CN107643272B - 一种基于少通道tcspc和多探测器的时间分辨荧光测量系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于少通道TCSPC和多探测器的时间分辨荧光测量系统，包括：激光光源，用于发出高频脉冲激光以激发样品发出荧光；分光组件，用于将不同波长的所述荧光在空间中分开；多个光子探测器，设置在不同位置上，用于探测由所述分光组件分离开的不同波长的荧光，并将光信号转化为光电脉冲信号；单光子计数器，具有两个以上通道。所述多个光子探测器中的每一个光子探测器探测到的光电脉冲信号经过连接多个探测器的不同电路传递到所述单光子计数器的多个通道中，通过光电脉冲信号到达不同通道的时间差来确定光电探测器的编号。本发明通过采用多个探测器，计数器的利用效率最高可以大幅提高。

Description

一种基于少通道TCSPC和多探测器的时间分辨荧光测量系统

技术领域

本发明涉及时间分辨荧光测量技术领域，尤其涉及一种基于少通道时间相关单光子计数器(TCSPC)和探测器的时间分辨荧光系统。

背景技术

时间相关单光子计数(TCSPC，time-correlated single-photon counting)技术是在1960年代为检测被射线激发的闪烁体发光而建立的，后来人们把它应用到荧光寿命的测量。它具有时间分辨本领好，灵敏度高，测量精度高，动态范围大，输出数据数字化，便于计算机存贮和处理等优点。TCSPC时间分辨荧光测量系统(以下简称“TCSPC系统”)的结构和基本工作原理，如图1(a)所示，TCSPC系统通常采用高重复频率的激发光源，现在常用的有80Mhz，40MHz，20MHz，10MHz等，对应的脉冲间隔时间为12.5ns，25ns，50ns，100ns等，这个时间被称为一个激发周期。该高频脉冲激光光源被分为两束，此两束的物理特性完全相同。其中一束激光用于激发样品室内的样品(荧光物质)，样品受到激光光源照射发出荧光。由于荧光体系中可能存在弛豫过程，会使得荧光存在不同的寿命。该荧光通过滤波片、偏振片和聚焦透镜后进入单色仪。接着，通过单色仪的单色光进入光子探测器，光子探测器将光信号转换为光电脉冲信号，该光电脉冲信号(脉冲信号)经电缆(即通道ch1)传输到单光子计数器中。另一束激光作为同步脉冲信号(即通道ch0)，用于触发单光子计数器，计数器受到触发而开始计数。

第一束激光连续地发出单个脉冲，依次激发样品产生荧光；第二束激光的连续脉冲依次触发TCSPC系统，且此二束激光脉冲的激发和触发是同步进行的。由于是单光子计数器，每个激发周期时间内只记录第一个到达的光子信号。然后检测样品发射的第一个荧光光子到达光子计数器的时间。这里，一个激发周期被分成很多时间间隔，每个时间间隔即为一个时间通道。每个激发周期内被检测到的荧光光子均被依次送入各对应的时间通道中累加贮存，通过计算机处理就获得了与原始波形一致的直方图，在某一时间间隔内检测到光子的几率与荧光发射强度成正比例，重复多次测量就能得到荧光强度衰变的规律，如图1(b)所示。

图1(c)即是某一波长处的荧光衰减曲线，其中横轴表示时间，纵轴表示光子计数数量。图中曲线的上升沿就是零时刻，表示此时刻开始出现荧光辐射。可以通过ch0或者ch1的电缆线长度来调节该零时刻的位置。

测量不同波长下的时间分辨荧光光谱可以获得更多的激发态能级信息，所以可以测量不同波长下的时间分辨荧光光谱的设备是很有意义的。而传统的TCSPC系统每次激发时，要求被激发出的荧光足够弱，平均每个激发周期只能记录到0.01个光子以下，也就是说，平均激发100次才能探测到一个光子，尽量保证每个激发周期只有一个光子到达计数器，因此计数器的利用率不高。

因此，需要一种能提高计数器利用效率的时间分辨荧光测量系统。

发明内容

本发明基于上述现有技术的缺点，提出了一种基于少通道时间相关单光子计数器和多探测器的时间分辨荧光测量系统。通过单光子探测器光电脉冲信号经过不同电路到达时间相关单光子计数器不同时间通道的时间差别，确定单光子探测器的编号Di信息，之后将该光电脉冲与同步信号之间的时间间隔累加到单光子探测器Di对应的时间通道中，从而实现一种基于少通道时间相关单光子计数器和多探测器的时间分辨荧光光谱和成像的快速测量。

本发明的一种基于少通道时间相关单光子计数器和多探测器的时间分辨荧光测量系统，包括：激光光源，用于发出高频脉冲激光以激发样品发出荧光；分光组件，用于将不同波长的所述荧光在空间中分开；多个单光子探测器，设置在不同位置上，用于探测由所述分光组件分离开的不同位置的荧光，并将光信号转化为光电脉冲信号；时间相关单光子计数器，其具有两个及以上通道，其中，所述激光光源与所述时间相关单光子计数器的第零(Ch0)通道连接，向所述时间相关单光子计数器发送同步信号，所述多个单光子探测器中的每一个通过电路与所述时间相关单光子计数器的除第零通道外的其他不同通道分别连接，在一个激发周期内，所述时间相关单光子计数器在被第零通道的同步信号触发后开始计算来自某个单光子探测器的光电脉冲信号到达所述其他不同通道的到达时间，以及计算机，与所述时间相关单光子计数器连接，并执行下述功能：(i)获得来自某个单光子探测器的光电脉冲信号到达所述其他不同通道中的每一个通道的到达时间；(ii)通过来自某个单光子探测器的光电脉冲信号到达所述其他不同通道中的任意两个通道的到达时间之差来确定所述光电脉冲信号对应的单光子探测器的编号Di；以及(iii)将第(i)步骤中获得的到达时间累加到第(ii)步骤确定的单光子探测器的对应的时间通道中，完成Di通道的时间相关单光子计数。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明与传统的单光子计数器相比，通过采用多个探测器，单光子计数器的计数效率可以获得大幅提高，通过将多个单光子探测器在一维方向上排布在不同荧光波长处，可以快速地获得荧光光谱不同波长的荧光寿命。

2、本发明通过光学系统对荧光物质进行成像，并将多个单光子探测器在二维方向上排布在像面处，可以实现快速的荧光寿命成像。

附图说明

图1(a)是传统的TCSPC系统的原理图，图1(b)是时间通道原理图，图1(c)是零时刻示意图。

图2(a)是本发明的一实施例的基于少通道时间相关单光子计数器和多探测器的TCSPC系统的结构示意图，图2(b)是各探测器与各通道连接的示意图。

图3是本发明的一实施例的单光子计数器的时间通道示意图。

图4是本发明的一个实施例的Ch1长线连接的示意图。

图5是本发明的另一实施例的探测器等距排列的示意图。

图6是本发明的又一实施例的荧光寿命二维成像示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好地理解本发明的研究内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1

如图2所示，本发明的一实施例的一种基于少通道时间相关单光子计数器和多探测器的时间分辨荧光光谱测量系统，包括：激光光源1、分光组件2、多个单光子探测器3、时间相关单光子计数器4以及计算机5。

激光光源1用于发出高频脉冲激光以激发样品发出荧光。样品放置在样品室内。样品发出的荧光通过透镜达到分光组件2，其中透镜主要作用是将荧光聚焦到探测器上。分光组件2用于将不同波长的所述荧光在空间中分开。分光组件可以为光栅或棱镜等色散元件。多个单光子探测器3包括光子探测器D1～Dn，设置在不同位置上，用于探测由所述分光组件2分离开的不同位置的荧光，并将各荧光信号转化为光电脉冲信号。

单光子计数器4具有两个以上通道，本实施例中除用于发送同步信号的第零通道ch0外还具有3个通道，即第一通道ch1，第二通道ch2和第三通道ch3。其中，激光光源1与时间相关单光子计数器4的第零(Ch0)通道连接，向所述时间相关单光子计数器发送同步信号。多个单光子探测器3中的每一个通过电路与时间相关单光子计数器4的除第零通道外的其他不同通道(例如第一通道～第三通道)分别连接。在一个激发周期内，时间相关单光子计数器4在被第零通道的同步信号触发后开始计算来自某个单光子探测器3的光电脉冲信号到达所述其他不同通道的到达时间。

计算机5，与时间相关单光子计数器4连接，并执行下述功能：

(i)获得来自某个单光子探测器的光电脉冲信号到达所述其他不同通道中的每一个通道的到达时间；

(ii)通过来自某个单光子探测器的光电脉冲信号到达所述其他不同通道中的任意两个通道的到达时间之差来确定所述光电脉冲信号对应的单光子探测器的编号Di；以及

(iii)将第(i)步骤中获得的到达时间累加到第(ii)步骤确定的单光子探测器的对应的时间通道中，完成Di通道的时间相关单光子计数。

本发明的多探测器系统中，由于是单光子计数器，每个激发周期只会记录一个光子信号，而这个信号可能会来自于这n个单光子探测器中的任意一个。相比于传统的只有一个光子探测器的系统，本发明中的n个光子探测器探测到的光信号都会被记录下来，所以大幅提高了测量效率，缩短了测量时间。

下面介绍单光子计数器4与多个光子探测器3通过电路连接的情况。多个单光子探测器D1～Dn中的每一个通过第一电缆连接到第一通道ch1，并且多个单光子探测器的每一个通过第二电缆同时连接到第二通道ch2和第三通道ch3，来自各探测器3的光电脉冲信号通过电路分别到达单光子计数器4的各个通道中。那么，在一个激发周期内，单光子计数器4计算得到某个探测器3的光电脉冲信号通过电路分别到达第一通道的到达时间、第二通道的到达时间以及第三通道的到达时间。

通过上述的连接方式，计算机5获得前述第一通道的到达时间，并根据第二通道的到达时间以及第三通道的到达时间之差来确定与第一通道测得的光电脉冲信号到达时间对应的单光子探测器的编号，及对应的荧光波长，然后将ch1记录的光电脉冲信号到达时间累加到该探测器编号(或者波长)对应的时间通道中。之后多次累积，可以实现利用三个时间相关通道来同时测量n个荧光发射波长(即n个探测器)的荧光寿命。

本实施例中，如图3所示，类似于传统的单光子计数器，当单光子计数器4的第零通道Ch0接收到激光的同步脉冲信号时，单光子计数器4开始工作。随后，第一通道至第三通道Ch1、Ch2和Ch3在经过不同时间后分别接收到电脉冲信号。图3中，横轴表示时间(时间通道)，纵轴表示探测器的各个通道。例如，ch1通道的“停止1”表示接收到一个电脉冲信号(即某个探测器探测到一个光子)后停止计数，横轴上的时间即表示光电脉冲信号到达ch1通道的时间，以此类推。“停止2”和“停止3”之间的时间差Δt表示第二通道ch2和第三通道ch3之间的时间差，也就是光电脉冲信号到达第二通道ch2的时间和到达第三通道ch3的时间之间的差。

如前所述，在一个激发周期中可以探测到一个光子信号，但是本发明的系统具有多个光子探测器的情况下，还需要确定该一个光子信号是由哪个光子探测器探测到的。本发明是通过单光子计数器的第二通道ch2和第三通道ch3分别探测到电脉冲的时间间隔来确定是哪个光子探测器。因为不同的光子探测器与电缆连接的位置是不同的，即不同的光子探测器与光子计数器的ch2端口或ch3端口之间的电缆长度是不同的，所以每个探测器的电脉冲信号传递到ch2和ch3的时间也是不同的。利用这种ch2和ch3之间的时间差，可以将ch1测得信号与具体的探测器一一对应。而该时间差，通过事先设定好的各光子探测器的电缆线长度可以计算得到。

例如以5个探测器等距排列为例，选取D1、D3、D5三个光子探测器进行说明，假设电缆连接情况是这样的：

光子探测器D1连接到单光子计数器的ch2端口的电缆长度为L，光子探测器D1连接到单光子计数器的ch3端口的电缆长度为5L。因此可以计算得到光电脉冲信号从光子探测器D1到单光子计数器的ch2端口需要的时间是T，光电脉冲信号从光子探测器D1到单光子计数器的ch3端口需要的时间是5T；则两者的时间差是4T；

光子探测器D3连接到单光子计数器的ch2端口的电缆长度为3L，光子探测器D3连接到单光子计数器的ch3端口的电缆长度为3L。因此可以计算得到光电脉冲信号从光子探测器D3到单光子计数器的ch2端口需要的时间是3T，光电脉冲信号从光子探测器D3到单光子计数器的ch3端口需要的时间是3T；则两者的时间差是0；

光子探测器D5连接到单光子计数器的ch2端口的电缆长度为5L，光子探测器D5连接到单光子计数器的ch3端口的电缆长度为L。因此可以计算得到光电脉冲信号从光子探测器D5到单光子计数器的ch2端口需要的时间是5T，光电脉冲信号从光子探测器D3到单光子计数器的ch3端口需要的时间是T；则两者的时间差是-4T。

可见，通过预先设定好各光子探测器的电缆线的长度，可以得到各光子探测器对应的ch2和ch3之间的时间差。如上所举的例子，光子探测器D1对应的时间差为4T；光子探测器D3对应的时间差为0；光子探测器D5对应的时间差为-4T。因此，一个激发周期内，通过ch2和ch3之间的时间差，即可确定是哪个光子探测器探测到光子，从而将所计算到的光子数对应到该光子探测器。

基于这种原理，通过多次重复的脉冲激发，本发明就可以同时获得这n个光子探测器测得的时间分辨荧光光谱，从而实现了利用少通道完成多个探测器的时间分辨荧光光谱的记录，提高了光子探测器的利用率。

另外，由于本发明的系统具有多个光子探测器，每个光子探测器的计数0时刻是不同的，需要将每个光子探测器的计数0时刻被调节到基本上相同的位置。

如图4所示，0时刻调节可以通过下述方式实现：所述每个单光子探测器D1～Dn之间用短线电缆连接，再通过长线电缆连接到所述光子计数器的第一通道ch1，长线电缆的长度远大于短线电缆的长度，以使每个光子探测器之间的电缆线长度忽略不计。这样，光电脉冲信号通过电缆线到达光子计数器的主要时间受到长电缆线的影响，由此实现将每个探测器的计数0时刻调节到几乎相同的位置。

实施例2

下面介绍本发明的实施例2的方案，这里仅对不同于实施例1的部分进行详细描述，相同的部分将不再赘述。一般在光子探测器数量较少的情况下，所述单光子计数器的通道数量除第零通道ch0外，可以仅具有第一通道和第二通道两个通道。这种情况下，将每个光子探测器之间的连接电缆设置为等长度L，如图5所示。

在本实施例中，与实施例1不同的是，根据某个光子探测器的光电脉冲信号到达所述单光子计数器的第一通道和第二通道的时间差来确定第一通道测得的到达时间所对应的光子探测器编号。

在本方案中，由于每个探测器之间的连接线(电缆)被预先设置为等长度，则每个探测器的光电脉冲信号到达ch1或者ch2的时间满足等差数列分布。因为探测器的光电脉冲信号在电缆中以一定的速度传播，那么每个探测器到达ch1和ch2之间的时间差就可以由此确定。Ch1和Ch2的时间差可以用于判断对应的探测器。例如，设置D1到ch1的距离为L，信号传播L距离需要时间为T，那么D2到达ch2需要2T，D3需要3T，Dn需要nT；同样，Dn到ch2需要时间T，Dn-1到达ch2需要2T，D1到ch2需要nT。所以，根据每个探测器的光电脉冲信号到ch1和ch2的时间差就可以确定到具体探测器。

另外，关于计数0时刻，第一通道每个光子探测器的计数0时刻通过软件被调节到基本上相同的位置。具体地，0时刻调节通过每个光子探测器的光电脉冲信号到达所述单光子计数器的第一通道的时间和到达第二通道的时间之间的时间差来校正。以ch1端记录光子计数为例，第m个探测器到达ch1的时间是mT，那么在记录时，通过软件将光子到达ch1的时间减去mT，再存到计算机中就可以实现零时刻的调整。

本实施例1即为只采用两个时间相关单光子计数通道并通过后续软件校正的方法来实现实施例1中描述的测量。

实施例3

下面介绍本发明的实施例3的方案，这里仅对不同于实施例1的部分进行详细描述，相同的部分将不再赘述。如图6所示，在光子探测器的数量较多的情况下，所述单光子计数器的通道数量除第零通道外，可以具有第一通道、第二通道、第三通道和第四通道，所述多个光子探测器的空间位置被设置成二维阵列，每个探测器都通过网格状的方式被连接到电缆线a和电缆线b上。电缆线a的两端分别连接到单光子计数器的ch1和ch2上，电缆线b的两端分别连接到单光子计数器的ch3和ch4上。阵列中的任意一个探测器接收到光子，其信号都会传递到ch1、ch2、ch3和ch4四个通道，分别对应着四个时间，这四个时间就能够精确的定位出具体的某一个探测器。例如一个4×4的阵列，探测器D23到达ch1的时间为5T，到达ch2的时间为6T，到达ch3的时间为6T，到达ch4的时间为5T；同理，D32到达ch1、ch2、ch3和ch4的时间分别为5T、4T、4T和5T。利用这四个时间就可以实现对阵列中的探测器进行定位。之后将记录到的光电脉冲信号到达时间间隔累积到该探测器所对应的时间通道上。

在荧光寿命成像中，采用宽场光源激发出的荧光通过成像系统成像在本实施例描述的二维阵列光子探测器上。这不同于现在普遍采用的基于荧光共聚焦扫描显微镜，通过扫描空间每个像素，并在每个像素上逐一测量时间分辨荧光的方法。本实施例的方法可以同时对空间中光子计数探测列阵中所有像素进行同时测量，可以一次性实现荧光寿命成像，提高测量效率，缩短了测量时间。

显然，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围。

Claims (4)

1.一种基于少通道TCSPC和多探测器的时间分辨荧光测量系统，其特征在于，包括：

激光光源，用于发出高频脉冲激光以激发样品发出荧光；

分光组件，用于将不同波长的所述荧光在空间中分开；

多个单光子探测器，设置在不同位置上，用于探测由所述分光组件分离开的不同位置的荧光，并将光信号转化为光电脉冲信号；

时间相关单光子计数器，其具有两个以上通道，其中，所述激光光源与所述时间相关单光子计数器的第零通道连接，向所述时间相关单光子计数器发送同步信号，所述多个单光子探测器中的每一个通过电路与所述时间相关单光子计数器的除第零通道外的其他不同通道分别连接，在一个激发周期内，所述时间相关单光子计数器在被第零通道的同步信号触发后开始计算来自某个单光子探测器的光电脉冲信号到达所述其他不同通道的到达时间，以及计算机，与所述时间相关单光子计数器连接，并执行下述功能：

(i)获得来自某个单光子探测器的光电脉冲信号到达所述其他不同通道中的每一个通道的到达时间；

(ii)通过来自某个单光子探测器的光电脉冲信号到达所述其他不同通道中的任意两个通道的到达时间之差来确定所述光电脉冲信号对应的单光子探测器的编号Di；以及

(iii)将第(i)步骤中获得的到达时间累加到第(ii)步骤确定的单光子探测器的对应的时间通道中，完成Di通道的时间相关单光子计数。

2.根据权利要求1所述的一种基于少通道TCSPC和多探测器的时间分辨荧光测量系统，其特征在于，所述多个单光子探测器为一维排列的多个单光子探测器列阵，荧光在经过所述分光元件后到达一维排列的多个单光子探测器列阵，以实现不同波长下的时间分辨荧光光谱的快速测量。

3.根据权利要求2所述的一种基于少通道TCSPC和多探测器的时间分辨荧光测量系统，其特征在于，所述分光组件为光栅或棱镜的色散元件。

4.根据权利要求1所述的一种基于少通道TCSPC和多探测器的时间分辨荧光测量系统，其特征在于，所述多个单光子探测器为二维排列的多个单光子探测器面阵，荧光在经过成像系统后到达二维排列的多个单光子探测器面阵，以实现荧光寿命成像的快速测量。

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