CN107703294A

CN107703294A - 一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法

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Publication number: CN107703294A
Application number: CN201710944539.6A
Authority: CN
Inventors: 吉传义; 何信群; 杨建波; 龚文波; 李峰; 谢建勇; 伏刚; 方鹏飞; 严成; 郝伟伟; 潘华柱; 扶海
Original assignee: China Construction Bioengineering Group Co Ltd
Current assignee: Chengdu Ruisheng High-tech Co.,Ltd.
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2037-10-12
Also published as: CN107703294B

Abstract

本发明提供了一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，包括：制备包被抗原、包被、洗涤、封闭、加样、添加酶标抗体、显色、终止反应和效价测定，首次设计了含有双抗原表位和多聚赖氨酸的合成肽作为包被抗原且首次建立了含有该包被抗原的ELISA方法，用于测定鸡血清中cLHRH抗体的效价；其中，包被抗原为cLHRH‑Lys10‑cLHRH，效价测定是通过终点稀释法或标准曲线法进行测定。采用该方法可用以检测鸡血清中cLHRH抗体效价，其检测结果准确、可靠、稳定。

Description

一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法

技术领域

本发明属于LHRH抗体效价的测定技术领域，具体涉及一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法。

背景技术

“去势术”是我国古代重大发明之一，俗称“阉割”，是一项改善肉质的传统畜牧业生产技术，沿用数千年，在我国牧业经济和传统美食文明中具有决定性地位。除改善畜禽肉质、口感和风味以外，去势可以使动物温顺、便于管理、使役、增重快，能降低热量消耗，提高饲料的利用率。然而，手术“阉割”除了“残忍”外，主要还存在不足之处有：会引起出血，容易造成伤口感染，甚至可能导致动物死亡；对动物应激很强，会引起减食和体重下降，饲养周期延长；技术原始，劳动强度大，不适合现代集约化、规模化生产；对施术者的技术经验要求相当高，适用动物范围也很受限；为了防止破伤风，手术后常要打“破抗”，加重畜主负担。

随着科技的进步，现在的去势方法是接种去势疫苗来替代传统的手术去势，用于克服传统“阉割”手术的缺陷。用去势疫苗免疫肉鸡，可有效激发其产生鸡促黄体素释放激素(cLHRH)，通过对该激素的中和效应，进而抑制性腺轴发育，达到免疫去势的目的。cLHRH抗体作为疫苗免疫后在鸡体内所产生的效应物，其水平的高低，决定和影响疫苗的免疫去势效果和持续期，是评判疫苗免疫效力的基本依据。但现有技术中对鸡血清中cLHRH抗体效价的评估，还没有相应的检测方法。

酶联免疫吸附试验(ELISA)，是一种基于抗原抗体间特异性反应建立的用于检测样品中抗原或抗体的免疫学检测方法，该方法具有简洁、快速、灵敏等特点。自从Engvall和Perlmann于1971年发明以来，该方法得到了迅猛的发展，已广泛应用于各种抗原抗体的检测，其基本原理是将酶分子共价偶联在抗体或抗抗体分子上，这种偶联不改变抗体的免疫学特性以及酶的催化活性，酶标抗体再与吸附在固相载体上的抗原或抗体特异性结合，加入酶底物溶液后，底物在标记酶的催化下产生颜色反应，根据颜色反应的强弱来判断样品中抗原或抗体的含量。ELISA方法集酶催化反应的灵敏性和抗原抗体间结合的特异性于一体，从而赋予了此方法高灵敏性和高特异性。可用于测定鸭、鹅、大鼠、中蜂等体内抗体的效价，但对于检测鸡血清中cLHRH抗体的效价，未见相关报道。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，首次实现了采用ELISA方法检测鸡血清中cLHRH抗体的效价，该方法可以准确、稳定、特异地检测出鸡血清中cLHRH抗体效价水平。

本发明还提供了一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的包被抗原，该包被抗原为含有双抗原表位和多聚赖氨酸的cLHRH-Lys10-cLHRH，分子量为3353.82，纯度大于90％(HPLC)，包被抗原中的氨基酸序列为：

Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly。

该cLHRH-Lys10-cLHRH包被抗原为双抗原表位技术的首创，实现了去势技术包被抗原的三阶段突破，第一阶段：以激素或激素类似物作为包被抗原，这类包被抗原特异性良好，但包被效率不高，检测敏感性很差；第二阶段：以激素偶联牛血清白蛋白作为包被抗原，其敏感性好，但由于会与动物血清中偶然出现的BSA抗体反应，因而特异性不高，影响了检测判定的灵敏度和稳定性；第三阶段：专门设计含有双抗原表位和多聚赖氨酸的合成肽纯品作为包被抗原，利用多聚赖氨酸本身不具有任何抗原性而利于包被的特点，在提高抗原包被效率的同时，通过双激素抗原表位，以期提高包被抗原与待检抗体的亲和力，结果证明，其特异性良好，敏感性高，为最佳的包被抗原。

本发明还提供了一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的样品稀释液，该样品稀释液为含1％BSA、0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝8.0。

鉴于包被抗原为小分子多肽，对待检血清样品中存在的各种蛋白酶或肽酶敏感，在反应过程中易被降解的特点，在样品稀释液中添加复方肽酶抑制剂Cocktail，试验表明能显著提高本ELISA反应灵敏度和检测稳定性。在样品稀释液中加入复方肽酶抑制剂Cocktail为配制样品稀释液的首创技术。

本发明提供的用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法可应用于制备ELISA试剂盒，该试剂盒包括独立分装的以下成分：包被抗原、酶标抗体、包被缓冲液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、标准血清、阳性质控血清、阴性质控血清、TMB显色液和终止液；

其中，包被抗原为含有双抗原表位和多聚赖氨酸的cLHRH-Lys10-cLHRH，分子量为3353.82，纯度大于90％(HPLC)，包被抗原中的氨基酸序列为：

Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly；

样品稀释液为含1％BSA、0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝8.0；

阳性质控血清为SPF疫苗免疫血清；阴性质控血清为非免疫SPF阴性血清。

该试剂盒不仅可以用于测定鸡血清中cLHRH抗体的效价，还可以用于其他禽类或畜类血清中LHRH抗体效价的测定。

以下过程为cLHRH抗体效价测定的ELISA方法的具体过程：

一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，包括：制备包被抗原、包被、洗涤、封闭、加样、添加酶标抗体、显色、终止反应和效价测定，首次设计了含有双抗原表位和多聚赖氨酸的合成肽作为包被抗原且首次建立了含有该包被抗原的ELISA方法，用于测定鸡血清中cLHRH抗体的效价；其中，包被抗原为cLHRH-Lys10-cLHRH，

分子量为3353.82，纯度大于90％(HPLC)，包被抗原中的氨基酸序列为：

效价测定是通过终点稀释法或标准曲线法进行测定。

本发明还对各个过程的条件进行了优化，优化结果如下：

进一步地，包被具体过程为：用包被缓冲液将包被抗原稀释至0.5-1μg/ml，然后加入酶标板的酶标孔内，每孔加入量为80-100μl，2-8℃包被12h；其中，包被缓冲液为0.1mol/L，pH＝9.0的磷酸缓冲液；优选用包被缓冲液将包被抗原稀释至1μg/ml，每孔加入量为80-100μl，4℃包被12h。

进一步地，洗涤具体过程为：每孔加300μl洗涤液洗涤包被的酶标板，洗涤4-5次，每次4-5min，拍干；其中，洗涤液为含0.05％吐温-20，浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸缓冲液。

进一步地，封闭具体过程为：向洗涤后的酶标板中加入封闭液封闭，每孔加300μl，置于37℃孵育2h，然后重复洗涤过程；其中，封闭液为含2％明胶和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝9.0。

进一步地，加样具体过程为：将待检样品、阴性样品、阳性样品和标准血清样品分别用样品稀释液稀释，然后按照100μl/孔加入封闭后的酶标板中，置于37℃孵育1h，然后重复洗涤过程；其中，样品稀释液为含1％BSA、0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝8.0；待检样品、阴性样品和阳性样品分别用样品稀释液稀释1000倍、1000倍和2000倍。

进一步地，添加酶标抗体具体过程为：将酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释5000倍，然后按照100μl/孔加入封闭后的酶标板中，置于37℃孵育1h，重复洗涤过程；其中，所用酶标抗体为兔抗鸡酶标二抗；其中，酶标抗体稀释液为含1％BSA的PBST溶液。

进一步地，显色具体过程为：向酶标板中加入TMB显色液，加入量为100μl/孔，置于37℃显示15min；其中，TMB显色液通过以下方法制备得到：

A液：将0.2mol/L Na₂HPO₄和0.1mol/L柠檬酸混合，使溶液pH＝4.5，接着加蒸馏水至100ml，制得pH＝4.5的磷酸-柠檬酸缓冲液，最后加入2％H₂O₂，磷酸-柠檬酸缓冲液和2％H₂O₂的体积比为1000:1.5；

B液：将TMB溶于无水乙醇中，使其浓度为2mg/ml；

将A液和B液按体积比为20:1混合。

进一步地，终止反应具体过程为：向酶标板中加入终止液终止反应，加入量为50μl/孔，然后在450nm下测定OD₄₅₀值；其中，终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液。

进一步地，终点稀释法为：免疫血清OD₄₅₀值/免疫前血清OD₄₅₀值≥2.1，OD₄₅₀值>0.2，判断为阳性，以样品中出现阳性反应的最高稀释度来判定抗体效价；

标准曲线法为：免疫血清OD₄₅₀值/免疫前血清OD₄₅₀值≥2.1，OD₄₅₀值>0.2，判断为阳性；以标定效价的SPF鸡标准抗血清建立标准曲线，根据测定的OD₄₅₀值获得被检样品阳性抗体的ELISA效价测定值，ELISA效价测定值×稀释倍数，即为被检样品cLHRH抗体效价。

本发明提供的用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，具有以下有益效果：

我们设计合成了ELISA包被用cLHRH抗原，并通过包被及抗体反应条件等方面优化试验，建立了适用于鸡血清中cLHRH抗体效价测定的间接ELISA方法，并通过天然鸡促黄体素释放激素(cLHRH)的ELISA抑制试验以及免疫前血清(阴性对照)的平行测定试验，证实了该ELISA方法的特异性。通过终点稀释法，以P/N≥2.1且OD_450nm>0.2的最高稀释度作为判定标准，可清澈判定免疫鸡血清中的cLHRH抗体效价。为了进一步规范ELISA检测程序、数据处理和结果判定，我们采用SPF鸡免疫及非免疫血清作为阳性及阴性质控，以标定效价的SPF鸡标准抗血清建立标准曲线，通过标准曲线法，根据一个稀释度检验样品的OD_450nm平均值来精确判定样品的cLHRH抗体效价，并采用ELISA数据处理软件(Skanlt software 4.1，Thermo)自动分析和报告检测结果，从而保证了抗体ELISA效价检测结果的准确性、可靠性、稳定性和可比性，为规范疫苗效力检验SOP提供了依据。

附图说明

图1为包被时间与pH对间接ELISA(OD₄₅₀)的影响结果，其中，(+)为cLHRH阳性SPF鸡免疫血清；(-)为非免疫SPF鸡阴性血清。

图2为包被抗原浓度对ELISA反应(OD₄₅₀)的影响结果，其中，2^#、5^#、9^#、15^#(此处为样品标号)为疫苗免疫肉鸡(九斤)抗血清；阴性2^#、阴性3#、阴性7^#、阴性11^#为非免疫肉鸡阴性血清。

图3为pH值及肽酶抑制剂对ELISA检测结果(OD₄₅₀)的影响结果，其中酶抑制剂(+，添加；-，不添加)，血清样品(+，阳性血清；-，阴性血清)。

图4为cLHRH激素抗原对疫苗免疫血清不同稀释度的抑制效应图，其中，血清样品(+，阳性血清；-，阴性血清)，cLHRH(+，抑制组；-，对照组)。

图5为cLHRH激素抗原对不同免疫血清样品的ELISA抑制效应图，其中，cLHRH(+)为抑制实验组；cLHRH(-)为对照实验组。

图6为ELISA终点稀释法测定鸡血清cLHRH抗体效价结果图，其中，1^#、2^#、3^#(+)为免疫后血清样品；C1、C2、C3(－)为免疫前血清样品(阴性对照)。

具体实施方式

实施例1

1、所用试剂

包被抗原：cLHRH-Lys10-cLHRH，为人工合成的抗原多肽，分子量为3353.82，纯度为90.82％，浓度为1mg/ml；其中，氨基酸序列为：

酶标抗体：兔抗鸡酶标二抗，购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

包被缓冲液：0.1mol/L，pH＝9.0及pH＝7.4磷酸缓冲液。

洗涤液PBST：0.01mol/L，pH7.4磷酸缓冲盐水(PBS)+0.05％吐温-20。

封闭液：含2％明胶+0.05％吐温-20的0.1mol/L，pH＝9.0磷酸缓冲液。

复方肽酶抑制剂Cocktail：购于BIO-TOOL公司。

样品稀释液：含1％BSA+0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail+0.05％吐温-20的0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液。

酶标抗体稀释液：含1％BSA的PBST。

标准血清：为SPF鸡疫苗免疫血清，标定抗体ELISA效价为16000。

阳性质控血清：为SPF鸡疫苗免疫血清，标定抗体ELISA效价为16408。

阴性质控血清：为非免疫SPF鸡阴性血清。

待检血清样品：免疫SPF鸡血清及其免疫前血清样品。

TMB显色液：

A液：将0.2mol/L Na₂HPO₄(28.4g/L)25.7ml，0.1mol/L柠檬酸(19.2g/L)适量，混匀，使溶液pH＝4.5，加蒸馏水至100ml，再加2％H₂O₂ 150μl；

B液：将TMB溶于无水乙醇中，使其浓度为2mg/ml；

临用时将A液和B液按体积比为20:1混合。

终止液：2mol/L硫酸溶液。

2、间接ELISA基本操作步骤

(1)将所有试剂置于18-25℃

(2)包被

用包被缓冲液将包被抗原稀释，然后加入酶标板的酶标孔内，每孔加入量为100μl，4℃包被12h；

(3)洗涤

每孔加300μl洗涤液洗涤包被的酶标板，洗涤4-5次，每次4-5min，拍干；

(4)封闭

向拍干后的酶标板中加入封闭液封闭，每孔加300μl，置于37℃孵育2h，重复步骤(3)；

(5)加样

将待检样品、阴性样品(阴性质控血清样品)、阳性样品(阳性质控血清样品)和标准血清样品分别用样品稀释液稀释，然后按照100μl/孔加入封闭拍干后的酶标板中，置于37℃孵育1h，重复步骤(3)；

(6)添加酶标抗体

将酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释5000倍，然后按照100μl/孔加入封闭拍干后的酶标板中，置于37℃孵育1h，重复步骤(3)；

(7)显色

加入TMB显色液，每孔100μl，置于37℃显示15min；

(8)终止

每孔加入50μl终止液终止反应，然后在450nm下测定OD_450nm值。

3、ELISA条件的优化

(1)包被

①温度

在2-8℃、18-25℃(室温)及37℃等不同温度条件下的包被试验比较结果表明，温度对包被所需的时间有一定的影响，关键是要给予充分的反应时间。鉴于包被抗原为小分子多肽的特点，为了减少潜在蛋白酶(肽酶污染)对包被抗原多肽的催化降解，我们选择了低温2-8℃包被，优选4℃包被，以保证ELISA方法的稳定性。

②pH

采用pH7.4及pH9.0，0.1mol/L磷酸缓冲液，我们重点对中性及碱性包被条件进行了比较。

③时间

在上述条件下，我们比较了0.5、2和12小时等不同包被时间对ELISA反应灵敏度(OD_450nm)的影响，结果如图1和表1所示。

表1包被时间与pH对间接ELISA(OD_450nm)的影响

由图1、表1可见，随着包被时间从0.5h延长到12h，阳性血清OD_450nm值明显升高，而阴性血清的OD_450nm值变化不明显；包被pH9.0优于pH7.4。根据试验结果，我们选择pH9.0，0.1mol/L磷酸缓冲液作为包被缓冲液，并将包被时间从常规的1-2h延长到12h，以保证充分的抗原包被效率和ELISA反应灵敏度。

④最适包被浓度

在预备试验中，我们采用了1μg/ml(100ng/孔)的包被浓度。最适包被浓度试验是在其他反应条件优化的前提下进行的，将抗原肽以pH9.0，0.1mol/L磷酸溶液稀释，使其终浓度分别为5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml、500ng/ml、250ng/ml及125ng/ml，用于包被，用SPF鸡或肉鸡免疫血清及非免疫对照鸡血清样品进行间接ELISA试验，获取包被浓度与OD_450nm之间的相关曲线，结果如图2所示，各数据参见表2。

表2包被抗原浓度对ELISA反应(OD_450nm)的影响

由图2和表2可知，当包被浓度从125ng/ml上升到500ng/ml以上的时候，阳性血清OD_450nm值急剧上升；当从500ng/ml继续上升到5μg/ml的时候阳性血清OD_450nm值基本不再升高；阴性血清OD_450nm值不随包被浓度变化而变化。因此500ng/ml的包被浓度已经到达饱和包被浓度，为保证更稳定的效果，我们定1μg/ml为最适包被浓度。

(2)封闭

ELISA板通常可选用含1％-2％明胶、BSA或酪蛋白的PBST进行封闭。考虑到明胶的抗原“惰性”，可最大限度地避免血清异嗜抗体或其他因素所造成的非特异性交叉反应，我们选用含2％明胶及0.05％吐温-20的pH9.0，0.1mol/L磷酸缓冲液，按常规，于37℃反应2小时封闭ELISA板。

(3)抗体反应缓冲液的pH值及肽酶对ELISA检测的影响

鉴于ELISA包被抗原cLHRH-Lys10-cLHRH为小分子多肽，考虑到血清样品中普遍存在的肽酶潜在污染，通过在血清稀释液中添加复方肽酶抑制剂Cocktail(BIO-TOOL)，发现肽酶对ELISA检测影响较大。在pH分别为7.0、7.5、8.0和8.5抗体稀释缓冲液中不添加与添加0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail(BIO-TOOL)对比试验，采用1：2000稀释的鸡免疫血清及阴性对照作ELISA试验，测定OD_450nm值,在考察pH值因素的同时，进一步验证肽酶对ELISA检测的影响，如图3所示(参见表3)。

表3pH值及肽酶抑制剂对ELISA检测结果(OD_450nm)的影响

注：P/N为阳性血清OD_450nm值/阴性血清OD_450nm值。

由图3和表3可知，随着pH值的升高，免疫血清和未免疫血清OD_450nm值均升高，并且使用复方肽酶抑制剂Cocktail的免疫血清OD_450nm值明显高于未使用肽酶抑制剂的，提升了ELISA检测cLHRH抗体的灵敏度。免疫血清pH＝8.0和pH＝8.5时OD_450nm值上升非常快速，使用复方肽酶抑制剂Cocktail的免疫血清P/N比在pH＝8.0时出现峰值，提升了ELISA检测cLHRH抗体的特异性。因此我们选择cLHRH抗体反应的缓冲液为含有0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail的0.1mol/L，pH＝8.0的磷酸缓冲液。

4、间接ELISA方法的特异性

以下为cLHRH激素(标准抗原)对鸡免疫血清ELISA反应的抑制试验：

(1)免疫血清梯度稀释条件下的cLHRH激素ELISA抑制试验

将鸡免疫血清和非免疫阴性血清按照250、500、1000、2000、4000倍梯度稀释，分别加入cLHRH激素，使其终浓度为1.5ug/ml，37℃孵育1h后作ELISA试验，每个样品3个重复，并设无cLHRH激素免疫与非免疫血清对照，测定OD_450nm值。根据添加cLHRH激素的抑制组与无cLHRH激素对照组的OD_450nm值比值，计算抑制率，结果如表4所示，参见图4。

表4cLHRH激素对疫苗免疫血清不同稀释度的抑制效应

由图4和表4可知，添加cLHRH激素对不同稀释度的免疫血清ELISA反应均具有显著的抑制效应，1:250稀释的免疫血清因抗体过量，故ELISA抑制率较低，其余血清稀释度的ELISA反应抑制率均稳定在50％左右；非免疫阴性血清未显示任何抑制效应。标准激素抗原对免疫血清抗体间接ELISA反应的显著而且稳定的抑制效应，不仅证明了ELISA反应的特异性，同时表明cLHRH抗体在体外能与cLHRH激素特异性结合。

(2)cLHRH激素对不同免疫血清样品的ELISA抑制验证试验

为进一步验证cLHRH激素的抑制效应，采用5份免疫血清及非免疫鸡阴性血清重复试验。1000倍稀释血清样品后，分别加入终浓度为1.5ug/ml cLHRH激素，37℃作用1h。重复4次，并设无鸡cLHRH激素对照，测定OD_450nm值。根据添加cLHRH激素抑制组与无cLHRH激素对照组OD_450nm值的比值，计算抑制率，结果如表5所列，见图5。

表5免疫血清及非免疫鸡阴性血清cLHRH抑制验证试验

由图5和表5可知，添加cLHRH激素对不同SPF鸡及肉鸡免疫血清ELISA反应均具有显著的抑制效应；非免疫阴性血清未显示任何抑制效应。进一步验证了ELISA反应的特异性。

5、终点稀释法测定cLHRH抗体效价

终点稀释法是抗体ELISA效价测定的常规方法，通常以样品出现阳性反应(P/N≥2.1)的最高稀释度来判定抗体ELISA效价。为了验证间接ELISA方法用于免疫鸡血清中cLHRH抗体检测的有效性，我们以免疫前血清作为阴性对照，通过终点稀释法对疫苗免疫肉鸡及SPF鸡血清样品中cLHRH抗体进行了测定，此方法应用于前期实验室研究。

以实验室研究制备的cLHRH融合蛋白抗原乳化后，免疫九斤黄肉鸡部分代表性血清样品的检测结果为例，我们将免疫前与免疫后的血清样品从1:250起始做2倍递增稀释，进行间接ELISA检测，根据免疫后血清OD_450nm/免疫前血清OD_450nm计算P/N值，以样品出现阳性反应(P/N≥2.1)的最高稀释度来判定抗体ELISA效价，结果如图6所示，参见表6。

表6免疫前后鸡血清终点稀释法OD_450nm的测定值

注：*表示OD_450nm＞0.2且P/N≥2.1的最高稀释度。

由表6可见，不同稀释度所有免疫前血清样品均OD_450nm＜0.2，而免疫血清OD_450nm对应不同样品稀释度呈现良好的递减梯度；而且当免疫血清OD_450nm＞0.2且P/N≥2.1的最高稀释度判定，3份免疫血清抗体ELISA效价1#为8000、2#8000及3#16000。

因此，根据“样品出现阳性反应的最高稀释度”的抗体ELISA效价判定原则，我们以“P/N≥2.1，且OD_450nm>0.2的最高稀释度”，作为免疫鸡血清抗体ELISA效价的判定标准，以保证结果判定的准确性和可靠性。实验室前期研究中鸡血清cLHRH抗体ELISA检测，上千份免疫血清样品与其免疫前血清样品的检测结果表明，该方法特异性强，敏感度高，结果判定标准明确，可清澈判定免疫鸡血清中cLHRH抗体ELISA效价。

6、标准曲线法测定cLHRH抗体效价

为了进一步规范ELISA检测程序、数据处理和结果判定，我们采用SPF鸡免疫及非免疫血清作为阳性及阴性质控，以标定效价的SPF鸡标准抗血清建立标准曲线，通过标准曲线法，根据一个稀释度检样的OD_450nm平均值来精确判定样品的cLHRH抗体效价，并采用ELISA数据处理软件(Skanlt software 4.1，Thermo)自动分析和报告检测结果，以期保证抗体ELISA效价检测结果的准确性、有效性、稳定性和可比性，为规范疫苗效力检验SOP提供了依据。

(1)SPF鸡免疫血清cLHRH抗体效价的标定

首先，我们采用终点稀释法对批量混合的SPF鸡疫苗免疫血清cLHRH抗体效价进行标定，用非免疫SPF鸡血清作阴性对照，以P/N≥2.1(P/N为免疫血清OD_450nm值/免疫前血清OD_450nm值)，且OD_450nm>0.2的最高稀释度判定抗体效价。如此进行5次独立试验的重复测定，每次独立测定又包含3个重复，计算所有15个抗体效价测定结果的平均值为19200，即获得该血清的标定ELISA效价，结果参见表7。

表7SPF鸡免疫血清cLHRH抗体ELISA效价的标定

(2)标准阳性血清的分装与保存

从标准曲线和稀释计算方便起见，我们将标定抗体效价为19200的SPF鸡免疫血清用无菌生理盐水稀释抗体效价至16000，混匀，按50μl及100μl批量分装，作为标准阳性血清。

(3)标准曲线的建立

将cLHRH抗体效价为16000的标准血清作125、250、500、1000、2000、4000、8000及16000倍梯度稀释，获得抗体效价为128、64、32、16、8、4、2、1的标准血清稀释液，通过ELISA测定各稀释度抗体效价所对应的OD_450nm值，用ELISA数据处理软件(Skanlt software 4.1，Thermo)中的自定义法生成标准曲线，获取相关系数R²。反复进行6个独立试验的重复测定，所得标准曲线中R²分别为0.999、0.999、0.995、1.000、0.995及0.996，均在0.995以上，表明各稀释度的OD_450nm值与相应抗体效价有极显著(≥0.99)的相关关系。

(4)标准曲线法抗体ELISA效价测定结果的稳定性及试验有效性判定标准

选取1只SPF鸡cLHRH免疫血清用终点稀释法进行三次独立试验，每次三个重复，标定其ELISA抗体效价。然后将该免疫血清稀释1000倍，通过标准曲线法测定其抗体ELISA效价；同时将非免疫SPF鸡阴性血清稀释1000倍，重复测定OD_450nm值；共进行6次独立试验的重复测定，每次试验，阳性血清和阴性血清均做三个重复，计算平均值、标准差、变异系数等相关参数，以期验证标准曲线法ELISA试验的稳定性及检测结果的可重复性。以此标定抗体ELISA效价的免疫SPF鸡阳性血清及标定OD_450nm值的非免疫SPF鸡阴性血清作为阳性及阴性质控，并依据标准差、变异系数等相关参数确定阳性质控和阴性质控ELISA测定值置信区间，制定ELISA试验有效性判定标准。

①终点稀释法标定SPF鸡cLHRH免疫血清

选取1只SPF鸡cLHRH免疫血清用终点稀释法进行三次独立试验，每次三个重复，标定其ELISA抗体效价，结果如表8。表8显示SPF鸡cLHRH免疫血清抗体效价平均值为16000，SD为6928，变异系数为43.3％，将此血清做为阳性质控血清。

表8终点稀释法标定SPF鸡cLHRH免疫血清OD_450nm以及抗体效价

②标准曲线法抗体ELISA效价测定结果的敏感性、稳定性和准确性

用标准曲线法对免疫SPF鸡阳性质控血清的6次重复测定结果及相关参数见表9。

表9阳性质控血清OD_450nm与抗体效价测定值及相关参数

注：质控血清(2000倍稀释)经标准曲线法检测，其效价平均值：16408；标准差：2292；变异系数：13.97％。

标准曲线法抗体ELISA效价测定结果的敏感性：

用终点稀释法标定的阳性质控血清，阳性质控血清测得抗体效价分别有8000、16000、32000等不同的的抗体效价(见表8)，差距达到2倍，有效数字精确到千位；而标准曲线法标定阳性质控血清，由于标准曲线的存在，检测的阳性质控血清抗体效价分别为14328、13914、16126、15948、18262、19872，有效数字精确到个位。故标准曲线法比终点稀释法的精确度高，检测灵敏性高，标准曲线法的敏感性好。

标准曲线法抗体ELISA效价测定结果的稳定性和准确性：

阳性质控血清经标准曲线法测定所得抗体效价平均值(Mean)为16408，变异系数为13.97％，与终点稀释法标定的抗体效价(16000)和变异系数(43.3％)相比，抗体效价平均值符合率为97.52％，但变异系数明显降低，具有更高的可信度。根据标准曲线法变异系数(CV，13.97％)来考察6次独立测定结果的重复性，可见抗体ELISA效价测定结果具有良好的稳定性，测定值与标定值的偏差仅为13.97％，检测结果可信度高达86.03％，可有效保证检验样品抗体效价测定结果的准确性和可靠性。

非免疫SPF鸡阴性血清6次重复测定结果及相关参数见表10。

表10非免疫SPF鸡阴性血清的6次重复测定结果(OD_450nm值)

注：阴性质控血清平均OD_450nm值：0.1473；标准差：0.0186；变异系数：12.65％。

由表10可知，阴性对照OD_450nm平均值为0.1473，变异系数为12.65％，从ELISA阴性反应的角度，进一步证明了间接ELISA方法的特异性和稳定性。

③试验有效性判定标准

以上述标定抗体ELISA效价(16408)的免疫SPF鸡阳性血清及标定OD_450nm值(0.1473)的非免疫SPF鸡阴性血清作为阳性及阴性质控，用以判定ELISA检测试验的有效性。

对阳性质控血清，根据6次独立重复测定值所得的平均值16408，标准差2292，变异系数13.97％，确定抗体效价测定值有效性范围在16408±3SD(9532～23284)之间，理论允许偏差41.91％(13.97％×3)。

对阴性质控血清，根据6次独立重复测定值所得的平均值0.1473，标准差0.0186，平均值0.1473+3SD＝0.2031，我们以阴性质控血清OD_450nm值<0.2作为试验有效性的判定标准，从而，有效避免背景显色对ELISA特异性判定的干扰。

在本发明中，我们设计合成了ELISA包被用cLHRH抗原，并通过包被及抗体反应条件等方面优化试验，建立了适用于鸡血清中cLHRH抗体效价测定间接ELISA方法，并通过天然鸡促黄体素释放激素(cLHRH)的ELISA抑制试验以及免疫前血清(阴性对照)的平行测定试验，证实了该ELISA方法的特异性。

终点稀释法作为cLHRH抗体ELISA测定的基本方法，以免疫前血清作为阴性对照，按P/N≥2.1(免疫血清OD_450nm值/免疫前血清OD_450nm值)，且OD_450nm>0.2的样品阳性反应最高稀释度判定cLHRH抗体ELISA效价，可用于疫苗免疫鸡cLHRH抗体效价的半定量测定，对标准血清或质控血清等没有要求，尤其适用于田间免疫效力的评判。

针对疫苗效力检验在质量控制及精确定量等方面的特殊要求，为了进一步规范ELISA检测程序、数据处理和结果判定，采用SPF鸡免疫及非免疫血清作为阳性及阴性质控，以标定效价的SPF鸡标准抗血清建立标准曲线，采用ELISA数据处理软件(Skanlt software4.1，Thermo)自动分析和报告检测结果，根据一个稀释度检验样品的OD_450nm平均值对应标准曲线获得ELISA效价测定值，乘以稀释倍数即为该血清的cLHRH抗体效价。对标准抗血清6次重复测定值与标定值的偏差仅为13.97％，检测结果准确性可信度度高达86.03％，适于样品的cLHRH抗体效价的精确测定。为保证ELISA测定结果的可靠性，P/N≥2.1(免疫血清OD_450nm值/免疫前血清OD_450nm值)的前提下，建议以标准曲线相关系数R²>0.95,阳性质控血清抗体效价测定值在16408±3SD(9532～23284)范围，阴性质控血清平均OD_450nm值<0.2，作为试验有效性的判定依据。

Claims

1.一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：制备包被抗原、包被、洗涤、封闭、加样、添加酶标抗体、显色、终止反应和效价测定，其首次设计了含有双抗原表位和多聚赖氨酸的合成肽作为包被抗原且首次建立了含有该包被抗原的ELISA方法，用于测定鸡血清中cLHRH抗体的效价；其中，包被抗原为cLHRH-Lys10-cLHRH，分子量为3353.82，纯度大于90％，包被抗原中的氨基酸序列为：

效价测定是通过终点稀释法或标准曲线法进行测定。

2.根据权利要求1所述的用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，其特征在于，包被具体过程为：用包被缓冲液将包被抗原稀释至0.5-1μg/ml，然后加入酶标板的酶标孔内，每孔加入量为80-100μl，2-8℃包被12h；其中，包被缓冲液为0.1mol/L，pH＝9.0的磷酸缓冲液；

洗涤具体过程为：每孔加300μl洗涤液洗涤包被的酶标板，洗涤4-5次，每次4-5min，拍干；其中，洗涤液为含0.05％吐温-20，浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸缓冲液；

封闭具体过程为：向洗涤后的酶标板中加入封闭液封闭，每孔加300μl，置于37℃孵育2h，然后重复洗涤过程；其中，封闭液为含2％明胶和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝9.0。

3.根据权利要求1所述的用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，其特征在于，加样具体过程为：将待检样品、阴性样品、阳性样品和标准血清样品分别用样品稀释液稀释，然后按照100μl/孔加入封闭后的酶标板中，置于37℃孵育1h，然后重复洗涤过程；其中，样品稀释液为含1％BSA、0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝8.0；待检样品、阴性样品和阳性样品分别用样品稀释液稀释1000倍、1000倍和2000倍。

4.根据权利要求1所述的用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，其特征在于，添加酶标抗体具体过程为：将酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释5000倍，然后按照100μl/孔加入封闭后的酶标板中，置于37℃孵育1h，重复洗涤过程；其中，所用酶标抗体为兔抗鸡酶标二抗；其中，酶标抗体稀释液为含1％BSA的PBST溶液。

5.根据权利要求1所述的用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，其特征在于，显色具体过程为：向酶标板中加入TMB显色液，加入量为100μl/孔，置于37℃显示15min；其中，TMB显色液通过以下方法制备得到：

B液：将TMB溶于无水乙醇中，使其浓度为2mg/ml；

将A液和B液按体积比为20:1混合。

6.根据权利要求1所述的用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，其特征在于，终止反应具体过程为：向酶标板中加入终止液终止反应，加入量为50μl/孔，然后在450nm下测定OD₄₅₀值；其中，终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液。

7.根据权利要求1所述的用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法，其特征在于，终点稀释法为：免疫血清OD₄₅₀值/免疫前血清OD₄₅₀值≥2.1，OD₄₅₀值>0.2，判断为阳性，以样品中出现阳性反应的最高稀释度来判定抗体效价；

8.一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的包被抗原，其特征在于，所述包被抗原为含有双抗原表位和多聚赖氨酸的cLHRH-Lys10-cLHRH，分子量为3353.82，纯度大于90％，包被抗原中的氨基酸序列为：

9.一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的样品稀释液，其特征在于，所述样品稀释液为含1％BSA、0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝8.0。

10.一种用于检测禽类血清中LHRH抗体效价的ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括独立分装的以下成分：包被抗原、酶标抗体、包被缓冲液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、标准血清、阳性质控血清、阴性质控血清、TMB显色液和终止液；

其中，包被抗原为含有双抗原表位和多聚赖氨酸的cLHRH-Lys10-cLHRH，分子量为3353.82，纯度大于90％，包被抗原中的氨基酸序列为：