CN107628888B - 一种具有抗旱功能的海藻液体肥料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种具有抗旱功能的海藻液体肥料及其制备方法与应用。该肥料包含以下组分:海藻抗旱功能载体、外源抗旱物质、腐殖酸、化学肥料、表面活性剂。所述海藻抗旱功能载体是将由新鲜海藻依次经酶解、菌解得到的提取物经活性保全技术处理后,再经过分子膜多级分离,并通过作物幼苗抗旱活性检测筛选得到。海藻抗旱功能载体与外源抗旱物质均匀混合后,依次与腐植酸、化学肥料复配,最后加入表面活性剂等,制备出海藻液体肥料。本发明的肥料运输方便,除可对作物灌根施用外,还可叶喷,大型种植区可与滴灌系统相结合,非常适合水肥一体化系统。大田干旱试验结果表明,本发明的液体肥料可将菜心产量较传统施肥明显提高14.7%~19.8%。
Description
技术领域
本发明涉及肥料生产技术领域,尤其涉及一种具有抗旱功能的海藻液体肥料及其制备方法与应用。
背景技术
干旱是农业生产中最严重的限制因子之一,干旱或季节性干旱可造成作物减产、农产品品质下降。干旱胁迫时,植株生长素和赤霉素含量明显减少,ABA含量上升,加速了组织衰老和脱落;同时,干旱胁迫还诱导了活性氧自由基大量积累,造成细胞膜蛋白被氧化,导致膜脂过氧化。为了应对抗旱胁迫,农作物形成了一整套抗旱机制,如通过渗透调节作用,主动积累某些氨基酸(如脯氨酸)、氨基酸衍生物(甜菜碱)、糖类(可溶性糖)和多元醇类(甘露醇)等小分子有机物,提高细胞液浓度,以应对水分胁迫。上述结论大多在试验条件件下得到的,然而,在大田生产实践中,如何利用农作物的抗旱机制来提高其抗旱性目前还没有专利报道。研制具有抗旱功能的功能性肥料是一条提高农作物抗旱性的重要途径。
中国专利(申请号:CN106431687A)公布了一种水葫芦抗旱缓释肥料及其制备方法,该肥料的抗旱机制主要是在肥料中添加了丙烯酰胺等保水物质,以此提高肥料对水分的吸收与释放调控,达到增强作物抗旱的作用。中国专利(申请号:CN106242826A)公开了一种抗旱、全营养型玉米专用长效肥料及其制备方法,该专利生产的肥料也主要依靠添加高分子保水剂达到增强玉米抗旱的目的。同样,中国专利(公开号:CN106187468A)公开的专性抗旱肥也是通过添加保水剂,来达到提高银杏树抗旱的目的。
大量文献表明,海藻提取物中含有多种化合物,如海藻多糖、酚类多聚化合物、甘露醇、甜菜碱、氨基酸、吲哚乙酸、细胞分裂素等;此外,还含有氮、磷、钾、镁、钙、铁、锌、硼、钼、碘、硒等大量元素或中微量营养元素。理论上,这些物质能促进作物生长和增强作物抗逆。但是,在实际生产中,这些物质能否起作用取决于其在产品中的含量与存在形态。由于不同工艺生产的海藻提取物中上述化合物的种类与数量存在明显差异,所以,它们在促进作物生长方面所起作用不同。
中国专利(申请号201510507236.9)公开了一种膨果型海藻有机液体冲施肥及其生产方法,该冲施肥利用海藻提取物与NPK复配,制备了具有膨果功能的有机液体。该冲施肥中海藻酸含量为5%,赤霉素为20ng/g,吲哚乙酸为30ng/g,这些具有膨果效应的功能物质含量很低,而且没有任何活性保全技术,该类肥料在多种作物中是否有膨果效应,还需要深入研究。中国专利(申请号201310603775.3)公开了一种多菌共酵海藻制备功能性海藻肥料的方法,该专利将地衣芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌和放线菌加入于海藻粉体系中发酵,然后低温干燥粉碎制备功能性海藻肥料,该方法将多种菌的代谢产物混合在一起,产品可能具有某种功效,但多种代谢产物中可能存在相互抑制、拮抗的物质,如果不进行分离,将其混合在一起,可能降低其功效。从上述存在的问题中可知,具有明显功能尤其是具有抗旱功能的海藻肥仍没有突破性进展。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的目的在于提供一种具有抗旱功能的海藻液体肥料。该海藻液体肥料中海藻提取物经活性保全技术处理,活性丧失较少,然后经过分子膜多级分离筛选、并通过作物抗旱活性检测得到抗旱功能载体,同时加入外源抗旱物质,不仅能提供作物生长所需的营养物质,而且可促进作物抗旱。
本发明的另一目的在于提供上述具有抗旱功能的海藻液体肥料的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种具有抗旱功能的海藻液体肥料,按质量百分比计包含以下组分:海藻抗旱功能载体20%~60%、外源抗旱物质0.1%~1%、腐殖酸1%~5%、化学肥料25%~75%、表面活性剂0.1%~2%。
优选的,按质量百分比计包含以下组分:海藻抗旱功能载体20%~60%、外源抗旱物质0.5%、腐殖酸3%~4%、化学肥料35%~75%、表面活性剂0.5%。
更优选的,按质量百分比计包含以下组分:海藻抗旱功能载体40%、外源抗旱物质0.5%、腐殖酸3%~4%、化学肥料55%~56%、表面活性剂0.5%。
所述的海藻抗旱功能载体的制备方法,包括如下步骤:
1)将新鲜海藻除杂剪碎匀浆后制成浆液;
2)往步骤1)的浆液中加入特定的复合酶酶解得到酶解液,然后接种微生物进行发酵,发酵结束后将发酵液用纱布过滤,得到滤液为海藻提取物;
3)往步骤2)的海藻提取物中加入功能物质保护剂以保全功能物质活性;
4)将经活性保全后的海藻提取物依次通过不同分子量的分子膜,得到几种不同分子量的组分,并通过作物抗旱活性检测,评价这几种组分对作物抗旱活性的影响,筛选出抗旱活性最高的组分即为海藻抗旱功能载体。
优选的,步骤1)中所述的新鲜海藻包括海带、马尾藻、泡叶藻等中的一种或多种。
优选的,步骤1)中所述的浆液是将市售新鲜海藻除杂后剪成1~4cm2的碎片状,按质量比为1:2~1:10(优选为1:3~1:10)的比例加入清水,用组织捣碎机匀浆后,放置在摇床上震荡1~4小时(优选为2h)制备而成,温度设为30~50℃,转速设为120~200rpm(优选的,温度设为30~40℃,转速设为160~200rpm)。
优选的,步骤2)中所述的酶解液是将海藻浆液pH调至中性(约为6.5~7.0),加入海藻浆液质量计0.01%~0.1%(优选为0.05%~0.1%)的PPC复合酶,接着在摇床上震荡酶解2~12小时制备而成,温度设为30~50℃,转速设为120~200rpm(优选的,温度设为30~40℃,转速设为160~200rpm)。
所述的PPC复合酶包括纤维素酶、果胶酶、蛋白酶。优选的,质量比纤维素酶:果胶酶:蛋白酶=4:3:3。
所述的PPC复合酶,加入的顺序是:先向浆液中加入一部分纤维素酶和全部的果胶酶后,将体系在摇床上震荡1~6小时后,再加入余下的纤维素酶和全部的蛋白酶,再次将体系在摇床上震荡1~6小时。
优选的,步骤2)中所述的发酵液是先向酶解液中加入微生物所需的营养物质充分搅拌均匀,再接种种类不同的微生物,然后在摇床上震荡发酵8~24小时(优选为15~24h)制备而成,温度设为30~50℃,转速设为120~200rpm(优选的,温度设为30~38℃,转速设为160~200rpm)。
所述的微生物所需的营养物质包括:酶解液质量计0.3%~0.5%的无水葡萄糖、0.1%~0.5%的酵母粉、0.01%~0.1%的磷酸二氢钾、0~0.01%的硫酸镁、0~0.01%的氯化钙溶液。
优选的,所述的微生物所需的营养物质包括:酶解液质量计0.4%~0.5%的无水葡萄糖、0.3%~0.5%的酵母粉、0.05%~0.1%的磷酸二氢钾、0.01%的硫酸镁、0.01%的氯化钙溶液。
所述的种类不同的微生物包括:浆液质量计1~2%的枯草芽孢杆菌、1~3%的巨大芽孢杆菌、1~5%的酵母菌。
优选的,所述的种类不同的微生物包括:浆液质量计2%的枯草芽孢杆菌、1~3%的巨大芽孢杆菌、3~5%的酵母菌。
优选的,步骤3)中所述的功能物质保护剂包括维生素C、螯合亚铁、亚磷酸、偏磷酸、过氧化氢、高锰酸钾、次氯酸钾等中的两种或多种。
所述的功能物质保护剂加入量为海藻浆液质量计的0.005%~0.05%;优选为0.02~0.03%。
优选的,步骤4)中所述的海藻抗旱功能载体的筛选是指将经活性保全后的海藻提取物依次通过不同分子量的分子膜,得到分子量不同的组分,将不同组分分别进行自由基清除实验、作物幼苗抗旱试验,用幼苗的生长情况来表征不同组分的抗旱性,并筛选出抗旱性最好的组分即为海藻抗旱功能载体。
所用海藻提取物通过先酶解再菌解的方法制备而成,且过程中加入功能物质保护剂以防功能物质在后面过分子膜或复配过程中活性的丧失;海藻抗旱功能载体是由海藻提取物通过多次过分子膜分离并由植物抗旱活性检测得到,如果用海藻提取物直接作为功能载体,其中某些成分可能吸附、包裹或拮抗具有抗旱功能的活性物质;所述液体肥中除了加入作物生长所必需的养分外,还加入了外源抗旱物质,目的是提高海藻肥的抗旱功效。
优选的,所述的海藻抗旱功能载体是将由新鲜海藻依次经酶解、菌解得到的提取物经活性保全技术处理后,再经过分子膜多级分离,并通过作物幼苗抗旱活性检测筛选得到,所述海藻抗旱功能载体为总液体肥质量的20%~60%。
优选的,所述的活性保全技术是指向海藻提取物中加入功能物质保护剂;
优选的,所述的外源抗旱物质包括二甲基磺基丙酯、三甲基甘氨酸、芸苔素内酯、氯化胆碱、赤霉素、水杨酸、三苯基酚中的一种或几种,所述外源抗旱物质为总液体肥质量的0.1%~1%。
优选的,所述的腐殖酸可由黄腐酸、硝基腐殖酸、黄腐酸钾中的一种代替,所述的腐殖酸为总液体肥质量的1%~5%。
优选的,所述的化学肥料包括大量元素、中量元素、微量元素;大量元素为尿素、硝酸钾、磷酸一铵、磷酸二铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸钾中的至少两种,中量元素为七水硫酸镁、氯化镁、乙二胺四乙酸二钠钙中的至少两种,微量元素为七水硫酸锌、硫酸亚铁、硼砂、五水硫酸铜、氯化锰中的至少两种;所述的化学肥料为液体肥总质量的25%~75%。
优选的,所述的表面活性剂包括烷基聚氧乙烯醇、聚丙烯酰胺、苄基酚聚氧乙烯醚、甘油脂肪酸酯、木质素磺酸盐等中的一种或几种,所述的表面活性剂为液体肥总质量的0.1%~2%。
本发明还提供上述具有抗旱功能的海藻液体肥料的制备方法,包括如下步骤:
(1)向海藻抗旱功能载体中加入外源抗旱物质混合均匀后,再加入腐殖酸、化学肥料,充分搅拌均匀;
(2)最后,加入表面活性剂,再次搅拌均匀,制备得到具有抗旱功能的海藻液体肥料。
优选的,所述的具有抗旱功能的海藻液体肥料主要施用方式为灌根或叶喷,灌根稀释倍数为300~500倍,叶喷稀释倍数为1000~2000倍。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明提供的具有抗旱功能的海藻肥料由海藻抗旱功能载体物质与化学肥料复配,同时含有作物生长必须的养分,又含有诱导抗旱的功能载体,是一种环保、高效的液体肥。
(2)本发明提供的具有抗旱功能的海藻肥在制备过程中提及的海藻提取物是由新鲜海藻经过酶解和菌解提取得到,既避免了物理提取的高技术要求和高成本,又避免了化学提取中强酸、强碱等环境对功能物质活性的损害,产品抗旱活性高,且对环境无污染。
(3)本发明所述的海藻提取物在酶解、菌解过程后,添加了活性保全物质,减少了抗旱功能活性物质在后续分离或复配过程中活性的丧失。
(4)本发明所述的海藻抗旱功能载体是由海藻提取物经不同分子量的分子膜层层分离,并经过自由基清除实验和作物幼苗抗旱检测筛选得到,有针对性的将海藻中抗旱功能载体富集,减小了其他成分对功能物质的吸附、功能抑制或拮抗,一定程度上提高了产品增强作物抗旱的能力。
(5)本发明提供的具有抗旱功能的海藻液体肥料除含有具有抗旱作用的海藻抗旱功能载体,还外源添加了抗旱功能物质,以补充内源功能物质含量不高的缺点,增强了海藻肥的抗旱功效。
(6)本发明提供的具有抗旱功能海藻液体肥运输方便,除可对作物灌根施用外,还可叶喷,大型种植区可与滴灌系统相结合,非常适合水肥一体化系统。
(7)大田干旱试验结果表明,本发明制备的液体肥料可将菜心产量较传统施肥明显提高14.7%~19.8%。
附图说明
图1是提取物不同分子量组分清除自由基能力比较及对干旱条件下菜心幼苗生长的影响;其中,图1a为制备海藻抗旱功能载体用超滤管摄像图,图1b、1c分别为海藻提取物不同分子量组分对羟基自由基、超氧阴离子的清除率,图1d、1e分别为海藻提取物不同分子量组分对干旱胁迫下菜心幼苗鲜重及含水量的影响;羟基自由基清除率的测定方法参考文献:闫明艳,秦松.2014,复合酶解刺参内脏蛋白制备抗氧化肽工艺,食品工业,07:50-53.超氧阴离子清除率的测定方法参考文献:林祥潮,黄晓东.2012,中药对超氧阴离子自由基清除率的测定,广州化学,37(1):32-36.;柱子上具有相同字母的表示差异不显著(α=0.05),试验结果采用The SAS System for windows9.0(SAS Institute Inc.,USA,2002)进行平均值、标准偏差,数据多重比较。
图2是海藻肥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对干旱胁迫条件下菜心生物量及品质的影响;其中,CK是对照处理,海藻肥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别表示本法明制备的海藻肥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ处理,水溶肥表示普通水溶肥处理;图2a表示菜心植株可溶性糖的含量,图2b表示菜心植株可溶性蛋白的含量,图2c表示菜心植株生物量;可溶性糖采用蒽酮比色法测定,可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定,柱子上具有相同字母的表示差异不显著(α=0.05),试验结果采用The SAS System forwindows9.0(SAS Institute Inc.,USA,2002)进行平均值、标准偏差,数据多重比较。
图3是海藻肥Ⅳ、Ⅴ对干旱胁迫条件下菜心生物量及品质的影响;其中,CK是对照处理,海藻肥Ⅳ、Ⅴ分别表示本法明制备的海藻肥Ⅳ、Ⅴ处理,水溶肥表示普通水溶肥处理;图3a表示菜心植株可溶性糖的含量,图3b表示菜心植株可溶性蛋白的含量,图3c表示菜心植株生物量;可溶性糖采用蒽酮比色法测定,可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定,柱子上具有相同字母的表示差异不显著(α=0.05),试验结果采用The SAS System for windows9.0(SAS Institute Inc.,USA,2002)进行平均值、标准偏差,数据多重比较。
图4是正常供水条件下海藻肥对菜心生物量及品质指标的影响;其中,CK是对照处理,海藻肥、0.8倍海藻肥、0.6倍海藻肥分别表示分发明制备的海藻肥Ⅵ、减量20%海藻肥Ⅵ、减量40%海藻肥Ⅵ,表1表示正常供水条件下施肥1、2、3次后菜心叶长、叶宽、株高,其中同列相同字母表示差异不显著(α=0.05);图4a表示正常供水条件下菜心植株可溶性糖的含量,图4b表示正常供水条件下菜心植株可溶性蛋白的含量,图4c表示正常供水条件下菜心植株VC含量,图4d表示正常供水条件下菜心可溶性固形物的含量,图4e表示正常供水条件下菜心植株生物量,图4f表示正常供水条件下六个处理收样时植株摄像图,其中可溶性糖采用蒽酮比色法测定,可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定,维生素C采用2,6-二氯靛酚滴定法,可溶性固形物利用糖度计(托普云农TD45)测定,柱子上具有相同字母的表示差异不显著(α=0.05),试验结果采用The SAS System for windows9.0(SAS Institute Inc.,USA,2002)进行平均值、标准偏差,数据多重比较。
图5是干旱胁迫条件下海藻肥对菜心生物量及品质指标的影响;其中,CK是对照处理,海藻肥、0.8倍海藻肥、0.6倍海藻肥分别表示分发明制备的海藻肥Ⅵ、减量20%海藻肥Ⅵ、减量40%海藻肥Ⅵ,表2表示干旱胁迫条件下施肥1、2、3次后菜心叶长、叶宽、株高,其中同列相同字母表示差异不显著(α=0.05);图5a表示干旱条件下菜心植株可溶性糖的含量,图5b表示干旱条件下菜心植株可溶性蛋白的含量,图5c表示干旱条件下菜心植株VC含量,图5d表示干旱条件下菜心可溶性固形物的含量,图5e表示干旱条件下菜心植株生物量,图5f表示干旱条件下六个处理收样时植株摄像图,其中可溶性糖采用蒽酮比色法测定,可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定,维生素C采用2,6-二氯靛酚滴定法,可溶性固形物利用糖度计(托普云农TD45)测定,柱子上具有相同字母的表示差异不显著(α=0.05),试验结果采用The SAS System for windows9.0(SAS Institute Inc.,USA,2002)进行平均值、标准偏差,数据多重比较。
图6是海藻功能肥的大田肥效试验研究(广东地区)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
按下述步骤制备海藻抗旱功能载体A:
(1)制备海藻浆液:将市场上购买的海带除杂后剪成1~4cm2的小块,按质量比片状海带:水=1:3比例加入自来水,用组织捣碎机匀浆,搅拌后放在摇床上震荡2小时,摇床温度设为40℃,转速为160rpm。
(2)酶解:用氢氧化钾或柠檬酸溶液将海带浆液pH调至7.0,然后加海带浆液质量计0.1%的PPC复合酶(质量比纤维素酶:果胶酶:蛋白酶=4:3:3),其加入的先后顺序是:先加入一部分纤维素酶和全部的果胶酶后,将体系在摇床上震荡6小时后,再加入余下的纤维素酶和全部的蛋白酶,再将体系在摇床上震荡6小时。
(3)菌解:在酶解液中加入酶解液质量计0.5%的无水葡萄糖、0.5%的酵母粉、0.1%磷酸二氢钾、0.01%的硫酸镁、0.01%的氯化钙溶液,再接种发酵液质量计2%的枯草芽孢杆菌、3%的巨大芽孢杆菌、3%的酵母菌,然后在摇床上震荡20小时,摇床温度设为38℃,转速为160rpm;发酵结束后,将发酵液通过2层纱布自然过滤,收集滤液作为海带提取液,滤渣用于制备有机肥。
(4)活性保全技术处理:向海带提取液中加入总量为浆液质量计0.03%的螯合亚铁和过氧化氢,并搅拌均匀。
(5)提取液的分离:首先将海带提取液依次通过10KDa、5KDa、3KDa的分子膜(本发明使用带滤膜的超滤管,如图1a所示,但不限定于此)过滤,依次得到所含物质分子量大于10KDa、5KDa~10KDa、3KDa~5KDa、小于3KDa的4种组分。
(6)不同分子量组分的自由基清除能力测定:原提取液组分、分子量>10KDa组分、5KDa~10KDa组分、3KDa~5KDa组分、<3KDa组分对超氧阴离子和羟自由基的清除效果见图1b、图1c所示。
(7)不同分子量组分的抗旱性试验:将海带提取物和不同分子量的四种组分用于处于干旱胁迫中的菜心幼苗,试验如下:
本试验于2016年3月于华南农业大学资环楼八楼无土栽培试验棚进行,利用4种不同分子量的组分及提取物原液,在底面直径为5cm、高为12cm的涂黑漆的玻璃杯中进行水培试验,每杯盛200mL的1/2营养液(华农叶菜类营养液),将长至3叶1心的菜心幼苗移入玻璃杯中,每杯1株;3天后更换含有10%PEG6000的1/2营养液,然后设置原提取液、分子量>10KDa组分、5KDa~10KDa组分、3KDa~5KDa组分、<3KDa组分、清水共6个处理,每个处理5次重复,每杯中用移液枪注入提取液或分子量不同的组分或清水2毫升,3天后测定供试植株的生物量、植株含水量。测定结果图1d、1e所示:
由图1b、1c可以看出,提取物中四种不同分子量的组分及原液对羟基自由基和超氧阴离子的清除率都表现为分子量<3KDa组分最强,其中对羟基自由基的清除率达46.67%、对超氧阴离子清除率达25.89%,表明提取物中分子量<3KDa组分的抗氧化能力最强;通过图1d、1e可知,与清水对比,提取物中分子量<3KDa的组分最能促进干旱胁迫条件下菜心幼苗的生长,可将其生物量和含水量较清水对照分别提高46.38%、7.87%;综上所述,海带提取物可促进菜心幼苗抗旱,且其中起主要作用的是分子量<3KDa(低分子量)的组分,即本实施例所需海藻抗旱功能载体A就是为海带提取物中分子量<3KDa的组分。
实施例2
按下述步骤制备海藻抗旱功能载体B:
(1)制备海藻浆液:将新鲜马尾藻除杂后剪成1~4cm2的小块,按照质量比片状马尾藻:水=1:5比例加入自来水,用组织捣碎机匀浆后,搅拌放在摇床上震荡2小时,摇床温度设为35℃,转速为180rpm。
(2)酶解:用氢氧化钾或柠檬酸溶液将紫菜浆液pH调至7.0,然后加马尾藻浆液质量计0.08%的PPC复合酶(质量比纤维素酶:果胶酶:蛋白酶=4:3:3),其加入的先后顺序是:先加入一部分纤维素酶和全部的果胶酶后,将体系在摇床上震荡5小时后,再加入余下的纤维素酶和全部的蛋白酶,再将体系在摇床上震荡6小时。
(3)菌解:在酶解液中加入酶解液质量计0.4%的无水葡萄糖、0.3%的酵母粉、0.1%磷酸二氢钾、0.01%的硫酸镁、0.01%的氯化钙溶液,再接种发酵液质量计2%的枯草芽孢杆菌、2%的巨大芽孢杆菌、4%的酵母菌,然后在摇床上震荡15小时,摇床温度设为35℃,转速为180rpm;发酵结束后,将发酵液通过2层纱布自然过滤,收集滤液作为马尾藻提取液,滤渣用于制备有机肥。
(4)活性保全处理:向马尾藻提取液中加入总量为浆液质量计0.02%的偏磷酸与次氯酸钠,并搅拌均匀。
(5)海藻抗旱功能载体的筛选:首先将马尾藻提取液依次通过15KDa、10KDa、1KDa的分子膜过滤,依次得到所含物质分子量>15KDa、10KDa~15KDa、1KDa~10KDa、<1KDa的4种组分,其中分子量<1KDa的组分即为海藻抗旱功能载体B。
实施例3
按下述步骤制备海藻抗旱功能载体C:
(1)制备海藻浆液:将泡叶藻除杂后剪成1~4cm2的小块,按质量比片状泡叶藻:水=1:10比例加入自来水,用组织捣碎机匀浆,搅拌后放在摇床上震荡2小时,摇床温度设为30℃,转速为200rpm。
(2)酶解:用氢氧化钾或柠檬酸溶液将活化后的泡叶藻浆液pH调至7.0,然后加泡叶藻浆液质量计0.05%的PPC复合酶(质量比纤维素酶:果胶酶:蛋白酶=4:3:3),其加入的先后顺序是:先加入一部分纤维素酶和全部的果胶酶后,将体系在摇床上震荡6小时后,再加入余下的纤维素酶和全部的蛋白酶,再将体系在摇床上震荡6小时。
(3)菌解:在酶解液中加入酶解液质量计0.4%的无水葡萄糖、0.4%的酵母粉、0.05%磷酸二氢钾、0.01%的硫酸镁、0.01%的氯化钙溶液,再接种发酵液质量计2%的枯草芽孢杆菌、1%的巨大芽孢杆菌、5%的酵母菌,然后在摇床上震荡24小时,摇床温度设为30℃,转速为200rpm;发酵结束后,将发酵液通过2层纱布自然过滤,收集滤液作为泡叶藻提取液,滤渣用于制备有机肥。
(4)活性保全技术处理:向泡叶藻提取液中加入总量为浆液质量计0.03%的亚硫酸钾与高锰酸钾,并搅拌均匀。
(5)海藻抗旱功能载体的筛选:首先将泡叶藻提取液依次通过20KDa、10KDa、5KDa的分子膜过滤,依次得到所含物质分子量>20KDa、10KDa~20KDa、5KDa~10KDa、<5KDa的4种组分,其中分子量<5KDa的组分即为海藻抗旱功能载体C。
实施例4
一种具有抗旱功能的海藻液体肥料,其原料组分包括:海藻抗旱功能载体20%~60%、外源抗旱物质0.1%~1%、腐殖酸1%~5%、化学肥料25%~75%、表面活性剂0.1%~2%。具体如下:
海藻肥Ⅰ(海藻肥总配料100g):海藻抗旱功能载体A 20g、三甲基氨基酸0.3g、氯化胆碱0.2g、腐殖酸4g、硝酸钾15g、磷酸二氢钾18g、硫酸钾15g、尿素18g、乙二胺四乙酸二钠钙3g、氯化镁4g、七水硫酸锌1g、五水硫酸铜1g、木质素磺酸钠0.5g。
海藻肥Ⅱ(海藻肥总配料100g):海藻抗旱功能载体A 40g、三甲基氨基酸0.3g、氯化胆碱0.2g、腐殖酸4g、硝酸钾10g、磷酸二氢钾13g、硫酸钾10g、尿素13g、乙二胺四乙酸二钠钙3g、氯化镁4g、七水硫酸锌1g、五水硫酸铜1g、木质素磺酸钠0.5g。
海藻肥Ⅲ(海藻肥总配料100g):海藻抗旱功能载体A 60g、三甲基氨基酸0.3g、氯化胆碱0.2g、腐殖酸4g、硝酸钾5g、磷酸二氢钾8g、硫酸钾5g、尿素8g、乙二胺四乙酸二钠钙3g、氯化镁4g、七水硫酸锌1g、五水硫酸铜1g、木质素磺酸钠0.5g。
制备方法为:向海藻抗旱功能载体中加入三甲基氨基酸、氯化胆碱混合均匀后,再加入腐殖酸、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸钾、尿素、乙二胺四乙酸二钠钙、氯化镁、七水硫酸锌、五水硫酸铜,过程中边加入不同的原料组分边搅拌均匀,最后加入木质素磺酸钠,再次搅拌均匀,最终得到海藻肥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
海藻肥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的肥效试验:
本试验于2016年3月~4月在华南农业大学资环学院网室进行,以菜心为试验材料利用制备的海藻肥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、普通水溶肥(购自深圳市深绿帅农业科技有限公司)在塑料盆中进行土培试验,共设置海藻肥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、普通水溶肥、对照5个处理,每个处理3次重复;将菜心种子播种于苗床上,待长至三叶一心时移至塑料盆中,每盆一株,缓苗后统一进行干旱处理,使土壤含水量为田间最大持水量(取一定重量的风干土置于底部有孔塑料盆中,注水使塑料盆中土壤饱和,隔夜后称量总重并计算土壤含水量,以此时土壤含水量为田间最大持水量)的50%,并于每天17:00~18:00通过称重法补水控水;干旱处理的第2天开始第一次灌根施肥,而后每10天施肥一次不同配方的肥料,海藻肥和普通水溶肥均稀释300倍使用,每次200mL,对照以200mL清水代替。第3次施肥10天后收获,测定供试可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、植株生物量,结果如图2所示。
从图2a可溶性糖的结果来看,海藻肥Ⅱ明显优于海藻肥Ⅰ、Ⅲ,可分别较对照和普通水溶肥处理下的可溶性糖含量提高34.26%和18.85%;图2b表明海藻肥Ⅱ处理下的可溶性蛋白含量明显高于海藻肥Ⅰ,但和海藻肥Ⅲ处理比较差异不明显;从图2c中菜心植株鲜重来看,海藻肥Ⅱ与海藻肥Ⅰ、Ⅲ处理之间差异明显,且海藻肥Ⅱ可将菜心植株鲜重较对照和普通水溶肥处理分别提高85.64%和39.47%。上述分析结果表明,五个处理中海藻肥Ⅱ处理效果最优,对照海藻肥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ配方来看,仅海藻抗旱功能载体与大量元素的加入量不同,海藻抗旱功能载体的加入量分别为20%、40%、60%,对应大量元素的加入量分别为66%、46%、26%,说明海藻抗旱功能载体约为添加量为40%时海藻肥抗旱效果较好。
实施例5
一种具有抗旱功能的海藻液体肥料,其原料组分包括:海藻抗旱功能载体20%~60%、外源抗旱物质0.1%~1%、腐殖酸1%~5%、化学肥料25%~75%、表面活性剂0.1%~2%。具体如下:
海藻肥Ⅳ(海藻肥总配料100g):海藻抗旱功能载体B 40g、二甲基磺基丙酯0.3g、赤霉素0.2g、黄腐酸3g、磷酸二铵10g、磷酸二氢钾11g、氯化钾10g、尿素13g、乙二胺四乙酸二钠钙5g、氯化镁5g、硼砂1g、七水硫酸锌1g、烷基聚氧乙烯醇0.5g。
海藻肥Ⅴ(海藻肥总配料100g):海藻抗旱功能载体B 40g、黄腐酸3g、磷酸二铵10g、磷酸二氢钾11g、氯化钾10g、尿素13g、乙二胺四乙酸二钠钙5g、氯化镁5g、硼砂1g、七水硫酸锌1g、烷基聚氧乙烯醇1g。
制备方法为:向海藻抗旱功能载体中加入二甲基磺基丙酯、赤霉素后混合均匀,再加入黄腐酸、磷酸二铵、磷酸二氢钾、氯化钾、尿素、乙二胺四乙酸二钠钙、氯化镁、硼砂、七水硫酸锌,过程中边加入不同的原料组分边搅拌均匀,最后加入烷基聚氧乙烯醇,再次搅拌均匀,最终得到海藻肥Ⅳ、Ⅴ。
海藻肥Ⅳ、Ⅴ的肥效试验:
本试验于2016年3月~4月在华南农业大学资环学院网室进行,利用制备的2种海藻肥及普通水溶肥在塑料盆中进行土培试验,每盆1株,共设置海藻肥Ⅳ、Ⅴ、普通水溶肥、清水对照4个处理,每个处理3次重复;移苗并缓苗后统一进行干旱处理,使土壤含水量为田间最大持水量(取一定重量的风干土置于底部有孔塑料盆中,注水使塑料盆中土壤饱和,隔夜后称量总重并计算土壤含水量,以此时土壤含水量为田间最大持水量)的50%,并于每天17:00~18:00补水控水;每10天灌根施用不同配方的海藻肥(300倍稀释)、水溶肥(300倍稀释)200mL,对照以200mL清水代替。第3次施肥10天后收获,测定供试植株可溶性糖、可溶性蛋白含量、生物量,结果如图3所示。
从图3a结果来看,本发明制备的海藻肥Ⅳ、Ⅴ均可明显提高菜心可溶性糖含量,可分别较对照处理提高48.96%和32.08%,分别较普通水溶肥处理提高28.60%和14.03%,且两处理间差异明显;图3b可溶性蛋白的结果表明,海藻肥Ⅳ、Ⅴ处理间差异不明显,且这两个处理较对照和普通水溶肥处理也无明显差异;图3c中,海藻肥Ⅳ处理的菜心鲜重明显高于海藻Ⅴ、普通水溶肥、对照处理;整体来看,海藻肥Ⅳ效果优于其他处理,从配方又可看出海藻肥Ⅳ、Ⅴ中除海藻肥Ⅳ添加了外源抗旱物质二甲基磺基丙酯和赤霉素外,其他均相同,综合来看,外源添加抗旱物质可提高海藻肥抗旱效果。
实施例6
一种具有抗旱功能的海藻液体肥料,其原料组分包括:海藻抗旱功能载体20%~60%、外源抗旱物质0.1%~1%、腐殖酸1%~5%、化学肥料25%~75%、表面活性剂0.1%~2%。具体如下:
海藻肥Ⅵ(海藻肥总配料100g):海藻抗旱功能载体A 40g、三甲基氨基酸0.3g、赤霉素0.2g、黄腐酸钾3g、磷酸一铵11g、磷酸氢二钾13g、尿素20g、乙二胺四乙酸二钠钙5g、七水硫酸镁5g、氯化锰1g、七水硫酸锌1g、聚丙烯酰胺0.5g。
制备方法为:向海藻抗旱功能载体中加入三甲基氨基酸、赤霉素混合均匀后,再加入黄腐酸钾、磷酸一铵、磷酸氢二钾、尿素、乙二胺四乙酸二钠钙、七水硫酸镁、氯化锰、七水硫酸锌,过程中边加入不同的原料组分边搅拌均匀,最后加入聚丙烯酰胺,再次搅拌均匀,最终得到具有抗旱活性的海藻肥Ⅵ。
海藻肥Ⅵ的肥效试验如下:
试验A:本试验于2016年5月~6月在华南农业大学资环学院网室进行,利用制备的海藻肥在塑料盆中进行土培试验,每盆1株,共设置海藻肥Ⅵ、0.8倍海藻肥Ⅵ(海藻肥减量20%)、0.6倍海藻肥Ⅵ(海藻肥减量40%),普通复合肥(购自湖北兴发化工集团股份有限公司)、普通水溶肥、清水对照6个处理,每个处理3次重复;每10天灌根施用海藻肥Ⅵ、减量海藻肥Ⅵ(300倍稀释)或普通复合肥、普通水溶肥(300倍稀释)200mL,对照以200mL清水代替,期间各处理均进行正常水分管理。第3次施肥10天后收获,分别于第2次、3次施肥、收获前一天测定供试菜心植株叶片(开始处理时选定的菜心植株的倒四叶)的长、宽,株高,收获后测定供试植株可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、可溶性固形物含量,结果如表1、图4所示。
表1:正常供水条件下海藻肥对菜心形态指标的影响
表1表明,与对照相比,施用海藻肥Ⅵ或施用减量海藻肥Ⅵ均可明显提高菜心的叶长、叶宽、株高,且海藻肥Ⅵ、0.8倍海藻肥Ⅵ、0.6倍海藻肥Ⅵ处理下任何时期的叶长、叶宽、株高均无显著差异;整体来看,海藻肥Ⅵ或减量海藻肥Ⅵ处理下的叶长、叶宽、株高与复合肥相比差异也不明显;但与水溶肥相比,海藻肥Ⅵ可在菜心生长的中后期将其叶宽与株高显著提高。图4a~4d表明,与对照或水溶肥相比,海藻肥Ⅵ或减量海藻肥Ⅵ处理可明显提高菜心可溶性糖、可溶性蛋白,维生素C、可溶性固形物的含量;但与复合肥相比,仅海藻肥Ⅵ与0.8倍海藻肥Ⅵ可明显提高菜心的可溶性糖含量;结合图4e和图4f来看,除对照外,其他五个处理条件下的菜心生物量之间均无显著差异;
试验B:本试验与试验A在同一时间、同一地点、相同土壤下进行,唯一不同之处在于本试验所有处理均在供试菜心植株处于干旱胁迫下进行。将菜心移苗并缓苗后各盆统一进行干旱处理,使土壤含水量为田间最大持水量(取一定重量的风干土置于底部有孔塑料盆中,注水使塑料盆中土壤饱和,隔夜后称量总重并计算土壤含水量,以此时土壤含水量为田间最大持水量)的50%,并于每天17:00~18:00通过称重方式进行补水控水)。本试验处理与处理重复数、处理时间、测定指标、指标测定时间均与试验A同期进行,结果如表2、图5所示。
表2干旱胁迫条件下海藻肥对菜心形态指标的影响
表2表明,干旱条件下,与对照相比,施用海藻肥Ⅵ或施用减量海藻肥Ⅵ均可明显提高菜心的叶长、叶宽、株高;从各形态指标和生物量总体评价,海藻肥Ⅵ、0.8倍海藻肥Ⅵ的肥效明显优于0.6倍海藻肥Ⅵ;与水溶肥相比,海藻肥Ⅵ或0.8倍海藻肥Ⅵ可在菜心生长的中后期将其叶宽与株高显著提高,与复合肥相比结果也是如此。图5a~5d表明,与对照或水溶肥相比,海藻肥Ⅵ或0.8倍海藻肥Ⅵ处理可明显提高干旱条件下菜心可溶性糖、可溶性蛋白,维生素C、可溶性固形物的含量;海藻肥Ⅵ与复合肥相比时,可明显提高菜心的可溶性糖含量、维生素C、可溶性固形物含量,0.8倍海藻肥Ⅵ与复合肥相比时,可明显提高菜心可溶性糖和维生素C含量。结合图5e和图5f来看,与对照相比,海藻肥Ⅵ、0.8倍海藻肥Ⅵ、0.6海藻肥Ⅵ均可明显提高菜心生物量;另外,海藻肥Ⅵ或0.8倍海藻肥Ⅵ处理条件下的菜心生物量与水溶肥相比差异明显,但仅海藻肥Ⅵ可较复合肥处理下的菜心生物量明显提高。
结合试验A和B可知,正常供水条件下,海藻肥Ⅵ肥效与复合肥相比均无明显优势,但与水溶肥相比优势明显,且海藻肥Ⅵ减量20%仍能一定程度上提高菜心形态指标和品质指标;干旱条件下,无论与复合肥还是水溶肥相比,海藻肥Ⅵ或减量20%海藻肥Ⅵ均优势明显;综上所述,海藻肥Ⅵ与复合肥或水溶肥相比可提高菜心抗旱性,且适当减量依旧能达到抗旱效果。
实施例7
海藻肥(Ⅵ)的大田试验1:
试验材料:碧清菜心(种子来源于广东省农科院)。
试验时间:2016年10月~11月
试验设置:试验地点设在广东广州白云区钟落潭试验基地蔬菜大棚(23.16°N东经112.34°N),田间采用随机区组排列,每一小区面积为10m×1.5m,每一小区为一个处理的一次重复,共设置海藻功能肥(海藻肥Ⅵ)、传统施肥(复合肥)、对照三个处理,3次重复,且分别在正常供水条件下和干旱条件下同时进行。菜心育苗统一在育苗盘的基质中进行,当菜心长至三叶一心移至大田土壤中,行株距15cm×15cm,菜心完全缓苗后开始处理,每10天灌根施用海藻肥Ⅵ或复合肥10L/m2 1次,共施肥3次;干旱区在菜心生长的中后期(20~40天)进行断水处理,每次断水5天后正常供水一次,正常区每天进行正常水分管理;收获时测定菜心产量及品质指标(可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C,可溶性固形物),统计结果如表3所示。
表3大田条件下海藻肥对广东地区菜心产量及品质的影响
注:表中数据为平均值±标准偏差(n=3),经济产量为亩(667m2)产量,可溶性糖采用蒽酮比色法测定,可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定,维生素C采用2,6-二氯靛酚滴定法,可溶性固形物利用糖度计(托普云农TD45)测定,表中同列(正常供水与干旱分开比较)具有相同字母的表示差异不显著(α=0.05),试验结果采用The SAS System forwindows9.0(SAS Institute Inc.,USA,2002)进行平均值、标准偏差,数据多重比较。图6为海藻肥在广东地区的大田肥效实验田间摄像图。
表3表明,正常供水条件下,与对照相比,海藻肥Ⅵ可明显提高大田条件下广东菜心的产量与品质指标,但海藻肥Ⅵ与传统施肥(复合肥)处理条件下菜心的产量与品质均无明显差异。干旱胁迫时,与复合肥相比,海藻肥Ⅵ可明显提高菜心产量、可溶性糖、可溶性蛋白含量,增幅分别为19.81%、28.03%、11.03%;上述结果说明,正常供水条件下海藻肥Ⅵ与传统施肥相比并无太大优势,但干旱条件下可明显提高广东地区菜心产量与主要品质指标。
实施例8
海藻肥(Ⅵ)的大田试验2:
试验材料:增城迟菜心(种子来源于深圳市深绿帅农业科技有限公司)。
试验时间:2017年3月~6月
试验设置:试验地点设在宁夏省固原市原州区马园村试验基地(36.01°N东经106.28°N),田间采用随机区组排列,每一小区面积为667m2,每一小区为一个处理的一次重复,共设置海藻功能肥(海藻肥Ⅵ)、传统施肥(复合肥)、对照三个处理,3次重复,且分别在正常供水条件下和干旱条件下同时进行。菜心育苗统一在育苗盘的基质中进行,当菜心长至三叶一心移至大田土壤中,行株距20cm×20cm,菜心完全缓苗后开始处理,每10天灌根施用海藻肥Ⅵ或复合肥10L/m2 1次,共施肥4次;干旱区在菜心生长的中后期(30~50天)进行断水处理,每次断水5天后正常供水一次,正常区每天进行正常水分管理;收获时测定菜心产量及品质指标(可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C,可溶性固形物),统计结果如表4所示。
表4大田条件下海藻肥对宁夏地区菜心产量及品质的影响
注:表中数据为平均值±标准偏差(n=3),经济产量为亩(667m2)产量,可溶性糖采用蒽酮比色法测定,可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定,维生素C采用2,6-二氯靛酚滴定法,可溶性固形物利用糖度计(托普云农TD45)测定,表中同列(正常供水与干旱分开比较)具有相同字母的表示差异不显著(α=0.05),试验结果采用The SAS System forwindows9.0(SAS Institute Inc.,USA,2002)进行平均值、标准偏差,数据多重比较。
表4的结果表明,当给宁夏地区的菜心正常供水时,施用海藻肥Ⅵ可将菜心产量较传统施肥(复合肥)明显提高14.67%,同时,可将菜心可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、可溶性固形物含量分别提高26.30%、12.20%、7.06%、8.75%、处理间达到显著水平。处于干旱胁迫时,与传统施肥相比,海藻肥Ⅵ对菜心产量、可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、可溶性固形物含量增幅变大,分别达18.72%、42.23%、16.58%、15.07%、22.04%;综上所述,在宁夏地区,施用海藻肥Ⅵ不仅可在干旱胁迫时提高菜心产量与品质,在正常条件下也能使菜心增质增产,这与广东地区大田试验的结果有一定差异,可能与南北温差、光照、土壤性质等环境因素有一定关系。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种具有抗旱功能的海藻液体肥料,其特征在于按质量百分比计包含以下组分:海藻抗旱功能载体40%、外源抗旱物质0.5%、腐殖酸3~4%、化学肥料55~56%、表面活性剂0.5%;
所述的外源抗旱物质包括二甲基磺基丙酯、三甲基甘氨酸、氯化胆碱、赤霉素、水杨酸、三苯基酚中的一种或几种;
所述的化学肥料包括大量元素、中量元素、微量元素;大量元素为尿素、硝酸钾、磷酸一铵、磷酸二铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸钾中的至少两种,中量元素为七水硫酸镁、氯化镁、乙二胺四乙酸二钠钙中的至少两种,微量元素为七水硫酸锌、硫酸亚铁、硼砂、五水硫酸铜、氯化锰中的至少两种;
所述的表面活性剂包括烷基聚氧乙烯醇、聚丙烯酰胺、苄基酚聚氧乙烯醚、甘油脂肪酸酯、木质素磺酸盐中的一种或几种;
所述的海藻抗旱功能载体的制备方法,包括如下步骤:
1)将新鲜海藻除杂剪碎匀浆后制成浆液;所述的新鲜海藻包括海带、马尾藻、泡叶藻中的一种或多种;
2)往步骤1)的浆液中加入特定的复合酶酶解得到酶解液,然后接种微生物进行发酵,发酵结束后将发酵液用纱布过滤,得到滤液为海藻提取物;所述的微生物包括:浆液质量计1~2%的枯草芽孢杆菌、1~3%的巨大芽孢杆菌、1~5%的酵母菌;所述的发酵的条件为温度设为30~50℃,转速设为120~200rpm,震荡发酵8~24小时;
3)往步骤2)的海藻提取物中加入功能物质保护剂以保全功能物质活性;所述的功能物质保护剂包括维生素C、螯合亚铁、亚磷酸、偏磷酸、过氧化氢、高锰酸钾、次氯酸钾中的两种或多种;所述的功能物质保护剂加入量为海藻浆液质量计的0.005%~0.05%;
4)将经活性保全后的海藻提取物依次通过不同分子量的分子膜,得到几种不同分子量的组分,并通过作物抗旱活性检测,评价这几种组分对作物抗旱活性的影响,筛选出抗旱活性最高的组分即为海藻抗旱功能载体。
2.根据权利要求1所述的具有抗旱功能的海藻液体肥料,其特征在于:
步骤1)中所述的浆液是将市售新鲜海藻除杂后剪成1~4cm2的碎片状,按质量比为1:2~1:10的比例加入清水,用组织捣碎机匀浆后,放置在摇床上震荡1~4小时制备而成,温度设为30~50℃,转速设为120~200rpm。
3.根据权利要求1所述的具有抗旱功能的海藻液体肥料,其特征在于:
步骤2)中所述的酶解液是将海藻浆液pH调至中性,加入海藻浆液质量计0.01%~0.1%的PPC复合酶,接着在摇床上震荡酶解2~12小时制备而成,温度设为30~50℃,转速设为120~200rpm;
所述的PPC复合酶包括纤维素酶、果胶酶、蛋白酶;
所述的PPC复合酶,加入的顺序是:先向浆液中加入一部分纤维素酶和全部的果胶酶后,将体系在摇床上震荡1~6小时后,再加入余下的纤维素酶和全部的蛋白酶,再次将体系在摇床上震荡1~6小时。
4.根据权利要求1所述的具有抗旱功能的海藻液体肥料,其特征在于:
步骤2)中所述的发酵液是先向酶解液中加入微生物所需的营养物质充分搅拌均匀,再接种种类不同的微生物,然后在摇床上震荡发酵8~24小时制备而成;
所述的微生物所需的营养物质包括:酶解液质量计0.3%~0.5%的无水葡萄糖、0.1%~0.5%的酵母粉、0.01%~0.1%的磷酸二氢钾、0~0.01%的硫酸镁、0~0.01%的氯化钙溶液。
5.根据权利要求1所述的具有抗旱功能的海藻液体肥料,其特征在于:
所述的腐殖酸由黄腐酸、硝基腐殖酸、黄腐酸钾中的一种代替。
6.权利要求1~5任一项所述的具有抗旱功能的海藻液体肥料的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)向海藻抗旱功能载体中加入外源抗旱物质混合均匀后,再加入腐殖酸、化学肥料,充分搅拌均匀;
(2)最后,加入表面活性剂,再次搅拌均匀,制备得到具有抗旱功能的海藻液体肥料。
7.权利要求1~5任一项所述的具有抗旱功能的海藻液体肥料的施用方法,其特征在于包括如下步骤:
将所述的具有抗旱功能的海藻液体肥料进行灌根或叶喷施用,其中,灌根稀释倍数为300~500倍,叶喷稀释倍数为1000~2000倍。
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