CN107643397A - 一种用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条，包括NMO‑IgG分型膜条，所述NMO‑IgG分型膜条上吸附有小肽A、小肽C和小肽E；小肽A的氨基酸序列从N端到C端为TINWGGTEKPLPVDMV；小肽C的氨基酸序列从N端到C端为CVTPPSVVGGLGVTTVHGNLTAG；小肽E的氨基酸序列从N端到C端为INYTGASMNPARSFGPAVIMGNWENHW。该用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条能够对NMO患者体液中的NMO‑IgG进行精准分型，协助临床做出精确诊断，从而对症下药；目前，本发明的分型方法在国际和国内均属首次，具有明显的进步意义。
Description
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，具体是一种用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条。
背景技术
视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSDs)是一种严重的神经系统退行性疾病，在东亚地区发病率远高于欧美。绝大多数NMOSD患者血液中能够检测到水通道蛋白4(AQP4)的自身抗体(NMO-IgG)，这已经成为诊断该疾病的重要标志物。虽然AQP4自身抗体产生的原因尚不清楚，但其致病机制却已经基本明了：该自身抗体穿越血脑屏障后攻击中枢神经系统的星形胶质细胞，通过特异性的细胞毒性作用导致星形胶质细胞凋亡，继而引起中枢神经系统发生脱髓鞘病变。在NMOSDs 2015年的诊断标准中已将AQP4自身抗体阳性列为其中一项。
近期的研究表明，不同种类的NMO-IgG对AQP4的攻击靶点也不同，其种类也可以分为数种，其中疾病特异性及致病毒性也有显著的差异。如果能对其种类进行精确的鉴别和区分，临床上就可以对症下药，进行精准医疗。遗憾的是，目前国际上对该自身抗体的分型仅仅处于研发的起步阶段。
当下，对NMOSD疾病的诊断除了临床症状之外，还可以通过ELISA法和基于细胞的免疫荧光法(CBA法)，其反应的原理均是通过抗原抗体之间的特异性结合。目前临床上采用最多的是CBA法：通过在特定细胞中过表达AQP4蛋白，进而将稀释不同浓度的患者血清与其共孵育，最后人工镜检荧光强度来判断患者血清中NMO-IgG的阴阳性和抗体滴度。该方法仅可通过荧光强弱判断出NMO-IgG的有或无，以及通过稀释血清来获得半定量的病毒滴度，并不能精确的为患者体内的NMO-IgG种类进行鉴别。至于应用较少的ELISA法，其虽然能够定量地检测出患者体内NMO-IgG的浓度，但目前世界上依然没有一种ELISA试剂盒能够鉴别患者体内的NMO-IgG种类。因此上述粗糙的鉴定方式已不能满足临床精准医学的需求。
因此，本发明提供一种用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条，将AQP4蛋白三种不同的胞外抗原决定簇合成并转印在PVDF膜上，随后利用该膜条检测NMO-IgG阳性患者血清内NMO-IgG的类型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条，包括NMO-IgG分型膜条，所述NMO-IgG分型膜条上吸附有小肽A、小肽C和小肽E；
小肽A的氨基酸序列从N端到C端为TINWGGTEKPLPVDMV；
小肽C的氨基酸序列从N端到C端为CVTPPSVVGGLGVTTVHGNLTAG；
小肽E的氨基酸序列从N端到C端为INYTGASMNPARSFGPAVIMGNWENHW。
一种用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条的制备方法，所述NMO-IgG分型膜条的制备方法包括以下步骤：
1)、以AQP4细胞膜外抗原优势表位序列为蓝本，设计并合成三种小肽，随后用超纯水分别溶解三种小肽，三种小肽溶解后的溶液浓度均为1微克每微升，再加入一定量上样缓冲液；
2)、随后通过蛋白质电泳及转膜技术将三种小肽转移到PVDF膜上，即得NMO-IgG分型膜条。
作为本发明进一步的方案：所述NMO-IgG分型膜条的使用方法包括以下步骤：
一、首先利用脱脂奶粉封闭NMO-IgG分型膜条，室温封闭1小时，随后将NMO-IgG分型膜条浸没于一定稀释倍数的待测患者血清中进行孵育；
二、再利用TBST清洗1遍，清洗时间为5分钟，温度为室温，随后添加交联了辣根过氧化物酶(HRP)的驴抗人二抗继续孵育；最后用TBST洗涤三次后添加ECL，利用感光胶片曝光显影或直接利用相机直接拍摄。
作为本发明进一步的方案：步骤一、首先利用脱脂奶粉封闭NMO-IgG分型膜条，室温封闭2小时，随后将NMO-IgG分型膜条浸没于一定稀释倍数的待测患者血清中进行孵育，孵育温度为37℃，孵育时间为2小时。
作为本发明进一步的方案：患者血清稀释倍数为10-1000倍。
作为本发明进一步的方案：步骤二、再利用TBST清洗1遍，清洗温度为25℃，清洗时间为5分钟，随后添加交联了辣根过氧化物酶(HRP)的驴抗人二抗继续孵育，孵育温度为25℃，孵育时间为1小时，二抗上附着HRP基团；最后用TBST在25℃下洗涤三次后添加ECL，利用感光胶片曝光显影或直接利用相机直接拍摄。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条能够对NMO患者体液中的NMO-IgG进行精准分型，协助临床做出精确诊断，从而对症下药；目前，本发明的分型方法在国际和国内均属首次，具有明显的进步意义。
附图说明
图1为本发明的膜条的结构示意图。
图2为本发明实验例1的膜条检测图。
图3为本发明实验例2的膜条检测验证图之一。
图4为本发明实验例2的膜条检测验证图之二。
其中：1-NMO-IgG分型膜条。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
请参阅图1-4，一种用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条，包括NMO-IgG分型膜条1，所述NMO-IgG分型膜条1上吸附/粘附有小肽A、小肽C和小肽E；
以AQP4细胞膜外抗原优势表位序列为蓝本，合成三种小肽，分别为：
小肽A，小肽A的氨基酸序列从N端到C端为TINWGGTEKPLPVDMV；
小肽C，小肽C的氨基酸序列从N端到C端为CVTPPSVVGGLGVTTVHGNLTAG；
小肽E，小肽E的氨基酸序列从N端到C端为INYTGASMNPARSFGPAVIMGNWENHW；
所述NMO-IgG分型膜条1的制备方法，包括以下步骤：
1)、先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳在同一个泳道内利用三种小肽分子量上的差异进行分离，三种小肽上样量相同；具体步骤为：以AQP4细胞膜外抗原优势表位序列为蓝本，设计并合成三种小肽，随后用超纯水分别溶解三种小肽，三种小肽溶解后的溶液浓度均为1微克每微升，再加入一定量上样缓冲液；
2)、随后通过蛋白质电泳和转膜技术将三种小肽转移到PVDF膜上，即得NMO-IgG分型膜条；具体步骤为：利用滤纸剪出约2毫米X5毫米的长方形滤纸条，随后三种小肽溶解液分别用移液器吸取2微升转移至滤纸上不同位置，并让滤纸完全吸收，再将滤纸转移到PVDF膜上，通过湿转将三种小肽转印到PVDF膜上不同位置，可通过丽春红染色确定三种小肽在膜上的位置后，将有条带的PVDF膜割下，最后制备成NMO-IgG分型膜条1；
所述NMO-IgG分型膜条1的使用方法，包括以下步骤：
一、首先利用脱脂奶粉封闭NMO-IgG分型膜条1，室温封闭2小时，随后将NMO-IgG分型膜条1浸没于一定稀释倍数的待测患者血清中进行孵育，患者血清：TBS为1：(10-1000)，孵育温度为37℃，孵育时间为2小时；
二、再利用TBST清洗1遍，清洗时间为5分钟，温度为室温，优选25℃，随后添加交联了辣根过氧化物酶(HRP)的驴抗人二抗继续孵育；驴抗人二抗继续孵育，孵育温度为25℃，孵育时间为1小时，二抗上附着HRP基团；最后用TBST在25℃下洗涤三次后添加ECL，利用感光胶片曝光显影或直接利用相机直接拍摄，可用柯达胶片显影。利用该方法能够有效检测出NMO患者血清中与NMO-IgG分型膜条1上相对应小肽的NMO-IgG；通过精准分型，可以为患者后续针对性治疗提供关键性诊断参考。
实验例1
利用实施例1的NMO-IgG分型膜条1检测两位临床上已确诊为NMO的患者血清(分别为患者甲、乙)，检测结果见图2，发现左侧泳道患者甲血清中同时含有针对三种小肽的NMO-IgG，但是其中针对小肽E的NMO-IgG含量较少。右侧泳道的患者乙血清中则同时含有针对小肽A和小肽C的NMO-IgG，并未检测到针对小肽E的NMO-IgG。
实验例2
根据实验例1检测结果，将患者乙血清分别进行两组NMO动物模型试验，并验证NMO-IgG分型膜条1检测的可靠性，图3中，左图为将患者乙血清分别与BSA共孵育，及与小肽E共孵育之后再注射入大鼠中枢神经系统，通过行为学检测发现小肽E并不能有效降低患者血清中NMO-IgG的毒性。随后将患者乙血清分别与BSA共孵育，及与小肽A和小肽C共孵育之后再注射入大鼠中枢神经系统，通过行为学检测发现小肽A和小肽C可以显著降低患者血清中NMO-IgG的毒性。这一实验结果与NMO-IgG分型膜条1检测结果完全相符。
本发明的工作原理是：本发明的NMO-IgG分型膜条1，由于其上粘附有根据AQP4抗原决定簇氨基酸序列设计的多肽，因此能够通过抗原抗体反应结合相应的NMO-IgG，通过显影判断，该NMO-IgG分型膜条1能够特异性地分辨患者血清中的NMO-IgG的类型，从而为NMO-IgG分类，实现精准医疗，方便临床对症下药。为了进一步验证检验的可靠性，将患者乙血清用相应的多肽中和后，再加入NMO动物模型的脊髓中，相比NMO对照组，多肽中和组能有效降低NMO模型的行为学评分，降低疾病的症状。动物模型上的吻合，验证了该膜条检测的准确性。
该用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条能够对NMO患者体液中的NMO-IgG进行精准分型，协助临床做出精确诊断，从而对症下药；目前，本发明的分型方法在国际和国内均属首次，具有明显的进步意义。
在本用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“相连”及“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (6)
1.一种用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条，其特征在于，包括NMO-IgG分型膜条，所述NMO-IgG分型膜条上吸附有小肽A、小肽C和小肽E；
小肽A的氨基酸序列从N端到C端为TINWGGTEKPLPVDMV；
小肽C的氨基酸序列从N端到C端为CVTPPSVVGGLGVTTVHGNLTAG；
小肽E的氨基酸序列从N端到C端为INYTGASMNPARSFGPAVIMGNWENHW。
2.一种如权利要求1所述的用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条的制备方法，其特征在于，所述NMO-IgG分型膜条的制备方法包括以下步骤：
1)、以AQP4细胞膜外抗原优势表位序列为蓝本，设计并合成三种小肽，随后用超纯水分别溶解三种小肽，三种小肽溶解后的溶液浓度均为1微克每微升，再加入一定量上样缓冲液；
2)、随后通过蛋白质电泳及转膜技术将三种小肽转移到PVDF膜上，即得NMO-IgG分型膜条。
3.一种如权利要求1所述的用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条的使用方法，其特征在于，所述NMO-IgG分型膜条的使用方法包括以下步骤：
一、首先利用脱脂奶粉封闭NMO-IgG分型膜条，室温封闭1小时，随后将NMO-IgG分型膜条浸没于一定稀释倍数的待测患者血清中进行孵育；
二、再利用TBST清洗1遍，清洗时间为5分钟，温度为室温，随后添加交联了辣根过氧化物酶(HRP)的驴抗人二抗继续孵育；最后用TBST洗涤三次后添加ECL，利用感光胶片曝光显影或直接利用相机直接拍摄。
4.根据权利要求3所述的用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条的使用方法，其特征在于，步骤一、首先利用脱脂奶粉封闭NMO-IgG分型膜条，室温封闭2小时，随后将NMO-IgG分型膜条浸没于一定稀释倍数的待测患者血清中进行孵育，孵育温度为37℃，孵育时间为2小时。
5.根据权利要求4所述的用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条的使用方法，其特征在于，患者血清稀释倍数为10-1000倍。
6.根据权利要求3所述的用于视神经脊髓炎致病自身抗体分型的膜条的使用方法，其特征在于，步骤二、再利用TBST清洗1遍，清洗温度为25℃，清洗时间为5分钟，随后添加交联了辣根过氧化物酶(HRP)的驴抗人二抗继续孵育，孵育温度为25℃，孵育时间为1小时，二抗上附着HRP基团；最后用TBST在25℃下洗涤三次后添加ECL，利用感光胶片曝光显影或直接利用相机直接拍摄。
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