CN107615057A - 用于阈值分析物校准及使用阈值分析物校准进行定量的系统、设备和方法 - Google Patents

用于阈值分析物校准及使用阈值分析物校准进行定量的系统、设备和方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于定性和定量检测生物标本中的分析物的确定性筛选技术。

Description

用于阈值分析物校准及使用阈值分析物校准进行定量的系 统、设备和方法
相关申请
本申请要求2015年3月16日提交的美国临时申请No.62/133,717和2015年8月30日提交的美国临时申请No.62/211,855的优先权，每份美国临时申请均以引用方式并入本文。
技术领域
本发明整体涉及液相色谱和质谱方法，特别是对质谱分析的基质效应的归一化很有用的液相色谱和质谱方法。
背景技术
目前，通过使用竞争性结合技术或免疫结合技术的免疫测定法来执行生物标本(例如尿液)中的分析物筛选(例如药物筛选)。免疫测定法的选择性取决于分析物上的表位与测定法中采用的试剂抗体的免疫反应性。众所周知，具有相似表位的分析物类别诸如阿片类、苯二氮卓类或苯丙胺类可在筛选免疫测定法中交叉反应。因此，免疫测定法对于特异性分析物的检测不具有选择性，但可以检测该类别内反应性不同的分析物。此外，在任何内源性或外源性化学物质被表位结合位点识别并结合到表位结合位点的情况下，而且在内源性化学物质和外源性化学物质因与抗体非特异性结合而引起的其他结合的情况下，可能发生免疫测定法交叉反应。使用含有阈值浓度的表位相似类别分析物之一的生物标本，对筛选免疫测定法进行校准。因此，免疫测定方法可能无法对分析物进行确定性鉴定。所以，需要进一步测试以进行确定性鉴定。免疫测定法仅提供分析物或分析物类别的推定性鉴定，并被分类为推定性测试而不是确定性测试。
鉴于与免疫测定法相关的缺陷、持续担忧化学试剂和生物试剂对公众健康的影响以及对鉴定抵御疾病的新候选药物的关注越来越多，需要确定性高通量分析物筛选技术(例如药物筛选)。
发明内容
本文提供了用于检测生物标本中的分析物的非推定性(即确定性)筛选技术。技术包括例如在用于选择性药物和代谢物检测的色谱(诸如液相色谱-质谱技术)分离中使用阈值分析物校准。这些技术相比基于免疫测定法的常规方法具有许多优点。
例如，与免疫测定法相比，本文所述的TAC测定法代表了在生物标本的筛选中检测和鉴定分析物的确定性测试。此外，免疫测定法可能对存在于生物标本中的任何内源性或外源性试剂呈阳性，即非选择性。例如，如果试剂仅仅因为表位相似性或非特异性结合而结合到抗体，则免疫测定法可能不能够将这些事件与特异性结合事件区分开，从而导致假阳性结果。然而，由于TAC测定法在分析中使用液相色谱-质谱技术，所以允许对分析物进行选择性检测和鉴定。
本文所述的TAC测定法的另一个优点是，其允许在单轮分析筛选中进行多分析物检测和鉴定。参见例如图4。通过免疫测定法进行推定性筛选，需要对每种分析物类别进行多次测定。
本文所述的TAC测定法的另一个优点是，其仅需要可获得的纯化分析物来用作参考分析物。换句话讲，本文所述的TAC测定法可快速适应于新出现的分析物(例如设计药物)的筛选。相比之下，免疫测定法筛选需要抗体和其他免疫测定试剂的商业开发，这对新出现的分析物可能不适用。
本文所述的TAC测定法的另一个优点是，其允许所分析的每个标本的阈值准确度。相比之下，免疫测定法仅用该分析物类别的单个成员进行校准。与该分析物类别的其他成员不同的反应性改变了该分析物类别的成员的阈值检测浓度。
本文所述的TAC测定法的另一个优点是，其代表定性和定量这两种测定的确定性测试。就免疫测定法而言，一旦获得推定性结果，当前就使用同位素稀释技术作为第二次测试。通过同位素稀释技术实现的分析物准确定量(在生物标本中所存在的阈值浓度和整个分析范围浓度两者处)需要针对每种分析物的同位素标准品(例如氘化标准品)的可用性。需要针对每种分析物的同位素标准品，以补偿可能在每个正被测试的生物样品中可变地发生的基质效应。参见例如图1和图2。这种方法的问题是同位素标准品并不适用于所有药物和代谢物，特别是新出现的策划药。至少出于这个原因，同位素稀释不易适用于筛选大量生物标本中的多分析物。然而，所述的TAC方法不受同位素标准品的可用性的限制。这是因为所公开的方法通过例如以下方式来补偿基质效应：加入以与纯生物样品中的任何分析物相同的方式来与生物基质相互作用的加标参考分析物。参见例如图3。
本发明方法通过至少提供以下方面来解决与基于免疫测定法的常规方法相关的问题：在生物标本筛选(定性和定量这两者)中检测和鉴定分析物的确定性测试、在单轮分析筛选中的多分析物检测和鉴定、仅需要可获得的纯化分析物来用作参考分析物的方法、以及所分析的每个标本的阈值准确度。此外。在寻找与基于免疫测定法的常规方法相关的问题的解决方案时，针对本文所述的TAC定量方法意外地发现，参考分析物的浓度比在本文公开的TAC筛选和检测技术的示例性实施方案中使用的阈值浓度大许多倍，这引起TAC比率和浓度之间的关系线性化。参见例如图15。所得的TAC比率和浓度之间的线性关系允许在单个测定法中对多种分析物进行定性和定量这两种测定。
本文还提供了用于按照本文所述的方法计算分析物的阈值比率和校准定量关系的装置。
附图说明
图1示出了使用具有相同分析物浓度的三个尿液样品时基质效应对离子面积计数的影响。
图2示出了使用具有不同分析物浓度的三个尿液样品时基质效应对离子面积计数的影响。
图3示出了使用本文所述方法通过在阈值浓度的参考分析物的加标(S)之前和之后分析样品而实现的基质效应的归一化。
图4示出了根据本文所述方法得出的TAC校准比率的尿液间再现性。
图5表示按照本文所述方法进行的TAC分析的定性筛选应用。
图6示出了按照本文所述方法进行的对案例标本的TAC筛选。
图7示出了通过如本文所述的TAC技术进行的多分析物校准的示例性实施方案。
图8示出了通过本文所述方法测试的分析物的TAC比率。
图9表示根据本文所述方法的孔内样品制备。
图10表示根据本文所述方法的在水解情况下的快速孔内样品制备。
图11表示根据本文所述方法的高通量滤板制备。
图12示出了根据本文所述方法的高于和低于阈值质量控制数据的测定法准确度。
图13示出了根据本文所述方法的高于和低于阈值质量控制数据的测定法精度。
图14表示根据本文所述方法的确认测试与TAC筛选的比较。
图15示出了根据本文所述方法的TAC定量原理。
图16示出了根据本文所述方法的TAC定量的校准性能。
图17示出了根据本文所述方法的TAC定量的校准精度。
图18示出了根据本文所述方法的TAC定量的质量控制精度。
图19示出了根据本文所述方法的TAC定量的偏差图。
具体实施方式
阈值分析物校准(“TAC”)是本文所述的分析技术或方法，其采用液相色谱-质谱技术，并允许准确和选择性地筛选、检测、鉴定和定量生物标本类型(例如尿液、口腔液、血液、毛发、指/趾甲和其他体液或组织)中的单种或多种分析物(例如药物、药物代谢物或其他化学试剂)。TAC利用阈值浓度标准来明确检测和鉴定分析物和/或确定TAC比率和分析物浓度之间的关系以进行定量。
当用作筛选和检测技术(“TACS”)时，本文的TAC方法包括确定如本文所述的浓度阈值，以明确鉴定生物样品中的分析物。可以通过测定含有阈值浓度的分析物的生物标本来执行TACS方法中的校准。参见例如图4至图9。
在一个方面，在任选的标本预分析处理或清理之后，筛选和检测(“TACS”)测定方法包括在添加和不添加参考分析物制剂的情况下制备和分析生物标本。对生物标本进行两次分析，一次没有添加参考分析物(纯物质)，一次添加有参考分析物(纯物质+加标物)。然后，对于所分析的每种生物标本类型，计算纯物质与加标物分析物离子的TAC比率。加标物分析物离子计数或面积由纯物质+加标物分析和纯物质分析之间的分析物离子差值确定。对于每种生物标本类型的测定法，通过对补充有在阈值浓度下的参考分析物的阴性生物标本样品进行TAC分析来对TAC比率进行校准，从而实现阈值准确的药物检测和鉴定。然后，使用标准质量控制操作，利用TAC比率来选择性地且准确地检测具有未知分析物浓度的生物标本中的分析物。
当用作定量技术(“TACQ”)时，本文的TAC方法包括使用多个校准品，将在正被分析的样品中的分析物的TAC比率和浓度之间的关系限定在该关系的线性范围内。参见例如图15至图18。
在一个实施方案中，在任选的标本预分析处理或清理之后，该定量(“TACQ”)测定方法包括在添加和不添加参考分析物制剂的情况下制备和分析具有不同分析物浓度的一系列生物标本。对每个生物标本进行两次分析，一次没有添加参考分析物(纯物质)，一次添加有参考分析物(纯物质+加标物)。然后，对于所分析的每种生物标本，计算纯物质与加标物分析物离子的TAC比率。加标物分析物离子计数或面积由纯物质+加标物分析和纯物质分析之间的分析物离子差值确定。然后使用回归分析来确定一系列生物标本的TAC比率和分析物浓度之间的关系。然后使用标准质量控制操作，利用TAC比率和分析物浓度之间的关系来确定具有未知分析物浓度的生物标本中的分析物的量。
本文所述的TAC测定方法适用于测定分析物(参考分析物)的纯化制剂可用的任何分析物，包括但不限于标记的内标不可用的新出现的分析物(例如设计药物)。TACS和TACQ均适用于使用液相色谱-质谱技术的测定方法。
提供了用于检测和/或定量生物标本中的分析物的另外的方法。在一个示例性实施方案中，所述方法包括分析第一样品以获得第一结果，所述第一样品包括生物标本的第一部分；分析第二样品以获得第二结果，所述第二样品包括所述生物标本的一部分和在限定浓度下的参考分析物；以及计算以下两者之间的比率：(i)第一结果和(ii)第二结果与第一结果之间的差值。在一些实施方案中，该方法还可以包括将该比率与校准的阈值比率进行比较。在各种实施方案中，该方法还可以包括基于该比较来确定阈值分析物结果。
在示例性实施方案中，用于计算校准的阈值比率的步骤可以包括分析生物标本的已知样品以获得第一校准结果；分析已知样品和在限定浓度下的参考分析物的组合以获得第二校准结果；以及将校准的阈值比率计算为以下两者之间的比率：(i)第一校准结果和(ii)第二校准结果与第一校准结果之间的差值。例如，参考分析物的限定浓度可以是分析物的阈值浓度。在其他示例中，参考分析物的限定浓度可以高于或低于分析物的阈值浓度。在一些示例性实施方案中，限定浓度可以在分析物阈值浓度的约10％至分析物阈值浓度的约750％的范围内。例如，参考分析物的限定浓度可以是该测定法的线性度的上限和下限之间的任何浓度。参见例如图12和图13。
在另一方面，用于定量生物标本中的分析物的方法包括分析第一样品以获得第一结果，所述第一样品包括生物标本的第一部分；分析第二样品以获得第二结果，所述第二样品包括生物标本的一部分和在限定浓度下的参考分析物；计算以下两者之间的比率：(i)第一结果和(ii)第二结果与第一结果之间的差值；以及将所计算的比率与校准的定量关系进行比较，以及基于校准的定量关系确定生物样品中的分析物的量。
在另一方面，用于检测和定量生物标本中的分析物的方法包括分析第一样品以获得第一结果，所述第一样品包括生物标本的第一部分；分析第二样品以获得第二结果，所述第二样品包括生物标本的一部分和在限定浓度下的参考分析物；计算以下两者之间的比率：(i)第一结果和(ii)第二结果与第一结果之间的差值；以及将所述比率与校准的定量关系进行比较，以及基于所述比较，确定生物标本中的分析物的量和阈值分析物结果两者。
在示例性实施方案中，用于计算校准的定量关系的步骤可以包括分析生物标本的多个已知样品以获得多个第一校准结果，所述多个已知样品各自包含不同浓度的已知分析物；分析与在限定浓度下的参考分析物结合的所述多个已知样品中的每个以获得多个第二校准结果；以及将校准的定量关系计算为如下的线性回归：(a)以下两者之间的多个比率：(i)多个第一校准结果中的每个和(ii)第二校准结果中的每个与第一校准结果中的每个之间的对应差值，以及(b)已知样品中的已知分析物的对应不同浓度。例如，多个已知样品中的已知分析物的不同或变化浓度可至少包括定量下限处的第一浓度和定量上限处的第二浓度。定量上限在一些示例中也可以指定量线性度的上限或上至测定法中使用的最高校准品(即测定法中使用的已知分析物的最高浓度)的定量线性度。定量下限在一些示例中也可以指定量线性度的下限、下至测定法中使用的最低校准品(即测定法中使用的已知分析物的最低浓度)的定量线性度，或测定法的最低检测限度。在一些实施方案中，多个已知样品中的已知分析物的不同浓度可以包括定量下限和定量上限之间的多个浓度。在示例性实施方案中，分析物的阈值浓度可以介于定量下限处的第一浓度与定量上限处的第二浓度之间。参见例如图15。
在示例性实施方案中，参考分析物的限定浓度可以大于分析物定量上限的约15％。在一些实施方案中，参考分析物的限定浓度可以大于分析物定量上限的约25％。在一些实施方案中，参考分析物的限定浓度可以大于分析物定量上限的约30％。在一些实施方案中，参考分析物的限定浓度可以大于分析物定量上限的约50％。在一些实施方案中，参考分析物的限定浓度可以在分析物定量上限的约30％至分析物定量上限的约50％的范围内。参考分析物浓度是指在添加到生物标本后得到的参考分析物的最终浓度。
也可以使用本文所述的TAC测定方法中的样品制备的机器人自动化，该机器人自动化可以改进与TAC测定方法相关的工作流程。此外，TAC分析技术的实施方案可用于定量分析物，以及在存在于生物样品中的分析物浓度的整个范围内进行全面定量分析。筛选方法不需要定量，但TAC的定量应用可允许该方法用于需要定量一种或多种分析物的确认测试。
在本文所公开的示例性方法中使用的生物标本/样品可以包括能够经由色谱法分析的任何材料，诸如尿液、毛发、血液、口腔液和其他材料。在一个方面，生物标本/样品是尿液。
因此，在一些实施方案中，已开发并验证UPLC-MS/MS分析的阈值分析物校准(TAC)方法，以便使用临床测试方案或法医测试方案进行尿液中的靶向药物的阈值准确度筛选。该方法包括例如在有和没有参考分析物加标物的情况下测试尿液，具体方式是使用尿液(纯物质)的初始测试，然后通过加入在阈值浓度下的分析物来分析尿液(加标物样品)。参见例如图5和图6。在一个方面，按照该方法的各个尿液样品显示出由于电喷雾离子化中的基质效应，相同阈值浓度的分析物的离子面积有所变化。然而，纯尿液中的分析物与加标尿液中的分析物的离子面积比率(TAC比率)在尿液标本之间是可再现的，并允许对每个尿液标本进行阈值准确的药物检测。在一个方面，然后通过分析补充有在阈值浓度下的参考分析物的阴性尿液样品，对在阈值药物浓度下的每种分析物校准TAC比率。之然后将校准的响应比率用于以批量分析的方式在质量控制和案例标本中进行选择性和准确的药物检测。参见例如图14。
在一些实施方案中，该程序涉及通过托盘加入尿液标本，然后制备待用于由阈值校准方法进行UPLC-MS/MS药物筛选的初级标本的存管记录等分试样。参见例如图9。在UPLC-MS/MS分析之前，通过与纯化的β葡萄糖醛酸酶(IMCSzyme)一起温育，将独立的纯测试样品和加标测试样品水解，添加试剂再加上起始流动相稀释约五倍，然后真空过滤。将美沙吡林加入所有纯样品制剂和加标物样品制剂中，以监测UPLC进样体积可靠性。使用选择性反应监测(SRM)，通过UPLC-MS/MS在96孔板格式中分析经过滤的样品，且双重采集诊断鉴定性离子跃迁以及可用时的定性离子跃迁。参见例如图9至图11。针对包含分析物阈值浓度的校准品尿液，确定了TAC比率，即纯物质分析中的分析物离子的离子面积除以加标分析中的加标分析物离子面积。然后针对所有质量控制和测试样品计算TAC比率，以准确的确定阈值阴性或阳性分析物结果。在一些实施方案中，该方法在阈值浓度范围内是定量准确的，但不用于阈值范围之外的分析物定量。
在一些实施方案中，可以在临床方案和法医方案两者中的测定认证之后报告所有阴性测试结果。也可以在认证之后报告临床测试中的阳性测试结果。在法医测试中，只有在使用另一个初始标本等分试样和替代方法测试和认证为阳性之后，才将具有阈值阳性结果的案例报告为阳性。
在一个实施方案中，还开发了UPLC-MS/MS分析的TAC定量方法，以便使用临床测试方案或法医测试方案定量尿液中的靶向药物。参见例如图16至图18。该方法涉及例如确定给定分析物的TAC比率和浓度之间的关系。使用多个校准品(即具有一系列已知浓度的样品)来确定TAC比率和浓度之间的关系，以将正被分析的样品中的分析物的TAC比率和浓度之间的校准品分析和校准曲线关系限定在由该校准曲线建立的线性范围内。该校准的范围从该测定法的定量下限(LLOQ)延伸到定量上限(ULOQ)，其中最低校准品和最高校准品位于这些浓度点。定量上限在一些示例中也可以指定量线性度的上限或上至测定法中使用的最高校准品(即测定法中使用的已知分析物的最高浓度)的定量线性度。定量下限在一些示例中也可以指定量线性度的下限、下至测定法中使用的最低校准品(即测定法中使用的已知分析物的最低浓度)的定量线性度，或测定法的最低检测限度。
在本文所述的TAC定量方法中，意外地发现，参考分析物的浓度比在本文公开的TAC筛选和检测技术的示例性实施方案中使用的阈值浓度大许多倍，这引起TAC比率和浓度之间的关系线性化，如例如图15所示。例如，参考分析物的浓度为分析物所需定量的上限的约50％，引起在参考分析物处于阈值浓度时无法实现的所述线性关系。
本文所述的方法中使用的样品量取决于各种因素，诸如仪器灵敏度、可用性、稳定性等。在一个实施方案中，使用约500μL的样品。可以冷藏或冷冻样品/标本直到分析。分析后，在一些实施方案中，将阴性测试样品以冷藏(2-8℃)或冷冻(＜0℃)方式保存一个月。在一些实施方案中，将非阴性测试样品以冷冻(＜0℃)方式保存一年。
待由本发明方法筛选的感兴趣的药物和分析物不受限制，并且可以包括任何治疗药物或设计药物，或者感兴趣的一般分析物。例如，在一些方面，本文所述的方法可以用作毒理学目的(诸如用于法律、临床和就业)的筛选方法，并且可以包括例如治疗药物、非法药物和设计药物的目标列表，包括拟交感神经药、阿片样物质、苯二氮卓、可卡因和迷幻剂。
与本文所述方法兼容的色谱仪器和色谱柱化学作用包括例如能够从样品中分离感兴趣的药物和分析物的那些。这样的色谱仪器和色谱柱化学作用包括例如正相色谱法、反相色谱法、基于二氧化碳的色谱法、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲水相互作用液体相互作用色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、以及它们的组合。柱材料可以包括可用于从样品中分离感兴趣的药物和分析物的材料。这样的柱包括例如二氧化硅基(例如有机/无机杂化二氧化硅、高强度二氧化硅)和聚合物基(例如，亲水聚合物珠)制备柱、分析柱和毛细管柱、或它们的组合。
在一个实施方案中，本文使用的色谱仪器是UPLC-MS/MS系统(例如，WatersAcquityI-Class液相色谱系统、Waters自动进样器和WatersTQD质谱仪，每种均可购自美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford MA))。
在一个实施方案中，柱化学包括具有杂化基二氧化硅颗粒的分析柱(例如，AcquityBEH Phenyl色谱柱，1.7μm，2.1×50mm，可购自美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司)。
例如，参考分析物的浓度可以大于分析物定量上限的约15％。在一些实施方案中，参考分析物的限定浓度可以大于分析物定量上限的约25％。在一些实施方案中，参考分析物的限定浓度可以大于分析物定量上限的约30％。在一些实施方案中，参考分析物的限定浓度可以大于分析物定量上限的约50％。在一些实施方案中，参考分析物的限定浓度可以在分析物定量上限的约30％至分析物定量上限的约50％的范围内。对每种分析物校准TAC比率和浓度之间的关系。然后可将校准的定量关系用于定量药物检测。
在一个实施方案中，使用所公开的TACQ方法在偏离实际量的小于约20％的变化内获得定量。参见例如图17和图18。在另一个实施方案中，使用所公开的TACQ方法在小于约20％的偏差内获得定量结果。参见例如图19。在另一个实施方案中，针对所公开的全范围的分析物使用所公开的TACQ方法，在偏离实际量的小于约20％的变化内和小于约20％的偏差内获得定量。参见例如图17至图19和下面的示例部分。
示例
以下代表用于检测生物标本中的分析物的示例性程序，其包括本文所述的方法。
仪器
UPLC-MS/MS系统
Waters AcquityI-Class液相色谱系统、Waters自动进样器和WatersTQD质谱仪，每种均可购自美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司。
分析柱：
AcquityBEH Phenyl色谱柱，1.7μm，2.1×50mm，可购自美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司，部件号186002884。柱温45℃。
气体
氮气发生器(Peak Scientific DR11)。压力设定在100p.s.i.
氩气(UN1006 UHP-35罐)，Airgas East，Karner Road，Albany NT 12205。氩气碰撞池压力应为约4.5×10-3。
MSD校准
质量检测器(MS1和MS2)用碘化钠和碘化铯的混合物校准，对于静态分析，在20Da-925Da的质量范围内校准，而对于扫描分析，则在20Da-1000Da的质量范围内校准。根据仪器制造商的建议执行校准。
流动相
流动相A：2mM甲酸铵和0.1％甲酸的水溶液；流动相B：2mM甲酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液；进样体积：10μL；运行时间：3.3min；进样针清洗(溶剂B)：进样前6秒-进样后12秒
梯度
条件
极性：ES+
毛细管(kV)：0.54
RF(V)：2.50
提取器(V)：3.00
源温度：150℃
脱溶剂温度550℃
脱溶剂气流量：1000升/小时
采集时间：3.0min
材料
程序
如下所示准备一个96孔过滤板(例如Sirocco)，对于每个所测试的样品使用两个相邻列的孔，第一列标记为纯物质(“N”)，第二列标记为加标物(“S”)。清楚地标记Sirocco板上所有使用的孔。还可参见例如图9至图11。
对于分析中包含的所有标准品、对照和测试样品，使用以下板模板进行纯物质孔位置和加标物孔位置的工作表鉴定。
从冰箱获得或准备新鲜工作美沙吡林回收标准品(RS)、阈值校准品(加标物)、测定校准品(Cal)、QC75试剂、QC125试剂和QC1000试剂。
准备足够的水解试剂以执行当天的分析。
对于批量分析中使用的所有试剂，将所有校准品、QC试剂及其他试剂的批号和有效期记录在板工作表的背面。
取200μL的标准品、对照或标本加入纯物质孔和加标的孔中，且根据板工作表对样品进行适当标识。
将50μl的阴性尿液加入分析中使用的所有纯物质孔中。
将50μl的加标物加入分析中使用的所有加标物孔中。
将50μL的回收标准品加入所有分析孔中。
使板在实验台上轻柔地做圆弧滑动，由此混合孔至少10秒钟。
将50μL的缓冲葡萄糖醛酸酶加入所有分析孔中，并重复圆弧混合技术。
用铝箔覆盖分析板，并在55℃的烘箱中温育1小时。
温育完成后，将600μL的起始流动相加入所有分析孔中，并重复混合技术。
将96孔收集板置于过滤装置中，并且在该装置的顶部上正确对准Sirocco分析板之后，施加负压以将稀释的反应混合物过滤到收集板中。
过滤后，将收集板置于自动进样器(Acquity I Class自动进样器)中并对准，并且使用软件(Waters MassLynx软件)建立样品列表。
建立样品列表时使用的样品文件名是当前日期后跟样品名，如板工作表上所指示。以下是要在UPLC-MS/MS分析中使用的文件名连同进样顺序的实施例：
--------------相似顺序的剩余样品-----------------
进样(倒数第二)080614_Cal 100 N 孔(倒数第二)
进样(最后)080614_Cal 100 S 孔(最后)
使用进样方法中所用的已建立的96孔进样板格式，在样品列表上鉴定并输入每次分析的正确孔位置。
为所有进样选择10μL进样体积。
在样品列表上正确的Inlet文件和MS文件中浏览(在这两个文件中选择ThresholdStandardized Screening(阈值标准化筛选))。复制这些文件，以在每次进样时使用相同的inlet和MS文件。
保存样品列表，并标识分析日期和方法(例如，080614_Threshold StandardizedScreen)。
打开氮气和氩气碰撞气体两者，然后打开MS源，具体方式是例如打开MassLynxTUNE页面并点击顶部工具栏上的气体图标。
如果不需要灌注，则开始将流动相泵入分析柱中，具体方式是例如打开MassLynxINLET页面并打开称为Threshold Standardized Screening(阈值标准化筛选)的进样方法。如果需要灌注，则在进行柱泵送之前灌注流动相A和B，具体方式是例如打开CONSOL页面。(注意：当从上一次Threshold Standard Screening(阈值标准筛选)分析以来一直没有使用其他进样方法时，不需要灌注)。
监测例如MassLynx CONSOL页面上的柱压力。当一段时间内的压力差低于100psi时，达到稳定的压力。
当压力稳定时，选择所有样品，具体方式是例如进入样品页面，并且在选择运行图标(在页面顶部处指向右侧的箭头)之前选择所有样品。
当已采集第一加标样品时，查看总SRM色谱图，以验证采集窗口内是否存在分析物跃迁离子以及正确的峰对称性。
结果
根据示例性实施方案，要将分析物报告为阳性：
-保留时间与预期值的偏差必须在0.3分钟以内；
-跃迁离子比率必须在可接受的限度内(与50ng/ml标准品相比)；
-≥0.50的比率与预期值的偏差必须在20％以内；
-0.20至＜0.50的比率与预期值的偏差必须在25％以内；
-0.10至＜0.20的比率与预期值的偏差必须在30％以内；
-＜0.10的比率与预期值的偏差必须在50％以内；
-质量控制分析(包括水解控制)必须符合质量控制标准；以及
-如果分析物阳性案例进样后的样品进样对于相同的分析物是阳性的，并且如果初始阳性结果具有比QC1000分析更大的离子面积，则必须在报告之前重复对该后续案例进行纯物质样品分析和加标样品分析这两者，以确认筛选阳性结果。
可以通过该方法在临床和法医这两种测试中报告所有阴性测试结果。也可以报告临床测试中的阳性测试结果。在法医测试中，具有阳性结果的案例需要使用替代测试方法对初级标本进行重新测试。
所有结果都应先由认证科学家或实验室主任审查和认证，之后再报告。
本领域的普通技术人员将会了解基于上述实施方案的本发明的另外的特征和优点。因此，本发明不受已经具体示出和描述的内容的限制，由所附权利要求所指示的除外。

Claims (21)

1.一种用于检测生物标本中的分析物的方法，包括：
分析第一样品以获得第一结果，所述第一样品包括生物标本的第一部分；
分析第二样品以获得第二结果，所述第二样品包括所述生物标本的一部分和在限定浓度下的参考分析物；以及
计算以下两者之间的比率：(i)所述第一结果和(ii)所述第二结果与所述第一结果之间的差值。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括将所述比率与校准的阈值比率进行比较。
3.根据权利要求2所述的方法，还包括基于所述比较来确定阈值分析物结果。
4.根据权利要求2所述的方法，其中用于计算所述校准的阈值比率的步骤包括：
分析生物标本的已知样品以获得第一校准结果；
分析所述已知样品和在所述限定浓度下的所述参考分析物的组合以获得第二校准结果；以及
将所述校准的阈值比率计算为以下两者之间的比率：(i)所述第一校准结果和(ii)所述第二校准结果与所述第一校准结果之间的差值。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述参考分析物的所述限定浓度是所述分析物的阈值浓度。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述参考分析物的所述限定浓度在所述分析物的阈值浓度的约10％至所述分析物的阈值浓度的约750％的范围内。
7.一种用于定量生物标本中的分析物的方法，包括：
分析第一样品以获得第一结果，所述第一样品包括生物标本的第一部分；
分析第二样品以获得第二结果，所述第二样品包括所述生物标本的一部分和在限定浓度下的参考分析物；以及
计算以下两者之间的比率：(i)所述第一结果和(ii)所述第二结果与所述第一结果之间的差值；
将所述比率与校准的定量关系进行比较；以及
基于所述校准的定量关系来确定所述生物样品中的分析物的量。
8.根据权利要求7所述的方法，其中用于计算所述校准的定量关系的步骤包括：
分析生物标本的多个已知样品以获得多个第一校准结果，所述多个已知样品各自包含不同浓度的已知分析物；
分析与在所述限定浓度下的所述参考分析物结合的所述多个已知样品中的每个以获得多个第二校准结果；以及
将所述校准的定量关系计算为如下的线性回归：(a)以下两者之间的多个比率：(i)所述多个第一校准结果中的每个和(ii)所述第二校准结果中的每个与所述第一校准结果中的每个之间的对应差值，以及(b)所述已知样品中的所述已知分析物的对应不同浓度。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个已知样品中的已知分析物的所述不同浓度至少包括定量下限处的第一浓度和定量上限处的第二浓度。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个已知样品中的已知分析物的所述不同浓度包括定量下限和定量上限之间的多个浓度。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述参考分析物的所述限定浓度大于所述分析物的定量上限的约15％。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述参考分析物的所述限定浓度大于所述分析物的定量上限的约25％。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述参考分析物的所述限定浓度大于所述分析物的定量上限的约30％。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述参考分析物的所述限定浓度大于所述分析物的定量上限的约50％。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述参考分析物的所述限定浓度在所述分析物的定量上限的约30％至所述分析物的定量上限的约50％的范围内。
16.一种用于检测和定量生物标本中的分析物的方法，包括：
分析第一样品以获得第一结果，所述第一样品包括生物标本的第一部分；
分析第二样品以获得第二结果，所述第二样品包括所述生物标本的一部分和在限定浓度下的参考分析物；以及
计算以下两者之间的比率：(i)所述第一结果和(ii)所述第二结果与所述第一结果之间的差值。
将所述比率与校准的定量关系进行比较；以及
基于所述比较，确定所述生物标本中的分析物的量和阈值分析物结果两者。
17.根据权利要求16所述的方法，其中用于计算所述校准的定量关系的步骤包括：
分析生物标本的多个已知样品以获得多个第一校准结果，所述多个已知样品各自包含不同浓度的已知分析物；
分析与在所述限定浓度下的所述参考分析物结合的所述多个已知样品中的每个以获得多个第二校准结果；以及
将所述校准的定量关系计算为如下的线性回归：(a)以下两者之间的多个比率：(i)所述多个第一校准结果中的每个和(ii)所述第二校准结果中的每个与所述第一校准结果中的每个之间的对应差值，以及(b)所述已知样品中的所述已知分析物的对应不同浓度。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个已知样品中的已知分析物的所述不同浓度至少包括定量下限处的第一浓度和定量上限处的第二浓度。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述分析物的阈值浓度介于所述第一浓度与所述第二浓度之间。
20.根据权利要求16所述的方法。其中所述参考分析物的所述限定浓度大于所述分析物的定量上限的约50％。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述参考分析物的所述限定浓度在所述分析物的定量上限的约30％至所述分析物的定量上限的约50％的范围内。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7464695B2 (ja) 2019-08-08 2024-04-09 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 自動ピーク積分のための方法および装置

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007001899A1 (en) * 2005-06-20 2007-01-04 Cargill, Incorporated Method, apparatus and system for quantifying the content of genetically modified material in a sample comprising contaminations
CN101762668A (zh) * 2009-12-24 2010-06-30 山东海科化工集团有限公司 肝素中硫酸皮肤素定量检测方法
CN101819186A (zh) * 2009-02-26 2010-09-01 上海宝钢化工有限公司 一种蒽醌中杂质的定性分析方法
US20130102478A1 (en) * 2007-11-26 2013-04-25 Waters Technologies Corporation Internal standards and methods for use in quantitatively measuring analytes in a sample
CN103563043A (zh) * 2011-03-31 2014-02-05 马泰奥·弗洛里迪亚 用于样品定量化学分析的具有对仪器响应的校准的特别是医学领域的系统及其对应方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5948684A (en) * 1997-03-31 1999-09-07 University Of Washington Simultaneous analyte determination and reference balancing in reference T-sensor devices
AU2003220321A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 University Of Utah Methods for quantitative analysis by tandem mass spectrometry
CA2616164A1 (en) * 2005-07-25 2007-02-01 Metanomics Gmbh Means and methods for analyzing a sample by means of chromatography-mass spectrometry
WO2008144937A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-04 Mcmaster University Automated solid phase analytical derivatization
WO2008150488A1 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for quantification of peptides and other analytes
US8268388B1 (en) * 2007-08-29 2012-09-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Method to incorporate a fluorescent internal standard on substrates
DE112010000967T5 (de) * 2009-03-05 2012-08-16 Hitachi High-Technologies Corp. Analysator
WO2011068917A1 (en) * 2009-12-01 2011-06-09 George Mason Intellectual Properties, Inc. Qualifying a specimen for protein or peptide analysis
EP2548015A1 (en) * 2010-03-15 2013-01-23 Anderson Forschung Group, Inc. Improved mass spectrometric assays for peptides

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007001899A1 (en) * 2005-06-20 2007-01-04 Cargill, Incorporated Method, apparatus and system for quantifying the content of genetically modified material in a sample comprising contaminations
US20130102478A1 (en) * 2007-11-26 2013-04-25 Waters Technologies Corporation Internal standards and methods for use in quantitatively measuring analytes in a sample
CN101819186A (zh) * 2009-02-26 2010-09-01 上海宝钢化工有限公司 一种蒽醌中杂质的定性分析方法
CN101762668A (zh) * 2009-12-24 2010-06-30 山东海科化工集团有限公司 肝素中硫酸皮肤素定量检测方法
CN103563043A (zh) * 2011-03-31 2014-02-05 马泰奥·弗洛里迪亚 用于样品定量化学分析的具有对仪器响应的校准的特别是医学领域的系统及其对应方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DR STUART JONES 等: "making an HPLC Calibration work (Part 1)", 《HTTPS://WWW.LABMATE-ONLINE.COM/ARTICLE/CHROMATOGRAPHY/1/LASERCHROM-HPLC-LABORATORIES-LTD/MAKING-AN-HPLC-CALIBRATION-WORK-PART-1/536》 *
郝家勇 等: "LC-MS/MS 测定鱼肉中的孔雀石绿及其代谢物残留及基质效应分析", 《农产品加工 学刊》 *

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