CN107709564A - 来自少花龙葵的抗晚疫病基因及使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于增强植物对由疫霉种导致的植物病害的抗性的组合物和方法。所述组合物包含编码抗性(R)基因产物及其变体的核酸分子以及含有这类核酸分子的植物、种子和植物细胞。用于增强植物对由疫霉种导致的植物病害的抗性的所述方法包括将编码R基因产物的核酸分子引入植物细胞中。另外提供的是在农业中使用所述植物抑制植物病害的方法。

Description

来自少花龙葵的抗晚疫病基因及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求保护2015年5月9日提交的美国临时专利申请号62/159,240的权益，所述申请案在此通过引用以其整体结合到本文中。

对提交为文本文件的序列表的引用

所述序列表的正式文本经由EFS-Web以电子方式提交为ASCII格式的序列表，文件命名为070294-0095.TXT，创建于2016年4月22日，以及具有27.4千字节的大小，且与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式文档中的所述序列表为本说明书的部分，且通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及基因分离和植物改良的领域，具体而言涉及通过使用抗病基因来增强植物对植物病害的抗性。

发明背景

由卵菌纲病原体致病疫霉(Phytophthora infestans)导致的晚疫病，为马铃薯(Solanum tuberosum)栽培种和番茄(Solanum lycopersicum)栽培种的毁灭性病害，导致每年数十亿美元的损失(Jones(2014)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.369:20130087-20130087)。预计的是，仅在欧洲，在马铃薯生产上的晚疫病花费就超过10亿欧元，包括控制成本以及由所述病原体导致的损害的成本(Haverkort(2008)Potato Res.51:47-57)。

植物育种者通常每次从野生近缘种引入一个Rpi(即抗致病疫霉)基因到马铃薯栽培种中。然而，该过程费力且缓慢，以及到目前为止，产生的Rpi基因被新的致病疫霉(P.infestans)生理小种克服，与繁殖包含Rpi基因的新的马铃薯变种耗费的时间相比，新的致病疫霉生理小种克服该生理小种Rpi基因的时间更短(Jones等2014)。一种转基因方法允许同时引入数个基因(种基因叠加”因，得到更持久的抗性。虽然已报道赋予抗晚疫病抗性的数个主要基因，但因致病疫霉快速进化所致，仍需要克隆另外的Rpi基因。

已克隆的Rpi基因及其功能等位基因包括例如：来自落果薯(Solanum demissum)的Rpi-blb1/RB(van der Vossen等(2003)Plant J.36:867-882；Song等(2003)PNAS 100:9128-9133)及分别来自匍枝薯(S.stoloniferum)和S.papita的其同系物Rpi-sto1和Rpi-pta1(Vleeshouwers等(2008)PLOS ONE3:e2875)；来自落果薯落果薯的Rpi-blb2(van derVossen EA等(2005)Plant J.44:208-222)；来自球栗薯(S.bulbocastanum)的Rpi-blb3及其同系物Rpi-abpt和R2-like以及来自落果薯的R2(Lokossou等，(2009)MPMI 22:630-641)以及分别来自S.edinense、S.schenckii和S.hjertingii的另外的同系物Rpi-edn1.1、Rpi-edn1.2、Rpi-snk1.1、Rpi-snk1.2和Rpi-hjt1.1至Rpi-hjt1.3，其通过Champouret((2010)“Functional genomics of Phytophthora infestans effectors and Solanumresistance genes(致病疫霉效应子和茄属(Solanum)抗性基因的功能基因组学)，”博士学位论文，Wageningen Univ.，Wageningen)描述；来自落果薯的Rpi-bt1(Oosumi等(2009)Amer.J.Potato Res.86:456-465)；来自落果薯的R1(Ballvora等(2002)Plant J.30:361-71)；来自落果薯的R3a和R3b(分别为Huang等(2005)Plant J.42:261-271；Li等(2011)MPMI24:1132-1142)；来自S.venturii的Rpi-vnt1.1、Rpi-vnt1.2、Rpi-vnt1.3(Foster等(2009)MPMI 22:589-600；Pel等(2009)MPMI 22:601-615；WO2009013468)；来自S.mochiquense的Rpi-mcq1(WO2009013468)；来自S.chacoense的Rpi-chc(WO2011034433)和来自S.pimpinellifolium的Ph-3(Zhang等(2014)Theor.Appl.Genet.127:1353-1364)。

对于致病疫霉感染而言，龙葵(Solanum nigrum)及近缘种一般被认为是非寄主。其在实验室条件下不受感染，且在野外也非常罕见地观察到感染(Lebecka(2009)Eur.J.Plant Pathol.124:345-348)。然而，有龙葵(S.nigrum)对致病疫霉感染的易感性的一篇报道，以及在将感病品系与抗病品系杂交且F1自交产生F2子代时的抗性的孟德尔式分离的一篇报道(Lebecka(2008)Eur.J.Plant Pathol.120:233-240；Lebecka(2009)Eur.J.Plant Pathol.124:345-348)。在强病原体压力下的所述抗性表明，存在于龙葵中的抗性基因可能具有独特的功效和识别特异性，使得对其进行克隆和表征为有价值的。龙葵为复合多倍体来源的六倍体植物，这使得传统的图位克隆费力且耗时。为克服这些限制，我们在少花龙葵(S.americanum，龙葵的假定的二倍体祖先)的品系(accession)中研究了对致病疫霉的抗性和易感性(Poczai和Hyvonen(2010)Mol.Biol.Rep.38:1171-1185)。少花龙葵为在全世界范围内生长的草本有花植物，很可能起源于美洲的亚热带地区。

尽管传统的图位克隆法已用于从植物中分离抗性(R)基因，但许多植物基因组携带大型染色体区段，其因重组受阻抑而不能进行传统的图位克隆(Gaut等(2007)NatureRev.Genet.8:77-84)，且茄科植物也不例外。因此，需要应用不依赖于重组的新方法来从茄科植物栽培种及其在茄科(Solanaceae)家族的未驯化近缘种中快速鉴定另外的Rpi基因。

发明概述

本发明提供关于抗性(R)基因的核酸分子，其能够赋予植物(具体而言茄科植物)对已知在所述植物中导致植物病害的疫霉(Phytophthora)种(sp.)的至少一个生理小种的抗性。在一个实施方案中，本发明提供包含R基因(其在本文中称为Rpi-amr3i)及其变体的核酸分子，所述变体包括例如直向同源变体和非天然存在的变体。

本发明进一步提供在其基因组中包含一个或多个本发明的多核苷酸构建体的植物、植物细胞和种子。所述多核苷酸构建体包含编码本发明的抗性(R)蛋白的核苷酸序列。所述R蛋白通过本发明的R基因编码。在一个优选的实施方案中，所述植物和种子为已使用一个或多个本发明的多核苷酸构建体转化的转基因茄科植物和种子。优选的是，与不含所述多核苷酸构建体的对照植物的抗性相比，所述茄科植物包含对已知在茄科植物中导致植物病害的疫霉种的至少一个生理小种的增强的抗性。本发明的茄科植物包括但不限于驯化的茄科植物，包括例如驯化的各种马铃薯和番茄。

本发明提供用于增强植物(具体而言茄科植物)对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性的方法。所述方法包括将包含本发明的R基因的核苷酸序列的多核苷酸构建体引入至少一个植物细胞中。优选的是，所述多核苷酸构建体或其部分稳定并入所述植物细胞的基因组中。所述方法可任选进一步包括使所述植物细胞再生成在其基因组中包含所述多核苷酸构建体的植物。优选的是，相对于不含所述多核苷酸构建体的对照植物，所述植物包含对由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性。更优选的是，相对于不含所述多核苷酸构建体的对照植物，所述植物包含对由疫霉种的至少两个、三个、四个、五个或更多个生理小种导致的植物病害的增强的抗性。

本发明另外提供用于鉴定这样的茄科植物的方法，所述茄科植物显示对由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的新赋予的抗性或增强的抗性。所述方法包括在所述茄科植物中检测所述R基因Rpi-amr3i的存在。

亦提供了在农作物生产中使用本发明的植物来抑制由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的方法。所述方法包括种植本发明的植物(例如幼苗)、块茎或种子，其中所述植物、块茎或种子包含本发明的至少一个R基因核苷酸序列。所述方法进一步包括使植物在对所述植物的生长和发育有利的条件下生长，并任选从所述植物收获至少一个果实、块茎、叶子或种子。

另外提供的是包含本发明的一个或多个核酸分子的植物、植物部分、种子、植物细胞、其他宿主细胞、表达盒和载体。

附图说明

图1为显示在离体叶子测定中受致病疫霉感染的各种少花龙葵品系的表型的摄影图。用致病疫霉生理小种88069感染十周龄少花龙葵植株。从上至下：仅品系954750186易感所有测试的生理小种，而品系954750174、954750184和944750095保持为完全抗病的。用含1,000个孢子的6-8滴液滴接种各叶子；在接种后(dpi)7天获取照片。

图2为基于DM参照基因组的基因座R2/Rpi-blb3、C17和C18的物理连锁图。a)部分：集团分离分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)联合RenSeq使得能够在Ch4的约5.1Mb(3.6-8.7Mb)间距上定位Rpi-amr3。使用来源于全基因组鸟枪法测序(WGS)数据的标记对50个F2和F3感病株进行基因分型，得到两个侧翼标记(3.59Mb处的R2l_1_4和8.69Mb处的R2l_2_4)，和另外八个“与抗性共分离的”性共分离标记)。NLR基因和标记的物理位置以Mb给出，且基于参照的双单倍体(doubled monohaploid，DM)马铃薯基因组。以‘铃薯开头的标记为RenSeq标记，而以‘记nSe开头的标记为WGS标记。黑色实心条标示NLR基因簇。b)部分：来自回交群体(BC₁F₂)的405株植物的基因分型和表型分型证实了DM的物理图谱上的6.61Mb处的标记R2l_2_5和7.99Mb处的标记R2l_1_11之间的C18基因座(在参照DM基因组中有10个NLR)上的Rpi-amr3的位置。c)部分：来自PacBio-RenSeq的从头组装与C18DM基因座的比对得到14个全长C18旁系同源Rpi-amr3候选基因。

图3为显示候选Rpi-amr3i在本氏烟(N.benthamiana)叶子的瞬时互补测定中赋予抗致病疫霉抗性的摄影图。使用过表达R2(阳性对照)、Rpi-amr3候选基因或GFP(阴性对照)的载体pICSLUS0003::35S浸润本氏烟植株的三片叶子，并在24小时后接种致病疫霉生理小种88069。对于R2和Rpi-amr3i，未观察到致病疫霉生长(图示)，而在所有其他Rpi-amr3候选基因和GFP对照的浸润部位，仍有致病疫霉。所述图片显示Rpi-amr3a，作为对所有其他候选基因观察到的表型的一个实例。在6dpi获取所述照片。

图4为显示具有Rpi-amr3i的基因组构建体在本氏烟叶子的瞬时互补测定中赋予抗致病疫霉抗性的摄影图。在使用所述Rpi-amr3基因组构建体(天然启动子和终止子)的瞬时互补测定中，Rpi-amr3将致病疫霉的生长限制为如同在35S启动子下的水平。将过表达GFP的载体用作阴性对照。所述实验如前所述进行。在6dpi之后获取所述照片。

图5为在35S启动子控制下的携带Rpi-amr3的稳定转基因马铃薯植株的叶子表现出对多个致病疫霉生理小种的抗性的摄影图。表达35S::Rpi-amr3的二倍体马铃薯品系26的转化株(由Pim Lindhout，索林塔(Solynta)友情提供)抗致病疫霉生理小种88069(右上)、3926_A(右中)和EC3527(右下)。所述转基因品系在接种部位未显示症状或显示弱HR。所述非转基因对照(左)显示大量坏死斑和孢子形成。各叶子均用含1,000个孢子的液滴接种；在6dpi获取照片。

图6为在天然调控元件控制下的携带Rpi-amr3的稳定转基因马铃薯植株(品系索林塔26)的叶子表现出对致病疫霉生理小种88069的抗性的摄影图。在天然调控元件下表达Rpi-amr3i的转基因二倍体马铃薯“品系26薯因索林塔有限公司)抗致病疫霉隔离群88069(上)。所述转基因品系在接种部位显示无HR至弱HR。相比之下，携带非功能性候选基因(Rpi-amr3a，下)的对照植物显示大量坏死斑和孢子形成。各叶子均用含500个游动孢子的液滴接种；在6dpi获取照片。

图7为在天然调控元件控制下的携带Rpi-amr3的稳定转基因马铃薯植株(栽培种玛丽斯派珀(Maris Piper))的叶子表现出对多个致病疫霉生理小种的抗性的摄影图。在天然调控元件下表达Rpi-amr3i的转基因四倍体马铃薯玛丽斯派珀抗致病疫霉隔离群88069(左)。所述转基因品系在接种部位显示无HR至弱HR。相比之下，所述对照野生型玛丽斯派珀植株显示大量坏死斑和孢子形成。各叶子均用含500个游动孢子的液滴接种；在6dpi获取照片。

序列表

在随附序列表中列举的核苷酸和氨基酸序列，使用用于核苷酸碱基的标准字母缩写以及用于氨基酸的三字母密码来显示。所述核苷酸序列遵循从所述序列的5’端开始并朝3’端前进(即在各行从左往右)的标准惯例。尽管只显示了各核苷酸序列的一条链，但将所述互补链理解为通过任意参考所显示的链而包含在内。所述氨基酸序列遵循从所述序列的氨基端开始并朝羧基端前进(即在各行从左往右)的标准惯例。

SEQ ID NO:1描述所述R基因(Rpi-amr3i)的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2描述Rpi-amr3i(通过Rpi-amr3i编码的R蛋白)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3描述所述Rpi-amr3i cDNA的编码区的核苷酸序列。需要时，可将终止密码子(例如TAA、TAG、TGA)与包含SEQ ID NO:3的核酸分子的3’端可操作连接。

具体实施方式

现在将根据附图在下文中更充分地阐述本发明，其中显示了本发明的某些但并非所有的实施方案。事实上，本发明可以许多不同的形式实施且不应理解为限于本文所述的实施方案；更确切地说，提供这些实施方案以使本公开内容将满足适用的法律要求。同样的数字始终指示同样的要素。

本发明所属领域的技术人员将想到本文所述的本发明的许多修改及其他实施方案，其得益于在上文描述和附图中呈现的教导。因此，要理解的是，本发明不限于所公开的具体实施方案，且意图修改及其他实施方案包含在随附权利要求的范围内。尽管在本文中使用了特定术语，但其仅以通用和描述性的意义使用，且不以限制为目的。

本发明涉及一种植物抗性(R)基因的分离，具体而言涉及赋予茄科植物对由致病疫霉的多个生理小种导致的晚疫病的抗性的R基因的分离。如在下文中所公开的，所述R基因(在本文中称为Rpi-amr3i)分离自少花龙葵(马铃薯的二倍体非块茎近缘种)。使用先前已阐述的包括R基因序列捕获(RenSeq)连同长读段测序的方法从少花龙葵中分离Rpi-amr3i(Eid等(2008)Science 323:133-138；Sharon等(2013)Nat.Biotechnol.31:1009-14；二者均通过引用结合到本文中)。

本发明提供包含R基因的核苷酸序列的核酸分子，具体而言包含Rpi-amr3i及其天然存在的变体(例如直向同源变体和等位基因变体)和合成的或人工的(即非天然存在的)变体的核苷酸序列的核酸分子。所述R基因的核苷酸序列，其在本文中亦称为R基因核苷酸序列，编码R蛋白。本发明的R基因核苷酸序列包括但不限于包含天然启动子及含编码区的3’相邻区的野生型R基因、cDNA序列和仅包含编码区的核苷酸序列。所述R基因核苷酸序列的实例包括在SEQ ID NO:1和SEQ NO:3中所述的核苷酸序列及其变体。在其中未使用天然R基因启动子来驱动编码所述R蛋白的核苷酸序列表达的实施方案中，可将异源启动子与编码本发明的R蛋白的核苷酸序列可操作连接，来驱动编码R蛋白的核苷酸序列在植物中表达。

优选的是，本发明的R蛋白为这样的功能性R蛋白，其能够赋予包含所述R蛋白的植物(具体而言茄科植物)对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性。在某些优选的实施方案中，本发明的R蛋白包含对致病疫霉的多个生理小种的广谱抗性，例如通过Rpi-amr3i编码的R蛋白Rpi-amr3i。

本发明进一步提供包含这样的多核苷酸构建体的转基因植物，所述多核苷酸构建体包含本发明的R基因核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体稳定并入所述植物的基因组中，以及在其他实施方案中，所述植物通过瞬时转化法进行转化且所述多核苷酸构建体未稳定并入所述植物的基因组中。用于植物的稳定转化和瞬时转化二者的方法在本文别处公开，或者在本领域中以其他方式得知。在本发明的一个优选的实施方案中，所述转基因植物为包含对由致病疫霉的至少一个生理小种导致的晚疫病的增强的抗性的稳定转化的马铃薯或番茄植株。在本发明的一个更优选的实施方案中，所述转基因植物为包含对由致病疫霉的至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个生理小种导致的晚疫病的增强的抗性的稳定转化的马铃薯或番茄植株。

在某些实施方案中，本发明的转基因植物包含这样的多核苷酸构建体，其包含编码R蛋白的核苷酸序列和可操作连接以表达所述编码R蛋白的核苷酸序列的异源启动子。异源启动子选择可取决于许多因素，例如所需的时间安排、定位和表达模式，以及对特定生物刺激物或非生物刺激物的反应性。目标启动子包括但不限于病原体诱导型启动子、组成型启动子、组织优选启动子、创伤诱导型启动子和化学调节启动子。

在本发明的某些实施方案中，所述转基因植物(具体而言转基因茄科植物)可包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个编码R蛋白的核苷酸序列。通常但并非必要的是，所述两个或更多个R蛋白将彼此不同。对于本发明而言，当两个R蛋白不具有相同的氨基酸序列时，所述R蛋白与另一个R蛋白不同。在本发明的某些实施方案中，用于抵抗由疫霉种导致的植物病害的不同的R蛋白各自具有在抗性特征上的一个或多个差异，例如对相同疫霉种的一个不同的生理小种和/或一组不同的生理小种乃至于不同疫霉种的抗性。认为的是，通过将两个、三个、四个、五个、六个或更多个多核苷酸序列组合，各核苷酸序列编码用于抵抗疫霉种的不同生理小种或多个疫霉种(spp.)的不同的R蛋白，可产生包含抗单个疫霉种的多个生理小种乃至于抗多个疫霉种的广谱抗性的茄科植物。所述茄科植物(具体而言马铃薯或番茄植株)在疫霉种的多个生理小种(例如致病疫霉的多个生理小种)盛行的地区的农业中得到应用。

可在单个马铃薯植株中与本发明的Rpi-amr3i核苷酸序列组合的R基因的实例包括但不限于以下克隆的Rpi基因：Rpi-blb1(亦称为“RB”；登录号FB764493.1和AY336128.1)、Rpi-sto1(登录号EU884421)、Rpi-pta1(登录号EU884422)、Rpi-blb2(登录号DQ122125)、Rpi-blb3(登录号FJ536326)、Rpi-abpt(登录号FJ536324)、R2-like(登录号FJ536323)、R2(登录号FJ536325)、Rpi-edn1.1(登录号GU563963)、Rpi-edn1.2、Rpi-snk1.1、Rpi-snk1.2、Rpi-hjt1.1至Rpi-hjt1.3(登录号GU563971-3)、Rpi-bt1(登录号FJ188415)、R1(登录号AF447489)、R3a(登录号AY849382)、R3b(登录号JF900492)、Rpi-vnt1.1(登录号FJ423044)、Rpi-vnt1.2(登录号FJ423045)、Rpi-vnt1.3(登录号FJ423046)、Rpi-mcq1(登录号GN043561)、Rpi-chc和Ph-3(登录号KJ563933)。对应于上文所列举的基因的登录号的核苷酸序列或者在本文别处公开的任何基因或蛋白质的核苷酸序列，可获自可公开访问的在线核苷酸和氨基酸序列数据库，例如GenBank和EMBL数据库(分别可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/genbank和ebi.ac.uk上获得)。

可通过用包含本发明的R基因核苷酸序列(例如Rpi-amr3i核苷酸序列或其变体)的多核苷酸构建体转化已包含一个或多个其他R基因核苷酸序列的植物，来产生包含多个R基因的本发明的转基因植物。所述已包含一个或多个其他R基因核苷酸序列的植物，可包含这样的R基因，其对所述基因组或所述植物而言为天然的，其经由有性生殖引入所述植物中，或者通过用R基因核苷酸序列转化所述植物或其祖代来引入。或者，可通过例如转化或有性生殖，将所述一个或多个其他的R基因核苷酸序列引入已包含本发明的多核苷酸构建体的本发明的转基因植物中。

在其他实施方案中，可通过用包含两个或更多个R基因核苷酸序列的多核苷酸构建体或载体稳定转化植物，来将两个或更多个不同的R基因序列引入所述植物中。认为的是，所述方法对于植物育种而言可以是优选的，因为预期的是，所述两个或更多个R基因核苷酸序列将紧密连接并因此分离为单个基因座。或者，可使用在本文别处描述或在本领域中以其他方式得知的基于同源重组的基因组修饰法，将本发明的多核苷酸构建体紧邻另一个R基因核苷酸序列并入植物的基因组中。

本发明进一步提供用于增强植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性的方法。所述方法包括将本发明的多核苷酸构建体引入至少一个植物细胞中，具体而言来自茄科植物的植物细胞。在某些实施方案中，所述多核苷酸构建体稳定并入所述植物细胞的基因组中。需要时，所述方法可进一步包括将使述植物细胞再生成在其基因组中包含所述多核苷酸构建体的植物。优选的是，相对于对照植物对植物病害的抗性，所述再生植物包含对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性。需要时，所述方法可进一步包括产生如上所述包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个编码R蛋白的核苷酸序列的植物，优选各核苷酸序列编码不同的R蛋白。

本文所公开的植物在用于在农作物生产中抑制由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的方法中得到应用，特别是应用于其中所述植物病害盛行且已知其负面影响或至少可能负面影响农业产量的地区。本发明的方法包括种植本发明的植物(例如幼苗)、块茎或种子，其中所述植物、块茎或种子包含至少一个本发明的R基因核苷酸序列。所述方法进一步包括使来源于所述幼苗、块茎或种子的植物在有利于所述植物的生长和发育的条件下生长，并任选从所述植物收获至少一个果实、块茎、叶子或种子。

本发明另外提供用于鉴定这样的茄科植物的方法，所述茄科植物显示出对由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的新赋予的或增强的抗性。所述方法在繁殖用于抵抗由疫霉种导致的植物病害(例如晚疫病)的茄科植物中得到应用。所述抗性植物在用于人类或家畜消费或其他用途的果实、块茎、叶子和/或种子的农业生产中得到应用。所述方法包括在茄科植物或者在其至少一部分或细胞中检测所述R基因Rpi-amr3i的存在。在本发明的一些实施方案中，检测所述R基因的存在包括在分离自茄科植物的基因组DNA中检测整个R基因。然而，在优选的实施方案中，检测R基因的存在包括检测所述R基因内的至少一个标记的存在。在本发明的其他实施方案中，检测R基因的存在包括使用例如涉及对所述R蛋白特异的抗体的免疫学检测法，检测通过所述R基因编码的R蛋白的存在。

在用于鉴定显示出对由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的新赋予的或增强的抗性的茄科植物的方法中，在所述茄科植物中检测所述R基因的存在可包括在本文别处公开的或在本领域中以其他方式得知的下列分子生物学技术中的一种或多种，包括但不限于从所述植物中分离基因组DNA和/或RNA，通过PCR扩增来扩增包含所述R基因和/或其中标记的核酸分子，将包含所述R基因和/或标记的核酸分子测序，通过核酸杂交鉴定所述R基因、所述标记或所述R基因的转录物，以及进行免疫学测定以用于检测通过所述R基因编码的R蛋白。认为的是，可对寡核苷酸探针和PCR引物进行设计以鉴定本发明的R基因，以及可将所述探针和PCR引物用于在本文别处公开或在本领域中以其他方式得知的方法，以在植物群体中快速鉴定包含本发明的R基因的一种或多种植物。

根据所需的结果，可将本发明的多核苷酸构建体稳定并入所述植物细胞的基因组中或不将其稳定并入所述植物细胞的基因组中。例如，如果所需结果是要产生具有对由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性的稳定转化的植物，则可将所述多核苷酸构建体例如融合到适于将所述多核苷酸构建体稳定并入所述植物细胞的基因组中的植物转化载体中。通常，所述稳定转化的植物细胞将再生成在其基因组中包含所述多核苷酸构建体的转化植物。所述稳定转化的植物能够经由有性生殖和/或无性生殖将所述多核苷酸构建体传递给后代中的子代植物。对于单子叶植物和双子叶植物而言，用于使用引入的多核苷酸构建体稳定转化植物的植物转化载体、方法以及用于从转化的植物细胞和组织再生植物的方法在本领域中通常为已知的或者在本文别处描述。

在其中不需要将所述多核苷酸构建体稳定并入所述植物的基因组中的本发明的其他实施方案中，可利用瞬时转化法将所述多核苷酸构建体引入植物的一个或多个植物细胞中。所述瞬时转化法包括例如涉及使用病毒颗粒或至少病毒核酸的基于病毒的方法。一般而言，所述基于病毒的方法包括构建修饰的病毒核酸，其包含与所述病毒核酸可操作连接的本发明的多核苷酸构建体，然后使所述植物与包含所述修饰病毒核酸的修饰病毒接触，或者与所述病毒核酸或所述修饰病毒核酸本身接触。可将所述修饰病毒和/或修饰病毒核酸应用于所述植物或其部分，例如根据用于农业的常规方法，例如通过喷射、灌溉、撒粉等进行。所述修饰病毒和/或修饰病毒核酸可借助于喷射、喷雾、撒粉、散布或浇灌，以可直接喷射的溶液、散剂、混悬剂或分散体、乳剂、油分散体、糊剂、可撒粉产品、用于散布的材质或颗粒的形式应用。认为的是，在应用于所述植物或其部分之前制备包含所述修饰病毒和/或修饰病毒核酸的制剂可以是合乎需要的。用于制备农药制剂的方法在本领域中通常为已知的或在本文别处描述。

本发明提供包含R基因的核酸分子。优选的是，所述R基因能够赋予宿主植物(具体而言茄科宿主植物)对由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性。因此，所述R基因在农业生产中应用于抑制由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害。本发明的R基因包括但不限于其核苷酸序列在本文中公开的R基因，但亦包括能够赋予植物对由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性的直向同源物及其他变体。用于确定植物对由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性的方法在本领域中为已知的或在本文中以其他方式公开，包括例如在本文别处描述的利用离体的本氏烟(Nicotianabenthamiana)叶子的离体叶子测定。

本发明进一步提供包含Rpi-amr3i的植物及其细胞，具体而言茄科植物及其细胞，其通过不涉及将重组DNA引入所述植物或其细胞中的方法来产生。所述方法可包括例如涉及两个或更多个不同植物物种的种间杂交。在某些实施方案中，所述茄科植物为除少花龙葵植株之外的任何茄科植物。在其他实施方案中，所述茄科植物为包含具有在SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列的Rpi-amr3i的除少花龙葵植株之外的任何茄科植物。

另外提供的是用于将Rpi-amr3i引入在其基因组中不含Rpi-amr3i(SEQ ID NO:1)的茄科植物中的方法。所述方法包括使在其基因组中包含Rpi-amr3i的至少一个拷贝的第一茄科植物与在其基因组中不含Rpi-amr3i的第二茄科植物杂交(即异花传粉)。所述第一和第二茄科植物可以是相同的茄科物种或者可以是不同的茄科物种。例如，所述第一茄科植物可以是少花龙葵，而所述第二茄科植物可以是马铃薯或番茄。植物的第一物种与植物的第二物种的所述杂交被称为种间杂交，且可用于将来自一个物种的目标基因(例如Rpi-amr3i)基因渗入不含所述目标基因的近缘种中，以及通常包括用所述近缘种对子代的多代回交和在包含所述目标基因的子代的各代进行选择。所述种间杂交、基因渗入和回交法在本领域中为众所周知的且可用于本发明的方法中。参见“Principals of CultivarDevelopment(栽培种发育原理)，”Fehr，1993，Macmillan Publishing Company，New York；和“Funda mentals of Plant Genetics and Breeding(植物遗传学及育种基本原理)，”物遗传学及，1981，John Wiley&Sons，Inc.，New York。

在用于将Rpi-amr3i引入在其基因组中不含Rpi-amr3i的茄科植物的本发明的方法中，要么所述第一茄科植物要么所述第二茄科植物为花粉供体植物。例如，如果所述第一茄科植物为花粉供体植物，则所述第二茄科植物为花粉受体植物。同样，如果所述第二茄科植物为花粉供体植物，则所述第一茄科植物为花粉受体植物。杂交之后，使所述花粉受体植物在有利于所述植物的生长和发育的条件下生长，并生长达到足以使种子成熟的时间或者生长至达到用于后续体外萌发操作(例如下文所述的胚胎拯救)的另外的所需生长阶段。然后可收获种子并通过本领域中已知的任何方法鉴定所述包含Rpi-amr3i的种子，所述方法包括例如在本文别处描述的用于鉴定显示出对由疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的新赋予的或增强的抗性的茄科植物的方法。在某些实施方案中，所述第一茄科植物为包含Rpi-amr3i的少花龙葵植株，而所述第二植物为不含Rpi-amr3i的少花龙葵植株。在优选的实施方案中，所述第一茄科植物为包含Rpi-amr3i的少花龙葵植株或者在其基因组中包含Rpi-amr3i的其他茄科植物物种，而所述第二茄科植物为除少花龙葵之外的茄科植物物种。优选的茄科植物为马铃薯、番茄、茄子、辣椒、烟草和矮牵牛。

然而认为的是，在涉及种间杂交的本发明的某些实施方案中，在未成熟的生长阶段收获从所述种间杂交得到的种子并随后使所述未成熟种子在培养基中萌发(即在体外)可以是有利的，其中使用在本领域中称为“胚胎拯救”法的方法使所述种子在培养基中萌发。参见Reed(2005)“Embryo Rescue(胚胎拯救)，”Plant Development andBiotechnology(植物发育及生物技术)，Trigiano和Gray编辑(PDF).CRC Press，BocaRaton，第235-239页；和Sharma等(1996)Euphytica 89:325-337。另外认为的是，“当通过种间杂交产生的成熟种子显示极少萌发或不萌发时，其中产生极少或未产生种间杂交植物时，通常使用胚胎拯救法。

本发明的方法应用于产生具有对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性的植物。通常，当与对照植物对疫霉种的相同生理小种的抗性进行比较时，本发明的方法将使所述主题植物对所述植物病害的抗性增强或增加至少25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、500％或更多。除非另有说明或从用例文段中显而易见，否则用于本发明的对照植物为不包含本发明的多核苷酸构建体的植物。优选的是，除所述对照不含所述多核苷酸构建体之外，所述对照植物与包含本发明的多核苷酸构建体的植物基本相同(例如，相同的种、亚种和变种)。在一些实施方案中，所述对照将包含多核苷酸构建体，但不包含存在于本发明的多核苷酸构建体中的所述一个或多个R基因序列。

另外，本发明提供通过本发明的方法产生的和/或包含本发明的多核苷酸构建体的转化植物、种子和植物细胞。亦提供的是包含本发明的多核苷酸构建体的子代植物及其种子。本发明亦提供通过本发明的转化植物和/或子代植物产生的果实、种子、块茎、叶、茎、根及其他植物部分，以及包含所述植物或其任何部分、或者产生或来源于所述植物或其任何部分的食物产品及其他农产品，其任何部分包括但不限于果实、块茎、叶、茎、根和种子。其他农产品包括例如自烟叶生产的烟产品(例如卷烟、雪茄以及烟斗烟草和嚼用烟草)以及自马铃薯块茎生产的食用淀粉和工业淀粉产品。认为的是，所述食物产品可被人类及其他动物消费或使用，所述其他动物包括但不限于宠物(例如狗和猫)、家畜(例如猪、奶牛、鸡、火鸡和鸭)以及在淡水和海水养殖系统中产生的动物(例如鱼、虾、对虾、鳌虾和龙虾)。

本发明的组合物和方法的非限制性实例如下：

1.一种核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列：

(a)在SEQ ID NO:1中描述的核苷酸序列；

(b)编码在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的核苷酸序列，以及任选其中所述核苷酸序列不为天然存在的；

(c)在SEQ ID NO:3中描述的核苷酸序列；

(d)与在SEQ ID NO:1和3中所述的核苷酸序列中的至少一个具有至少90％序列一致性的核苷酸序列，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种(Phytophthora sp)的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性，且任选其中所述核苷酸序列不为天然存在的；和

(e)包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列与在SEQID NO:2中所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性，且任选其中所述核苷酸序列不为天然存在的。

2.实施方案1的核酸分子，其中所述核酸分子为分离的核酸分子。

3.一种表达盒，其包含实施方案1或2的核酸分子和可操作连接的异源启动子。

4.一种载体，其包含实施方案1或2的核酸分子或者实施方案3的表达盒。

5.实施方案4的载体，其进一步包含另外的R基因。

6.一种宿主细胞，其转化有实施方案1或2的核酸分子、实施方案3的表达盒或者实施方案4或5的载体。

7.实施方案6的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞、细菌、真菌细胞或动物细胞。

8.实施方案6或7的宿主细胞，其中所述宿主细胞为茄科植物细胞。

9.一种植物或植物细胞，其包含实施方案1或2的核酸分子、实施方案3的表达盒或者实施方案4或5的载体。

10.实施方案9的植物或植物细胞，其中所述植物为茄科植物且所述植物细胞为茄科植物细胞。

11.实施方案10的植物，其中所述茄科植物不为少花龙葵且所述茄科植物选自马铃薯、番茄、茄子、辣椒、烟草和矮牵牛。

12.一种转基因植物，其包含稳定并入其基因组中的多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含选自以下的核苷酸序列：

(a)在SEQ ID NO:1中描述的核苷酸序列；

(b)编码在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)在SEQ ID NO:3中描述的核苷酸序列；

(d)与在SEQ ID NO:1和3中所述的核苷酸序列中的至少一个具有至少90％序列一致性的核苷酸序列，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性；和

(e)包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列与在SEQID NO:2中所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性。

13.实施方案12的转基因植物，其中所述多核苷酸构建体包含(b)-(e)中任一项的核苷酸序列且另外包含可操作连接的、用于在植物中表达所述核苷酸序列的启动子。

14.实施方案13的转基因植物，其中所述启动子选自病原体诱导型启动子、组成型启动子、组织优选启动子、创伤诱导型启动子和化学调节启动子。

15.实施方案12-14中任一项的实施方案的转基因植物，其中所述转基因植物为茄科植物。

16.实施方案12-15中任一项的实施方案的转基因植物，其中所述茄科植物选自马铃薯、番茄、茄子、辣椒、烟草和矮牵牛。

17.实施方案12-16中任一项的转基因植物，其中相对于对照植物，所述转基因植物包含对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性。

18.实施方案17的转基因植物，其中相对于对照植物，所述转基因植物包含对由致病疫霉(Phytophthora infestans)的至少一个生理小种导致的晚疫病的增强的抗性。

19.实施方案12-18中任一项的转基因植物，其中所述转基因植物为马铃薯或番茄植株。

20.一种用于增强植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性的方法，所述方法包括将多核苷酸构建体引入至少一个植物细胞中，所述多核苷酸构建体包含选自以下的核苷酸序列：

(a)在SEQ ID NO:1中描述的核苷酸序列；

(b)编码在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)在SEQ ID NO:3中描述的核苷酸序列；

(d)与在SEQ ID NO:1和3中所述的核苷酸序列中的至少一个具有至少90％序列一致性的核苷酸序列，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性；和

(e)包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列与在SEQID NO:2中所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性。

21.实施方案20的方法，其中所述多核苷酸构建体稳定并入所述植物细胞的基因组中。

22.实施方案20或21的方法，其中使所述植物细胞再生成在其基因组中包含所述多核苷酸构建体的植物。

23.实施方案20-22中任一项的方法，其中所述多核苷酸构建体包含(b)-(e)中任一项的核苷酸序列且另外包含可操作连接的用于在植物中表达所述核苷酸序列的启动子。

24.实施方案23的方法，其中所述启动子选自病原体诱导型启动子、组成型启动子、组织优选启动子、创伤诱导型启动子和化学调节启动子。

25.实施方案20-24中任一项的方法，其中相对于对照植物，包含所述多核苷酸构建体的植物包含对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性。

26.实施方案25的方法，其中相对于对照植物，所述植物包含对由致病疫霉的至少一个生理小种导致的晚疫病的增强的抗性。

27.实施方案20-26中任一项的方法，其中所述植物为马铃薯或番茄植株。

28.一种植物，其通过实施方案20-27中任一项的方法产生。

29.实施方案9-19和28中任一项的植物的果实、块茎、叶子或种子，其中所述果实、块茎、叶子或种子包含所述多核苷酸构建体。

30.一种在农作物生产中抑制由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的方法，所述方法包括种植实施方案9-19和28中任一项的植物的幼苗、块茎或种子，并使所述幼苗、块茎或种子在有利于自其得到的植物的生长和发育的条件下生长，其中所述幼苗、块茎或种子包含所述核酸分子、表达盒、载体或多核苷酸构建体。

31.实施方案30的方法，其进一步包括从所述植物收获至少一个果实、块茎、叶子和/或种子。

32.实施方案9-19、28、29和41-45中任一项的植物、块茎或种子在农业中的用途。

33.一种人类或动物食物产品，其包含实施方案9-19、28、29和41-45中任一项的植物、果实、块茎、叶子和/或种子或使用所述植物、果实、块茎、叶子和/或种子生产。

34.一种多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

(a)通过在SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

(b)在SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列；

(c)通过在SEQ ID NO:3中所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；和

(d)与在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列，其中包含所述氨基酸序列的多肽能够赋予包含所述多肽的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性。

35.一种用于鉴定显示出对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害具有新赋予的或增强的抗性的茄科植物的方法，所述方法包括检测所述植物中或其至少一个部分或细胞中的Rpi-amr3i的存在。

36.实施方案35的方法，其中所述植物病害为由致病疫霉的至少一个生理小种导致的晚疫病。

37.实施方案35或36的方法，其中所述茄科植物为马铃薯或番茄植株。

38.实施方案35-37中任一项的方法，其中通过检测Rpi-amr3i内的至少一个标记来检测Rpi-amr3i的存在。

39.实施方案35-38中任一项的方法，其中Rpi-amr3i包含在SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列或由SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列组成。

40.实施方案35-39中任一项的方法，其中检测Rpi-amr3i的存在包括选自以下的成员：PCR扩增、核酸测序、核酸杂交和用于检测通过Rpi-amr3i编码的R蛋白的免疫学测定。

41.通过实施方案35-40中任一项的过程鉴定的茄科植物。

42.实施方案40的茄科植物，其中所述茄科植物不为少花龙葵。

43.实施方案41或42的茄科植物的种子。

44.一种包含Rpi-amr3i的植物或植物细胞，其中所述植物不为少花龙葵植株且其中所述植物细胞不为少花龙葵植物细胞。

45.实施方案44的植物或植物细胞，其中所述植物为茄科植物且所述植物细胞为茄科植物细胞。

本发明的方法和组合物的另外的实施方案，在本文别处进行描述。

本发明的优选植物为茄科植物。如在本文中所使用的，术语“茄科植物”是指其为茄科家族的成员的植物。所述茄科植物包括例如茄科家族的驯化成员和非驯化成员。本发明的茄科植物包括但不限于马铃薯(Solanum tuberosum)、茄子(Solanum melongena)、矮牵牛(矮牵牛属(Petunia spp.)，例如Petunia x hybrida或Petunia hybrida)、酸浆属(Physalis sp.)、木本茄属植物(欧白英(Solanum dulcamara))、园艺越橘类植物(木龙葵(Solanum scabrum))、gboma茄子(Solanum macrocarpon)、辣椒(辣椒属(Capsicum spp)；例如辣椒(Capsicum annuum)、浆果状辣椒(C.baccatum)、黄灯笼辣椒(C.chinense)、灌木状辣椒(C.frutescens)、茸毛椒(C.pubescens)，等等)、番茄(Solanum lycopersicum或Lycopersicon esculentum)、烟草(烟草属(Nicotiana spp.)，例如烟草(N.tabacum)、本氏烟)、少花龙葵、Solanum demissum、Solanum stoloniferum、Solanum papita、Solanumbulbocastanum、Solanum edinense、Solanum schenckii、Solanum hjertingii、Solanumventuri、Solanum mochiquense、Solanum chacoense和醋栗番茄(Solanumpimpinellifolium)。在优选的实施方案中，所述茄科植物为在农业中栽培的茄科植物，包括但不限于马铃薯、番茄、茄子、辣椒、烟草和矮牵牛。在更优选的实施方案中，所述茄科植物为马铃薯和番茄。在还更优选的实施方案中，所述优选的植物为马铃薯。在某些其他的实施方案中，所述优选的茄科植物为除少花龙葵之外的所有茄科植物。

除非文段中另有明确指示，否则意图术语“茄科植物”包括处于成熟或发育的任何阶段的茄科植物，以及获自或来源于任何所述植物的任何细胞、组织或器官(植物部分)。茄科植物部分包括但不限于果实、茎、块茎、根、花、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体等。本发明亦包括通过本发明的茄科植物产生的种子。

本发明的组合物和方法应用于产生具有对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种的增强的抗性的植物。在本发明的优选实施方案中，所述疫霉种为致病疫霉。在其他实施方案中，所述疫霉种为能够对至少一种植物导致植物病害的疫霉种。对于本发明而言，疫霉种包括但不限于致病疫霉、寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、橡树疫霉(Phytophthora ramorum)、番薯疫霉(Phytophthora ipomoeae)、紫茉莉疫霉(Phytophthora mirabilis)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、韭葱疫霉(Phytophthoraporri)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)和菜豆疫霉(Phytophthora phaseoli)。

在本发明的一个实施方案中，所述编码R蛋白的核苷酸序列与在SEQ ID NO:1中所述的整个核苷酸序列或与其片段具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在本发明的另一个实施方案中，所述编码R蛋白的核苷酸序列与在SEQ ID NO:3中所述的整个核苷酸序列或与其片段具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。

本发明包括分离的或基本上纯化的多核苷酸(在本文中亦称为“核酸分子”、“核酸”，等等)或蛋白质(在本文中亦称为“多肽”肽组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质、或其生物活性部分，基本上或实质上不含这样的组分，所述组分通常伴随所述多核苷酸或蛋白质或与之相互作用，如在其天然存在环境中所发现的。因此，当通过重组技术产生时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当以化学方法合成时，其基本上不含化学前体或其他化学物质。最优的是，“分离的”多核苷酸不含这样的序列(最优蛋白编码序列)，在所述多核苷酸来源的生物的基因组DNA中，所述序列天然位于所述多核苷酸两侧(即序列位于所述多核苷酸的5’端和3’端)。例如，在多个实施方案中，所述分离的多核苷酸可含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的这样的核苷酸序列，在所述多核苷酸来源的细胞的基因组DNA中，所述序列天然位于所述多核苷酸两侧。基本上不含细胞物质的蛋白质，包括具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)的污染蛋白的蛋白质制品。当本发明的蛋白质或其生物活性部分为重组产生时，最优的是，培养基显示少于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)的化学前体或非目标蛋白化学物质。

本发明亦包括所公开的多核苷酸的片段和变体以及由其编码的蛋白质。对于“片段”，意图其为所述多核苷酸的一部分或所述氨基酸序列的一部分以及由其编码的蛋白质。包含编码序列的多核苷酸的片段可编码保留全长或天然蛋白质的生物活性的蛋白质。或者，用作杂交探针的多核苷酸的片段一般不编码保留生物活性的蛋白质或者不保留启动子活性。因此，核苷酸序列的片段范围可从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸直至本发明的全长多核苷酸。

在本发明的某些实施方案中，所公开的多核苷酸的片段和变体以及由其编码的蛋白质为能够赋予植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性的多核苷酸的片段和变体以及由其编码的蛋白质。优选的是，包含本发明的天然R多核苷酸的片段的多核苷酸，能够赋予包含所述多核苷酸的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性。同样，包含本发明的天然R蛋白的蛋白或多肽，优选能够赋予包含所述蛋白或多肽的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性。

其为天然R多核苷酸的片段的多核苷酸，包含至少16、20、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550或575个连续的核苷酸，或者多达存在于本文所公开的全长R多核苷酸中的核苷酸的数量(例如，对于SEQ ID NO:1和3分别为5352和2661个核苷酸)。

意图“变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸而言，变体包括这样的多核苷酸，其在5’和/或3’端具有缺失(即截短)；在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个核苷酸；和/或在天然多核苷酸的一个或多个位点取代一个或多个核苷酸。如在本文中所使用的，“天然的”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸而言，保守变体包括这样的序列，其因遗传密码的简并性而编码本发明的R蛋白之一的氨基酸序列。诸如这些天然存在的等位基因变体，可使用众所周知的分子生物学技术进行鉴定，例如使用如在下文中概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸亦包括合成得到的多核苷酸，例如，如通过使用定点突变生成、但其仍编码本发明的R蛋白的多核苷酸。一般而言，本发明的特定多核苷酸的变体将与所述特定多核苷酸具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，如通过如在本文别处所述的序列比对程序和参数所确定。在本发明的某些实施方案中，本发明的特定多核苷酸的变体将与选自SEQ ID NO:1和3的至少一个核苷酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，且任选包含这样的非天然存在的核苷酸序列，其因选自以下的至少一个核苷酸修饰而与在SEQ ID NO:1和/或3中所述的核苷酸序列不同：取代至少一个核苷酸、添加至少一个核苷酸和缺失至少一个核苷酸。理解的是，所述添加至少一个核苷酸可以是在本发明的核苷酸序列(例如SEQ ID NO:1或3)内部添加一个或多个核苷酸、向本发明的核苷酸序列的5’端添加一个或多个核苷酸和/或向本发明核苷酸序列的3’端添加一个或多个核苷酸。

本发明的特定多核苷酸(即所述参照多核苷酸)的变体亦可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由所述参照多核苷酸编码的多肽之间的百分序列一致性来评价。因此，例如，公开了编码这样的多肽的多核苷酸，所述多肽具有相对于SEQ ID NO:2和4的多肽的给定的百分序列一致性。可使用在本文别处所述的序列比对程序和参数来计算任何两个多肽之间的百分序列一致性。当本发明的任何给定的多核苷酸对是通过比较其编码的两个多肽共享的百分序列一致性来评价时，所述两个编码多肽之间的百分序列一致性为至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在本发明的某些实施方案中，本发明的特定多肽的变体将具有与在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，且任选包含这样的非天然存在的氨基酸序列，其因选自以下的至少一个氨基酸修饰而与在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸不同：取代至少一个氨基酸、添加至少一个氨基酸和缺失至少一个氨基酸。理解的是，所述添加至少一个氨基酸可以是在本发明的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2)内部添加一个或多个氨基酸、向本发明的氨基酸序列的N-端添加一个或多个氨基酸和/或向本发明的氨基酸序列的C-端添加一个或多个氨基酸。

意图“变体”蛋白意指这样的蛋白质，其通过在天然蛋白质的N-端和/或C-端缺失(所谓的截短)一个或多个氨基酸；在天然蛋白质中的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个氨基酸；或者在天然蛋白质中的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸来从所述天然蛋白质得到。所述变体可由例如遗传多态性或由人工操作得到。R蛋白的生物活性变体将具有与所述天然蛋白的氨基酸序列(例如在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列)的至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，如通过在本文别处所述的序列比对程序和参数所确定。本发明的蛋白质的生物活性变体可因仅1-15个氨基酸氨基、仅1-10个(例如6-10个)、仅5个、仅4、3、2个乃至1个氨基酸残基而与所述蛋白质不同。

本发明的蛋白质可以多种方式进行改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于这类操作的方法在本领域中一般为已知的。用于突变发生和多核苷酸改变的方法在本领域中为众所周知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492；Kunkel等(1987)Methods in Enzymol.154:367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编辑(1983)Techniques in Molecular Biology(分子生物学技术)(MacMillanPublishing Company，New York)及其中引用的参考文献。对于不影响目标蛋白的生物活性的适当氨基酸取代的指导，可见于Dayhoff等(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白质序列和结构图册)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C.)的模型，通过引用结合到本文中。诸如将一个氨基酸取代成具有类似特性的另一个氨基酸的保守取代，可以是最优的。

因此，本发明的基因和多核苷酸既包括天然存在的序列，又包括突变体及其他变体形式。同样，本发明的蛋白质既包括天然存在的蛋白质，又包括其变体及修饰形式。更优选的是，所述变体赋予包含所述变体的植物或其部分对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性。在一些实施方案中，将要在编码所述变体的DNA中进行的突变，将不会使所述序列置于阅读框之外。最优的是，所述突变将不会形成可产生二级mRNA结构的互补区。参见EP专利申请公布号75,444。

本文所包括的蛋白质序列的缺失、插入和取代，不意图其产生在所述蛋白质的特性上的彻底改变。然而，鉴于难以在进行所述取代、缺失或插入之前预测其确切影响，本领域技术人员将理解的是，将通过常规筛选实验来评价所述影响。即，可通过下文公开的测定法来评价所述活性。

变体多核苷酸和蛋白质亦包括来源于诱变程序和引发重组的程序(例如DNA改组)的序列和蛋白质。用于所述DNA改组的策略在本领域中为已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370:389-391；Crameri等(1997)Nature Biotech.15:436-438；Moore等(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4504-4509；Crameri等(1998)Nature391:288-291；和美国专利号5,605,793和5,837,458。

本发明的多核苷酸可用于从其他生物(具体而言其他植物)中分离相应的序列。以此方式，诸如PCR、杂交等方法可用于基于这类序列与本文所述的序列的序列同源性来鉴定所述序列。基于其与本文所述的完整序列或与其变体和片段的序列一致性来分离的序列，包括在本发明之内。所述序列包括其为所公开序列的直向同源物的序列。意图“直向同源物”意指这样的基因，其来源于共同的祖先基因且因物种形成而存在于不同物种中。认为存在于不同物种中的这样的基因为直向同源物，如果其核苷酸序列和/或其编码的蛋白序列共享至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。直向同源物的功能常常在物种间为高度保守的。因此，本发明包括这样的分离的多核苷酸，其编码R蛋白以及在严格条件下与本文所公开的或在本领域中以其他方式得知的至少一种R蛋白或者与其变体或片段杂交。

在一个实施方案中，本发明的直向同源物具有以下编码序列和/或编码以下蛋白质，所述编码序列包含与以下核苷酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸序列一致性，所述核苷酸序列选自在SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:3中所述的核苷酸序列，所述蛋白质包含与以下氨基酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸序列一致性，所述氨基酸序列选自在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列。

在PCR方法中，可对寡核苷酸引物进行设计，以在PCR反应中用于从提取自任何目标植物的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域中一般为已知的且公开于Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork)。亦参见Innis等编辑(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications(PCR方案：方法及应用指南)(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand编辑(1995)PCR Strategies(PCR策略)(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand编辑(1999)PCR Methods Manual(PCR方法手册)(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，将已知多核苷酸的全部或部分用作探针，所述探针与存在于来自所选生物的一群克隆基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组文库或cDNA文库)中的其他的对应的多核苷酸选择性杂交。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，且可使用诸如³²P等可检测基团或任何其他可检测标记进行标记。因此，例如，用于杂交的探针可通过基于本发明的多核苷酸标记合成的寡核苷酸来制备。用以制备用于杂交的探针和用于构建cDNA文库和基因组文库的方法，在本领域中一般为已知的且公开于Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

例如，本文所公开的整个多核苷酸或其一个或多个部分，可用作能够与相应的多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为实现在各种条件下的特异性杂交，所述探针包含在目标序列的基因或cDNA的序列中为独特的序列，和优选长度为至少约10个核苷酸，以及最优选长度为至少约20个核苷酸。所述探针可用于通过PCR从所选植物中扩增关于特定目标基因的相应的多核苷酸。该技术可用于从所需植物中分离另外的编码序列或作为诊断测定用以在植物中确定编码序列的存在。杂交技术包括平板DNA文库的杂交筛选(噬菌斑或菌落；参见，例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。对核酸杂交的广泛指导见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes(生物化学和分子生物学实验室技术——使用核酸探针杂交)，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现行方案)，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。参见Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)(第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

认为的是，本发明的R蛋白编码序列包括这样的多核苷酸分子，其包含与SEQ IDNO:1和3中的任何一个或多个核苷酸序列充分一致的核苷酸序列。术语“充分一致的”在本文中用于指相对于第二氨基酸或核苷酸序列，第一氨基酸或核苷酸序列含有足够数量或最小数量的相同或等同的(例如具有相似的侧链)氨基酸残基或核苷酸，由此所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含具有至少约45％、55％或65％一致性、优选75％一致性、更优选85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的共有结构域的氨基酸或核苷酸序列，在本文中定义为充分一致的。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸的百分一致性，以最优比对为目的将所述序列进行比对。所述两个序列之间的百分一致性为所述序列共享的相同位置的数量的函数(即百分一致性＝相同位置的数量/位置总数(例如重叠位置)x 100)。在一个实施方案中，所述两个序列为相同长度的。可使用与下述类似的技术(允许或不允许有空位)来确定两个序列之间的百分一致性。在计算百分一致性时，通常对精确匹配进行计数。

两个序列之间的百分一致性的确定，可使用数学算法来完成。用于比对两个序列的数学算法的优选的非限制性实例为Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中得到改进。所述算法已并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可使用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的多核苷酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可使用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得以最优比对为目的的空位比对，可使用Gapped BLAST，如描述于Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389。或者，可使用PSI-Blast进行迭代检索，其检测分子之间的远缘关系。参见上述Altschul等(1997)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast、XBLAST和NBLAST可在万维网ncbi.nlm.nih.gov上获得。用于序列比对的数学算法的另一个优选的非限制性实例为Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法。所述算法已并入ALIGN程序(版本2.0)中，其为GCG序列比对软件包的部分。当使用所述ALIGN程序以比对氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。亦可通过检查来手动进行比对。

除非另有说明，否则在本文中提供的序列一致性/相似性值是指使用本发明的全长序列并使用借助于算法Clustal W(Nucleic Acid Research，22(22):4673-4680，1994)的多重比对得到的值，其使用包含在软件包Vector NTI Suite版本7(InforMax,Inc.，Bethesda，MD，USA)中的程序AlignX(使用缺省参数)；或其任何等同的程序。对于“等同的程序”，意图其为任何下列序列比对程序，对于讨论中的任何两个序列而言，当与通过使用缺省参数的CLUSTALW(版本1.83)(可在万维网ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index上的欧洲生物信息研究所网站上获得)生成的相应比对进行比较时，所述序列比对程序得到具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的百分序列一致性的比对。

使用术语“多核苷酸”，不意图其将本发明限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识的是，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核苷酸的组合。所述脱氧核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物二者。本发明的多核苷酸亦包括序列的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构，等等。

所述包含R蛋白编码区的多核苷酸构建体可以用于在目标植物或其他生物或非人类宿主细胞中进行表达的表达盒提供。所述表达盒将包括与所述R蛋白编码区可操作连接的5’和3’调控序列。意图“可操作连接的”意指两个或多个元件之间的功能性连接。例如，目标多核苷酸或基因与调控序列(即启动子)之间的可操作连接为允许表达所述目标多核苷酸的功能性连接。可操作连接的元件可以是连续的或非连续的。当用于指两个蛋白编码区的连接时，对于可操作连接，意图所述编码区在相同的阅读框中。所述表达盒可另外包含待共转化到所述生物中的至少一个另外的基因。或者，可在多个表达盒上提供所述另外的基因。所述表达盒拥有多个限制位点和/或重组位点，用于插入待接受所述调控区的转录调控的R蛋白编码区。所述表达盒可另外包含选择性标记基因。

所述表达盒将沿5’-3’转录方向包含在植物或其他生物或非人类宿主细胞中起作用的转录和翻译起始区(即启动子)、本发明的R蛋白编码区以及转录和翻译终止区(即终止区)。所述调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或本发明的R蛋白编码区对于所述宿主细胞或对于彼此而言可以是天然的/类似的。或者，所述调控区和/或本发明的R蛋白编码区对于所述宿主细胞或对于彼此而言可以是异源的。

如在本文中所使用的，就核酸分子、多核苷酸、核苷酸序列或多核苷酸构建体而言的“异源的”，为这样的核酸分子、多核苷酸、核苷酸序列或多核苷酸构建体，其来源于外来物种，或者如果来自相同物种，则为对其天然形式通过有意的人为干涉在组成和/或基因组基因座上进行了修饰。例如，与异源多核苷酸可操作连接的启动子是来自这样的物种，其与所述多核苷酸来源的物种不同，或者如果来自相同/类似的物种，则其一或二者与其原始形式和/或基因组基因座相比为大幅修饰的，或者所述启动子不为用于所述可操作连接的多核苷酸的天然启动子。如在本文中所使用的，嵌合基因包含与转录起始区可操作连接的编码序列，所述转录起始区对于所述编码序列而言为异源的。

本发明提供包含本发明的核酸分子、表达盒和载体的至少一个的宿主细胞。在本发明的优选实施方案中，宿主细胞为植物细胞。在其他实施方案中，宿主细胞选自细菌、真菌细胞和动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞为非人类动物细胞。然而，在另一些实施方案中，所述宿主细胞为体外培养的人类细胞。

尽管使用异源启动子来表达所述R蛋白可能是最优的，但亦可使用相应R基因的天然启动子。

所述终止区就所述转录起始区而言可以是天然的、就所述可操作连接的目标R蛋白编码区而言可以是天然的、就所述植物宿主而言可以是天然的，或者可来自其他来源(即对于所述启动子、所述目标R蛋白和/或所述植物宿主而言为外来的或异源的)，或其组合。合适的终止序列可获自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。亦参见Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等(1990)Plant Cell2:1261-1272；Munroe等(1990)Gene 91:151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；和Joshi等(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。

适当时，可针对在转化植物中增加表达来优化所述多核苷酸。即，可使用植物偏好的密码子来合成所述多核苷酸以用于改善表达。参见，例如用于论述宿主偏好密码子使用的Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11。用于合成植物偏好基因的方法在本领域为可得的。参见，例如美国专利号5,380,831和5,436,391以及Murray等(1989)NucleicAcids Res.17:477-498，通过引用结合到本文中。

已知另外的序列修饰在细胞宿主中增强基因表达。这些序列修饰包括去除编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及可能不利于基因表达的其他这类充分表征的序列。可将所述序列的G-C含量调整至对于给定细胞宿主而言的平均水平，如通过参考在所述宿主细胞中表达的已知基因所计算。如有可能，将所述序列修饰成避免预测的mRNA发夹二级结构。

所述表达盒可另外包含5’前导序列。所述前导序列可用于增强翻译。翻译前导序列在本领域中为已知的且包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy Stein等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6126-6130)；马铃薯y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus))(Gallie等(1995)Gene165(2):233-238)、MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒(Maize Dwarf Mosaic Virus))(Virology 154:9-20)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等(1991)Nature 353:90-94)；来自苜宿花叶病毒的外壳蛋白mRNA (AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling等(1987)Nature 325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等(1989)MolecularBiology of RNA(RNA分子生物学)，Cech编辑(Liss，New York)，第237-256页)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等(1991)Virology 81:382-385)。亦参见Della Cioppa等(1987)Plant Physiol.84:965-968。

在制备所述表达盒时，可对所述多种DNA片段进行操作，以便以合适的方向以及适当时以合适的阅读框提供所述DNA序列。为此目的，可使用衔接子或接头来连接所述DNA片段，或者可包括其他操作以提供便利的限制位点、去除冗余DNA、去除限制位点，等等。为此目的，可将体外诱变、引物修补、限制、退火、再取代(例如转换和颠换)包括在内。

许多启动子可用于实施本发明。可基于所需的结果来选择所述启动子。所述核酸可与用于在植物中表达的组成型启动子、组织优选启动子或其他启动子组合。所述组成型启动子包括例如核CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell2:163-171)；泛素(Christensen等(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)，等等。其他组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611。

组织优选启动子可用于靶向增强所述R蛋白编码序列在特定植物组织中的表达。所述组织优选启动子包括但不限于叶优选启动子、根优选启动子、种子优选启动子和茎优选启动子。组织优选启动子包括Yamamoto等(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343；Russell等(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等(1996)PlantPhysiol.112(3):1331-1341；Van Camp等(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等(1994)Plant CellPhysiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco等(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590；和Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3):495-505。如有必要，可修饰所述启动子以进行弱表达。

一般而言，从诱导型启动子特别是从病原体诱导型启动子表达所述基因将是有利的。所述启动子包括来自发病机制相关的蛋白(PR蛋白)，其在感染之后通过病原体诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。参见，例如Redolfi等(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254；Uknes等(1992)Plant Cell 4:645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4:111-116。亦参见WO 99/43819，通过引用结合到本文中。

关注的是在病原体感染的部位或其附近局部表达的启动子。参见，例如Marineau等(1987)Plant Mol.Biol.9:335-342；Matton等(1989)Molecular Plant-MicrobeInteractions 2:325-331；Somsisch等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2427-2430；Somsisch等(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98；和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14972-14977。亦参见Chen等(1996)Plant J.10:955-966；Zhang等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2507-2511；Warner等(1993)Plant J.3:191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1:961-968；美国专利号5,750,386(线虫诱导型)；及其中引用的参考文献。特别关注的是用于玉米PRms基因的诱导型启动子，通过病原体串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)来诱导其表达(参见，例如Cordero等(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200)。

另外，鉴于病原体可通过创伤或昆虫损伤进入植物，所以可将创伤诱导型启动子用于本发明的多核苷酸构建体。所述创伤诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449；Duan等(1996)Nature Biotechnology14:494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford等(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208)；系统素(McGurl等(1992)Science 225:1570-1573)；WIP1(Rohmeier等(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792；Eckelkamp等(1993)FEBS Letters 323:73-76)；MPI基因(Corderok等(1994)Plant J.6(2):141-150)；等等，通过引用结合到本文中。

化学调节启动子可用于通过应用外源化学调节剂来调节基因在植物中的表达。根据目标，所述启动子可以是化学诱导型启动子，其中应用所述化学物质诱导基因表达，或者为化学阻抑型启动子，其中应用所述化学物质阻抑基因表达。化学诱导型启动子在本领域中为已知的且包括但不限于玉米In2-2启动子(其通过苯磺酰胺除草剂安全剂来激活)、玉米GST启动子(其通过用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物来激活)和烟草PR-1a启动子(其通过水杨酸来激活)。其他的目标化学调节启动子包括甾族化合物反应性启动子(参见，例如Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10421-10425和McNellis等(1998)PlantJ.14(2):247-257)中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型启动子和四环素阻抑型启动子(参见，例如Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237，以及美国专利号5,814,618和5,789,156)，通过引用结合到本文中。

所述表达盒亦可包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。将选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂化合物抗性的基因，所述除草剂化合物例如草铵膦、溴草腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。另外的选择性标记包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等(2004)Biotechnol Bioeng 85:610-9和Fetter等(2004)Plant Cell 16:215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等(2004)J.Cell Science 117:943-54和Kato等(2002)Plant Physiol 129:913-42)，和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP^TM，参见Bolte等(2004)J.Cell Science117:943-54)。对于另外的选择性标记，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christopherson等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6314-6318；Yao等(1992)Cell 71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422；Barkley等(1980)，TheOperon(操纵子)，第177-220页；Hu等(1987)Cell 48:555-566；Brown等(1987)Cell49:603-612；Figge等(1988)Cell 52:713-722；Deuschle等(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA 86:5400-5404；Fuerst等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2549-2553；Deuschle等(1990)Science 248:480-483；Gossen(1993)博士学位论文，Heidelberg大学；Reines等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1917-1921；Labow等(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356；Zambretti等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3952-3956；Baim等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5072-5076；Wyborski等(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162；Degenkolb等(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595；Kleinschnidt等(1988)Biochemistry 27:1094-1104；Bonin(1993)博士学位论文，Heidelberg大学；Gossen等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551；Oliva等(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913-919；Hlavka等(1985)Handbook of Experimental Pharmacology(实验药理学手册)，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等(1988)Nature 334:721-724。所述公开内容通过引用结合到本文中。

选择性标记基因的上述列表，不意图其为限制性的。本发明可使用任何选择性标记基因。

用于转化植物的许多植物转化载体和方法为可得的。参见，例如An,G.等(1986)Plant Pysiol.，81:301-305；Fry,J.，等(1987)Plant Cell Rep.6:321-325；Block,M.(1988)Theor.Appl Genet.76:767-774；Hinchee，等(1990)Stadler.Genet.Symp.203212.203-212；Cousins，等(1991)Aust.J.Plant Physiol.18:481-494；Chee,P.P.和Slightom,J.L.(1992)Gene.118:255-260；Christou，等(1992)Trends.Biotechnol.10:239-246；D’Halluin，等(1992)Bio/Technol.10:309-314；Dhir，等(1992)Plant Physiol.99:81-88；Casas等(1993)Proc.Nat.Acad Sci.USA 90:11212-11216；Christou,P.(1993)In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant；29P:119-124；Davies，等(1993)Plant Cell Rep.12:180-183；Dong,J.A.和Mchughen,A.(1993)Plant Sci.91:139-148；Franklin,C.I.和Trieu,T.N.(1993)Plant.Physiol.102:167；Golovkin，等(1993)Plant Sci.90:41-52；Guo Chin Sci.Bull.38:2072-2078；Asano，等(1994)Plant CellRep.13；Ayeres N.M.和Park,W.D.(1994)Crit.Rev.Plant.Sci.13:219-239；Barcelo，等(1994)Plant.J.5:583-592；Becker，等(1994)Plant.J.5:299-307；Borkowska等(1994)Acta.Physiol Plant.16:225-230；Christou,P.(1994)Agro.Food.Ind.Hi Tech.5:17-27；Eapen等(1994)Plant Cell Rep.13:582-586；Hartman，等(1994)Bio-Technology 12:919923；Ritala，等(1994)Plant.Mol.Biol.24:317-325；以及Wan,Y.C.和Lemaux,P.G.(1994)Plant Physiol.104:3748。

本发明的方法包括将多核苷酸构建体引入植物中。对于“引入”，意图其以这样的方式将所述多核苷酸构建体呈递给所述植物，所述方式使所述构建体能够进入所述植物的细胞的内部。本发明的方法不依赖用于将多核苷酸构建体引入植物中的具体方法，只要所述多核苷酸构建体能够进入所述植物的至少一个细胞的内部便可。用于将多核苷酸构建体引入植物中的方法在本领域中为已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

对于“稳定转化”，意图引入植物中的所述多核苷酸构建体整合到所述植物的基因组中且能够通过其子代遗传。对于“瞬时转化”，意图引入植物中的多核苷酸构建体未整合到所述植物的基因组中。认为的是，稳定转化法和瞬时转化法包括将一个或多个核酸分子(例如DNA)、特别是一个或多个重组核酸分子(例如重组DNA)引入植物、植物细胞或者其他宿主细胞或生物中。

对于植物和植物细胞的转化，使用标准技术将本发明的核苷酸序列插入适于在植物或植物细胞中表达所述核苷酸序列的本领域已知的任何载体中。所述载体的选择取决于优选的转化技术和待转化的目标植物物种。

用于构建植物表达盒和将外源核酸引入植物中的方法在本领域中一般为已知的且先前已进行阐述。例如，可使用肿瘤诱导(Ti)质粒载体将外源DNA引入植物中。用于外源DNA递送的其他方法包括使用PEG介导的原生质体转化、电穿孔、显微注射颈须(whisker)以及用于直接DNA摄取的基因枪法或微粒轰击。所述方法在本领域中为已知的。(Vasil等，美国专利号5,405,765；Bilang等(1991)Gene 100:247-250；Scheid等，(1991)Mol.Gen.Genet.，228:104-112；Guerche等，(1987)Plant Science 52:111-116；Neuhause等，(1987)Theor.Appl Genet.75:30-36；Klein等，(1987)Nature 327:70-73；Howell等，(1980)Science 208:1265；Horsch等，(1985)Science 227:1229-1231；DeBlock等，(1989)Plant Physiology 91:694-701；Methods for Plant Molecular Biology(用于植物分子生物学的方法)(Weissbach和Weissbach编辑)Academic Press,Inc.(1988)和Methods inPlant Molecular Biology(植物分子生物学方法)(Schuler和Zielinski编辑)AcademicPress,Inc.(1989)。所述转化的方法取决于待转化的植物细胞、所用载体的稳定性、基因产物的表达水平及其他参数。

将核苷酸序列引入植物细胞并随后插入所述植物基因组中的其他合适的方法包括如Crossway等(1986)Biotechniques 4:320-334的显微注射，如通过Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606阐述的电穿孔，如通过Townsend等，美国专利号5,563,055、Zhao等，美国专利号5,981,840阐述的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化，如通过Paszkowski等(1984)EMBO J.3:2717-2722阐述的直接基因转移，以及弹道粒子加速，如描述于例如Sanford等，美国专利号4,945,050；Tomes等，美国专利号5,879,918；Tomes等，美国专利号5,886,244；Bidney等，美国专利号5,932,782；Tomes等(1995)“DirectDNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment(经由微粒轰击将DNA直接转移到完整植物细胞中)，”Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods(植物细胞、组织和器官培养：基本方法)，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等(1988)Biotechnology 6:923 926)；和Lec1转化(WO00/28058)。亦参见，Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford等(1987)Particulate Science and Technology 5:27-37(洋葱)；Christou等(1988)PlantPhysiol.87:671-674(大豆)；McCabe等(1988)Bio/Technology 6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta等(1990)Biotechnology 8:736-740(水稻)；Klein等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6:559-563(玉米)；Tomes，美国专利号5,240,855；Buising等，美国专利号5,322,783和5,324,646；Tomes等(1995)“Direct DNA Transfer into Intact PlantCells via Microprojectile Bombardment(经由微粒轰击将DNA直接转移到完整植物细胞中)，”Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods(植物细胞、组织和器官培养：基本方法)，Gamborg编辑(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8:833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等(1984)Nature(London)311:763-764；Bowen等，美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等(1985)，The Experimental Manipulation of Ovule Tissues(胚珠组织的实验操作)，Chapman等编辑(Longman，New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等(1990)Plant Cell Reports 9:415-418和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(颈须介导的转化)；D’Halluin等(1992)Plant Cell4:1495-1505(电穿孔)；Li等(1993)Plant Cell Reports 12:250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany75:407-413(水稻)；Osjoda等(1996)Nature Biotechnology 14:745-750(玉米经由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens))；其全部通过引用结合到本文中。

可通过使植物与病毒或病毒核酸接触来将本发明的多核苷酸引入植物中。一般而言，所述方法包括将本发明的多核苷酸构建体并入病毒DNA或RNA分子中。另外，认为的是，本发明的启动子亦包括用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸构建体引入植物中并表达其中编码的蛋白质的方法，在本领域中为已知的。参见，例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931；通过引用结合到本文中。

需要时，可将所述修饰的病毒或修饰的病毒核酸制备成制剂。所述制剂以已知的方式制备(参见例如回顾美国3,060,084、EP-A 707 445(用于液体浓缩剂)、Browning，“Agglomeration(团聚)聚，Chemical Engineering(化学工程)，1967年12月4日，147-48、Perry’s Chemical Engineer’s Handbook(Perry化学工程师手册)，第4版，McGraw-Hill，New York，1963，第8-57页和以下：WO 91/13546、US 4,172,714、US 4,144,050、US 3,920,442、US 5,180,587、US 5,232,701、US 5,208,030、GB 2,095,558、US 3,299,566、Klingman，Weed Control as a Science(科学除草)，John Wiley and Sons,Inc.，NewYork，1961、Hance等Weed Control Handbook(除草手册)，第8版，Blackwell ScientificPublications，Oxford，1989和Mollet,H.、Grubemann,A.，Formulation technology(制剂技术)，Wiley VCH Verlag GmbH，Weinheim(Germany)，2001、2.D.A.Knowles，Chemistryand Technology of Agrochemical Formulations(农用化学品制剂的化学反应及技术)，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，1998(ISBN 0-7514-0443-8)，例如通过使用适于配制农用化学品的辅料扩散所述活性化合物，所述辅料例如溶剂和/或载体、需要时使用乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、消泡剂、抗冻剂，对于种子处理制剂亦任选使用着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂。

在具体的实施方案中，可使用本领域已知的各种瞬时转化法，将本发明的多核苷酸构建体和表达盒提供给植物。所述方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见，例如Crossway等(1986)Mol Gen.Genet.202:179-185；Nomura等(1986)Plant Sci.44:53-58；Hepler等(1994)PNAS Sci.91:2176-2180和Hush等(1994)J.Cell Science 107:775-784，其全部通过引用结合到本文中。或者，可使用本领域已知的技术将所述多核苷酸瞬时转化到所述植物中。所述技术包括如在本文别处所述的病毒载体系统和根癌土壤杆菌介导的瞬时表达。

已转化的细胞可按照常规方式生长成植物。参见，例如，McCormick等(1986)PlantCell Reports 5:81-84。然后可使这些植物生长，与相同转化株或不同转化株传粉，并鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得杂种。可使两代或更多代生长以确保所需表型特征的表达得到稳定保持和遗传，并随后收获种子以确保已实现所需表型特征的表达。以此方式，本发明提供具有稳定并入其基因组中的本发明的多核苷酸构建体(例如，本发明的表达盒)的转化种子(亦称为“转基因种子”)。

用于在植物的基因组中修饰DNA的本领域已知的任何方法，可用于在植物原位修饰基因组核苷酸序列，以产生或插入抗性基因乃至于置换或修饰内源抗性基因或其等位基因。所述方法包括但不限于基因组编辑技术，例如，涉及定向突变、同源重组和诱变育种的方法。定向诱变或类似技术公开于美国专利号5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972、5,871,984和8,106,259；其全部通过引用以其整体结合到本文中。包括同源重组在内的用于基因修饰或基因置换的方法，可包括使用以下酶在DNA中诱导双链断裂：锌指核酸酶(ZFN)、TAL(转录激活因子样)效应物核酸酶(TALEN)、规律成簇的间隔短回文重复序列/CRISPR-相关的核酸酶(CRISPR/Cas核酸酶)或这样的归巢内切酶，其对内切酶进行工程改造以在植物、其他生物或宿主细胞的基因组中的特异性识别序列产生双链断裂。参见，例如Durai等，(2005)Nucleic Acids Res 33:5978-90；Mani等(2005)Biochem BiophysRes Comm 335:447-57；美国专利号7,163,824、7,001,768和6,453,242；Arnould等(2006)JMol Biol 355:443-58；Ashworth等，(2006)Nature 441:656-9；Doyon等(2006)J Am ChemSoc 128:2477-84；Rosen等，(2006)Nucleic Acids Res 34:4791-800；和Smith等，(2006)Nucleic Acids Res34:e149；美国专利申请公布号2009/0133152；和美国专利申请公布号No.2007/0117128；其全部通过引用以其整体结合到本文中。

TAL效应物核酸酶(TALEN)可用于在植物的基因组中的特异性识别序列产生双链断裂，以用于通过同源重组进行基因修饰或基因置换。TAL效应物核酸酶为一类序列特异性核酸酶，其可用于在植物或其他生物的基因组中的特异性靶序列产生双链断裂。TAL效应物核酸酶通过将天然的或工程改造的转录激活因子样(TAL)效应物或其功能部分与内切核酸酶(例如FokI)的催化结构域融合来产生。所述独特的模块化TAL效应物DNA结合域允许设计具有潜在的任何给定DNA识别特异性的蛋白质。因此，可将所述TAL效应物核酸酶的DNA结合域工程改造为识别特异性DNA靶位点，并因此用于在所需靶序列产生双链断裂。参见WO2010/079430；Morbitzer等(2010)PNAS 10.1073/pnas.1013133107；Scholze&Boch(2010)Virulence 1:428-432；Christian等Genetics(2010)186:757-761；Li等(2010)Nuc.AcidsRes.(2010)doi:10.1093/nar/gkq704；和Miller等(2011)Nature Biotechnology 29:143-148；其全部通过引用结合到本文中。

所述CRISPR/Cas核酸酶系统亦可用于在植物的基因组中的特异性识别序列产生双链断裂，以用于通过同源重组进行基因修饰或基因置换。所述CRISPR/Cas核酸酶为一种RNA-引导的(简单向导RNA，简称sgRNA)DNA内切核酸酶系统，其在与所设计的RNA同源的DNA片段中进行序列特异性双链断裂。设计所述序列的特异性为可能的(Cho S.W.等，Nat.Biotechnol.31:230-232，2013；Cong L.等，Science 339:819-823，2013；Mali P.等，Science 339:823-826，2013；Feng Z.等，Cell Research:1-4，2013)。

此外，可使用ZFN在植物的基因组中的特异性识别序列产生双链断裂，以用于通过同源重组进行基因修饰或基因置换。所述锌指核酸酶(ZFN)为包含负责DNA切割的FokI限制酶的部分和识别特异性设计基因组序列的锌指蛋白的融合蛋白，并在所述序列切割所述双链DNA，从而产生游离的DNA末端(Urnov F.D.等，Nat Rev Genet.11:636-46，2010；CarrollD.，Genetics.188:773-82，2011)。

使用诸如上文所述的位点特异性核酸酶使DNA断裂，可增加在所述断裂区中的同源重组的速率。因此，将上述这类效应物与核酸酶偶联，使得能够在基因组中产生定向的变化，其包括添加、缺失及其他修饰。

本发明的核酸分子、表达盒、载体和多核苷酸构建体可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。

如在本文中所使用的，术语“植物”包括种子、植物细胞、植物原生质体、可从其再成生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块以及在植物或植物部分中为完整的植物细胞，例如胚、花粉、胚珠、种子、块茎、繁殖体、叶、花、枝、果实、根、根尖、花药，等等。所述再生植物的子代、变种或突变株亦包括在本发明的范围之内，只要这些部分包含所述引入的多核苷酸便可。除非另有明确说明或者从用例文段中显而易见，否则如在本文中所使用的“子代”和“子代植物”包括植物的任何后代，而不论其由有性生殖和/或无性繁殖得到。

如在本文中所使用的，术语“转基因植物”和“转化植物”为等同的术语，其是指如上所述的“植物”，其中所述植物包含通过例如在本文别处公开的或在本领域中以其他方式得知的任何的稳定转化法和瞬时转化法引入植物中的异源核酸分子、异源多核苷酸或异源多核苷酸构建体。所述转基因植物和转化植物亦指例如将所述异源核酸分子、异源多核苷酸或异源多核苷酸构建体首先引入其中的植物，以及包含所述异源核酸分子、异源多核苷酸或异源多核苷酸构建体的任何的其子代植物。

在本发明的某些实施方案中，所述方法包括种植幼苗和/或块茎并随后使所述幼苗和块茎生长，从而产生来源于其中的植物并任选从所述植物收获植物部分。如在本文中所使用，“幼苗”是指未完全成熟的植物，在进行户外或温室种植或移植以产生可收获植物部分(例如番茄果实、马铃薯块茎或烟叶)之前，其通常在温室中或在其他受控或半受控(例如阳畦)环境条件下栽培。除非另有说明或从用例文段中显而易见，否则如在本文中使用的“块茎”是指整个块茎或其部分。本发明的优选块茎为马铃薯块茎。

在涉及种植块茎的本发明的方法中，块茎的部分优选包含所述块茎的充足部分，借此所述部分能够在对于来自所述块茎的植物的生长和发育而言有利的条件下生长成植物。认为的是，对作物植物(具体而言茄科作物植物)的生长和发育而言的所述有利条件，在本领域中一般为已知的。

在本发明的一些实施方案中，使用本发明的编码R蛋白的多核苷酸构建体转化植物细胞。如在本文中使用的术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。从DNA分子“表达”或“产生”蛋白质或多肽，是指转录并翻译所述编码序列以产生所述蛋白质或多肽，而从RNA分子“表达”或“产生”蛋白质或多肽，是指翻译所述RNA编码序列以产生所述蛋白质或多肽。编码R蛋白的多核苷酸构建体和核酸分子的实例在本文别处描述。

在本文中使用术语“DNA”或“RNA”，不意图其将本发明限于包含DNA或RNA的多核苷酸分子。本领域普通技术人员将认识的是，本发明的方法和组合物包括由脱氧核苷酸(即DNA)、核糖核苷酸(即RNA)或核糖核苷酸和脱氧核苷酸的组合组成的多核苷酸分子。所述脱氧核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物二者，所述合成类似物包括但不限于这样的核苷酸类似物或修饰的主链残基或键合，其为合成的、天然存在的及非天然存在的，其具有与所述参照核酸类似的结合特性，并且其以类似于所述参照核苷酸的方式代谢。所述类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。本发明的多核苷酸分子亦包括多核苷酸分子的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构，等等。此外，本领域普通技术人员理解的是，本文所公开的核苷酸序列亦包括所例示的核苷酸序列的互补序列。

本发明关注用于增强植物对植物病害的抗性的组合物和方法，具体而言关注用于增强植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性的组合物和方法。对于“抗病性”，意图指所述植物避免作为植物-病原体相互作用的结果的疾病症状。即，阻止病原体导致植物病害和相关的疾病症状，或者，使由所述病原体导致的疾病症状减至最小或减轻。

经由举例说明而非经由限制来提供下列实施例。

实施例

实施例1：少花龙葵为抗晚疫病基因的丰富来源

我们着手在获自三个欧洲种子保藏所的一组少花龙葵(2n)和龙葵(6n)品系中研究对致病疫霉的免疫反应(表1)。流式细胞仪分析鉴定的是，最初列为龙葵的品系944750095、A54750014和A14750006为二倍体而非六倍体(未显示数据)。这与先前报道的龙葵和少花龙葵之间的频繁错误鉴定相一致(Manoko等(2007)Plant Syst.Evol.267:1-11)。对于本发明的目的，除非另有说明或从用例文段中显而易见，否则所有植物品系都将归属于广义上的少花龙葵组。此外认识的是，本发明亦不依赖于从特定植物物种中分离的本发明的R基因或者乃至为茄属的所述物种。此外，本发明提供天然存在的和非天然存在的(即合成的或人工的)R基因二者，其提供晚疫病抗性，具体而言马铃薯晚疫病抗性。

表1.茄属品系

¹RU-Radboud大学，Nijmegen，荷兰；IPK-IPK Gatersleben，德国和NHM-自然历史博物馆，英国伦敦。

²中美洲为包括北美洲的南部和南美洲的北部的区域，且包括墨西哥、伯利兹城、哥斯达黎加、萨尔瓦多、危地马拉、洪都拉斯、尼加拉瓜、巴拿马、哥伦比亚和委内瑞拉。

使用四个高毒性致病疫霉生理小种(06_3928A、88069、EC1和NL07434)，在离体叶子测定(DLA)中评价病原体易感性。品系954750186易感所有测试的生理小种(支持菌丝体生长和孢子形成)。所有其他品系保持为完全抗病的，不具有可见的感染迹象或者仅在致病疫霉接种的部位具有以局部细胞死亡为形式的小型过敏反应(HR)部位(图1)。

为确定少花龙葵抗性的遗传基础，我们将所有抗病品系作为父本与感病品系954750186杂交。杂合的F1子代未显示对致病疫霉生理小种06_3928A和EC1的抗性的分离(对各F1测试了6-8株植物)，以及允许其自花传粉产生F2群体。我们对各F2的60-100株植物测试了对06_3928A和EC1的反应，并发现的是，呈比例分离的六个F1杂交的子代表明单(半)显性抗性基因的存在(符合3:1或2:1)。另外六个杂交显示15:1分离或完全不显示分离(所有植物均为抗病的)，表明存在两个或更多个非连锁的R基因(表1)。挑选由所述杂交之一(954750186x 944750095)得到的F2群体以用于R基因鉴定。

实施例2：RenSeq基因定位显示Rpi-amr3位于马铃薯4号染色体上的R2附近

在F2幼株(F1 954750186x 944750095)的叶子上接种病原体显示99个抗病株和6个感病株(15:1分离)，表明存在两个非连锁的显性Rpi基因。为分离所述基因，我们使15个抗病F2植株自花传粉并在30-200个F3子代中确定抗性分离模式。在对来自幼株(8-10周龄)的叶子的DLA测试中，四个群体以3:1分离。令人关注的是，该结果与在年长植物中的不一致，表明在成株(大于12周龄)中存在另外的抗性基因，其在幼株时被评定为易感的。

我们假定的是，潜在的抗晚疫病基因编码NB-LRR/NLR蛋白。我们将RenSeq应用于抗病(R)和感病(S)亲代，以及应用于50个最易感植株的混合DNA，其包括6株最初鉴定的感病F2，以及在所述15个抗病F2植株的子代中的另外的感病株(大部分感病感病池，BS)。将所述富含NLR文库的MiSeq测序读段用于调用并比较所述样品和所述马铃薯参照基因组之间的多态性(The Potato Genome Sequencing Consortium(马铃薯基因组测序协会)(2011)Nature 475:189-195)。我们从头组装R亲代RenSeq读段并将所述组装用作参照以定位R、S和BS RenSeq读段。为找到相连的重叠群，我们调用了R和S亲代之间的纯合子SNP，其在BS中为不存在的(少于5％R等位基因；Jupe等(2013)Plant J.76:530-544)。使用BLAST将候选重叠群定位至所述双单倍体(DM)参照基因组(>80％一致性>1kb)，我们找到了连锁在4号染色体(Ch4)的间距，其在3.5-8.5Mb之间(在所述DM单倍型中，详见图2，a部分)。我们将所述潜在的抗性基因命名为Rpi-amr3。该间距包含所述DM基因组的物理图谱上的3个NLR基因簇(R2/Rpi-blb3、C17和C18，分别为30个、7个和10个NLR；Jupe等(2013)Plant J.76:530-544)。鉴于目前还未曾描述来自C17和C18的功能抗性基因，所述R2和Rpi-blb3基因赋予对抗大多数但非所有致病疫霉生理小种的生理小种特异性抗性。

所述少花龙葵的基因组与可得的已测序的DM马铃薯基因组为远缘的。因此，基于参考信息的标记开发受大量多态性和基因组重排所阻碍。为利于开发在所述定位间距中的各NLR两侧的标记，我们对R和S亲本品系的全基因组进行Illumina测序(全基因组鸟枪法测序，WGS)并从头组装R亲代WGS读段。我们使用BLAST将组装的重叠群锚定至所述参照DM基因组(>80％一致性，>2kb)，选择各NLR基因组两侧的重叠群并将其转换成CAPS标记(Konieczny和Ausubel(1993)Plant J.4:403-10)，其是基于来自R和S亲代的WGS数据使用如在Jupe等((2013)Plant J.76:530-544)中所述的标准方法并调用纯合子SNP进行(图2，a部分)。基于所述最初的50个感病株(用于产生BS)，我们发现的是，两个标志物(3.59Mb处的R2l_1_4和8.69Mb处的R2l_2_4)显示在基因型和表型之间的重组，而剩下的标记与抗性共分离。

为增加在候选区内的重组事件的数量并解析复杂的NLR基因簇结构，我们通过将抗病F1植株与感病品系954750186(母本)回交来产生更大的定位群体。选择对于两个侧翼标记而言为杂合的八个抗病(DLA)BC₁F₁植株并使之自花传粉。我们使用生理小种06_3928A筛选了八个BC₁F₂群体的60-100株植物，并发现两个群体(SP3534和SP3543)以3:1分离抗性，显示为单显性基因。我们将两个群体中的植株的数量分别增加至210株和195株，并使用06_3928A将所有这些植株进行表型分型。我们用侧翼标记将所有植株进行基因分型并发现51个重组子。使用标记R2l_2_5将这些植物进一步进行基因分型，其在生理上隔离了两个大型NLR基因簇R2/Rpi-blb3和C18(图2，b部分)。这证实了Rpi-amr3属于Ch 4上位于7.7-7.9Mb之间(在所述DM单倍型中)的CC-NBS-LRR基因的C18基因簇(图2，b部分)。

实施例3：RenSeq与PacBio测序组合使得能够组装14个共分离全长NLR基因的全长序列

本项目的一个主要动力为建立不需要构建BAC文库的R基因克隆法。我们先前发现的是，NLR基因的高拷贝数和序列相似性使得从头组装短Illumina RenSeq读段变复杂(Jupe等(2013)Plant J.76:530-544；Andolfo等(2014)BMC Plant Biol.14:120)。因此我们开发了与PacBio RSII提供的较长读取技术相组合的NLR富集(Eid等(2008)Science323:133-138)。我们使用我们的茄属NLR诱饵文库(Jupe等(2013)Plant J.76:530-544)，从来源于携带Rpi-amr3的亲代品系944750095的两个独立文库(1.5kb和2.5kb gDNA片段)捕获完整的NLR互补序列(详见方法)。分别在一个和两个SMRT cell上对1.5kb和2.5kb流分进行测序，得到总计70.6k插入片段读段(ROI)。联合NLR-分析程序使用已公布的NLR基序比对和检索工具(MAST)分析这些ROI(Jupe等(2012)BMC Genomics doi:10.1186/1471-2164-13-75；Jupe等(2013)Plant J.76:530-544；Steuernagel等(2015)Bioinformatics10.1093/bioinformatics/btv005)，显示超过21.5kb ROI(30％)来源于NLR，和1030个(约5％)读段具有全长NLR编码序列。所述NLR选择的ROI的后续从头组装，产生323个全长NLR和311个部分NLR(Steuernagel等(2015)Bioinformatics 10.1093/bioinformatics/btv005)。我们发现了11个序列(单ORF，全长cds)和10个截短的或部分的NLR为潜在的少花龙葵C18同系物(>80％一致性>1kb)。在部分NLR中校正均聚物，鉴定了另外的三个全长C-18NLR基因(图2，c部分)。使用严格条件将cDNA RenSeq数据映射到所有从头组装的基因(Rallapalli等(2014)BMC Genomics 15:341；Andolfo等(2014)BMC Plant Biol.14:120)，鉴定了所述候选者中的六个在所述全长序列上以一致的覆盖度高表达。我们使用基因特异性标记进一步证实了这些序列中的四个的共分离(Rpi-amr3a、Rpi-amr3i、Rpi-amr3j和Rpi-amr3k)，而对于另两个我们未能开发特异性CAPS标记(Rpi-amr3b和Rpi-amr3l)。因此，RenSeq联合PacBio使我们能够以迅速且具成本效益的方式快速鉴定共分离的候选抗性基因。

实施例4：五个共分离表达的NLR基因在本氏烟中的瞬时表达显示赋予致病疫霉抗性的一个基因

我们将所述六个候选NLR的可读框克隆到二元表达载体中在35S启动子的控制下，并将其转化到土壤杆菌属中。使这些构建体在本氏烟离体叶子中瞬时表达并接种致病疫霉生理小种88069(浸润后24小时)，生理小种88069通常用于在本氏烟植株中的瞬时测定，如描述于Lokossou等((2009)MPMI 22:661)和Saunders等((2012)Plant Cell 24:3420)。除R2对照和候选基因Rpi-amr3i之外，在GFP浸润的对照叶子上和所有其他构建体中，在接种后(dpi)6天均观察到致病疫霉生长。35S:Rpi-amr3i浸润的叶子直至15dpi仍保持无症状(图3)。在其天然启动子和终止元件(分别为SEQ ID NO:1的2kb 5’和1kb 3’，第1-1918位核苷酸和第4583-5352位核苷酸)下瞬时递送候选Rpi-amr3i接着致病疫霉感染，显示与35S:Rpi-amr3i构建体相同水平的抗性(图4)。该瞬时表达系统将候选Rpi-amr3i鉴定为功能性Rpi-amr3基因。

实施例5：携带35S::Rpi-amr3的稳定转化的马铃薯品系抗多个致病疫霉生理小种

使用描述于Kumar等((2009)Plant J.9:147)中的转化法，我们在二倍体纯合索林塔研究(Solynta Research)品系nr 26(可在万维网solynta.com上获得)中建立了具有35S::Rpi-amr3构建体的稳定转基因植物。该35S::Rpi-amr3构建体包含SEQ ID NO:1的第1858-4688位核苷酸。如通过Foster等((2009)MPMI 22:589-600)所述用离体叶子测定(DLA)测试转基因植物并显示抗多个致病疫霉生理小种，包括88069、06_3928A、EC3527、EC3626和MP324。(图5)。相比之下，携带非功能性Rpi-amr3旁系同源基因的全部四个品系保持对测试的致病疫霉生理小种的完全易感性(未显示数据)。该结果证实的是，所述克隆的基因为在植物体内赋予对致病疫霉的多个生理小种的抗性的功能性Rpi-amr3基因。

实施例6：Rpi-amr3为与R2连锁但与之远缘相关的多基因家族的成员

所述Rpi-amr3 2,664bp ORF编码887个氨基酸的蛋白质序列(SEQ ID NO:2)。其包含CC-NB-LRR类抗性蛋白的典型特征；即卷曲螺旋结构域(CC，1-115个aa)、核苷酸结合域(NB-ARC 151-433个aa)和七个富含亮氨酸的重复序列(LRR，500-800个aa)。

实施例7：携带Rpi-amr3的稳定转化的马铃薯品系并测试其对多个致病疫霉生理小种的抗性

通过使用描述于Kumar等((2009)Plant J.9:147)的用于马铃薯的稳定转化法，用包含天然启动子、可读框和终止区的全长Rpi-amr3基因(SEQ ID NO:1)转化索林塔研究品系nr 26和玛丽斯派珀来产生转化的马铃薯植株。对于所述转化，将所述Rpi-amr3序列掺入二元表达载体pICSLUS0001中。在上述离体叶子测定中对包含Rpi-amr3的各转基因索林塔26(图6)和玛丽斯派珀(图7)马铃薯植株(T₀)测试对致病疫霉生理小种88069的抗性，并在玛丽斯派珀的情况下与对照未转化马铃薯植株的抗性进行比较，或者在索林塔nr 26的情况下与包含非功能性Rpi-amr3旁系同源物的转化株系进行比较。在两种情况下，对照植物显示大量坏死斑和所述病原体的孢子形成，而表达Rpi-amr3的株系显示抗病表型，其由在感染部位的弱过敏防御反应或无过敏防御反应以及无坏死斑或孢子形成组成。

意图表达Rpi-amr3的各转基因马铃薯植株显示对致病疫霉的多个生理小种的增强的抗性，所述生理小种包括06_3928A、EC3527、EC3626和MP324。

冠词“一个(a和an)n在本文中用于指一个或多于一个(即至少一个)所述冠词的语法对象。例如，“一个要素”意指一个或多个要素。

在本说明书各处，术语“包括(comprising)，或诸如“诸如mprising或“诸如mprising)等变形，将理解为意指包含规定的要素、整体或步骤、或者要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他要素、整体或步骤、或者要素、整体或步骤的组。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请，均表明本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请均通过引用结合到本文中，其引用程度如同具体且分别地指出各独立的出版物或专利申请通过引用来结合。

尽管上述发明已通过图解和实施例来相当详细地阐述，以用于理解的清晰性的目的，但将显而易见的是，可在随附权利要求的范围内实施某些改变和修改。

序列表

<110> K·威特克

J·D·G·琼斯

<120> 来自少花龙葵的抗晚疫病基因及使用方法

<130> 070294.0095

<150> US 62/159,240

<151> 2015-05-09

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5352

<212> DNA

<213> 少花龙葵

<220>

<221> 启动子

<222> (1)..(1918)

<220>

<221> 终止子

<222> (4583 )..(5352)

<400> 1

gtccatatgt ggaagctact ctctttgtcc aaaaatagtt gtccactatt gacttacaca 60

caccttaaga aataataaat aataggggta ctattactac actatccttt gaatattata 120

aatttaatgc tctgggaaaa tgtattagat attgaatact ccctccgttt caaaaagaat 180

agtctacttt gacttggcaa agagttttaa aaaataaaga aaatttttca atcttgtagt 240

tctaaattaa tgttatgtca aatgtaccaa aatatctttt aatcttgtag ccttgaacat 300

gccacgtgga aagttgaaat taaagtgttg atcaaaaagg aaagaggtca ctattttcta 360

aacggagggg tggtatttaa ttgtaggggt aaaatagaca caaaaggata aattatcttt 420

tgattttcta aattggacaa gtattgttgg acaactattt ttcgtatagt gggcaagtaa 480

agatggacgg gggaggtatt accaagtcta aaaatgggaa gctatggcca agtctaaact 540

gatactccat gtgttccttt ttatttgtca cgtttttttt tttttgagaa atcaaactac 600

atgaattttg accaatattt taagatctac tttttcaaat agttctcaaa catctaaatt 660

ttaaataata aattattcta attcaaatta gcttcaaaaa ttagtcaaat tgactttcag 720

aaagtcaatt gtgacgatta aaaaagaatg gagagagtaa gtttttttaa aatcttattc 780

tccattattt acatgacgag tcttggagaa ttttcacttt gttaaggatt cgattcttca 840

tatcgtaatc ccttccccta ttcttccttt cacctgcccc tttttgaaaa ttaaatatga 900

cccagaggct gcttttttat atattgcttc acatacccca tttttttatt ttttattttg 960

aaaaacggaa aaagacatga cgagccccac tagtctttca ttatttctca ttttttgtac 1020

acattgaatt tctttggaat ttaataaagg tagtacttag atttgaccaa tccaaactat 1080

gtgcctttgg cgtgttgctt tttttaaaaa aattattttt tgaaactttt gataataagt 1140

tgtcacatgt gtagcatttt tgactttgat cttcaaggct tattgagggc aagtggggtc 1200

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tcgattttga aaagaatgtc tctttcgtaa tttgagaact cgttaatcac aatattgcac 1320

atcaacagat aacatgttta agatcacaaa attaaaaaac aatttgatat attattacac 1380

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tcgaatcaaa taaaaacgaa aaagttgaaa tagagagaga aaaggtagtt tccttgaaat 1500

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ggtcagtccc aaaaagaatg acacatttct acatttagta acaatttatt tttaaaatga 1680

cttttttact cttaatgaaa tgatttctag ccacacaaat atctaccact cattttagac 1740

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tgatcgtata atacatgatt tttactctcg tttcaacctt ctcagggtat tggtcatctc 3660

caagacaaat gaatacttcg agtcatttcc acttgtgatt acaaagttgt ttcatttgag 3720

atatctccaa gttcgatttc ttggagacat tcctgaatca atctcaaacc ttcaaaattt 3780

gcaaactcta atttgtagtg gtggtacttt acctgggaag atatggatga tgaagaactt 3840

gaggtatata agtataatag gcaacaaagt cacttattta ccaagtccta gaacagaaag 3900

tcttgtgaat ctagaggagt tttctgttct ttgttacaga agttgtacaa aagaagtcat 3960

ttctggcatt cccaatctaa agagattgac cattgatgta ctttctagca ttaacaacta 4020

ttttcccaat ggactaatag atatgtccag cttgacaaaa ctcgaagcat tcaagtgtaa 4080

taggtgttta tattcgaatt tcaatagttc tgttattcca acatcactta aggattttgt 4140

ttttccaaca tcacttaaga ggttgagttt aaactattat gctagtcatt ttttttggga 4200

agaaatatca tcaactatta tcatgttgcc taatcttgaa gagctgaagc ttaaagattg 4260

tcgatccgat gaatatgatg aatggagttt gagtgataaa gacaaattca aaagcttgaa 4320

gttgttggta ctaaccgaca ttttttttga tcgttgggaa gctaccagtg ataacttccc 4380

aaatctaaaa cgccttgttc tgaacaagtg cgacttagaa attccatcag attttgggga 4440

aatttgtact ttggaatcaa ttgagttaca tgattgcagc actagtgctg aggattctgc 4500

acgagagatt gaacaagaac aagaggagat gggaaataat atccttaagg tctacataca 4560

tggcagtcgc agtaagttct aaacagttat tcgattctct catctttgtt aaatcttacc 4620

tccttgaagt tatgatgatg acttcgattt tttgtcttgc ataggcagga aaatggaagc 4680

atatttcgag gaatcatcta atgccatctt ccaaatgcag aaccttttag attaatcttt 4740

tatgttctga ttgtttgtta aattcatgtt ttaggaataa acacgtttaa tacatgtttc 4800

gctctttctt tactatgtaa acagtaacta ttgatgtatt gttatatcta ttttgtgtta 4860

tgtgatagtt cgaaatgaat aatgtgttgg ggttttggtc tttttccctt cctatgtgga 4920

taaataaaag cccaattggt ctagcccact tatgcccata agcccaattt atggagcata 4980

cataagactt tctttaagtc ttattttcat atatcacaca taatttttac aagagagata 5040

agcatacata ttagagagaa aagagagaaa gtgcagattt tcgcacaaac cctagcagcc 5100

aatttcaaat cgcgattccc gcttcgtttc ttatctgatt aagctgattt ttggacagca 5160

cgttcctctc aacttaatct ttgattgaga actgacagag gtcgatttgg agtcccgtag 5220

ctccagattt ttgctcgtga acagcagctg ctatttggtg attttgctcc ttttacttct 5280

ctagttcttt ggtgctatct gtagttgttg ttgcctcgtt tttggcactt gttttggtga 5340

ccattttgga ga 5352

<210> 2

<211> 2661

<212> DNA

<213> 少花龙葵

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2661)

<400> 2

atg gca gct tat agt gct gta att tct ctt ctt caa aca ctt att gat 48

Met Ala Ala Tyr Ser Ala Val Ile Ser Leu Leu Gln Thr Leu Ile Asp

1 5 10 15

caa caa aat att tca gaa ctc ttt cat ggt cac act gcc caa acg ctc 96

Gln Gln Asn Ile Ser Glu Leu Phe His Gly His Thr Ala Gln Thr Leu

20 25 30

gat tct ctt cac act aca gct gaa tat ttt caa cat gtc ctt gaa aat 144

Asp Ser Leu His Thr Thr Ala Glu Tyr Phe Gln His Val Leu Glu Asn

35 40 45

att aca aga ttt gac tct gaa aag atc aaa tct ttg gag gaa aaa ata 192

Ile Thr Arg Phe Asp Ser Glu Lys Ile Lys Ser Leu Glu Glu Lys Ile

50 55 60

aga gtt gtt gtt agc tat gca gaa gat gtt gtt gca atg aaa att tct 240

Arg Val Val Val Ser Tyr Ala Glu Asp Val Val Ala Met Lys Ile Ser

65 70 75 80

caa atc atc ata ggc tca agc tgg aca ttt gga att tta caa cac cag 288

Gln Ile Ile Ile Gly Ser Ser Trp Thr Phe Gly Ile Leu Gln His Gln

85 90 95

gat tta cta cca ctt gtt gaa aaa atg gac aca aca aag aaa caa gtg 336

Asp Leu Leu Pro Leu Val Glu Lys Met Asp Thr Thr Lys Lys Gln Val

100 105 110

atg gac att ctt tct cat gat gat gat caa att ctt gaa tta act gca 384

Met Asp Ile Leu Ser His Asp Asp Asp Gln Ile Leu Glu Leu Thr Ala

115 120 125

ggg gat tcc ttg att ggc act tct tct aca act tat cca atg ttg gaa 432

Gly Asp Ser Leu Ile Gly Thr Ser Ser Thr Thr Tyr Pro Met Leu Glu

130 135 140

gat gat atc gtg cag gga att gat gat gac ttg gag atc ata gtt aaa 480

Asp Asp Ile Val Gln Gly Ile Asp Asp Asp Leu Glu Ile Ile Val Lys

145 150 155 160

aga ttg aca gga cca cca cgg gat tta gac gtt gtc aca ata aca ggt 528

Arg Leu Thr Gly Pro Pro Arg Asp Leu Asp Val Val Thr Ile Thr Gly

165 170 175

atg ggt ggc att ggt aaa aca aca ctc gct aga aag gct tat gat cat 576

Met Gly Gly Ile Gly Lys Thr Thr Leu Ala Arg Lys Ala Tyr Asp His

180 185 190

ctc aca atc agg tat cac ttt gac att ctt gtt tgg att aca ata tct 624

Leu Thr Ile Arg Tyr His Phe Asp Ile Leu Val Trp Ile Thr Ile Ser

195 200 205

caa gaa ttt cga tgt aga aat gta ttg tta gaa gct tta cat tgc att 672

Gln Glu Phe Arg Cys Arg Asn Val Leu Leu Glu Ala Leu His Cys Ile

210 215 220

tca aag tca aca gat att gtg aac aca aaa gat tat gat aag aag gat 720

Ser Lys Ser Thr Asp Ile Val Asn Thr Lys Asp Tyr Asp Lys Lys Asp

225 230 235 240

gac aat gag tta gct gac ata gta cag aaa aaa cta aag ggt cca aga 768

Asp Asn Glu Leu Ala Asp Ile Val Gln Lys Lys Leu Lys Gly Pro Arg

245 250 255

tac cta gtt gtt gtt gat gat att tgg agt aga gat gtt tgg gat agt 816

Tyr Leu Val Val Val Asp Asp Ile Trp Ser Arg Asp Val Trp Asp Ser

260 265 270

ata aga gga ata ttt cct aat tac aac aac ggg agt cga atc tta ttg 864

Ile Arg Gly Ile Phe Pro Asn Tyr Asn Asn Gly Ser Arg Ile Leu Leu

275 280 285

act act agg gaa aac gag gta gca atg tat gca aat act tgt agc cct 912

Thr Thr Arg Glu Asn Glu Val Ala Met Tyr Ala Asn Thr Cys Ser Pro

290 295 300

cat gag atg agt ctt ttg agt tta gaa aac ggt tgg agg tta ctt tgt 960

His Glu Met Ser Leu Leu Ser Leu Glu Asn Gly Trp Arg Leu Leu Cys

305 310 315 320

gat aag gtg ttt gga cca aaa cat gat cat cct cct gaa ttg gaa gaa 1008

Asp Lys Val Phe Gly Pro Lys His Asp His Pro Pro Glu Leu Glu Glu

325 330 335

att ggt aag gaa ata gtt gaa aaa tgc caa gga cta ccc tta aca att 1056

Ile Gly Lys Glu Ile Val Glu Lys Cys Gln Gly Leu Pro Leu Thr Ile

340 345 350

tca gtg att gcg gga cat gtt tct aaa atg ccc agg aca tta gaa tgt 1104

Ser Val Ile Ala Gly His Val Ser Lys Met Pro Arg Thr Leu Glu Cys

355 360 365

tgg aag gat gtc gcc cga acc tta agt gaa atc atc tct agt cat cca 1152

Trp Lys Asp Val Ala Arg Thr Leu Ser Glu Ile Ile Ser Ser His Pro

370 375 380

gat aat tgc tta gga gtg ctc ggt ttg agt tac cat cac ttg cct aat 1200

Asp Asn Cys Leu Gly Val Leu Gly Leu Ser Tyr His His Leu Pro Asn

385 390 395 400

cac ctc aaa cct tgc ttt ctt tct atg agt agt ttc cca gaa gat ttt 1248

His Leu Lys Pro Cys Phe Leu Ser Met Ser Ser Phe Pro Glu Asp Phe

405 410 415

cag gtt gaa act cgg aga ttg atc tac tta tgg atc gca gaa ggt ttc 1296

Gln Val Glu Thr Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Trp Ile Ala Glu Gly Phe

420 425 430

ata agg act tgc gaa aat ggt aaa agt ttg gag gaa gtt gca gta gat 1344

Ile Arg Thr Cys Glu Asn Gly Lys Ser Leu Glu Glu Val Ala Val Asp

435 440 445

tat ttg gag gac ctt att agc agg aac ttg ata caa gct aga aaa agg 1392

Tyr Leu Glu Asp Leu Ile Ser Arg Asn Leu Ile Gln Ala Arg Lys Arg

450 455 460

aga ttc aat ggt gag ata aaa gca tgt gga ata cat gat cta ctg cgt 1440

Arg Phe Asn Gly Glu Ile Lys Ala Cys Gly Ile His Asp Leu Leu Arg

465 470 475 480

gag ttc tgt ttg ata gaa gct gaa ata acg aag cat atg cat gtt gag 1488

Glu Phe Cys Leu Ile Glu Ala Glu Ile Thr Lys His Met His Val Glu

485 490 495

aga act tac cca act ctt cca aca caa aag aat aat gtt cgt cgc ttc 1536

Arg Thr Tyr Pro Thr Leu Pro Thr Gln Lys Asn Asn Val Arg Arg Phe

500 505 510

agt ttt caa aca aaa ttt tat tca gtt gat gat tgt aat aag cta tta 1584

Ser Phe Gln Thr Lys Phe Tyr Ser Val Asp Asp Cys Asn Lys Leu Leu

515 520 525

cca cct gtt gcc aga tct atc tac ttc ttt tct cag ttg gat cta cct 1632

Pro Pro Val Ala Arg Ser Ile Tyr Phe Phe Ser Gln Leu Asp Leu Pro

530 535 540

gtt gta ccc tat aag agg tat ctc agg tgt tgt ttg ccc atc cac cgt 1680

Val Val Pro Tyr Lys Arg Tyr Leu Arg Cys Cys Leu Pro Ile His Arg

545 550 555 560

gat gat cgt ata ata cat gat ttt tac tct cgt ttc aac ctt ctc agg 1728

Asp Asp Arg Ile Ile His Asp Phe Tyr Ser Arg Phe Asn Leu Leu Arg

565 570 575

gta ttg gtc atc tcc aag aca aat gaa tac ttc gag tca ttt cca ctt 1776

Val Leu Val Ile Ser Lys Thr Asn Glu Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Leu

580 585 590

gtg att aca aag ttg ttt cat ttg aga tat ctc caa gtt cga ttt ctt 1824

Val Ile Thr Lys Leu Phe His Leu Arg Tyr Leu Gln Val Arg Phe Leu

595 600 605

gga gac att cct gaa tca atc tca aac ctt caa aat ttg caa act cta 1872

Gly Asp Ile Pro Glu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Asn Leu Gln Thr Leu

610 615 620

att tgt agt ggt ggt act tta cct ggg aag ata tgg atg atg aag aac 1920

Ile Cys Ser Gly Gly Thr Leu Pro Gly Lys Ile Trp Met Met Lys Asn

625 630 635 640

ttg agg tat ata agt ata ata ggc aac aaa gtc act tat tta cca agt 1968

Leu Arg Tyr Ile Ser Ile Ile Gly Asn Lys Val Thr Tyr Leu Pro Ser

645 650 655

cct aga aca gaa agt ctt gtg aat cta gag gag ttt tct gtt ctt tgt 2016

Pro Arg Thr Glu Ser Leu Val Asn Leu Glu Glu Phe Ser Val Leu Cys

660 665 670

tac aga agt tgt aca aaa gaa gtc att tct ggc att ccc aat cta aag 2064

Tyr Arg Ser Cys Thr Lys Glu Val Ile Ser Gly Ile Pro Asn Leu Lys

675 680 685

aga ttg acc att gat gta ctt tct agc att aac aac tat ttt ccc aat 2112

Arg Leu Thr Ile Asp Val Leu Ser Ser Ile Asn Asn Tyr Phe Pro Asn

690 695 700

gga cta ata gat atg tcc agc ttg aca aaa ctc gaa gca ttc aag tgt 2160

Gly Leu Ile Asp Met Ser Ser Leu Thr Lys Leu Glu Ala Phe Lys Cys

705 710 715 720

aat agg tgt tta tat tcg aat ttc aat agt tct gtt att cca aca tca 2208

Asn Arg Cys Leu Tyr Ser Asn Phe Asn Ser Ser Val Ile Pro Thr Ser

725 730 735

ctt aag gat ttt gtt ttt cca aca tca ctt aag agg ttg agt tta aac 2256

Leu Lys Asp Phe Val Phe Pro Thr Ser Leu Lys Arg Leu Ser Leu Asn

740 745 750

tat tat gct agt cat ttt ttt tgg gaa gaa ata tca tca act att atc 2304

Tyr Tyr Ala Ser His Phe Phe Trp Glu Glu Ile Ser Ser Thr Ile Ile

755 760 765

atg ttg cct aat ctt gaa gag ctg aag ctt aaa gat tgt cga tcc gat 2352

Met Leu Pro Asn Leu Glu Glu Leu Lys Leu Lys Asp Cys Arg Ser Asp

770 775 780

gaa tat gat gaa tgg agt ttg agt gat aaa gac aaa ttc aaa agc ttg 2400

Glu Tyr Asp Glu Trp Ser Leu Ser Asp Lys Asp Lys Phe Lys Ser Leu

785 790 795 800

aag ttg ttg gta cta acc gac att ttt ttt gat cgt tgg gaa gct acc 2448

Lys Leu Leu Val Leu Thr Asp Ile Phe Phe Asp Arg Trp Glu Ala Thr

805 810 815

agt gat aac ttc cca aat cta aaa cgc ctt gtt ctg aac aag tgc gac 2496

Ser Asp Asn Phe Pro Asn Leu Lys Arg Leu Val Leu Asn Lys Cys Asp

820 825 830

tta gaa att cca tca gat ttt ggg gaa att tgt act ttg gaa tca att 2544

Leu Glu Ile Pro Ser Asp Phe Gly Glu Ile Cys Thr Leu Glu Ser Ile

835 840 845

gag tta cat gat tgc agc act agt gct gag gat tct gca cga gag att 2592

Glu Leu His Asp Cys Ser Thr Ser Ala Glu Asp Ser Ala Arg Glu Ile

850 855 860

gaa caa gaa caa gag gag atg gga aat aat atc ctt aag gtc tac ata 2640

Glu Gln Glu Gln Glu Glu Met Gly Asn Asn Ile Leu Lys Val Tyr Ile

865 870 875 880

cat ggc agt cgc agt aag ttc 2661

His Gly Ser Arg Ser Lys Phe

885

<210> 3

<211> 887

<212> PRT

<213> 少花龙葵

<400> 3

Met Ala Ala Tyr Ser Ala Val Ile Ser Leu Leu Gln Thr Leu Ile Asp

1 5 10 15

Gln Gln Asn Ile Ser Glu Leu Phe His Gly His Thr Ala Gln Thr Leu

20 25 30

Asp Ser Leu His Thr Thr Ala Glu Tyr Phe Gln His Val Leu Glu Asn

35 40 45

Ile Thr Arg Phe Asp Ser Glu Lys Ile Lys Ser Leu Glu Glu Lys Ile

50 55 60

Arg Val Val Val Ser Tyr Ala Glu Asp Val Val Ala Met Lys Ile Ser

65 70 75 80

Gln Ile Ile Ile Gly Ser Ser Trp Thr Phe Gly Ile Leu Gln His Gln

85 90 95

Asp Leu Leu Pro Leu Val Glu Lys Met Asp Thr Thr Lys Lys Gln Val

100 105 110

Met Asp Ile Leu Ser His Asp Asp Asp Gln Ile Leu Glu Leu Thr Ala

115 120 125

Gly Asp Ser Leu Ile Gly Thr Ser Ser Thr Thr Tyr Pro Met Leu Glu

130 135 140

Asp Asp Ile Val Gln Gly Ile Asp Asp Asp Leu Glu Ile Ile Val Lys

145 150 155 160

Arg Leu Thr Gly Pro Pro Arg Asp Leu Asp Val Val Thr Ile Thr Gly

165 170 175

Met Gly Gly Ile Gly Lys Thr Thr Leu Ala Arg Lys Ala Tyr Asp His

180 185 190

Leu Thr Ile Arg Tyr His Phe Asp Ile Leu Val Trp Ile Thr Ile Ser

195 200 205

Gln Glu Phe Arg Cys Arg Asn Val Leu Leu Glu Ala Leu His Cys Ile

210 215 220

Ser Lys Ser Thr Asp Ile Val Asn Thr Lys Asp Tyr Asp Lys Lys Asp

225 230 235 240

Asp Asn Glu Leu Ala Asp Ile Val Gln Lys Lys Leu Lys Gly Pro Arg

245 250 255

Tyr Leu Val Val Val Asp Asp Ile Trp Ser Arg Asp Val Trp Asp Ser

260 265 270

Ile Arg Gly Ile Phe Pro Asn Tyr Asn Asn Gly Ser Arg Ile Leu Leu

275 280 285

Thr Thr Arg Glu Asn Glu Val Ala Met Tyr Ala Asn Thr Cys Ser Pro

290 295 300

His Glu Met Ser Leu Leu Ser Leu Glu Asn Gly Trp Arg Leu Leu Cys

305 310 315 320

Asp Lys Val Phe Gly Pro Lys His Asp His Pro Pro Glu Leu Glu Glu

325 330 335

Ile Gly Lys Glu Ile Val Glu Lys Cys Gln Gly Leu Pro Leu Thr Ile

340 345 350

Ser Val Ile Ala Gly His Val Ser Lys Met Pro Arg Thr Leu Glu Cys

355 360 365

Trp Lys Asp Val Ala Arg Thr Leu Ser Glu Ile Ile Ser Ser His Pro

370 375 380

Asp Asn Cys Leu Gly Val Leu Gly Leu Ser Tyr His His Leu Pro Asn

385 390 395 400

His Leu Lys Pro Cys Phe Leu Ser Met Ser Ser Phe Pro Glu Asp Phe

405 410 415

Gln Val Glu Thr Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Trp Ile Ala Glu Gly Phe

420 425 430

Ile Arg Thr Cys Glu Asn Gly Lys Ser Leu Glu Glu Val Ala Val Asp

435 440 445

Tyr Leu Glu Asp Leu Ile Ser Arg Asn Leu Ile Gln Ala Arg Lys Arg

450 455 460

Arg Phe Asn Gly Glu Ile Lys Ala Cys Gly Ile His Asp Leu Leu Arg

465 470 475 480

Glu Phe Cys Leu Ile Glu Ala Glu Ile Thr Lys His Met His Val Glu

485 490 495

Arg Thr Tyr Pro Thr Leu Pro Thr Gln Lys Asn Asn Val Arg Arg Phe

500 505 510

Ser Phe Gln Thr Lys Phe Tyr Ser Val Asp Asp Cys Asn Lys Leu Leu

515 520 525

Pro Pro Val Ala Arg Ser Ile Tyr Phe Phe Ser Gln Leu Asp Leu Pro

530 535 540

Val Val Pro Tyr Lys Arg Tyr Leu Arg Cys Cys Leu Pro Ile His Arg

545 550 555 560

Asp Asp Arg Ile Ile His Asp Phe Tyr Ser Arg Phe Asn Leu Leu Arg

565 570 575

Val Leu Val Ile Ser Lys Thr Asn Glu Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Leu

580 585 590

Val Ile Thr Lys Leu Phe His Leu Arg Tyr Leu Gln Val Arg Phe Leu

595 600 605

Gly Asp Ile Pro Glu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Asn Leu Gln Thr Leu

610 615 620

Ile Cys Ser Gly Gly Thr Leu Pro Gly Lys Ile Trp Met Met Lys Asn

625 630 635 640

Leu Arg Tyr Ile Ser Ile Ile Gly Asn Lys Val Thr Tyr Leu Pro Ser

645 650 655

Pro Arg Thr Glu Ser Leu Val Asn Leu Glu Glu Phe Ser Val Leu Cys

660 665 670

Tyr Arg Ser Cys Thr Lys Glu Val Ile Ser Gly Ile Pro Asn Leu Lys

675 680 685

Arg Leu Thr Ile Asp Val Leu Ser Ser Ile Asn Asn Tyr Phe Pro Asn

690 695 700

Gly Leu Ile Asp Met Ser Ser Leu Thr Lys Leu Glu Ala Phe Lys Cys

705 710 715 720

Asn Arg Cys Leu Tyr Ser Asn Phe Asn Ser Ser Val Ile Pro Thr Ser

725 730 735

Leu Lys Asp Phe Val Phe Pro Thr Ser Leu Lys Arg Leu Ser Leu Asn

740 745 750

Tyr Tyr Ala Ser His Phe Phe Trp Glu Glu Ile Ser Ser Thr Ile Ile

755 760 765

Met Leu Pro Asn Leu Glu Glu Leu Lys Leu Lys Asp Cys Arg Ser Asp

770 775 780

Glu Tyr Asp Glu Trp Ser Leu Ser Asp Lys Asp Lys Phe Lys Ser Leu

785 790 795 800

Lys Leu Leu Val Leu Thr Asp Ile Phe Phe Asp Arg Trp Glu Ala Thr

805 810 815

Ser Asp Asn Phe Pro Asn Leu Lys Arg Leu Val Leu Asn Lys Cys Asp

820 825 830

Leu Glu Ile Pro Ser Asp Phe Gly Glu Ile Cys Thr Leu Glu Ser Ile

835 840 845

Glu Leu His Asp Cys Ser Thr Ser Ala Glu Asp Ser Ala Arg Glu Ile

850 855 860

Glu Gln Glu Gln Glu Glu Met Gly Asn Asn Ile Leu Lys Val Tyr Ile

865 870 875 880

His Gly Ser Arg Ser Lys Phe

885

Claims (30)

1.一种核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列：

(a)在SEQ ID NO:1中描述的核苷酸序列；

(b)编码在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的核苷酸序列，以及任选地，其中所述核苷酸序列不为天然存在的；

(c)在SEQ ID NO:3中描述的核苷酸序列；

(d)与在SEQ ID NO:1和3中所述的核苷酸序列中的至少一个具有至少90％序列一致性的核苷酸序列，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种(Phytophthora sp)的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性，且任选其中所述核苷酸序列不为天然存在的；和

(e)包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列与在SEQ IDNO:2中所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性，且任选其中所述核苷酸序列不为天然存在的。

2.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子为分离的核酸分子。

3.一种表达盒，其包含权利要求1或2的核酸分子和可操作连接的异源启动子。

4.一种载体，其包含权利要求1或2的核酸分子或者权利要求3的表达盒。

5.一种宿主细胞，其转化有权利要求1或2的核酸分子、权利要求3的表达盒或者权利要求4的载体。

6.一种植物或植物细胞，其包含权利要求1或2的核酸分子、权利要求3的表达盒或者权利要求4的载体。

7.权利要求6的植物或植物细胞，其中所述植物为茄科植物且所述植物细胞为茄科植物细胞。

8.一种转基因植物，其包含稳定并入其基因组中的异源多核苷酸构建体，所述异源多核苷酸构建体包含选自以下的核苷酸序列：

(a)在SEQ ID NO:1中描述的核苷酸序列；

(b)编码在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)在SEQ ID NO:3中描述的核苷酸序列；

(d)与在SEQ ID NO:1和3中所述的核苷酸序列中的至少一个具有至少90％序列一致性的核苷酸序列，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性；和

(e)包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列与在SEQ IDNO:2中所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性。

9.权利要求8的转基因植物，其中所述多核苷酸构建体包含(b)-(e)中任一项的核苷酸序列且另外包含可操作连接的用于在植物中表达所述核苷酸序列的启动子。

10.权利要求8或9的转基因植物，其中所述转基因植物为茄科植物。

11.权利要求8-10中任一项的权利要求的转基因植物，其中所述茄科植物选自马铃薯、番茄、茄子、辣椒、烟草和矮牵牛。

12.权利要求8-11中任一项的转基因植物，其中相对于对照植物，所述转基因植物包含对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性。

13.权利要求12的转基因植物，其中相对于对照植物，所述转基因植物包含对由致病疫霉(Phytophthora infestans)的至少一个生理小种导致的晚疫病的增强的抗性。

14.一种用于增强植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性的方法，所述方法包括将异源多核苷酸构建体引入至少一个植物细胞中，所述多核苷酸构建体包含选自以下的核苷酸序列：

(a)在SEQ ID NO:1中描述的核苷酸序列；

(b)编码在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)在SEQ ID NO:3中描述的核苷酸序列；

(d)与在SEQ ID NO:1和3中所述的核苷酸序列中的至少一个具有至少90％序列一致性的核苷酸序列，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性；和

(e)包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列与在SEQ IDNO:2中所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性。

15.权利要求14的方法，其中所述多核苷酸构建体稳定并入所述植物细胞的基因组中。

16.权利要求14或15的方法，其中使所述植物细胞再生成在其基因组中包含所述多核苷酸构建体的植物。

17.权利要求14-16中任一项的方法，其中所述多核苷酸构建体包含(b)-(e)中任一项的核苷酸序列且另外包含可操作连接的用于在植物中表达所述核苷酸序列的启动子。

18.权利要求14-17中任一项的方法，其中相对于对照植物，包含所述多核苷酸构建体的植物包含对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的增强的抗性。

19.权利要求18的方法，其中相对于对照植物，所述植物包含对由致病疫霉的至少一个生理小种导致的晚疫病的增强的抗性。

20.权利要求14-19中任一项的方法，其中所述植物为马铃薯或番茄植株。

21.权利要求14-20中任一项的方法产生的植物、或者所述植物的果实、块茎、叶子或种子，其中所述果实、块茎、叶子或种子包含所述多核苷酸构建体。

22.一种在农作物生产中抑制由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的方法，所述方法包括种植权利要求6-13和21中任一项的植物的幼苗、块茎或种子，并使所述幼苗、块茎或种子在有利于自其得到的植物的生长和发育的条件下生长，其中所述幼苗、块茎或种子包含所述核酸分子、表达盒、载体或多核苷酸构建体。

23.权利要求22的方法，其进一步包括从所述植物收获至少一个果实、块茎、叶子和/或种子。

24.权利要求6-13和21中任一项的植物、块茎或种子在农业中的用途。

25.一种人类或动物食物产品，其包含权利要求6-13和21中任一项的植物、果实、块茎、叶子和/或种子或使用所述植物、果实、块茎、叶子和/或种子生产。

26.一种多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

(a)通过在SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

(b)在SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列；

(c)通过在SEQ ID NO:3中所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；和

(d)与在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列，其中包含所述氨基酸序列的多肽能够赋予包含所述多肽的植物对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的抗性。

27.一种用于鉴定显示出对由至少一个疫霉种的至少一个生理小种导致的植物病害的新赋予的或增强的抗性的茄科植物的方法，所述方法包括检测所述植物中或其至少一个部分或细胞中Rpi-amr3i的存在。

28.权利要求27的方法，其中所述植物病害为由致病疫霉的至少一个生理小种导致的晚疫病。

29.权利要求27或28的方法，其中所述茄科植物为马铃薯或番茄植株。

30.权利要求27-29中任一项的方法，其中通过检测Rpi-amr3i内的至少一个标记来检测Rpi-amr3i的存在。