)
Q＝ΔOD415’
R＝磷酸盐标准曲线的截距
Z＝磷酸盐标准曲线的斜率
用以下方程计算样品中的植酸酶活性：
P＝[(X’×Vm/Vs)×(Ve/1000)×Di]/(Ti×DW)，
其中，
P＝植酸酶活性(FTU/g)，由每分钟每克饲料样品所释放的无机磷的μmol数所表示
X’＝由植酸酶活性所产生的有机磷酸盐的浓度(μM)；如上所述，X’＝(Q–R)/Z
Vm＝加入显色终止液后反应混合物的总体积(mL)。本测定实验中，它是0.375mL
Vs＝每个测定中包含植酸酶的稀释的样品提取物的体积(mL)。本测定实验中，它是0.075mL
Ve＝提取蛋白质所用缓冲液的体积(mL)。本测定实验中，Ve是50、100、150、200、250或300mL。
(Ve/1000)＝提取蛋白质所用缓冲液的体积(L)。本测定实验中，缓冲液体积是0.05、0.1、0.15、0.2、0.25或0.3L。
Di＝工作液稀释系数[Di＝Vf/Vp，其中，Vf＝混合液体的终体积(或者是质量，假设其密度为1)；Vp＝用于工作稀释液的提取蛋白质的体积(或者质量，假设其密度为1)。本测定实验中，用于饲料样品测定的Di为5、10、20或40。
Ti＝植酸酶测定过程中的孵育时间(min)。本测定实验中，Ti是60min。
DW＝用于每次提取的样品初始质量(g)。本测定实验中，DW是5、10、20或100g。
实施例3.为高效提取饲料中植酸酶和更准确测定活性而开发的缓冲液
图1显示了使用pH5.5、含0.01％吐温的醋酸钠缓冲液，pH10、含0.01％吐温的硼酸钠缓冲液及pH10.8的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的植酸酶提取效率的比较。根据图1所示，提取步骤是在23℃下，使用所有三种缓冲液进行的，并且植酸酶活性在37℃或65℃下进行测定。结果表明，在37℃下进行测定时，使用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液能够最高效的从粉状饲料中回收植酸酶活性。当在65℃下进行测定时，硼酸钠缓冲液和碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液回收植酸酶活性的效果相似，但相比pH5.5的醋酸钠缓冲液更有效。
当在65℃下进行植酸酶活性测定时，硼酸钠缓冲液和碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液回收植酸酶活性的效果相似，但相比pH5.5的醋酸钠缓冲液更有效。此外，还对三种缓冲液进行了提取物稀释对酶活性回收的影响的实验。参见图1，蛋白提取物与植酸在37℃或65℃下孵育1h前，用250mM的醋酸钠缓冲液(pH5.5，0.01％吐温1mM氯化钠)进行稀释。
植酸酶在37℃下进行稀释和测定。由于被浓缩植酸酶所释放的无机磷达到磷酸盐标准曲线的顶点平台期，且磷酸盐水平的检测变得不敏感，因此稀释5倍(低倍)后的植酸酶活性在三种提取缓冲液中无显著差异。当蛋白提取物被进一步稀释到10倍或20倍(高倍)，较少的植酸酶被添加到反应中，由酶所产生的磷酸盐更易于被检测到，且测定变得更加灵敏。碳酸盐-碳酸氢盐提取液稀释的蛋白质比其他缓冲液稀释的蛋白质能够检测到反应中更多的磷。研究发现，在37℃下，高度稀释后，通过碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液相比于硼酸钠缓冲液和醋酸钠缓冲液能够在饲料中提取到更多的植酸酶。
根据图1所示，在65℃下，补充添加了0.01％吐温的硼酸盐缓冲液和碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液在植酸酶活性回收方面具有相似的效率。使用这些缓冲液回收的植酸酶活性要比使用pH5.5的醋酸钠缓冲液的效率更高。
图2的实验数据显示pH10.8的30mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液对于从饲料中提取植酸酶是有效的。图2是一张蛋白印记图，显示了使用pH10.8的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液相比于使用pH5.5的醋酸钠缓冲液能够从饲料中提取更多的植酸酶。在碳酸钠/碳酸氢钠提取物中很少有非植酸酶蛋白的条带。同时观察到在提取蛋白质过程中升高温度能够从饲料中提取到更多的植酸酶。根据图2所示，1道和4道对应pH5.5、含0.01％吐温的250mM醋酸钠缓冲液在23℃(1道)或55℃(4道)下提取的蛋白，2道和5道对应pH10、含0.01％吐温的25mM硼酸钠缓冲液在23℃(2道)或55℃(5道)下提取的蛋白，3道和6道对应pH10.8、30mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液在23℃(3道)或55℃(6道)下提取的蛋白。尽管在23℃下使用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液和硼酸盐缓冲液显示出类似的植酸酶提取效果，但是碳酸盐/碳酸氢盐的提取物相比于硼酸盐的提取物具有更低的非特异性蛋白背景。无论是否添加植酸酶，单胃动物的饲料中无机磷酸盐通常以磷酸二氢钙和磷酸氢钙形式补加。饲料中的这种无机磷酸盐成分，以及饲料的蔬菜成分中存在的磷酸盐，与酶测定中由植酸酶活性所释放的磷酸盐无法区分开。因此，最大限度地减少从饲料提取的过程中的背景磷酸盐，同时最大程度提取植酸酶蛋白是有利的。饲料提取物中，相对于植酸酶浓度更低浓度的磷酸盐，会在植酸酶活性测定中产生较高的信噪比。根据图1和图2所示，pH10.8的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液相比于pH5.5的醋酸钠缓冲液能够从饲料中获得更多的植酸酶活性。pH10.8的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液回收的植酸酶活性稍高于pH10、补充有0.01％吐温的硼酸盐缓冲液所回收的酶活性。
实施例4.升高蛋白提取温度能够提高植酸酶提取的效率
升高蛋白提取温度有助于测试的三种缓冲液都从饲料中提取更多的植酸酶。
图3显示了使用碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液在55℃、65℃、75℃和85℃，50倍和100倍稀释度条件下从饲料样品中提取植酸酶的效率。图3的结果说明了在高温度55℃、65℃和75℃相比于室温22℃具有更高的植酸酶回收效率。所有处理的植酸酶活性测定都是在37℃下进行的。在测定过程中，蛋白提取物与植酸在37℃下孵育1小时之前用pH5.5的醋酸钠缓冲液进行稀释。
如图3所示，当蛋白提取在高温55℃、65℃和75℃(相比于室温22℃)下进行1h时，pH10.8的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液能够回收到更多的植酸酶活性。图3同时显示了蛋白提取在85℃下进行一小时后，植酸酶会失活。
图4说明了使用pH10、含有0.01％吐温的硼酸钠缓冲液(柱1和柱2)和pH10.8的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(柱3)提取后从饲料中回收的植酸酶活性。如图4所示，左侧列图显示了蛋白提取物稀释50倍后回收的植酸酶活性；右侧列图显示了蛋白提取物稀释100倍后回收的植酸酶活性。在图4中，从饲料中回收的植酸酶活性用与室温下使用pH10且含有0.01％吐温的硼酸盐缓冲液提取相应饲料样品、并在37℃下测定得到的植酸酶活性之间的百分比表示。与植酸在37℃或65℃下孵育1小时之前，蛋白提取物用pH5.5、含有0.01％吐温及1mM氯化钠的250mM醋酸钠稀释。柱1示出了使用pH10、含0.01％吐温的25mM硼酸钠在23℃下提取蛋白质1小时，并且在37℃下进行活性测定1小时的结果。柱2示出了使用pH10、含0.01％吐温的25mM硼酸钠(Na3BO3)在55℃下提取蛋白质1小时，并且在65℃下进行活性测定1小时的结果。柱3示出了使用pH10.8的30mM碳酸钠/碳酸氢钠(Na2CO3/NaHCO3)在55℃下提取蛋白质1小时，并且在65℃下进行活性测定1小时的结果。结果显示，从饲料中回收的植酸酶在55℃下进行蛋白提取并且在65℃下进行测定相比于在37℃下进行测定时有所提高。50倍稀释条件下，使用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液提取的植酸酶活性几乎与使用硼酸盐缓冲液一样高(柱2)。当饲料样品中含有高水平的磷酸盐时，蛋白提取物必须得到适当稀释以检测植酸酶产生的磷酸盐，因此，能够更有效的测定植酸酶活性。结果显示，100倍稀释条件下，碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液提取后的植酸酶活性最高，该缓冲液提取植酸酶比测试的处理中所有其他缓冲液都更有效。
实施例5.调整饲料质量与提取缓冲液体积的比例(W/V)能够促进从饲料中回收植 酸酶
图5A-5B显示了采用不同体积的碳酸钠/碳酸氢钠提取缓冲液从配制有1000FTU/kg(图5A)和3000FTU/kg(图5B)植酸酶的10g饲料中回收的最大活性的百分比。从300mL提取物中回收的植酸酶活性被定义为100％(最大回收的植酸酶活性)。如图5A和5B所示，配制有1000FTU/kg(图5A)或3000FTU/kg(图5B)的10g饲料分别与50mL(W/V＝1/5)、100mL(W/V＝1/10)、150mL(W/V＝1/15)、200mL(W/V＝1/20)、250mL(W/V＝1/25)和300mL(W/V＝1/30)碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液混合，然后在23℃下，以250rpm震荡1小时。蛋白提取物用pH5.5的醋酸钠缓冲液稀释，在37℃下测定1小时。如图5A所述，上述含有1000FTU/kg植酸酶的饲料，50mL的缓冲液可以提取到配制物中65％的活性。如图5B所述，上述含有3000FTU/kg植酸酶的饲料，50mL的缓冲液可以提取到配制物中37％的活性。如图5A和5B所述，增加提取缓冲液体积到150mL使得配制量为1000FTU/kg时提取到93％的活性且配制量为3000FTU/kg时提取到78％的活性。
实施例6.粉状物/饲料的颗粒尺寸影响酶的回收
玉米谷粒被磨碎并筛选出三种颗粒尺寸：1.0-1.4mm、1.7-2.36mm和2.8-3.35mm。每种研磨样品20克与100mL pH5.5的AOAC饲料缓冲液(220mM醋酸钠，69mM氯化钙，0.01％吐温)(1)或者碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液混合(2)并在23℃下以250rpm震荡1小时。四毫升固/液混合物经过离心，取上清用于植酸酶活性分析(初次提取)。其余的固/液混合物在4℃过夜保存，然后与另外的96mL的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液混合。固/液混合物在沉淀固体物质之前在23℃下以250rpm震荡1小时，上清用于植酸酶活性检测(第二次提取)。
图6显示了：从被研磨成三种不同的颗粒尺寸的转基因粉状物中，使用两种提取液(1)醋酸钠缓冲液和(2)碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液所回收的植酸酶活性。两种提取都在23℃下进行1小时。在第二次提取之前，96mL的提取缓冲液被加入到初次提取物之中。
如图6所示，使用两种缓冲液从大尺寸颗粒(2.8-3.35mm)中初次提取所回收的植酸酶活性比从第二次提取所获得的最大活性要低。例如，大尺寸颗粒使用碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(2)进行初次提取仅仅能达到第二次提取所回收的最大酶活性的24％。从中等尺寸颗粒(1.7-2.36mm)中回收的植酸酶要少于第二次提取所回收的最大活性的35％。通过额外的提取缓冲液和额外的提取时间，缓冲液1和缓冲液2分别从大尺寸颗粒中回收植酸酶活性的55％和83％；且从中等尺寸颗粒中回收植酸酶活性的69％和93％。结果显示，碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液从含有酶的小尺寸颗粒中回收植酸酶的效率更高。
实施例7.含有吐温 的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液能够促进从饲料中回收植酸酶
为了进一步提高植酸酶的提取效率，在碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中添加了吐温进行检测。
图7显示了使用碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(1)，含有0.01％吐温的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(2)和含有0.01％吐温的硼酸钠缓冲液(3)从配制有1000FTU/kg和3000FTU/kg植酸酶的饲料中回收的植酸酶活性。如图7所述，相比于含有吐温的硼酸钠缓冲液(3)，碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(1)可以从配制有3000FTU/kg植酸酶的饲料中回收更多的植酸酶。碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(1)与硼酸钠缓冲液(3)从低植酸酶含量(如1000FTU/kg)的饲料中回收植酸酶活性的效率相同。相比于硼酸钠缓冲液(3)的提取，添加吐温的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(2)能够从低植酸酶含量的饲料中获得更高的植酸酶提取效率。
实施例8.植酸酶活性在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中是稳定的
由于可以使饲料中的酶均匀化，并且在温度可能超过85℃的造粒过程中防止酶活性的丧失，造粒后应用液体酶是有利的。
提取之后，植酸酶提取物被储存在蛋白提取缓冲液中，在4℃下保存一段时间，然后酶活性被检测。图8显示了储存在包含或不包含吐温的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液或含有吐温的硼酸钠缓冲液中1小时(黑柱)、7天(斜线条纹柱)、14天(横条纹柱)和29天(灰柱)的植酸酶活性的稳定性。图8中，(1)对应pH10的30mM碳酸钠/碳酸氢钠；(2)对应pH10.8、含0.01％吐温20的30mM碳酸钠/碳酸氢钠；(3)对应pH10.0、含0.01％吐温20的25mM硼酸钠。如图8所示，在这些缓冲液中储存7天后植酸酶活性没有丧失。结果还显示，在任何缓冲液中储存21天后，大约有12％到23％活性的丧失。
因此，能够理解的是本发明并不局限于所公开的特定实施方式，而是意图覆盖本发明精神和范围内的全部变化方案，本发明的精神和范围由随附的权利要求书和上述说明书所限定和/或由附图示出。

Claims (31)

1.一种测定动物饲料中植酸酶活性的方法，该方法包括：
将一定量的动物饲料与碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液混合以获得混合物，其中，动物饲料包含植酸酶，并且碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包含浓度范围从10mM到500mM的碳酸钠和浓度范围从10mM到500mM的碳酸氢钠；
从混合物中提取植酸酶，以及
测定提取的植酸酶的活性。
2.根据权利要求1所述的方法还包括在混合步骤前将动物饲料研磨成粉状物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，粉状物含有尺寸范围在250μm到6000μm之间的颗粒。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，尺寸至少是250μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的pH是10.00或者更大。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液还含有非离子去垢剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，动物饲料的量在100g到500g之间的范围内。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，混合物的温度在20℃到80℃范围内。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，植酸酶是由基因工程宿主产生的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，宿主选自植物细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞及酵母细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，植酸酶是大肠杆菌植酸酶。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，植酸酶活性的测定是在20℃到80℃之间的温度范围内进行的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，温度是37℃。
14.一种提取饲料酶的方法，该方法包括：
将一定量的动物饲料与碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液混合以获得混合物，其中，动物饲料包含饲料酶，并且碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包含浓度范围从10mM到500mM的碳酸钠和浓度范围从10mM到500mM的碳酸氢钠；以及
从混合物中提取饲料酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的pH是10.00或者更大。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液还含有非离子去垢剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，非离子去垢剂是聚山梨酯。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，聚山梨酯的浓度在0.001％(v/v)到1.0％(v/v)的范围内。
19.根据权利要求14所述的方法，其中，混合物包含以小于或等于选自由以下组成的组中的一个比例存在的动物饲料和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液：1:5(w/v)、1:10(w/v)、1:20(w/v)、1:50(w/v)、1:60(w/v)、1:70(w/v)、1:80(w/v)、1:90(w/v)、1:100(w/v)、1:200(w/v)、1:300(w/v)、1:400(w/v)、1:500(w/v)、1:600(w/v)、1:700(w/v)、1:800(w/v)、1:900(w/v)及1:1000(w/v)。
20.根据权利要求14所述的方法，其中，动物饲料的量在100g到500g之间的范围内。
21.根据权利要求15所述的方法还包括将动物饲料研磨成粉状物，其中，粉状物含有尺寸范围在250μm到6000μm之间的颗粒。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，尺寸至少是250μm。
23.根据权利要求14所述的方法，其中，混合物的温度在20℃到80℃范围内。
24.根据权利要求14所述的方法，其中，温度是50℃。
25.根据权利要求14所述的方法，还包括测定饲料酶的活性。
26.根据权利要求14所述的方法，其中，饲料酶是由基因工程宿主产生的。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，宿主选自植物细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞及酵母细胞。
28.根据权利要求14所述的方法，其中，饲料酶选自包括植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、淀粉酶、蛋白酶、甘露糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、木糖苷酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、酯酶或纤维素酶的组中。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，植酸酶是大肠杆菌植酸酶。
30.根据权利要求25所述的方法，其中，测定步骤是在30℃到80℃之间的温度范围内进行的。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，温度是37℃。
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