CN1076281A - 免疫检测的金属溶胶银显色方法 - Google Patents

Abstract

本发明是用于医学、法医学和药物测试等免疫检 测的金属溶胶银显色方法，采用胶体金作检测标记物 和由银盐、还原剂、稳定剂所组成的银显色液为显色 剂。其中，还原剂是浓度(％)为0.02—0.5的抗坏血 酸或0.1—1的单宁酸，稳定剂是选用至少含有2个 卤素基团的环结构的物质(如曙红丫)，其浓度(％)是 0.01—0.1，与银盐的比例是1∶2—2∶1。本发明具 有高敏感性和特异性、稳定性好、成本低廉的优点。 还有不需要特殊仪器设备、易于推广应用的优点。

Description

本发明是用于医学、法医学和药物测试等免疫检测的金属溶胶银显色方法。免疫检测是基于抗原和针对此抗原的抗体间高度特异反应的一种检查方法。

现代免疫检测方法的特点是用某些特殊的物质标记反应系中抗原或抗体。最重要的方法包括同位素、荧光素、发光物质、酶以及近年来的金属溶胶尤其是胶体金。

1971年，Faulk和Taylor首先报告成功地将免疫胶体金技术应用于电镜检查。在组织化学领域的成功应用则是近年来所取得的重大突破。它需要在金标抗体染色后进一步用银显影液处理，使金颗粒周围吸附大量银颗粒，光镜检查时阳性部位呈现金属银的黑褐色。银显影液通常由对苯二酚和硝酸银（或乳酸银或醋酸银）银盐组成。

免疫胶体金技术用于免疫检测方面，也有一些成功的进展。如将金溶胶在免疫凝集试验时作为载体，金溶胶的光散射性因金颗粒的凝集发生变化。利用这一原理的免疫测定法的敏感性接近于放射免疫分析的水平。在已出版的Abstracts    of    the    Annual    Meeting    1986    of    the    International    congress    of    Immunology第363页中公开了一种直接滴定法，即利用硝酸纤维素膜固化抗体，在免疫过滤时捕获抗原，然后直接滴定金标抗体。红色代表阳性反应。弗郎西斯X.科尔在我国申请的专利（申请号88109104.9，公开号CN1032458A）中，描述了一种通过收集金溶胶颗粒与固相颗粒复合物来检测样品中分析物的方法。总的来说，直接测定金属溶胶的红色及其在免疫反应中的变化的免疫检测法，其敏感性和特异性难尽人意。

利用银显影液显色的免疫胶体金技术，难以推广的原因在于目前的银显影缺乏稳定性，必须临用前配制。而且，显色必须在避光的条件下进行。这是常规工作所不能接受的。此外，银显影液所产生的非特异颜色过强，也影响了其实用价值。

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种免疫检测的金属溶胶银显色方法。该方法能有效地显示胶体金颗粒以检出微量的抗原成分，从而在免疫检测领域中具有实用价值。

本发明的目的是这样实现的：采用胶体金为检测的标记物和由银盐、还原剂、稳定剂所组成的银显色液为显色剂。其中，还原剂是单种成分或混合成分，单种成分是，浓度（%）为0.02-0.5的抗坏血酸，或浓度（%）为0.1-1的单宁酸。稳定剂是选用至少含有2个卤素基团的环结构物质，其浓度（%）是0.01-0.1，与银盐的比例是1∶2-2∶1。

上述的胶体金的制备，金颗粒标记抗体、抗原，均可用公知技术获得。例如，一般可用0.01%氯化金在搅拌下加入一定量的还原剂如柠檬酸三钠、单宁酸、抗坏血酸等。反应后即获得从1毫微米至100毫微米的胶体金颗粒。在胶体金溶液中加入最小稳定量的抗体、抗原，经高速离心或凝胶过滤，即获得金标抗体或金标抗原。

上述的银盐可用硝酸银、硫酸银、醋酸银等，其中硝酸银效果最好，且成本很低。硝酸银浓度一般为0.01-0.1%。

上述的还原剂也可以是由抗坏血酸和单宁酸组成的混合成分，两者的用量可以是各自单用量的一半。还可以是由抗坏血酸和对苯二酚组成的混合成分，两者的浓度（%）可以分别是0.01-0.05、0.2-1。

上述的稳定剂可以是曙红丫（商品名四溴萤光黄钠盐，分子式为C₂₀H₆O₅Br₄Na₂），其分子量是硝酸银的4倍，但含有4个卤素基团，故两者比例约为1∶1。与溴化银不同的是，曙红丫的银化合物溶解度较高。

曙红丫同时具有二个方面的作用：一方面与银离子形成稳定的结合，使银离子在无胶体金催化的情况下很难被还原剂还原。另一方面，在胶体金存在的情况下，又能促进金颗粒的催化作用-助催化作用。其结果是，增进了显色系统的敏感性，同时又大大降低了非特异反应。其它具有类似结构的物质如酸性玫瑰红、四碘萤光黄等也有相同的作用，故它们也可作稳定剂。在确定它们与银盐的比例时，可先计算分子量，再根据一个卤素基团结合一个银离子的原则计算其比例。原则是必须保证绝大多数的银离子被结合。

在上述的显色剂中，各组分的比较好的浓度值可以是：

抗坏血酸（%）    0.05-0.2，

单宁酸（%）    0.2-0.5，

曙红丫（%）    0.03-0.06，

硝酸银（%）    0.03-0.06。

本发明的优点在于：其一，高敏感性和特异性，这有利于某些免疫检测项目如肝炎的检查。假阴性的肝炎病人血液输入正常人体后，有可能造成严重后果。本发明的显色剂在室温下历时2小时以上，不出现明显变化。但若加入1∶100万稀释的胶体金原液（5nm，金原液由0.01%氯化金获得，约含4.5×10¹³/ml个金颗粒），显色剂在5-10分钟内即出现明显的颜色变化。初步检测即已显示，间接法直接包被癌胚抗原所检出的癌胚抗原最小量在20皮克/ml以下。其敏感性超过酶免疫分析方法，与放射免疫分析相同或更为敏感。本发明的显色剂在无胶体金催化的情况下，可保持较长时间不变色。一旦出现颜色变化，即可认为是反应系中有金颗粒存在。非特异吸附至固相的金颗粒比较容易被清洗掉。因此，免疫检测系统本身造成的非特异显色程度极低。其特异性几乎完全取决于抗原、抗体的特性和纯度。可以说，本方法的特异性优于其它方法。

其二，本发明的免疫检测系统，不需要特殊仪器设备，因而容易推广应用。

其三，本发明的显色剂4℃保持一年以上，不会出现明显性质变化，稳定性好，明显优于其它免疫检测方法。

其四，成本低廉。本发明所需要的抗原抗体基本同其它方法，除此之外的试剂主要是氯化金和硝酸银，由于用量甚微，故本发明的试剂成本低于已被认为成本很低的酶免疫分析。

此外，本发明同样适用于其它金属胶体，如胶体铁、胶体银等。既可用于免疫检测，以临床医学为例，可作某些肿瘤检查的重要辅助手段，以及对某些传染病而言，如肝炎、爱滋病、寄生虫病等的最重要的检查方法。也可用于免疫学的其它领域，如免疫组织化学。并适用于一些类似于免疫学检验的技术领域，如分子杂交、凝集素化学等。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例一：

癌胚抗原的定量检测（间接法直接包被癌胚抗原）：

1、包被抗原：取用碳酸盐缓冲液（PH9.6）按一定比例稀释的癌胚抗原0.1ml加入聚苯乙烯板孔，4℃过夜。

2、洗板：用0.01uPBS（PH7.4，含0.05%Tween    20）洗3次×3分钟。

3、加抗血清：0.1ml癌胚抗原单克隆抗体，37℃，1小时后倾去。

4、加金标葡萄球菌A蛋白，0.1ml，37℃，30分钟。

5、洗涤：0.01mPBS1次×3分，蒸馏水5次。

6、显色：加0.1ml底物液（AgNO₃+曙红丫），含0.06%（即60mg/100ml）曙红丫，0.04%（即40mg/100ml）硝酸银。再加入0.05ml还原液，含抗坏血酸0.2%。室温静置15分钟后观察结果。也可用0.05ml 10% H₂SO₄终止反应后，用光度计测定光密度值。

实施例二：

日本血吸虫可溶性虫卵抗原抗体的检测：

1、包被：取0.1ml碳酸盐缓冲液稀释的日本血吸虫可溶性虫卵抗原加入聚苯乙烯板孔，4℃过夜。

2、洗板。

3、加样：0.1ml病人血清，37℃，10分钟后倾去。

4、加金标A蛋白。

5、洗涤。

6、显色：加显色液后，可在1分钟内观察结果。黑色为阳性，红色为阴性。

实施例三：

本实施例提供了五种显色液配方，（请见附表），检验过程同实施例一、二。表中的每种配方均含有硝酸银、曙红丫，只有还原剂方面只选用1-4中的一种：如方案一，若选用了抗坏血酸（即1号），余三种不用;若用抗坏血酸（即3号），另三种不用。方案二-五依此类推。硝酸银与曙红丫的比例为1∶1的，有方案一、三、五;比例为1∶2的有方案二;比例为2∶1的有方案四。

不同的配方适应不同的检验要求。共中方案三效果较好，可适应多数免疫检验。方案一、二具有高度的稳定性，敏感性稍差，这适于不需要特别敏感的检验，如血吸虫、可溶性抗原抗体的检验。方案四具有高度的敏感性，特异性较差，这适合于快速检验的显色，尤其是定性检验。方案五适于某些检验范围较广的检验，如癌胚抗原。

Claims (7)

1、一种免疫检测的金属溶胶银显色方法，采用胶体金为检测的标记物和由银盐、还原剂、稳定剂所组成的银显色液为显色剂，其特征在于所述的还原剂是单种成分或者混合成分，其中单种成分是抗坏血酸，浓度(%)为0.02-0.5，或是浓度(%)0.1-1的单宁酸，所述的稳定剂是选用至少含有2个卤素基团的环结构的物质，其浓度(%)是0.01-0.1，与银盐的比例是1∶2-2∶1。

2、根据权利要求1所述的显色方法，其特征是所述的稳定剂，是选用曙红丫，其与硝酸银的比例是1∶1。

3、根据权利要求1所述的显色方法，其特征在于所述的稳定剂是酸性玫瑰红。

4、根据权利要求1所述的显色方法，其特征在于所述的稳定剂是四碘萤光黄。

5、根据权利要求1所述的显色方法，其特征在于所述的混合成分的还原剂是由抗坏血酸和单宁酸组成，两者的用量是各自单用量的一半。

6、根据权利要求1所述的显色方法，其特征在于所述的混合成分的还原剂是由抗坏血酸和对苯二酚组成，两者浓度（%）分别是0.01-0.05、0.2-1。

7、根据权利要求1所述的显色方法，其特征在于显色剂中各组分的浓度是：

抗坏血酸0.05-0.2%，

单宁酸  0.2-0.5%，

曙红丫（%）0.03-0.06，

硝酸银（%）0.03-0.06。